CN102608252B - 一种中药组合物秦皮接骨制剂的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种中药组合物秦皮接骨制剂的检测方法，属于医药技术领域。本发明对现有的中药组合物秦皮接骨胶囊及其制剂质量标准进行了相应提高，在原标准的基础上改进了秦皮的鉴别方法，增加了川西小黄菊的鉴别方法，本发明在同一流动相下同时检测秦皮中秦皮甲素及秦皮乙素含量，还新增加了制剂中川贝母中的西贝母碱的含量测定方法，进一步确保了产品质量安全、均一、稳定、质量可控。从而确保了其临床疗效和广大患者的用药安全。
Description
技术领域
本发明涉及一种中药组合物的质量检测方法，特别涉及一种中药组合物秦皮接骨胶囊及其制剂的质量检测方法，属于医药技术领域。
背景技术
秦皮接骨胶囊为青海金诃藏药药业股份有限公司独家剂型产品，收载于国家中成药标准汇编·骨伤科分册，标准编号：WS-10901(ZD-0901)-2002-2011Z。秦皮接骨胶囊制剂是由如下重量配比的药材制成：秦皮113.0g、川西小黄菊80.0g、龙骨57.0g、川贝母80.0g。秦皮接骨胶囊传统制备方法为：取处方量的秦皮，川西小黄菊，龙骨，川贝母，粉碎成细粉，混匀，装入胶囊，即得。秦皮接骨胶囊具有活血散瘀，疗伤接骨，止痛的功效。用于跌打损伤，筋骨扭伤，瘀血肿痛，疗效显著，是历代藏医用于跌打损伤的代表药物。经临床验证，疗效显著，备受医生和患者青睐。
秦皮接骨胶囊组方科学，经临床验证，疗效显著。目前该制剂质量标准（标准号：WS-10901(ZD-0901)-2002-2011Z）只有秦皮的鉴别和秦皮甲素含量测定项，但研究发现秦皮中秦皮甲素及秦皮乙素在一定条件下可以相互转化，故仅检测秦皮甲素对秦皮的质量检测不全面，进而无法保证秦皮接骨制剂的安全、有效。川贝母为名贵中药材，伪劣产品中易出现错投、漏投等情况，但现有技术对秦皮接骨中川贝母未进行任何检测，使制剂存在一定隐患。现有技术中也未发现对于秦皮接骨胶囊的其他质量检测方法。因此，造成秦皮接骨胶囊制剂产品质量检测不精准，质量标准有待提高。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种中药组合物秦皮接骨胶囊及其制剂的质量检测方法。
发明概述
本发明对现有的中药组合物秦皮接骨胶囊及其制剂质量标准进行了相应提高，在原标准的基础上改进了秦皮的鉴别方法，增加了川西小黄菊的鉴别方法，本发明在同一流动相下同时检测秦皮中秦皮甲素及秦皮乙素含量，保证了制剂的安全，有效，同时节约了分析时间。还新增加了制剂中川贝母中的西贝母碱的含量测定方法，进一步确保了产品质量安全、均一、有效、质量可控。
术语说明：
秦皮接骨胶囊是国家中成药标准汇编（中成药地方标准上升国家标准部分）记载的药品名称。
秦皮接骨胶囊及其制剂包括秦皮接骨胶囊及用秦皮接骨胶囊原料药配方制备的其他制剂。
本发明的技术方案如下：
一种原料药重量比组成为秦皮113g、川西小黄菊80g、龙骨57g、川贝母80g的中药组合物秦皮接骨胶囊及其制剂的质量检测方法，该方法包括如下鉴别和/或含量测定方法中的一种或几种：
鉴别：
A.秦皮的鉴别：
取中药组合物秦皮接骨胶囊或其制剂1-5g，加沸程30-60℃石油醚10-30ml，超声处理5-20min，弃去石油醚，将药渣挥干，加1mol/L的盐酸溶液0.5-2ml与乙酸乙酯20-40ml，超声处理20-40min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1-5ml使溶解，作为供试品溶液；取秦皮对照药材1-5g，采用和供试品溶液制备同法制备对照药材溶液；照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述二种溶液各5-20μl，分别点于同一硅胶G薄层色谱板上，以体积份数比为4-8:2-8:0.3-0.8:0.2-0.6的二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
B.川西小黄菊的鉴别：
取中药组合物秦皮接骨胶囊或其制剂1-5g，加沸程30-60℃石油醚10-30ml，超声处理5-20min，弃去石油醚，将药渣挥干，加1mol/L的盐酸溶液0.5-2ml与乙酸乙酯20-40ml，超声处理20-40min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1-5ml使溶解，作为供试品溶液；取川西小黄菊对照药材1g，采用和供试品溶液制备同法制备对照药材溶液；照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述二种溶液各5-20μl，分别点于同一硅胶G薄层色谱板上，以体积份数比为4-8:2-8:0.3-0.8:0.2-0.6二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
含量测定：
A.秦皮的含量测定：
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-体积份数比0.1%磷酸水溶液为流动相；流动相体积份数比为80-90:20-10；检测波长为320-340nm；理论板数按秦皮甲素峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取秦皮甲素对照品、秦皮乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含秦皮甲素0.1mg、秦皮乙素0.05mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：中药组合物秦皮接骨胶囊或其制剂研细后，取2g，置具塞的锥形瓶中，加入甲醇50ml，密塞，加热回流0.5-1.5小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5-10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明中药组合物秦皮接骨胶囊或其制剂中秦皮的含量以秦皮甲素（C15H16O9）和秦皮乙素（C9H6O4）的总量计，不得少于2.5mg/g。
B.川贝母的含量测定：
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-体积份数比0.05%三乙胺水溶液为流动相；流动相体积份数比为70-80:30-20；蒸发光散射检测器检测；理论板数按西贝母碱峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备：取西贝母碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：中药组合物秦皮接骨胶囊或其制剂研细后，取6g，置具塞的锥形瓶中，加入氨水0.2ml，加入体积份数比3-5:0.5-1.5二氯甲烷-甲醇25ml，密塞，超声30min，放置24小时，用体积份数比3-5:0.5-1.5二氯甲烷-甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液20ml，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中，摇匀，过滤，即得；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各10-20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
本发明中药组合物秦皮接骨胶囊或其制剂中川贝母的含量以西贝母碱（C27H43NO3）计，不得少于0.026mg/g。
所述的制剂是指取中药组合物秦皮接骨胶囊原料药，按常规工艺，加入常规辅料制备成临床可接受的任何一种剂型，包括丸剂、微丸、滴丸、片剂、胶囊、颗粒。
优选的，一种原料药重量比组成为秦皮113g、川西小黄菊80g、龙骨57g、川贝母80g的中药组合物秦皮接骨胶囊的质量检测方法，该方法包括如下鉴别和/或含量测定方法中的一种或几种：
鉴别：
A.秦皮的鉴别：
取中药组合物秦皮接骨胶囊5g，加沸程30-60℃石油醚20ml，超声处理10min，弃去石油醚，将药渣挥干，加1mol/L的盐酸溶液1ml与乙酸乙酯30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取秦皮对照药材1g，采用和供试品溶液制备同法制备对照药材溶液；照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述二种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层色谱板上，以体积份数比为8:6:0.6:0.4的二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
B.川西小黄菊的鉴别：
取中药组合物秦皮接骨胶囊5g，加沸程30-60℃石油醚20ml，超声处理10min，弃去石油醚，将药渣挥干，加1mol/L的盐酸溶液1ml与乙酸乙酯30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取川西小黄菊对照药材1g，采用和 供试品溶液制备同法制备对照药材溶液；照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述二种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层色谱板上，以体积份数比为8:6:0.6:0.4二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
含量测定：
A.秦皮的含量测定：
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-体积份数比0.1%磷酸水溶液为流动相；流动相体积份数比为80:20；检测波长为335nm；理论板数按秦皮甲素峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取秦皮甲素对照品、秦皮乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含秦皮甲素0.1mg、秦皮乙素0.05mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：中药组合物秦皮接骨胶囊研细后，取内容物2g，置具塞的锥形瓶中，加入甲醇50ml，密塞，加热回流1小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明中药组合物秦皮接骨胶囊中秦皮的含量以秦皮甲素（C15H16O9）和秦皮乙素（C9H6O4）的总量计，为3.35mg/g。
B.川贝母的含量测定：
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-体积份数比0.05%三乙胺水溶液为流动相；流动相体积份数比为75：25；蒸发光散射检测器检测；理论板数按西贝母碱峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备：取西贝母碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：中药组合物秦皮接骨胶囊研细后，取内容物6g，置具塞的锥形瓶中，加入氨水0.2ml，加入体积份数比4:1二氯甲烷-甲醇25ml，密塞，超声30min，放置24小时，用体积份数比4:1二氯甲烷-甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液20ml，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中，摇匀，过滤，即得；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
本发明中药组合物秦皮接骨胶囊中川贝母的含量以西贝母碱（C27H43NO3）计，为0.0352mg/g。
本说明书中所述的重量份与体积份的单位对应关系为g/ml或kg/l。
中药组合物秦皮接骨胶囊原质量标准项下只有秦皮的鉴别和含量测定项，造成秦皮接 骨胶囊制剂产品质量检测不精准，质量标准有待提高。本发明对现有的中药组合物秦皮接骨胶囊质量标准进行了相应提高，在原标准的基础上改进了秦皮的鉴别方法，增加了川西小黄菊的鉴别方法，本发明在同一流动相下同时检测秦皮中秦皮甲素及秦皮乙素含量，还新增加了制剂中川贝母中的西贝母碱的含量测定方法，进一步确保了产品质量安全、均一、稳定、质量可控。
下述实验例和实施例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1：鉴别实验
中药组合物秦皮接骨胶囊由青海金诃藏药药业股份有限公司提供。
A.秦皮的鉴别：
取中药组合物秦皮接骨胶囊内容物5g，研细，加沸程30-60℃石油醚20ml，超声处理10min，弃去石油醚，将药渣挥干，加1mol/L的盐酸溶液1ml与乙酸乙酯30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。取秦皮对照药材1g，同法制备对照药材溶液。取按处方比例配制的缺秦皮阴性对照品，照供试品制备方法，同法制备阴性样品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层色谱板上，以二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开剂体积份数比为4-8:2-8:0.3-0.8:0.2-0.6的范围内取体积份数比分别为（8:2:0.6:0.4）、（8:4:0.6:0.4）、（8:6:0.6:0.4）、（8:8:0.6:0.4）的二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，说明该鉴别方法的专属性强，可作为秦皮接骨胶囊中秦皮的薄层鉴别方法。
结果分析：在体积份数比为4-8:2-8:0.3-0.8:0.2-0.6的二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸展开剂条件下，有较好的展开效果。其中，体积份数比8:6:0.6:0.4的二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸的展开剂展开效果最好。
B.川西小黄菊的鉴别：
取中药组合物秦皮接骨胶囊内容物5g，研细，加沸程30-60℃石油醚20ml，超声处理10min，弃去石油醚，将药渣挥干，加1mol/L的盐酸溶液1ml与乙酸乙酯30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取川西小黄菊对照药材1g，采用供试品溶液制备同法制备对照药材溶液。取按处方比例配制的缺秦皮阴性对照品，照供试品制备方法，采用和供试品溶液制备同法制备阴性样品溶液。照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层色谱板上，以二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂展开剂，体积份数比为4-8:2-8:0.3-0.8:0.2-0.6的范围内取体积份数比分别为（8:2:0.6:0.4）、（8:4:0.6:0.4）、（8:6:0.6:0.4）、（8:8:0.6:0.4）展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性对照无干扰，说明该鉴别方法的专属性强，可作为秦皮接骨胶囊中川西小黄菊的薄层鉴别方法。
结果分析：川西小黄菊的薄层鉴别结果显示，在体积比4-8:2-8:0.3-0.8:0.2-0.6的二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸展开剂条件下，有较好的展开效果。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性无干扰。此方法可作为秦皮接骨胶囊中川西小黄菊的鉴别方法。以体积比8:6:0.6:0.4的二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂条件下色谱斑点显色清晰，分离度好，Rf值亦符合要求。因此，为便于操作，秦皮和川西小黄菊的展开剂比例均优选为体积比8:6:0.6:0.4的二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸展开。
实验例2：含量测定实验
A.秦皮的含量测定：
秦皮为木犀科植物苦枥白蜡树、小叶白蜡树或秦岭白蜡树的树皮，性味苦，寒。清热燥湿中药。主治：清热燥湿、清肝明目、平喘止咳。用于热毒泻痢、目赤肿痛、目生翳障。为秦皮接骨中主药。但原标准中只对秦皮中秦皮甲素进行控制，本发明对色谱条件进行了重新选择，使之可以在同一条件下对秦皮甲素及秦皮乙素进行测定。保证了秦皮的质量，确保了秦皮接骨的安全性。
1.仪器、试药和供试样品
仪器：高效液相色谱仪：安捷伦1220高效液相色谱仪；岛津AUW220D电子天平。
对照品：秦皮甲素对照品（中国药品生物制品检定所）批号：0740-200104，秦皮乙素对照品（中国药品生物制品检定所）批号：110741-200506。
样品：秦皮接骨胶囊（青海金诃藏药药业股份有限公司），0.3g/粒，批号：20110111、20110114、20110115。
2.检测波长的选择
取秦皮甲素对照品、秦皮乙素对照品混合溶液，于190-400nm波长范围内进行扫描，根据紫外吸收图谱，选定335nm为检测波长。
3.流动相选择
研究发现中药组合物秦皮接骨胶囊原标准中体积份数比75:25甲醇-水为流动相，秦皮乙素峰性较差，改变流动相比例，同时改变有机相为乙腈后未得到改善。水相加入酸后，秦皮乙素峰性较好。研究表明，使用体积份数比1%醋酸及体积份数比0.1%磷酸均能达到分离效果，但磷酸较醋酸更稳定，故选择体积份数比0.1%磷酸配置流动相。同时使用甲醇-0.1%磷酸体积份数比80-90:20-10均能达到分离要求，其中以体积份数比80:20甲醇-0.1%磷酸为优。
4.对照品溶液制备及进样量的选择
取秦皮甲素对照品、秦皮乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含秦皮甲素0.1mg、秦皮乙素0.05mg的溶液，即得。
按上述条件进样，发现进样量大于10μl时，秦皮甲素、秦皮乙素出现峰前沿、拖尾等问题。故本法选择5μl进样量，避免了以上问题。
5.供试品溶液制备
本发明秦皮接骨胶囊分别用超声、加热回流、振摇处理方法，结果见表1、表2和表3。
表1提取方法考察试验结果
| 提取方法 | 超声 | 回流 | 振摇 |
| 秦皮甲素含量(mg/粒) | 0.535 | 0.713 | 0.357 |
| 秦皮乙素含量(mg/粒) | 0.228 | 0.346 | 0.119 |
表2提取溶剂考察试验结果
表3提取时间考察试验结果
结论：研究表明加热回流提取秦皮甲素、秦皮乙素的总量较超声更加充分，溶剂优选甲醇，提取时间优选1小时。优选具体方法如下：
中药组合物秦皮接骨胶囊研细后，取内容物2g，置具塞的锥形瓶中，加入甲醇50ml，密塞，加热回流1小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.系统适用性试验及阴性干扰的考察
在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各5μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，供试品色谱中主峰与其相邻色谱峰的分离度大于1.5，且阴性对照无干扰。见附图1、图2、图3和图4。
7.标准曲线的制备和线性关系的考察
取对照品贮备液溶液（秦皮甲素216μg/ml、秦皮乙素112μg/ml）1ml、3ml、5ml、8ml、10ml，分别置10ml容量瓶中，无水乙醇稀释至刻度，摇匀，各精密进样5μl，以峰面积(A)对对照品浓度（C）进行线性回归。见表4和表5及附图5和图6。
表4秦皮甲素标准曲线结果
回归方程：A=9.0051C+23.069
相关系数：R=0.9998
结论：在21.6μg/ml～216.0μg/ml范围内，秦皮甲素的峰面积(A)与浓度(C)线性关系良 好。
表5秦皮乙素标准曲线结果
| 序号 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 浓度C(μg/ml) | 11.2 | 33.6 | 56.0 | 78.4 | 112.0 |
| 峰面积A(mAU·s) | 147.6 | 403.6 | 634.9 | 863.8 | 1269.8 |
回归方程：A=11.005C+22.991
相关系数：R=0.9994
结论：在11.2μg/ml～112.0μg/ml范围内，秦皮乙素的峰面积(A)与浓度(C)的线性关系良好。
8.精密度试验
分别精密吸取混合对照品溶液5μl，注入液相色谱仪，各连续测定6次，记录峰面积并计算相对标准偏差，秦皮甲素、秦皮乙素面积的RDS%分别为0.747%、1.058%。结果表明，仪器精密度良好。见表6和表7。
表6秦皮甲素精密度试验结果
表7秦皮乙素精密度试验结果
9.稳定性试验
供试品溶液制备完成后，精密吸取5μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，以后每隔2小 时测定一次，考察8小时，计算峰面积的相对标准偏差，秦皮甲素、秦皮乙素RSD%分别为0.839%、1.242%。结果表明：供试品在8小时内测定结果稳定。见表8和表9。
表8样品稳定性秦皮甲素试验结果
表9样品稳定性秦皮乙素试验结果
10.重复性试验
取本品，重复测定6次，计算样品中秦皮甲素、秦皮乙素含量平均值分别为0.719mg/粒、0.355mg/粒，RSD分别为1.083%、1.505%。结果表明：分析方法重复性良好。见表10和表11。
表10秦皮甲素重复性试验结果
表11秦皮乙素重复性试验结果
11.回收率试验
精密称取同一批样品6份，每份1g，精密称定，每份加入样品各成分的含有量，按供试品制备方法处理样品并测定含量，计算回收率，结果见下表。结果表明：测定方法测定结果准确。见表12和表13。
表12秦皮甲素回收率表
表13秦皮乙素回收率表
12.样品测定
取中药组合物秦皮接骨胶囊三批，测定并计算秦皮甲素和秦皮乙素含量，结果如下。见表14。
表14样品含量测定结果
| 批号 | 秦皮甲素含量(mg/粒) | 秦皮乙素含量(mg/粒) |
| 20110111 | 0.720 | 0.356 |
| 20110114 | 0.716 | 0.350 |
| 20110115 | 0.725 | 0.361 |
综上：
本发明含量测定的方法通过控制组合物中秦皮的秦皮甲素和秦皮乙素的含量从而控制制剂的质量。本发明采用高效液相色谱法，比较了不同溶剂、不同提取时间、不同提取方法等供试品处理方法，同时研究确定了以甲醇-体积份数比0.1%磷酸水溶液为流动相的检测方法。
B.川贝母的含量测定：
川贝母百合科植物。为润肺止咳的名贵中药材。控制秦皮接骨制剂中川贝母的含量，对保证制剂的安全、有效，有重大意义。
1.仪器、试药和供试样品
仪器：高效液相色谱仪：日立2100高效液相色谱仪；Alltech ELSD2000ES；岛津AUW220D电子天平。
对照品：西贝母碱对照品（中国药品生物制品检定所）批号：110767-200504。
样品：秦皮接骨胶囊（青海金诃藏药药业股份有限公司），0.3g/粒，批号：20110111、20110114、20110115.
2.流动相选择
使用洗脱能力较强的乙腈为有机相，选择乙腈-水为流动相时，西贝母碱峰形及分离度较差；选择乙腈-碱溶液时，能够达到色谱检查条件要求。研究发现使用流动相乙腈-体积百分比0.05%三乙胺水溶液时，分离度为优，其中乙腈-体积百分比0.05%三乙胺水溶液体积份数比为75：25时为最佳。
3.供试品制备
本品分别用超声、加热回流的处理方法，选用甲醇、三氯甲烷、二氯甲烷、乙醚等为提取溶剂。但提取效果均不理想。
通过研究发现供试品需在碱性条件下较容易提取，故选择加入氨水0.2ml的方法使提取溶剂碱化。使用含甲醇的混合溶剂提取效果较好，为了保证毒性最低，选择二氯甲烷-甲醇为提取溶剂，研究发现，当二氯甲烷-甲醇体积份数比4:1时提取效果最佳。超声、回流均需放置过夜后，提取效果才能达到最佳。结果见表15、表16和表17。
表15提取方法考察试验结果
| 提取方法 | 超声 | 回流 |
| 西贝母碱含量(mg/粒) | 0.0116 | 0.0115 |
表16提取溶剂考察试验结果
表17提取时间考察试验结果
优选具体方法：中药组合物秦皮接骨胶囊研细后，取内容物6g，置具塞的锥形瓶中，加入氨水0.2ml，加入体积份数比4:1二氯甲烷-甲醇25ml，密塞，超声30min，放置24小时，用体积份数比4:1二氯甲烷-甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液20ml，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中，摇匀，过滤，即得。
4.系统适用性试验及阴性干扰的考察
在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照溶液各20μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果表明，供试品色谱中主峰与其相邻色谱峰的分离度均大于1.5，且阴性对照无干扰。见附图7、图8和图9。
5.标准曲线的制备和线性关系的考察
精密量取西贝母碱对照品贮备液溶液（281.6μg/ml）1ml、3ml、5ml、8ml、10ml，分别置10ml容量瓶中，甲醇释至刻度，摇匀，各精密进样20μl，以峰面积的对数（Log A）为纵坐标，对照品浓度的对数（Log C）为横坐标，进行线性回归，见表18和附图10。
表18西贝母碱线性关系考察结果
回归方程：Log A=1.0033Log C+3.8764
相关系数：R=0.9998
结果表明：西贝母碱在28.16μg/ml～281.60μg/ml范围内，线性关系良好。
6.精密度试验
分别精密吸取对照品溶液20μl，注入液相色谱仪，各连续测定6次，记录峰面积并计算相对标准偏差，西贝母碱的RSD为0.636%。结果表明，仪器精密度良好。见表19。
表19西贝母碱精密度试验结果
7.稳定性试验
供试品溶液制备完成后，精密吸取20μl，注入液相色谱仪，记录峰面积，以后每隔2小时测定一次，考察8小时，计算峰面积的相对标准偏差，西贝母碱的RSD为0.716%。结果表明：供试品在8小时内测定结果稳定。见表20。
表20样品稳定性试验结果
8.重复性试验
取本品，重复测定6次，计算样品中西贝母碱含量平均值为0.0118mg/粒，RSD为1.249%。结果表明：分析方法重复性良好。见表21。
表21重复性试验结果
9.回收率试验
精密称取同一批样品6份，每份3g，精密称定，每份加入样品各成分的含有量，按供试品制备方法处理样品并测定含量，计算回收率，结果见下表。结果表明：测定方法测定结果准确。见表22。
表22西贝母碱回收率实验结果
10.样品测定
取中药组合物秦皮接骨胶囊三批，测定并计算西贝母碱含量，结果如下。见表23。
表23样品含量测定结果
| 批号 | 西贝母碱含量(mg/粒) |
| 20110111 | 0.0119 |
| 20110114 | 0.0116 |
| 20110115 | 0.0118 |
下述实施例均能实现上述实验例所述的效果。
附图说明
图1是秦皮甲素对照品高效液相色谱图；
图2是秦皮乙素对照品高效液相色谱图；
图3是中药组合物秦皮接骨胶囊秦皮供试品高效液相色谱图；
图4是中药组合物秦皮接骨胶囊秦皮阴性对照高效液相色谱图；
图5是秦皮甲素线性关系图；
图6是秦皮乙素线性关系图；
图7是西贝母碱对照高效液相色谱图；
图8是中药组合物秦皮接骨胶囊川贝母供试品高效液相色谱图；
图9是中药组合物秦皮接骨胶囊川贝母阴性对照高效液相色谱图；
图10是西贝母碱线性关系图；
其中，图1、图2、图3、图4的横坐标是时间，单位：分钟（Minutes）；纵坐标是吸 光度（AU）。图7、图8、图9的横坐标是时间，单位：分钟（Minutes）；纵坐标是电压，单位：伏特（Volts）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作详细的阐述,但不限于这些具体记载的实施例。所检测的中药组合物秦皮接骨胶囊为青海金诃藏药药业股份有限公司产售。
实施例1：质量检测方法
鉴别：
A.秦皮的鉴别：
取中药组合物秦皮接骨胶囊内容物5g，加沸程30-60℃石油醚20ml，超声处理10min，弃去石油醚，将药渣挥干，加1mol/L的盐酸溶液1ml与乙酸乙酯30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取秦皮对照药材1g，采用和供试品溶液制备同法制备对照药材溶液；照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述二种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层色谱板上，以体积份数比为8:6:0.6:0.4的二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
B.川西小黄菊的鉴别：
取中药组合物秦皮接骨胶囊内容物5g，加沸程30-60℃石油醚20ml，超声处理10min，弃去石油醚，将药渣挥干，加1mol/L的盐酸溶液1ml与乙酸乙酯30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取川西小黄菊对照药材1g，采用和供试品溶液制备同法制备对照药材溶液；照薄层色谱法（中国药典2010年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述二种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层色谱板上，以体积份数比为8:6:0.6:0.4二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。
含量测定：
A.秦皮的含量测定：
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-体积份数比0.1%磷酸水溶液为流动相；流动相体积份数比为80:20；检测波长为335nm；理论板数按秦皮甲素峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取秦皮甲素对照品、秦皮乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含秦皮甲素0.1mg、秦皮乙素0.05mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：中药组合物秦皮接骨胶囊研细后，取内容物2g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，加入甲醇50ml，密塞，加热回流1小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
本发明中药组合物秦皮接骨胶囊中秦皮的含量以秦皮甲素（C15H16O9）和秦皮乙素（C9H6O4）的总量计，为3.35mg/g。
B.川贝母的含量测定：
照高效液相色谱法(《中国药典》2010年版一部附录ⅥD)测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-体积份数比0.05%三乙胺水溶液为流动相；流动相体积份数比为75：25；蒸发光散射检测器检测；理论板数按西贝母碱峰计算应不低于5000；
对照品溶液的制备：取西贝母碱对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.1mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：中药组合物秦皮接骨胶囊研细后，取内容物6g，置具塞的锥形瓶中，加入氨水0.2ml，加入体积份数比4:1二氯甲烷-甲醇25ml，密塞，超声30min，放置24小时，用体积份数比4:1二氯甲烷-甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液20ml，蒸干，残渣用甲醇溶解并定容至2ml容量瓶中，摇匀，过滤，即得；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，以外标两点法对数方程计算，即得。
本发明中药组合物秦皮接骨胶囊中川贝母的含量以西贝母碱（C27H43NO3）计，为0.0352mg/g。
Claims (3)
1.一种原料药重量比组成为秦皮113g、川西小黄菊80g、龙骨57g、川贝母80g的中药组合物秦皮接骨制剂中秦皮、川西小黄菊、川贝母的检测方法，该方法包括如下鉴别和/或含量测定方法中的一种或几种：
鉴别：
A.秦皮的鉴别：
取中药组合物秦皮接骨制剂1-5g，加沸程30-60℃石油醚10-30ml，超声处理5-20min，弃去石油醚，将药渣挥干，加1mol/L的盐酸溶液0.5-2ml与乙酸乙酯20-40ml，超声处理20-40min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1-5ml使溶解，作为供试品溶液；取秦皮对照药材1-5g，采用供试品溶液制备同法制备对照药材溶液；照薄层色谱法中国药典2010年版一部附录ⅥB试验，吸取上述二种溶液各5-20μl，分别点于同一硅胶G薄层色谱板上，以体积份数比为4-8:2-8:0.3-0.8:0.2-0.6的二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
B.川西小黄菊的鉴别：
取中药组合物秦皮接骨制剂1-5g，加沸程30-60℃石油醚10-30ml，超声处理5-20min，弃去石油醚，将药渣挥干，加1mol/L的盐酸溶液0.5-2ml与乙酸乙酯20-40ml，超声处理20-40min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1-5ml使溶解，作为供试品溶液；取川西小黄菊对照药材1g，采用供试品溶液制备同法制备对照药材溶液；照薄层色谱法中国药典2010年版一部附录ⅥB试验，吸取上述二种溶液各5-20μl，分别点于同一硅胶G薄层色谱板上，以体积份数比为4-8:2-8:0.3-0.8:0.2-0.6二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
含量测定：
A.秦皮的含量测定：
照高效液相色谱法《中国药典》2010年版一部附录ⅥD测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-体积份数比0.1%磷酸水溶液为流动相；流动相体积份数比为80-90:20-10；检测波长为320-340nm；理论板数按秦皮甲素峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取秦皮甲素对照品、秦皮乙素对照品适量，加甲醇制成每1ml含秦皮甲素0.1mg、秦皮乙素0.05mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：中药组合物秦皮接骨制剂研细后，取2g，置具塞的锥形瓶中，加入甲醇50ml，密塞，加热回流0.5-1.5小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5-10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本发明中药组合物秦皮接骨制剂中秦皮的含量以秦皮甲素和秦皮乙素的总量计，不得少于2.5mg/g。
2.如权利要求1所述的一种中药组合物秦皮接骨制剂中秦皮、川西小黄菊、川贝母的检测方法，其特征在于所述的制剂是指取中药组合物秦皮接骨胶囊原料药，按常规工艺，加入常规辅料制备成临床可接受的任何一种剂型。
3.如权利要求1或2所述的一种中药组合物秦皮接骨制剂中秦皮、川西小黄菊、川贝母的检测方法，其特征在于，该方法包括如下鉴别和/或含量测定方法中的一种或几种：
鉴别：
A.秦皮的鉴别：
取中药组合物秦皮接骨胶囊内容物5g，加沸程30-60℃石油醚20ml，超声处理10min，弃去石油醚，将药渣挥干，加1mol/L的盐酸溶液1ml与乙酸乙酯30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取秦皮对照药材1g，采用供试品溶液制备同法制备对照药材溶液；照薄层色谱法中国药典2010年版一部附录ⅥB试验，吸取上述二种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层色谱板上，以体积份数比为8:6:0.6:0.4的二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
B.川西小黄菊的鉴别：
取中药组合物秦皮接骨胶囊内容物5g，加沸程30-60℃石油醚20ml，超声处理10min，弃去石油醚，将药渣挥干，加1mol/L的盐酸溶液1ml与乙酸乙酯30ml，超声处理30min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；取川西小黄菊对照药材1g，采用供试品溶液制备同法制备对照药材溶液；照薄层色谱法中国药典2010年版一部附录ⅥB试验，吸取上述二种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层色谱板上，以体积份数比为8:6:0.6:0.4二甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；
含量测定：
A.秦皮的含量测定：
照高效液相色谱法《中国药典》2010年版一部附录ⅥD测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-体积份数比0.1%磷酸水溶液为流动相；流动相体积份数比为80:20；检测波长为335nm；理论板数按秦皮甲素峰计算应不低于2000；
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供试品溶液的制备：中药组合物秦皮接骨胶囊研细后，取内容物2g，精密称定，置具塞的锥形瓶中，加入甲醇50ml，密塞，加热回流1小时，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，即得；
本发明中药组合物秦皮接骨胶囊中秦皮的含量以秦皮甲素和秦皮乙素的总量计，为3.35mg/g。
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| PB01 | Publication | ||
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Owner name: SHANDONG JINHE DRUG RESEARCH AND DEVELOPMENT CO., Free format text: FORMER NAME: SHANDONG ARURA PHARMACEUTICAL RESEARCH + DEVELOPMENT CO., LTD. |
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Address after: 250101 Shandong city of Ji'nan province (Lixia District Shun) high wind Road No. 322 room 501-506 Patentee after: Shandong Jin He drug development research company limited Address before: 250101 Shandong city of Ji'nan province (Lixia District Shun) high wind Road No. 322 room 501-506 Patentee before: Shandong ARURA Pharmaceutical Research & Development Co., Ltd. |
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