CN105294818A

CN105294818A - 一种新的三萜类化合物及其制备方法和医药用途

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Publication number: CN105294818A
Application number: CN201510887421.5A
Authority: CN
Inventors: 杨辉
Original assignee: XINING YIGE INTELLECTUAL PROPERTY ADVISORY SERVICES Co Ltd
Current assignee: XINING YIGE INTELLECTUAL PROPERTY ADVISORY SERVICES Co Ltd
Priority date: 2015-12-07
Filing date: 2015-12-07
Publication date: 2016-02-03

Abstract

本发明公开了一种新的三萜类化合物及其制备方法和医药用途，提供了该化合物结构，含其的药物组合物及其制备方法和应用。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的三萜类化合物，可以从夏枯草的干燥成熟果穗中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物通过抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡发挥对人脑恶性胶质母细胞瘤U251细胞的抑制作用。这些发现为化合物(Ⅰ)治疗胶质瘤的临床药物研究提供依据，可以用来开发成治疗神经胶质瘤的药物。

Description

一种新的三萜类化合物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明属于药物技术领域，具体涉及从夏枯草的干燥成熟果穗中分离得到的一种具有治疗神经胶质瘤作用的三萜类化合物及其制备方法。

背景技术

夏枯草(拉丁学名：Prunellavulgaris)，俗称牛对头，又称九重楼、铁色草、大头花、棒柱头花、羊肠菜、锣锤草、六月干、棒头柱等；多年生草本植物。匍匐茎，节上长有须根。生长在山沟水湿地或河岸两旁湿草丛、荒地、路旁，广泛分布于中国各地，以河南、安徽、江苏、湖南等省为主要产地。临床上主要以其干燥成熟果穗入药，可以清火明目，能治目赤肿痛、头痛等作用。

夏枯草具有多种活性成分，主要有三萜类、甾体类、黄酮类、香豆素类等化合物。目前，研究人员已经从不同种属的夏枯草中分离并鉴定出众多化学成分。

夏枯草煎剂、水浸出液、乙醇-水浸出液及乙醇浸出液均可明显降低实验动物血压，茎、叶、穗及全草均有降压作用，但穗的作用较明显；夏枯草水煎醇沉液小鼠腹腔注射，有明显的抗炎作用；夏枯草煎剂在体外对痢疾杆菌、伤寒杆菌、霍乱弧菌、大肠杆菌、变形杆菌、葡萄球菌及人型结核杆菌均有一定的抑制作用。

正常人体细胞分裂的速度是在一定范围内进行的，当机体受到外在因素的影响或内在环境的失衡，肿瘤细胞的分裂周期或细胞凋亡速度改变，肿瘤细胞数量持续增加，肿块增大。因此，抑制肿瘤细胞的增殖作用是抗肿瘤的一条重要途径。目前，研究证明夏枯草提取物具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。

发明内容

本发明的目的是提供一种从夏枯草的干燥成熟果穗中分离得到的一种具有治疗神经胶质瘤作用的三萜类化合物及其制备方法。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：

具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，包含以下操作步骤：(a)将夏枯草的干燥成熟果穗粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

进一步地，步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。

进一步地，所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

药物组合物，其中含有治疗有效量的所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。

所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用。

所述的药物组合物在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。

该药物组合物含有治疗有效量的本发明化合物(Ⅰ)，其余为药物学上可接受的、对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的可药用载体或赋形剂是一种或多种选自固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明药物可通过口服或注射的形式施用于需要治疗的患者。用于口服时，可将其制成片剂、缓释片、控释片、胶囊、滴丸、微丸、混悬剂、乳剂、散剂或颗粒剂、口服液等；用于注射时，可制成灭菌的水性或油性溶液、无菌粉针、脂质体或乳剂等。

附图说明

图1为化合物(Ⅰ)结构式；

图2为化合物(Ⅰ)理论ECD值与实验ECD值比较；

图3为化合物(Ⅰ)处理后U251细胞洞凋亡率的变化。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明保护范围。尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

实施例1：化合物(Ⅰ)分离制备及结构确证

试剂来源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷为分析纯，购自上海凌峰化学试剂有限公司，甲醇，分析纯，购自江苏汉邦化学试剂有限公司。

制备方法：(a)夏枯草的干燥成熟果穗(10kg)粉碎，用80％乙醇热回流提取(25L×3次)，合并提取液，浓缩至无醇味(3L)，依次用石油醚(3L×3次)、乙酸乙酯(3L×3次)和水饱和的正丁醇(3L×3次)萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(398g)和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏(163g)；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用200-300目正相硅胶分离，依次用体积比为85:1(8个柱体积)、45:1(8个柱体积)、25:1(8个柱体积)、12:1(10个柱体积)和1:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4(49g)用200-300目正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1(8个柱体积)、12:1(10个柱体积)和5:1(5个柱体积)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2(30g)用十八烷基硅烷键合的反相硅胶ODS-C18分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)(143mg)。

结构确证：HR-ESIMS显示[M+Na]⁺为m/z525.3210，结合核磁特征可得分子式为C₃₀H₄₆O₆，不饱和度为8。核磁共振氢谱数据δ_H(ppm，DMSO-d₆，500MHz)：H-1(2.31，m)，H-1(2.17，m)，H-3(4.16，s)，H-5(1.31，dd，J＝13.5，4.1)，H-6(1.81，m)，H-6(1.62，br，t，J＝14.7)，H-7(3.16，d，J＝6.5)，H-11(1.78，m)，H-11(1.94，m)，H-12(1.49，m)，H-12(1.91，m)，H-15(1.65，m)，H-15(1.27，ddd，J＝12.5，12.5，5.3)，H-16(1.24，m)，H-16(2.03，m)，H-17(1.53，m)，H-18(0.91，s)，H-19(0.97，s)，H-20(1.32，m)，H-21(0.85，d，J＝6.6)，H-22(1.17，m)，H-22(1.35，m)，H-23(1.79，m)，H-23(1.97，m)，H-24(5.16，tt，J＝7.1，1.4)，H-26(1.61，s)，H-27(1.63，s)，H-28(0.91，s)，H-29(0.89，s)；核磁共振碳谱数据δ_C(ppm，DMSO-d₆，125MHz)：42.1(CH₂，1-C)，208.2(C，2-C)，81.5(CH，3-C)，44.9(C，4-C)，41.5(CH，5-C)，21.2(CH₂，6-C)，71.4(CH，7-C)，82.1(C，8-C)，97.2(C，9-C)，37.3(C，10-C)，22.0(CH₂，11-C)，34.5(CH₂，12-C)，46.0(C，13-C)，59.9(C，14-C)，20.7(CH₂，15-C)，27.8(CH₂，16-C)，51.6(CH，17-C)，14.2(CH₃，18-C)，16.7(CH₃，19-C)，34.7(CH，20-C)，18.5(CH₃，21-C)，35.9(CH₂，22-C)，24.1(CH₂，23-C)，124.2(CH，24-C)，131.7(C，25-C)，18.2(CH₃，26-C)，25.3(CH₃，27-C)，27.8(CH₃，28-C)，16.8(CH₃，29-C)，177.8(C，30-C)；碳原子标记参见图1。IR光谱显示该化合物含有羟基(3618cm^-1)，γ-内酯(1765cm^-1)和羰基(1728cm^-1)基团。¹HNMR谱显示含有六个单峰甲基信号δH0.91(H₃-18)，0.97(H₃-19)，1.61(H₃-26)，1.63(H₃-27)，0.91(H₃-28)和0.89(H₃-29)，以及一个双峰甲基信号δH0.85(H₃-21，d，J＝6.6Hz)，说明该化合物为三萜类化合物。¹³CNMR和DEPT谱显示30个碳信号，包括七个甲基，六个次甲基(两个含氧次甲基以及一个烯属次甲基)，八个亚甲基以及九个季碳(两个羰基碳，两个含氧季碳以及一个烯烃季碳)。此外，侧链具有24(25)-双键(δC131.7，124.2和δH5.16，tt，J＝7.1，1.4Hz)信号；HMBC谱中，H₃-26和H₃-27与C-24和C-25，H₃-21与C-17，C-20和C-22，以及H-24与C-22，C-23，H₃-26和H₃-27的相关性验证了上述推论。此外，一个酯羰基信号[δC177.8(C-30)]和两个碳信号[δC97.2(C-9)和59.9(C-14)]说明该化合物存在一个γ-内酯结构。HMBC谱中，H₃-18与C-14，H₂-15与C-30，H₂-11与C-9，H-11α与C-8以及H₃-19与C-9的相关性验证了30,9-这个官能团的连接关系。两个含氧碳[C-7(δC71.4)和C-8(δC82.1)]的化学位移表明它们各连有一个羟基。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据，可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本一致(图2)。

实施例2：化合物(Ⅰ)药理作用试验

一、材料和仪器

本实验采用人脑恶性胶质母细胞瘤U251细胞株，购自美国模式菌种收集中心。DMEM高糖培养基购自美国Hyclone公司；氯化钠、氢氧化钠、氯化钾、氯化氧、氢氧化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、甲醇购自南京化工厂。化合物(Ⅰ)自制，HPLC归一化纯度大于98％。甘氨酸、Tris、Tween20、二甲基亚砜(DMEM)购自美国Sigma公司；Aimexin-V/PI细胞裯亡试剂盒购自美国Invitrogen公司；细胞裂解液、0.25％胰蛋白酶、CellCountingKit-8试剂盒、青霉素、链霉素、Hoechst33258、细胞核染料DAPI、PMSF、Westernblot凝胶配制试剂盒、细胞核蛋白提取试剂盒、考马斯亮蓝染色液、标准蛋白、5X蛋白质变性缓冲液盒、ECL超敏发光液、显影定影试剂盒、X线胶片、硝酸纤维素膜、抗荧光淬灭封片液购自江苏碧云天生物研宄所。胎牛血清购自杭州四季青生物科技公司；兔抗人P65抗体购自美国NOVUS公司；兔抗人HistonH3抗体购自美国CST公司；山羊抗兔HRP二抗购自美国SantaCruz公司；山羊抗兔荧光二抗购自美国EarthOx公司。

-20℃低温冰箱(海尔青岛)，-80℃低温冰箱(海尔青岛)，低温冰箱(海尔青岛)，高速离心机(飞鹤上海)，培养皿/板(Coming美国)，离心管(Coming美国)，细胞培养箱(Thermo美国)，倒置显微镜(Olympus日本)，荧光倒置相差显微镜(ZEISS德国)，多用途恒温水浴箱(跃进上海)，电子天平仪(上海机密科学仪器)，超净工作台(ARITECH日本)，微量移液器(Dragon芬兰)，酶标仪(Bio-RAD德国)，流式细胞仪(BDAccuriC6

美国)。

二、试验方法

1、细胞培养及传代

人胶质母细胞瘤细胞系U251培养在含10％胎牛血清、1％青霉素、1％链霉素的DMEM高糖培养基中，于37℃，5％CO₂培养箱中常规培养，每隔2天予更换新鲜培养基。待细胞融合至80％左右后，吸除培养基，并用预热的无菌磷酸酸盐缓冲液洗3次，然后向培养皿中加入含0.25％族蛋白酶及0.02％EDTA的细胞消化液1mL消化约2分钟，光镜下观察细胞，可见细胞逐渐回缩变圆，胞间间隙变宽，此时移除细胞消化液，加入完全培养基4mL终止消化，1mL枪头轻柔吹打制成细胞悬液，低速离心机1000rpm离心5分钟，吸除上清液，加入完全培养基重悬，轻柔吹打均匀后，根据经验按1:3～1:5传代，传代后的细胞置于培养箱中继续培，约每周传代2次，以保持细胞处于对数生长期。细胞计数方法：细胞计数板擦拭干净，并将盖玻片盖在计数板上；将细胞悬液沿盖玻片边缘缓慢滴入计数板，光镜下观察，细胞透明、折光性好为活细胞，计数4个大方格中的活细胞数。每细胞数＝每个方格中活细胞数平均值×稀释倍数×10⁴。

2、CCK-8检测细胞生存率

取对数生长期的U251细胞，用含EDTA的0.25％胰酶消化吹打细胞制成单细胞悬液并计数，用完全培养基调整细胞浓度约2×l0⁴个/mL，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100μL，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养12小时，吸除原培养基，按分组给予不同处理：空白对照组(等量完全培养基)，化合物(Ⅰ)组设1、2、4mmol/L，每组设三个重复孔，无菌PBS封闭周边各孔，再次置于37℃、5％CO₂培养箱中，分别培养24、48、72小时后取出96孔板，吸除各组原有培养基，更换为100μLDMEM培养液，本底组无细胞只有DMEM培养液。每孔加入10μLCCK-8溶液，置于培养箱中继续培养2小时。用全自动酶标仪测定每孔吸光度值(OD值)，波长设定在450mn处，取每组复孔的均值。上述实验步骤重复3次，计算平均值。细胞生存率计算公式如下:细胞生存率＝(实验组OD值-本底组OD值)/(对照组OD值-本底组OD值)×100％，绘制生长抑制曲线图，并作统计学分析。

3、Hoechst33258染色

实验釆用碧云天公司Hoechst33258染色液，细胞发生凋亡时，会看到调亡细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染。根据细胞生存率结果，选取2mmol/L化合物(Ⅰ)作用48小时作为Hoechst33258染色的条件。将细胞消化、离心、计数，调整细胞浓度后种入24孔板中，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养12小时，吸除原有培养基，按分组给予不同处理:空白对照组(等量完全培养基)，化合物(Ⅰ)组设1、2、4mmol/L，无菌PBS封闭周边各孔，再次置于37℃、5％CO₂培养箱中，继续培养48小时后取出24孔板，吸除各组原有培养基，无菌PBS洗3次，每孔加入0.5mL多聚甲酸固定细胞15分钟，PBS洗3次，各孔加入100μLHoechst33258染色液，室温黑暗环境下染色10min，去染色液，PBS摇床晃动冲洗3次，每次5分钟，洗尽液体，每孔滴加一滴抗荧光淬灭液，340nm波长的荧光显微镜下拍照并观察细胞核形态学变化。

3、流式细胞术检测细胞循亡

根据细胞生存率结果，选取48小时作为检测细胞碉亡的特定时间点。取处于对数生长期且状态良好的U251细胞，按常规消化传代，接种于6孔板内37℃、5％CO₂培养箱中孵育12h，按分组给予不同处理：空白对照组(等量完全培养基)，化合物(Ⅰ)组设1、2、4mmol/L，置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养48小时后，将原有培养液洗至5mL离心管中，PBS洗涤贴壁细胞2次，加入含有EDTA的适量胰酶消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，尽量吸尽胰酶细胞消化液。加入收集的原有细胞培养液，稍混匀，转移到5mL离心管内，1000g离心5分钟，弃上清，收集细胞，用PBS轻轻重悬细胞并计数。取5万个重悬的细胞，1000g离心5分钟，弃上清，加入100μLAimexinV-FITC结合液轻轻重悬细胞。加2mLAnnexinV-FITC，轻轻混勾。室温避光辉育10分钟。1000g离心5分钟，弃上清，加入2μL碘化丙唆染色液，轻轻混勾，冰浴避光放置15min。随即进行流式细胞仪检测，AmexinV-FITC为绿色荧光，PI为红色荧光。记录AnnexinV-FITC+PI+和AnnexinV-FITC+PI-作为凋亡细胞，每次计数10000个细胞，计算各组凋亡率。

4、统计学处理

采用SPSS16.0进行统计学分析，实验所有数据均代表3次重复实验的结果，以均数士标准差表示。生存率的组间比较采用析因设计资料的方差分析，细胞凋亡率的组间比较釆用单因素方差分析，检验水准为a＝0.05，P<0.05为有显著性差异，P<0.01为极有显著性差异。

三、结果及结论

1、化合物(Ⅰ)对U251细胞生存率的影响

化合物(Ⅰ)抑制U251细胞存活生长CCK-8实验结果显示，不同浓度化合物(Ⅰ)作用U251细胞后，随着作用浓度増高，作用时间加长，U251细胞生存率明显下降，方差分析显示化合物(Ⅰ)浓度因素的主效应F＝945.8(P<0.01)；作用时间因素的主效应F＝302.67(P<0.01)，浓度、时间因素的交互作用F＝45.7(P<0.01)。结合表1，可发现化合物(Ⅰ)对U251细胞生存率的抑制作用呈时间、剂量依赖性，即化合物(Ⅰ)浓度越高，作用时间越长，其抑制作用越强。通过计算得出化合物(Ⅰ)作用24h、48h、72h的IC₅₀值分别为，3.67mmol/L、1.37mmol/L、1.09mmol/L。

2、化合物(Ⅰ)对U251细胞碉亡形态学的影响

正常组及化合物(Ⅰ)处理组细胞经Hochest33258染色，荧光显微镜下观察可见对照组细胞核形态规则，且呈淡蓝色均匀着色；而经2mmol/L化合物(Ⅰ)处理48小时后，与对照组相比，细胞核出现不同程度的固缩，颜色较为明亮，染色致密浓染，核碎裂明显，且可见典型的凋亡小体。以上细胞核形态学的改变提示化合物(Ⅰ)有诱导U251细胞凋亡作用。

3、化合物(Ⅰ)对U251细胞凋亡率的影响

对照组及各处理组经AnnexinV-FITC/PI染色后行流式细胞术检测，结果显示：对照组、1mmol/L化合物(Ⅰ)、2mmol/L化合物(Ⅰ)和4mol/L化合物(Ⅰ)处理48小时组细胞调亡率分别为3.30±0.98、14.97±2.67、27.53±5.51和55.90±5.1％。与对照组相比，各处理组细胞的凋亡率显著增加(P<0.01)。结果见图3。

结论：化合物(Ⅰ)通过抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡发挥对人脑恶性胶质母细胞瘤U251细胞的抑制作用。这些发现为化合物(Ⅰ)治疗胶质瘤的临床药物研究提供依据。

表1不同浓度化合物(Ⅰ)处理作用24～72h后U251细胞生存率(均数±标准差)

实施例3

片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例4

口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制成口服液。

实施例5

胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为1:9的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。

实施例6

注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例7

无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物(Ⅰ)，以及利用有机酸如酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。

Claims

1.具有下述结构式的化合物(Ⅰ)，

2.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a)将夏枯草的干燥成熟果穗粉碎，用75～85％乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；(b)步骤(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔树脂除杂，先用10％乙醇洗脱8个柱体积，再用75％乙醇洗脱10个柱体积，收集75％乙醇洗脱液，减压浓缩得75％乙醇洗脱物浸膏；(c)步骤(b)中75％乙醇洗脱浸膏用正相硅胶分离，依次用体积比为85:1、45:1、25:1、12:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到5个组分；(d)步骤(c)中组分4用正相硅胶进一步分离，依次用体积比为20:1、12:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；(e)步骤(d)中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70％的甲醇水溶液等度洗脱，收集8～10个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物(Ⅰ)。

3.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：步骤(a)中，用80％乙醇热回流提取，合并提取液。

4.根据权利要求2所述的化合物(Ⅰ)的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8型大孔吸附树脂。

5.一种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物(Ⅰ)和药学上可接受的载体。

6.权利要求1所述的化合物(Ⅰ)在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用。

7.权利要求5所述的药物组合物在制备治疗神经胶质瘤的药物中的应用。