CN102012405A - 木芙蓉总黄酮中黄酮类化合物的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的木芙蓉总黄酮中黄酮类化合物的检测方法，采用高效液相色谱仪、紫外检测器；按照中国药典2005版一部附录VI D高效液相色谱法测定；用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：XBridge Shield RP18，4.6mm×250mm，5μm；特定的流动相；检测波长370nm或254nm；进样量20μL，理论塔板数按槲皮苷计算应不低于3000；按照制得的供试品溶液、对照品溶液在色谱检测条件下注入高效液相色谱仪进行检测。本发明的方法，根据槲皮苷的峰面积可以计算槲皮苷在总黄酮中所占的含量，根据供试品溶液的各个峰的出峰时间定性检测出芦丁与金丝桃苷。
Description
技术领域
本发明属于中药检测技术领域，涉及一种木芙蓉总黄酮中黄酮类化合物的检测方法。
背景技术
木芙蓉属锦葵科植物，又名拒霜花、芙蓉木、木莲、大叶芙蓉、下排杯、地芙蓉、华木、旱芙蓉、九头花等，我国多有栽培。药用叶、花、根皮，夏秋季收。鲜用或晒干备用。全株具清热解毒、凉血消肿功效，用于痈疽肿毒初起、臁疮、烫伤、跌打损伤、目赤肿痛、肺痈、咳喘、赤白痢疾、妇人白带、肾盂肾炎等症。
木芙蓉中主要化学成分为黄酮类和甾醇类，分离得到的黄酮类成分有槲皮素、山奈酚、芸香苷、山奈酚-3-O-β-芸香糖苷、山奈酚-3-O-β-刺槐双糖苷及山奈酚-3-O-β-D-(6-E-对羟基桂皮酰基)-葡萄糖苷等。
采用木芙蓉叶加工得到中药，其黄酮类成份必须有着严格的控制，以满足医用的需要，现有木芙蓉中黄酮类成份质量的检测方法为：采用紫外分光光度法测定总黄酮；采用RP-HLPC法测定木芙蓉提取物中芦丁含量，以芦丁标准品为对照进行反向高效液相法测定：Ubondpak C18色谱柱，柱温25℃，在370nm波长处紫外检测；流动相：0.02mol/L磷酸二氢钾缓冲液(含1％冰醋酸)与甲醇以体积比为73∶27组成流动相，流速为1.0ml/min，SPD-2ASUV检测器于波长370nm检测；芦丁与木芙蓉中其他成分基线分离良好。或用ODS(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-水-冰醋酸(甲醇∶水∶冰醋酸体积比30∶70∶2.5)，检测波长：254nm。
采用HPLC法测定木芙蓉中槲皮甙的含量，色谱柱：ODS C18(4.6mm×250mm，10μm)；流动相为甲醇-水-冰乙酸(甲醇∶水∶冰乙酸体积比45∶55∶1.5)流速：1mL/min；检测波长：370nm。
采用HPLC法测定木芙蓉中金丝桃苷的含量，Agilent Zorbax SB C18(4.6mm×250mm，5μm)，ODS预柱。流动相：乙腈-甲醇-四氢呋喃-0.5％冰醋酸(乙腈∶甲醇∶四氢呋喃∶0.5％冰醋酸体积比为1∶1∶19.4∶78.6)，流速：1.0mL/min，柱温：30℃，检测波长：363nm。
可以看出，采用上述的方法检测起来比较麻烦，不能同时定性定量检测几种黄酮类成分；并且在同一高效液相色谱系统中，同时定性定量检测多种黄酮类成分的研究未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种木芙蓉总黄酮中黄酮类化合物的检测方法，可以一次定量检测出木芙蓉总黄酮中的槲皮苷，定性检测出木芙蓉总黄酮中的芦丁、金丝桃苷。
本发明采用的第一种技术方案是，一种木芙蓉总黄酮中黄酮类化合物的检测方法，具体按照以下步骤进行：
步骤1，
供试品溶液的制备：
称取木芙蓉总黄酮0.5g，精密称定后加入蒸馏水适量，超声溶解，功率为200w，频率为40kHz，时间为10min；然后用水稀释至50ml，加入沸点60℃-90℃石油醚萃取三次，每次50ml，石油醚液弃去，水液中再加入乙酸乙酯萃取三次，每次50ml，合并乙酸乙酯液并减压蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至50ml，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备：
精密称取芦丁、金丝桃苷、槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含40.0μg、32.2μg、28.0μg的混合溶液，即得；
采用的检测仪器：高效液相色谱仪、紫外检测器；
采用的色谱检测条件：按照中国药典2005版一部附录VID高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：XBridge Shield RP18色谱柱，4.6mm×250mm，5μm；流动相梯度为：
在0-10分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为85∶15，
在10-15分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为82∶18，
在15-20分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为81∶19，
在20-25分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为80∶20，
在25-28分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为79∶21，
在28-31分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为78∶22，
在31-33分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为77∶23，
在33-36分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为76∶24，
在36-38分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为75∶25，
在38-45分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为68∶32，
在45分钟后，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为65∶35；
检测波长370nm或254nm；进样量20μL，理论塔板数按槲皮苷计算应不低于3000；
步骤2，
按照步骤1制得的供试品溶液、对照品溶液在步骤1的色谱检测条件下注入高效液相色谱仪进行检测，根据槲皮苷的峰面积计算槲皮苷在总黄酮中所占的含量，根据供试品溶液的各个峰的出峰时间定性检测出芦丁与金丝桃苷。
本发明采用的第二种技术方案是，一种木芙蓉总黄酮中黄酮类化合物的检测方法，具体按照以下步骤进行：
步骤1，
供试品溶液的制备：
称取木芙蓉总黄酮2.0g，精密称定后分别依次加入占木芙蓉总黄酮质量8-10倍量、5-8倍量，5-8倍量，浓度为80％的乙醇回流提取三次，合并三次滤液，滤液蒸干至无醇味，加水稀释至20ml，再加入沸点60℃-90℃石油醚萃取三次，每次20ml，石油醚液弃去，在水液中加入乙酸乙酯萃取三次，每次20ml，合并乙酸乙酯液并减压蒸干，得到残渣加甲醇溶解，定容至10ml，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备：
精密称取芦丁、金丝桃苷、槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含40.0μg、32.2μg、28.0μg的混合溶液，即得；
采用的检测仪器：高效液相色谱仪、紫外检测器；
采用的色谱检测条件：按照中国药典2005版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：XBridge Shield RP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相梯度为：
在0-10分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为85∶15，
在10-15分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为82∶18，
在15-20分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为81∶19，
在20-25分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为80∶20，
在25-28分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为79∶21，
在28-31分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为78∶22，
在31-33分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为77∶23，
在33-36分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为76∶24，
在36-38分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为75∶25，
在38-45分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为68∶32，
在45分钟后，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为65∶35；
检测波长370nm或254nm；进样量20μL，理论塔板数按槲皮苷计算应不低于3000；
步骤2，
按照步骤1制得的供试品溶液、对照品溶液在步骤1的色谱检测条件下注入高效液相色谱仪进行检测，根据槲皮苷的峰面积计算槲皮苷在总黄酮中所占的含量，根据供试品溶液的各个峰的出峰时间定性检测出芦丁与金丝桃苷。
本发明采用的第三种技术方案是，一种木芙蓉总黄酮中黄酮类化合物的检测方法，具体按照以下步骤进行：
步骤1，
供试品溶液的制备：
称取木芙蓉总黄酮2.0g，精密称定后置具塞锥形瓶中，分别加入占木芙蓉总黄酮质量8-10倍量、5-8倍量，5-8倍量，浓度为80％的乙醇超声提取三次，功率200w、频率40kHz，然后合并三次滤液，滤液蒸干至无醇味，加水稀释至20ml，加入沸点60℃-90℃石油醚萃取三次，每次20ml，石油醚液弃去，在水液加入乙酸乙酯萃取三次，每次20ml，合并乙酸乙酯液并减压蒸干，得到残渣加甲醇溶解，定容至10ml，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备：
精密称取芦丁、金丝桃苷、槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含40.0μg、32.2μg、28.0μg的混合溶液，即得；
采用的检测仪器：高效液相色谱仪、紫外检测器；
采用的色谱检测条件：按照中国药典2005版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：XBridge Shield RP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相梯度为：
在0-10分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为85∶15，
在10-15分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为82∶18，
在15-20分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为81∶19，
在20-25分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为80∶20，
在25-28分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为79∶21，
在28-31分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为78∶22，
在31-33分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为77∶23，
在33-36分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为76∶24，
在36-38分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为75∶25，
在38-45分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为68∶32，
在45分钟后，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为65∶35；
检测波长370nm或254nm；进样量20μL，理论塔板数按槲皮苷计算应不低于3000；
步骤2，
按照步骤1制得的供试品溶液、对照品溶液在步骤1的色谱检测条件下注入高效液相色谱仪进行检测，根据槲皮苷的峰面积计算槲皮苷在总黄酮中所占的含量，根据供试品溶液的各个峰的出峰时间定性检测出芦丁与金丝桃苷。
采用本发明检测方法的有益效果是：
(1)首次在同一洗脱系统中，对木芙蓉总黄酮中的8个共有峰进行了分离，并以芦丁、金丝桃苷、槲皮苷峰为对照，进行了定性定量分析。
(2)优点：简便、稳定、精密度高、重现性好、易于掌握，能从色谱的整体特征面貌上把握木芙蓉及其提取物的品种和质量情况。
(3)采用指纹图谱对含量测定，提高了药材、制剂、提取物的质量控制标准，从而有效确保了含木芙蓉的品种均一、稳定、有效、可控，保证了工艺的规范化和质量的稳定一致。
附图说明
图1为本发明检测方法中在254nm波长下对照品芦丁、金丝桃苷、槲皮苷的色谱图。
图2为本发明检测方法中在370nm波长下对照品芦丁、金丝桃苷、槲皮苷的色谱图。
图3为本发明检测方法中在254nm波长下木芙蓉总黄酮的色谱图。
图4为本发明检测方法中在370nm波长下木芙蓉总黄酮的色谱图。
图5为本发明检测方法中的指纹图谱各共有指纹峰图。
图6为采用本发明检测方法的阴性样品的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明木芙蓉总黄酮中黄酮类化合物的检测方法，首先需要从木芙蓉中提取出木芙蓉总黄酮，现有的从木芙蓉中提取出木芙蓉总黄酮主要通过乙醇加热回流法、碱提酸沉法，然后将提取得到的黄酮类化合物再经过加工制备得到具有清热解毒、消肿排脓、凉血止血功能的中药。上述方法中，采用乙醇加热回流成本高，产品有机溶剂残留量超标；碱提酸沉法耗时长，强酸强碱对于设备的腐蚀性比较强，产品质量较差，不适合产业化生产。这里，给出了木芙蓉总黄酮的提取方法，采用以下步骤进行：
步骤1，
首先称取木芙蓉叶，在木芙蓉叶中加入浓度为80％的乙醇采用微波的方式提取3次，加入的乙醇的质量为木芙蓉叶质量的8-20倍；其中，第一次提取功率560w-500w，提取时间10min-20min；第二次提取功率500w-400w，提取时间10min-20min；第三次提取功率400w-350w，提取时间10min-20min；
步骤2，
合并步骤1中三次提取得到的提取液，在70℃减压浓缩至清膏，清膏相对密度(相对于水的密度)1.08-1.15，之后进行喷雾干燥，进风口温度180℃-230℃，出风口温度85℃-90℃，进料速度30ml/min-50ml/min；接着按照干燥后清膏质量的1％加入微粉硅胶，按照干燥后清膏质量的10％-15％加入可溶性淀粉，最后干燥成粉末，得到木芙蓉总黄酮。
然后采用上述方法得到的木芙蓉总黄酮可以制备成颗粒剂、胶囊、片剂、丸剂、软胶囊剂，用于流感、痈疽肿毒初起、臁疮、烫伤、跌打损伤、目赤肿痛、肺痈、咳喘、赤白痢疾、妇人白带、肾盂肾炎等症的治疗。
比如，将木芙蓉总黄酮制备成颗粒剂，具体采用以下步骤：
按照质量份，取木芙蓉总黄酮150份、淀粉500-1000份、糊精1500-3000份、糖粉700-900份，将取得的木芙蓉总黄酮、淀粉、糊精以及糖粉混合均匀后加入浓度为80％-90％的乙醇，乙醇为润湿剂，然后过孔径为1000μm的筛制备湿颗粒，湿颗粒在40℃-60℃烘干30min，再过孔径为1000μm的筛整粒后干燥，制得干颗粒剂，最后将干颗粒剂包装成每袋5g。
再比如，将木芙蓉总黄酮制备软胶囊，具体采用以下步骤：
按照质量比PEG400∶甘油∶PEG 6000∶水为100∶10∶2∶10，取PEG400、甘油、PEG 6000与水，四种原料混合制得A基质；按照质量比干明胶∶甘油∶水为1∶0.4∶1混合制得囊壳；取木芙蓉总黄酮，木芙蓉总黄酮与A基质按照1∶1.2的质量比混合，然后在混合物中加入适量防腐剂焦亚硫酸钠后置入囊壳内经旋转扎囊机压制成软胶囊，干燥后包装成成品。
下面是本发明木芙蓉总黄酮中黄酮类化合物的检测方法，能定量检测出槲皮苷，定性检测出芦丁和金丝桃苷。具体按照以下步骤进行：
步骤1，
供试品溶液的制备：
称取木芙蓉总黄酮0.5g，精密称定后加入蒸馏水适量，超声溶解，功率为200w，频率为40kHz，时间为10min；然后用水稀释至50ml，加入石油醚(60℃-90℃)萃取三次，每次50ml，石油醚液弃去，水液中再加入乙酸乙酯萃取三次，每次50ml，合并乙酸乙酯液并减压蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至50ml，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备：
精密称取芦丁、金丝桃苷、槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含40.0μg、32.2μg、28.0μg的混合溶液，即得；
采用的检测仪器：高效液相色谱仪、紫外检测器；
采用的色谱检测条件：按照中国药典2005版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：XBridge Shield RP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相梯度见表1；检测波长370nm或254nm；进样量20μL，理论塔板数按槲皮苷计算应不低于3000；
表1流动相梯度洗脱表
步骤2，
按照步骤1制得的供试品溶液、对照品溶液在步骤1的色谱检测条件下注入高效液相色谱仪进行检测，根据槲皮苷的峰面积可以计算槲皮苷在总黄酮中所占的含量，根据供试品溶液的各个峰的出峰时间定性检测出芦丁与金丝桃苷。提高了木芙蓉叶药材、制剂、提取物的质量控制标准，保证了工艺的规范化和质量的稳定一致。
其中，上述步骤1中供试品溶液的制备还可以采用第二种方法，具体通过以下步骤进行：称取木芙蓉总黄酮2.0g，精密称定后分别依次加入占木芙蓉总黄酮质量8-10倍量、5-8倍量，5-8倍量，浓度为80％的乙醇回流提取三次，合并三次滤液，滤液蒸干至无醇味，加水稀释至20ml，再加入石油醚(60℃-90℃)萃取三次，每次20ml，将石油醚液弃去，在水液中加入乙酸乙酯萃取三次，每次20ml，合并乙酸乙酯液并减压蒸干，得到残渣加甲醇溶解，定容至10ml，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；
或者，上述步骤1中供试品溶液的制备还可以采用第三种方法，具体通过以下步骤进行：称取木芙蓉总黄酮2.0g，精密称定后置具塞锥形瓶中，分别加入占木芙蓉总黄酮质量8-10倍量、5-8倍量，5-8倍量，浓度为80％的乙醇超声提取三次，功率200w、频率40kHz，然后合并三次滤液，滤液蒸干至无醇味，加水稀释至20ml，加入石油醚(60℃-90℃)萃取三次，每次20ml，石油醚液弃去，在水液加入乙酸乙酯萃取三次，每次20ml，合并乙酸乙酯液并减压蒸干，得到残渣加甲醇溶解，定容至10ml，即得供试品溶液。
采用上述第二种和第三种方法都可以制备所需的供试品溶液，但是，本发明后续描述以及实验所采用的供试品溶液均为采用第一种方法制备的供试品溶液。
对上述步骤确定的测定方法进行有效性评价，其中包括专属性、准确度、精密度、重复性、稳定性、测定范围以及耐用性；
空白干扰试验(专属性试验)：
用溶剂(甲醇)制成阴性对照溶液，并按照上述步骤1的色谱条件测试，结果阴性样品HPLC图谱中在与芦丁、金丝桃苷、槲皮苷对照品HPLC图谱中相同保留时间处未出现色谱峰，说明按本法的试验条件测定，溶剂对槲皮苷的含量测定无干扰。采用本发明检测方法的阴性样品的色谱图见图6。
线性关系考察：
精密称取槲皮苷对照品适量，加甲醇，制成每1ml含28.0μg槲皮苷的对照溶液，分别精密吸取4μl、8μl、12μl、16μl、20μl槲皮苷溶液，注入高效液相色谱仪，按步骤1色谱检测条件测定，以槲皮苷峰面积值为Y，进样量为x(单位ug)，进行线性回归，得线性方程：y＝21547x-11651，r＝1.0；结果表明，在5.6ug～28.0ug范围内，槲皮苷进样量与峰面积值呈良好的线性关系，线性关系实验数据见表2。
表2线性关系实验数据
精密度试验：
取步骤1制得的供试品溶液20μl，注入高效液相色谱仪，按照步骤1的色谱检测条件测试，记录色谱图，共测定5次，精密度实验数据见表3。
表3精密度试验数据
结果为相对标准偏差RSD＝1.58％＜5.0％，表明本测定方法精密度良好。
溶液的稳定性试验：
取步骤1制得的同一供试品溶液，每间隔2小时，精密吸取20μl，注入高效液相色谱仪测定一次，共测定8h，稳定性实验结果见表4。
表4稳定性试验结果
结果为相对标准偏差RSD＝1.75％＜5.0％，表明溶液在8小时内稳定性良好。
重复性试验：
取同一批木芙蓉总黄酮样品5份，分别按照步骤1制备成供试品溶液5份，并按步骤1的色谱检测条件测定，计算每份供试品溶液中槲皮苷的含量，并计算出RSD。重现性实验结果见表5。
表5样品重现性试验结果
结果为相对标准偏差RSD＝1.7％＜5.0％，表明该方法重复性良好。
回收率试验：
取已知含量的木芙蓉总黄酮样品，精密量取适量已知含量的槲皮苷对照品溶液，分别加入样品中，按供试品溶液制备方法制备，并按步骤1的色谱条件测试，计算回收率，结果见表6。
表6回收率实验数据
回收率试验结果表明，6个样品的回收率均在98.1％～101.6％之间，平均回收率为100.4％，RSD为1.3％(n＝6)，回收率良好。
限度确定：
取十批木芙蓉总黄酮样品，分别按供试品溶液制备方法制备，用步骤1的方法分别测定槲皮苷的含量，十批供试品溶液中槲皮苷含量测定结果见表7。
表7槲皮苷含量测定结果
从十批供试品溶液测定结果看，木芙蓉中槲皮苷的含量在1.81～3.48mg/g范围内，考虑到药材来源、加工、炮制等因素；本品含总黄酮以槲皮苷计，不得少于1.5mg/g。
本发明所述的检测方法，其中优选的波长在254nm或370nm波长下槲皮苷对照的色谱图的保留时间与峰面积，再使用matlab 7.1进行编程，将不同波长下的色谱图中相同组分按最大峰面积覆盖融合。指纹图谱特征参数为：有八个共有峰(见图5)，不同批木芙蓉叶的指纹图谱特征峰相近，各特征峰以8号峰(保留时间RT＝52.264)为参照峰，相对保留时间分别为：0.44，0.46，0.54，0.60，0.69，0.72，0.96，1.00。
将370nm波长下测得芦丁、金丝桃苷、槲皮苷的保留时间分别是24.71min、28.25min和38.37min；峰面积分别是1437233、873056、528079。样品中对应的峰分别是2号、3号、6号峰。
实施例1
供试品溶液的制备：称取木芙蓉总黄酮提取物约0.5g，精密称定后置具塞锥形瓶中，加入蒸馏水适量，超声溶解，功率200w，频率40kHz，时间10min，用水稀释至50ml，再加入石油醚(沸点60℃-90℃)萃取三次，每次50ml，石油醚液弃去，水液加入乙酸乙酯萃取三次，每次50ml，合并乙酸乙酯液并减压蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至50ml，过0.45μm微孔滤膜，即得。
对照品溶液的制备：精密称取芦丁、金丝桃苷、槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含40.0μg、32.2μg、28.0μg的混合溶液，即得。
用溶剂(甲醇)制成阴性对照溶液。
选择Waters 600高效液相色谱仪，紫外检测器，照高效液相色谱条件测定。色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；XBridge Shield RP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相梯度见表1；流速1.0mL/min；检测波长254nm；进样量20μL，理论塔板数按槲皮苷计算应不低于3000。
在254nm波长下对照品芦丁、金丝桃苷、槲皮苷的色谱图如图1所示。芦丁保留时间RT＝24.711、金丝桃苷RT＝28.255、槲皮苷RT＝38.372，在该系统下，峰形对称，分离度好。
在254nm波长下木芙蓉总黄酮的色谱图如图3所示。芦丁RT＝23.197、金丝桃苷RT＝27.833、槲皮苷RT＝37.023，在该系统下，峰形对称，分离度好。
实施例2
供试品溶液的制备：称取木芙蓉总黄酮提取物约0.5g，精密称定后置具塞锥形瓶中，加入蒸馏水适量，超声溶解，功率200w，频率40kHz，时间10min，用水稀释至50ml，再加入石油醚(沸点60℃-90℃)萃取三次，每次50ml，石油醚液弃去，水液加入乙酸乙酯萃取三次，每次50ml，合并乙酸乙酯液并减压蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至50ml，过0.45μm微孔滤膜，即得。
对照品溶液的制备：精密称取芦丁、金丝桃苷、槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含40.0μg、32.2μg、28.0μg的溶液，即得。
用溶剂(甲醇)制成阴性对照溶液。
选择Waters 600高效液相色谱仪，紫外检测器，照高效液相色谱条件测定。色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；XBridge Shield RP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相梯度见表1；流速1.0mL/min；检测波长370nm；进样量20μL，理论塔板数按槲皮苷计算应不低于3000。
在370nm波长下对照品芦丁、金丝桃苷、槲皮苷的色谱图如图2所示。芦丁RT＝24.711、金丝桃苷RT＝28.255、槲皮苷RT＝38.372，在该系统下，峰形对称，分离度好。
在370nm波长下木芙蓉总黄酮的色谱图如图4所示。芦丁RT＝23.199、金丝桃苷RT＝27.833、槲皮苷RT＝37.923，在该系统下，峰形对称，分离度好。
Claims (3)
1.一种木芙蓉总黄酮中黄酮类化合物的检测方法，其特征在于，具体按照以下步骤进行：
步骤1，
供试品溶液的制备：
称取木芙蓉总黄酮0.5g，精密称定后加入蒸馏水适量，超声溶解，功率为200w，频率为40kHz，时间为10min；然后用水稀释至50ml，加入沸点60℃-90℃石油醚萃取三次，每次50ml，石油醚液弃去，水液中再加入乙酸乙酯萃取三次，每次50ml，合并乙酸乙酯液并减压蒸干，残渣加甲醇溶解，定容至50ml，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备：
精密称取芦丁、金丝桃苷、槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含40.0μg、32.2μg、28.0μg的混合溶液，即得；
采用的检测仪器：高效液相色谱仪、紫外检测器；
采用的色谱检测条件：按照中国药典2005版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：XBridge Shield RP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相梯度为：
在0-10分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为85∶15，
在10-15分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为82∶18，
在15-20分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为81∶19，
在20-25分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为80∶20，
在25-28分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为79∶21，
在28-31分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为78∶22，
在31-33分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为77∶23，
在33-36分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为76∶24，
在36-38分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为75∶25，
在38-45分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为68∶32，
在45分钟后，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为65∶35；
检测波长370nm或254nm；进样量20μL，理论塔板数按槲皮苷计算应不低于3000；
步骤2，
按照步骤1制得的供试品溶液、对照品溶液在步骤1的色谱检测条件下注入高效液相色谱仪进行检测，根据槲皮苷的峰面积计算槲皮苷在总黄酮中所占的含量，根据供试品溶液的各个峰的出峰时间定性检测出芦丁与金丝桃苷。
2.一种木芙蓉总黄酮中黄酮类化合物的检测方法，其特征在于，具体按照以下步骤进行：
步骤1，
供试品溶液的制备：
称取木芙蓉总黄酮2.0g，精密称定后分别依次加入占木芙蓉总黄酮质量8-10倍量、5-8倍量，5-8倍量，浓度为80％的乙醇回流提取三次，合并三次滤液，滤液蒸干至无醇味，加水稀释至20ml，再加入沸点60℃-90℃石油醚萃取三次，每次20ml，将合并的石油醚液弃去，在水液中加入乙酸乙酯萃取三次，每次20ml，合并乙酸乙酯液并减压蒸干，得到残渣加甲醇溶解，定容至10ml，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备：
精密称取芦丁、金丝桃苷、槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含40.0μg、32.2μg、28.0μg的混合溶液，即得；
采用的检测仪器：高效液相色谱仪、紫外检测器；
采用的色谱检测条件：按照中国药典2005版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：XBridge Shield RP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相梯度为：
在0-10分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为85∶15，
在10-15分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为82∶18，
在15-20分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为81∶19，
在20-25分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为80∶20，
在25-28分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为79∶21，
在28-31分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为78∶22，
在31-33分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为77∶23，
在33-36分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为76∶24，
在36-38分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为75∶25，
在38-45分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为68∶32，
在45分钟后，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为65∶35；
检测波长370nm或254nm；进样量20μL，理论塔板数按槲皮苷计算应不低于3000；
步骤2，
按照步骤1制得的供试品溶液、对照品溶液在步骤1的色谱检测条件下注入高效液相色谱仪进行检测，根据槲皮苷的峰面积计算槲皮苷在总黄酮中所占的含量，根据供试品溶液的各个峰的出峰时间定性检测出芦丁与金丝桃苷。
3.一种木芙蓉总黄酮中黄酮类化合物的检测方法，其特征在于，具体按照以下步骤进行：
步骤1，
供试品溶液的制备：
称取木芙蓉总黄酮2.0g，精密称定后置具塞锥形瓶中，分别加入占木芙蓉总黄酮质量8-10倍量、5-8倍量，5-8倍量，浓度为80％的乙醇超声提取三次，功率200w、频率40kHz，然后合并三次滤液，滤液蒸干至无醇味，加水稀释至20ml，加入沸点60℃-90℃石油醚萃取三次，每次20ml，合并石油醚液弃去，在水液加入乙酸乙酯萃取三次，每次20ml，合并乙酸乙酯液并减压蒸干，得到残渣加甲醇溶解，定容至10ml，过0.45μm微孔滤膜，即得供试品溶液；
对照品溶液的制备：
精密称取芦丁、金丝桃苷、槲皮苷对照品适量，加甲醇制成每1mL分别含40.0μg、32.2μg、28.0μg的混合溶液，即得；
采用的检测仪器：高效液相色谱仪、紫外检测器；
采用的色谱检测条件：按照中国药典2005版一部附录VI D高效液相色谱法测定；
色谱条件与系统适用性试验：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂：XBridge Shield RP18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相梯度为：
在0-10分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为85∶15，
在10-15分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为82∶18，
在15-20分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为81∶19，
在20-25分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为80∶20，
在25-28分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为79∶21，
在28-31分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为78∶22，
在31-33分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为77∶23，
在33-36分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为76∶24，
在36-38分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为75∶25，
在38-45分钟，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为68∶32，
在45分钟后，流速1.0ml/min，水与乙腈体积比为65∶35；
检测波长370nm或254nm；进样量20μL，理论塔板数按槲皮苷计算应不低于3000；
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Denomination of invention: Detection method for flavonoids compounds in cotton rose general flavone Effective date of registration: 20170810 Granted publication date: 20121017 Pledgee: Bank of Communications Ltd. Shaanxi branch Pledgor: SHAANXI ACADEMY OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE HANTANG PHARMACEUTICAL CO.,LTD. Registration number: 2017610000086 |
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Date of cancellation: 20180731 Granted publication date: 20121017 Pledgee: Bank of Communications Ltd. Shaanxi branch Pledgor: SHAANXI ACADEMY OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE HANTANG PHARMACEUTICAL CO.,LTD. Registration number: 2017610000086 |
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Denomination of invention: Detection method for flavonoids compounds in cotton rose general flavone Effective date of registration: 20180801 Granted publication date: 20121017 Pledgee: Bank of Communications Ltd. Shaanxi branch Pledgor: SHAANXI ACADEMY OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE HANTANG PHARMACEUTICAL CO.,LTD. Registration number: 2018610000116 |
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Address after: 710300 No. 18 Caotang 4th Road, Caotang Science and Technology Industrial Base, Xi'an High-tech Zone, Shaanxi Province Patentee after: Shaanxi Hantang Pharmaceutical Co.,Ltd. Address before: 710018 No. 39 Mingguang Road, Xi'an City, Shaanxi Province Patentee before: SHAANXI ACADEMY OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE HANTANG PHARMACEUTICAL CO.,LTD. |
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Change date: 20190729 Registration number: 2018610000116 Pledgor after: Shaanxi Hantang Pharmaceutical Co.,Ltd. Pledgor before: SHAANXI ACADEMY OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE HANTANG PHARMACEUTICAL CO.,LTD. |
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Date of cancellation: 20190730 Granted publication date: 20121017 Pledgee: Bank of Communications Ltd. Shaanxi branch Pledgor: Shaanxi Hantang Pharmaceutical Co.,Ltd. Registration number: 2018610000116 |
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Denomination of invention: Detection method for flavonoids compounds in cotton rose general flavone Effective date of registration: 20190815 Granted publication date: 20121017 Pledgee: Bank of Communications Ltd. Shaanxi branch Pledgor: Shaanxi Hantang Pharmaceutical Co.,Ltd. Registration number: Y2019610000014 |
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Date of cancellation: 20201028 Granted publication date: 20121017 Pledgee: Bank of Communications Ltd. Shaanxi branch Pledgor: Shaanxi Hantang Pharmaceutical Co.,Ltd. Registration number: Y2019610000014 |
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Denomination of invention: Determination of flavonoids in total flavonoids of Hibiscus mutabilis Effective date of registration: 20201030 Granted publication date: 20121017 Pledgee: Bank of Communications Ltd. Shaanxi branch Pledgor: Shaanxi Hantang Pharmaceutical Co.,Ltd. Registration number: Y2020610000193 |
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Date of cancellation: 20211108 Granted publication date: 20121017 Pledgee: Bank of Communications Ltd. Shaanxi branch Pledgor: Shaanxi Hantang Pharmaceutical Co.,Ltd. Registration number: Y2020610000193 |
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Denomination of invention: Detection method for flavonoids in total flavonoids of Hibiscus chinensis Granted publication date: 20121017 Pledgee: Qin Shaanxi Rural Commercial Bank branch of agricultural Limited by Share Ltd. Pledgor: Shaanxi Hantang Pharmaceutical Co.,Ltd. Registration number: Y2024980009017 |
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