CN103275166B - 地黄叶中两个三萜内酯类化合物在制备抗肿瘤类药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及地黄叶中两个新三萜内酯类化合物在制备抗肿瘤类药物中的应用，可有效解决从地黄叶中制备新的活性成分，用于实现在抗肿瘤药物中的应用，方法是，将地黄叶粉碎，在闪式提取器加入丙酮提取，提取液减压回收溶剂，真空干燥，干粉用水分散溶解，离心，得上清液，上清液上大孔吸附树脂柱DiaionHP-20，用水冲洗至洗脱液无色，然后用甲醇冲洗至洗脱液无色，收集甲醇洗脱液，减压回收甲醇，真空干燥，干粉用水溶解，离心，上清液上凝胶ToyopearlHW-40柱，用水洗脱，经薄层色谱检识，收集含有相同成分的流份，得到流份1-8，其中流份3、5分别制得地黄三萜内酯C、地黄三萜内酯A，本发明方法简单，稳定可靠，操作方便，成本低，有效用于制备抗肿瘤类药物。

Description

地黄叶中两个三萜内酯类化合物在制备抗肿瘤类药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是一种地黄叶中两个新三萜内酯类化合物在制备抗肿瘤类药物中的应用。 

背景技术

肿瘤是严重威胁人类健康的一类常见疾病，寻找有效的抗癌药物与方法，彻底攻克癌症，是世界医学界重要的研究课题。目前主要采用手术、化疗、放疗、生物治疗等综合措施，但其疗效难以令人满意。传统的放、化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，也造成机体骨髓抑制和免疫功能地下，毒副作用大等副作用，使天然药物越来越受到人们的关注。 

在全球应用的将近180种抗癌药物中，大约60%直接或者间接来自于天然产物或其衍生物，可见天然产物在抗肿瘤药物的研究与开发中的重要地位。但是全球的高等植物中仅有6%做过生物活性筛选、不到10%经过详细的药理研究。所以，从天然产物研发创新药物的潜能十分巨大。 

地黄（Rehmannia glutinosa Libosch.）为玄参科（Scrophulariaceae）植物地黄的块根，使用历史悠久，是著名的“四大怀药”之一，始载于《神农本草经》，列为上品。是我国传统的大宗中药材，临床中药处方中的使用频率排名处于前10。地黄的药理学研究显示，地黄具有很强的药理活性，包括抗胃溃疡，抗衰老，降血糖，降血脂，抗肿瘤，保肝等。地黄叶为植物地黄的叶片，将其捣汁涂抹可用于治疗恶疮，手、足癣。地黄种植存在严重连作障碍，使地黄的产量受到限制，然而地黄叶的产量约为地黄块根的1/4，因此有效的开发利用地黄叶是非常关键的。地黄的抗肿瘤活性研究多有报道，但至今仍未有关于地黄叶中有效成分抗肿瘤活性方面的研究报道。 

之前对地黄叶的活性成分研究不多，仅有关于地黄叶中环烯醚萜类化合物的含量测定，尤其是对地黄叶中是否含有具有抗肿瘤的活性成分，至今未见有公开报导。 

发明内容

针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种地黄叶中两个新三萜内酯类化合物在制备抗肿瘤类药物中的应用，可有效解决从地黄叶中制备新的活性成分，用于实现在抗肿瘤药物中的应用。 

本发明解决的技术方案是，从地黄叶中制备新的活性成分是地黄三萜内酯A和地黄三萜内酯C，分子结构式分别见图1、图2所示，地黄三萜内酯A英文名称为Glutinosalactone A， 化学名称为3β,19α,20β,24,30-五羟基-12-乌苏烯-28-酸δ-内酯，地黄三萜内酯C英文名称为Glutinosalactone C，化学名称为12α,13α-环氧-3β,19α,20β,30-四羟基-28-乌苏酸δ-内酯，其制备方法是，将地黄叶粉碎，在室温25℃下用闪式提取器提取三次，每3kg地黄叶粉中加入体积浓度50%的丙酮水溶液作溶剂提取，每次丙酮水溶液加入量为25L，每次15-20分钟，合并三次提取液，于45℃减压回收溶剂，真空干燥后得干粉，干粉用水分散溶解，离心，得上清液，上清液上大孔吸附树脂柱Diaion HP-20，用水冲洗至洗脱液无色，然后依次用体积浓度为10%甲醇的冲洗至洗脱液无色、用体积浓度为20%的甲醇冲洗至洗脱液无色、用体积浓度为30%的甲醇冲洗至洗脱液无色，最后用体积浓度为40%的甲醇冲洗至洗脱液无色，收集体积浓度为40%的甲醇洗脱液，减压回收甲醇，真空干燥得甲醇洗脱液洗脱后的干粉，干粉用水溶解，离心，得上清液，上清液上凝胶Toyopearl HW-40柱，用水洗脱，经薄层色谱检识，收集含有相同成分的流份，得到流份1-8，其中流份3通过以下步骤制成地黄三萜内酯C： 

先以Toyopearl HW-40柱，用体积计的氯仿︰甲醇＝1︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第一次干粉； 

第一次干粉用silica gel柱，以体积计乙酸乙酯︰乙醇︰水＝20︰2︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第二次干粉； 

第二次干用RP-18柱，以体积计甲醇︰水＝4︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第三次干粉； 

第三次干粉以MCI gel CHP-20柱，用体积计甲醇︰水、7︰3作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第四次干粉； 

第四次干粉以Sephadex LH-20柱，以体积计甲醇︰水＝7︰3作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，纯化得到白色针状结晶新三萜内酯（Glutinosalactone）C； 

流份5采用MCI gel柱层析纯化，以体积计的甲醇︰水＝1︰1作洗脱液对流份5洗脱至薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得到白色针状结晶的地黄三萜内酯A； 

得到的地黄三萜内酯A和地黄三萜内酯C有效用于制备抗肿瘤药物，实现地黄叶中两个新三萜内酯类化合物在制备抗肿瘤类药物中的应用。 

采用MTT法检测地黄叶中地黄三萜内酯A和地黄三萜内酯C对人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人成骨肉瘤MG63细胞增殖的影响，发现两个新三萜内酯具有较强的抗肿瘤活性。 

本发明是从地黄叶中提取的两个三萜内酯，方法简单，稳定可靠，并经多次实验，均取得了相同或近似的结果，操作方便，成本低，其中两个新三萜内酯有效用于制备抗肿瘤类药 物，开辟的地黄叶药用新用途，临床意义巨大。 

附图说明

图1为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A的结构式。 

图2为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A的HMBC图。 

图3为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A的¹H-NMR谱。 

图4为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A的¹³C-NMR谱。 

图5为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A的DEPT135谱。 

图6为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A的HSQC谱。 

图7为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A的HMBC谱。 

图8为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A的NOESY谱。 

图9为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A的IR谱。 

图10为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A的HR TOF-MS谱。 

图11为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C的结构式。 

图12为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C的HMBC图。 

图13为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C的¹H-NMR谱。 

图14为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C的¹³C-NMR谱。 

图15为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C的DEPT135谱。 

图16为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C的HSQC谱。 

图17为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C的HMBC谱。 

图18为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C的NOESY谱。 

图19为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C的IR谱。 

图20为本发明化合物地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C的HR TOF-MS谱。 

图21为本发明地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A对HepG2细胞（肝癌细胞）的抑制作用示意图。 

图22为本发明地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C对HepG2细胞的抑制作用示意图。 

图23为本发明地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A对MCF-7细胞（乳腺癌细胞）的抑制作用示意图。 

图24为本发明地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C对MCF-7细胞的抑制作用示意图。 

图25为本发明地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A对MG63细胞（骨肉瘤细胞）的抑制作用示意图。 

图26为本发明地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C对MG63细胞的抑制作用示意图。 

具体实施方式

以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。 

本发明在具体实施中，所述的地黄叶中的两个新三萜内酯在制备抗肿瘤类药物中的应用，这两个新三萜内酯是由以下实施例给出： 

本发明所用的地黄叶经鉴定为玄参科植物地黄的叶。柱层析填料Diaion HP-20、MCI GelCHP-20为日本三菱化学公司生产，Toyopearl HW-40为日本TOSOH公司生产，Sephadex LH-20为Parmacia Biotech公司生产，柱层析所用硅胶H由青岛海洋化工厂生产(160-200目)，薄层层析硅胶为青岛海洋化工厂生产(颗粒范围10-40μm)，以0.5%CMC-Na制板，阴干，105℃活化0.5h。 

实施例1 

取河南温县产地黄叶3kg粉碎，室温25℃下在体积浓度50%丙酮水溶液中用闪式提取器组织破碎提取三次，丙酮水溶液每次加入量为25L，每次15-20分钟，合并提取液，于45℃减压回收溶剂，真空干燥后得干粉1235g，干粉用水分散溶解，离心，上清液上大孔吸附树脂柱Diaion HP-20，用水冲洗至洗脱液无色，然后用体积浓度为10%的甲醇冲洗至洗脱液无色、用体积浓度为20%的甲醇冲洗至洗脱液无色、用体积浓度为30%的甲醇冲洗至洗脱液无色、最后用体积浓度为40%的甲醇冲洗至洗脱液无色，收集体积浓度为40%的甲醇洗脱液，减压回收溶剂，真空干燥得干粉，用水充分溶解，离心，上清液上凝胶Toyopearl HW-40柱，用水洗脱，经薄层色谱检识，收集含有相同成分的流份，得到流份1-8，其中流份3通过以下步骤制成地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C： 

先以Toyopearl HW-40柱，用体积计的氯仿︰甲醇＝1︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第一次干粉； 

第一次干粉用silica gel柱，以体积计乙酸乙酯︰乙醇︰水＝20︰2︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第二次干粉； 

第二次干用RP-18柱，以体积计甲醇︰水＝4︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变 色，洗脱液浓缩、干燥，得第三次干粉； 

第三次干粉以MCI gel CHP-20柱，用体积计甲醇︰水、7︰3作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第四次干粉； 

第四次干粉以Sephadex LH-20柱，以体积计甲醇︰水＝7︰3作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，纯化得到白色针状结晶地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C48mg； 

流份5采用MCI gel柱层析纯化，以体积计的甲醇︰水＝1︰1作洗脱液对流份5洗脱至薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得到白色针状结晶地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A42mg。 

实施例2 

取河南武陟产地黄叶6kg粉碎，在室温25℃下用闪式提取器提取三次，每次地黄叶粉中加入体积浓度50%的丙酮水溶液50L作溶剂提取，每次15-20分钟，合并三次提取液，于45℃减压回收溶剂，真空干燥后得干粉2510g，干粉用水分散溶解，离心，得上清液，上清液上大孔吸附树脂柱Diaion HP-20，用水冲洗至洗脱液无色，然后依次用体积浓度为10%甲醇的冲洗至洗脱液无色、用体积浓度为20%的甲醇冲洗至洗脱液无色、用体积浓度为30%的甲醇冲洗至洗脱液无色，最后用体积浓度为40%的甲醇冲洗至洗脱液无色，收集体积浓度为40%的甲醇洗脱液，减压回收甲醇，真空干燥得甲醇洗脱液洗脱后的干粉，干粉用水溶解，离心，得上清液，上清液上凝胶Toyopearl HW-40柱，用水洗脱，经薄层色谱检识，收集含有相同成分的流份，得到流份1-8，其中流份3通过以下步骤制成地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C： 

先以Toyopearl HW-40柱，用体积计的氯仿︰甲醇＝1︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第一次干粉； 

第一次干粉用silica gel柱，以体积计乙酸乙酯︰乙醇︰水＝20︰2︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第二次干粉； 

第二次干用RP-18柱，以体积计甲醇︰水＝4︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第三次干粉； 

第三次干粉以MCI gel CHP-20柱，用体积计甲醇︰水、7︰3作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第四次干粉； 

第四次干粉以Sephadex LH-20柱，以体积计甲醇︰水＝7︰3作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，纯化得到白色针状结晶地黄三萜内酯（Glutinosalactone） C93mg； 

流份5采用MCI gel柱层析纯化，以体积计的甲醇︰水＝1︰1作洗脱液对流份5洗脱至薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得到白色针状结晶地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A80mg。 

实施例3 

取河南孟县产地黄叶9kg粉碎，在室温25℃下用闪式提取器提取三次，每次地黄叶粉中加入体积浓度50%的丙酮水溶液75L作溶剂提取，每次15-20分钟，合并三次提取液，于45℃减压回收溶剂，真空干燥后得干粉3710g，干粉用水分散溶解，离心，得上清液，上清液上大孔吸附树脂柱Diaion HP-20，用水冲洗至洗脱液无色，然后依次用体积浓度为10%甲醇的冲洗至洗脱液无色、用体积浓度为20%的甲醇冲洗至洗脱液无色、用体积浓度为30%的甲醇冲洗至洗脱液无色，最后用体积浓度为40%的甲醇冲洗至洗脱液无色，收集体积浓度为40%的甲醇洗脱液，减压回收甲醇，真空干燥得甲醇洗脱液洗脱后的干粉，干粉用水溶解，离心，得上清液，上清液上凝胶Toyopearl HW-40柱，用水洗脱，经薄层色谱检识，收集含有相同成分的流份，得到流份1-8，其中流份3通过以下步骤制成地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C： 

先以Toyopearl HW-40柱，用体积计的氯仿︰甲醇＝1︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第一次干粉； 

第一次干粉用silica gel柱，以体积计乙酸乙酯︰乙醇︰水＝20︰2︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第二次干粉； 

第二次干用RP-18柱，以体积计甲醇︰水＝4︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第三次干粉； 

第三次干粉以MCI gel CHP-20柱，用体积计甲醇︰水、7︰3作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第四次干粉； 

第四次干粉以Sephadex LH-20柱，以体积计甲醇︰水＝7︰3作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，纯化得到白色针状结晶地黄三萜内酯（Glutinosalactone）C130mg； 

流份5采用MCI gel柱层析纯化，以体积计的甲醇︰水＝1︰1作洗脱液对流份5洗脱至薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得到白色针状结晶地黄三萜内酯（Glutinosalactone）A116mg。 

根据上述方法按地黄叶产地和用量不同制备得两个新三萜内酯，并经反复实验均取得相 同或近似的结果，方法稳定可靠，所得两个新三萜内酯用于制备抗肿瘤类药物，有效解决恶性肿瘤的用药治疗问题，并经试验得到了充分证明，有关试验资料如下： 

首先运用先进的波谱学方法鉴定制备得到的产物结构。 

其次通过三种癌细胞（人肝癌HepG2细胞、人乳腺癌MCF-7细胞和人成骨肉瘤MG63细胞）MTT增殖实验，发现地黄叶中两个新三萜内酯都能够显著抑制癌细胞的增殖，说明它们具有很好的抗肿瘤活性。 

通过实验证明了本发明药物的结构论证和在制备抗肿瘤类药物中的新用途。其主要实施方案如下： 

一、两个新三萜内酯结构解析 

1.Glutinosalactone A的结构鉴定 

白色针晶（甲醇）。-61.3(c0.1266，MeOH)，HR TOF-MS给出准分子离子峰m/z：525.3187[M+Na]⁺(calcd.for C₃₀H₄₆O₆Na525.3192)。IR(KBr)ν_maxcm^-1：3436(OH)，1735(δ-lactone carbonyl)等吸收。在¹H-NMR(MeOD,500MHz)中出现5个甲基信号(δ0.81,0.92,1.03,1.18,1.37)，1个烯氢质子信号峰δ5.99(1H,br.s,H-12)，1个连氧次甲基氢质子信号δ3.76(1H,br.s,H-3)，两对连氧亚甲基氢质子信号δ3.84(1H,J=11.0Hz)，3.76(1H,J=11.0Hz)和δ3.68(1H,J=11.0Hz)，3.42(1H,J=11.0Hz)。在¹³C-NMR(MeOD,125MHz)给出30个碳信号，结合DEPT135给出化合物中有5个sp³杂化碳信号(δ16.2,16.5,22.8,23.4,25.8)，2个sp²杂化的碳信号(δ135.9,127.0)，2个连氧季碳信号(δ88.1,73.8)，1个连氧次甲基碳信号(δ71.3)，2个连氧亚甲基碳信号(δ66.2,63.6)。以上数据与3β,19α,23,30-tetrahydroxy-urs-12-en-28-oic acid(30-hydroxyrotundic acid)28-O-glucoside对照，发现C-20向低场位移(+39.9)，C-18向高场位移(-5.0)，C-22向高场位移(-3.8)，C-29向高场位移(-1.7)，这些变化主要是因为C-20位上的β-OH引起。化合物1的C/D/E数据与3β,19α,20β-trihydroxydroxyurs-12-en-28-oic acid相似。在HMBC谱中δ1.89(H-18)与C-12(δ127.0)，C-13(δ135.9)，C-17(δ41.9)，C-20(δ88.1)，C-28(δ181.0)有远程相关，δ1.37(H-29)与C-19(δ73.8)，C-20(δ88.1)有远程相关，δ3.84和3.76(H-30)与C-19(δ73.8)，C-20(δ88.1)，C-21(δ25.8)有远程相关，δ3.42和3.68(H-24)与C-3(δ71.3)，C-4(δ43.9)有远程相关。在NOESY谱中，H-3(δ3.76)与H-23(δ1.03)有NOE关系，说明3-OH为β构型，H-24(δ3.42,3.68)与H-25(δ0.92)有NOE关系，H-12(δ5.99)与H-18(δ2.20)/H-29(δ1.37)有NOE关系。此外红外光谱给出吸收峰1735(δ-lactone carbonyl) 以及δ88.1(C-20)，说明结构中中存δ-lactone。在综合以上，化合物的结构确定3β,19α,20β,24,30-pentahydroxyurs-12-en-28-oic acidδ-lactone，命名为Glutinosalactone A。经文献检索未见报道，确定其为新的天然化合物。详细数据归属见表1。 

表1Glutinosalactone A的¹H-NMR(500MHz，CD₃OD)和¹³C-NMR(125MHz，CD₃OD)数据 

注：该图给出了该化合物的碳氢归属，证明结构解析的正确性 

2.Glutinosalactone C的结构鉴定 

白色针晶（甲醇），Liebermann-Burchard反应阳性。-59.5(c0.1058，MeOH)，HRTOF-MS给出准分子离子峰m/z：525.3186[M+Na]⁺(calcd.for C₃₀H₄₆O₆Na525.3192)。IR(KBr)ν_maxcm^-1：3436(OH)，1735(δ-lactone carbonyl)等吸收。在¹H-NMR(CDCl₃,500MHz)中出现6个甲基信号(δ0.81,0.88,0.93,0.91,1.17,1.32)，2个连氧次甲基氢质子信号δ3.39(1H,br.s,H-3)和δ3.78(1H,d,J=4.2Hz,H-12)，1个连氧亚甲基氢质子信号δ3.76(1H,s,H-30)。在 ¹³C-NMR(CDCl₃,125MHz)给出30个碳信号，结合DEPT135给出化合物中有6个sp³杂化碳信号(δ15.3,16.4,17.8,22.0,26.5,28.2)，3个连氧季碳信号(δ85.2,74.5,66.2)，2个连氧次甲基碳信号(δ75.7,57.2)，1个连氧亚甲基碳信号(δ63.2)。以上数据与化合物glutinosalactone A对照，12,13位的双键没有了，多了一个连氧次甲基一个连氧季碳，结合HR-TOF-MS，推测结构中可能存在12,13-epoxy。在HMBC谱中δ1.82(H-18)与C-12(δ57.2)，C-13(δ66.2)，C-17(δ39.7)，C-20(δ85.2)，C-28(δ177.1)有远程相关，δ1.32(H-29)与C-19(δ74.5)，C-20(δ85.2)有远程相关，δ3.76(H-30)与C-19(δ74.5)，C-20(δ85.2)，C-21(δ24.8)有远程相关，δ0.81(H-23)与C-3(δ75.7)，C-4(δ37.1)，C-5(δ48.7)，C-24(δ28.2)有远程相关，δ0.92(H-24)与C-3(δ75.7)，C-4(δ37.1)有远程相关。在NOESY谱中，H-3(δ3.39)与H-23(δ0.83)有NOE关系，说明3-OH为β构型，H-24(δ0.92)与H-25(δ0.88)有NOE关系，H-12(δ3.78(1H,d,J=4.2Hz,H-12))与H-18(δ1.82)/H-29(δ1.32)有NOE关系，说明12,13-epoxy为α构型，19-OH为α构型。综合以上，化合物的结构确定12α,13α-epoxy-3β,19α,20β,30-tetrahydroxyurs-28-oic acidδ-lactone，命名为Glutinosalactone C。经文献检索未见报道，确定其为新的天然化合物。详细数据归属见表2。 

表2Glutinosalactone C的¹H-NMR(500MHz，CDCl₃)和¹³C-NMR(125MHz，CDCl₃)数据 

注：该图给出了该化合物的碳氢归属，证明结构解析的正确性 

二、MTT法检测两个新三萜内酯对三种肿瘤细胞的生长抑制作用 

（一）实验材料与方法 

1.实验药物 

地黄叶为玄参科植物地黄的叶。 

地黄叶用50%丙酮组织破碎提取，提取物经分离纯化得到Glutinosalactone A和Glutinosalactone C。 

分别称取Glutinosalactone A和Glutinosalactone C2mg，用DMSO溶解，经0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存。临用前以含2%小牛血清的DMEM培养基配制成1,10,25,50,100,200μM/mL，终浓度DMSO含量小于0.1%。阳性组用10μM/mL的5-氟尿嘧啶。 

2.细胞株 

人肝癌HepG2细胞株由军事医学科学院放射与辐射研究所吕秋军教授惠赠；人乳腺癌细胞MCF-7细胞株为北京中医药大学基础医学院王继峰教授惠赠；人成骨肉瘤MG63细胞株中国典型培养物保藏中心。 

3.主要器材与仪器 

CO₂培养箱（REVCO），超净工作台（江苏苏净集团），倒置显微镜（NIKON ECLIPSE TS100），酶联免疫检测仪（美国BIO-RAD Model680），微量移液器（Nichipet EX PLUS），细胞冻存管、培养皿、培养瓶、96孔培养板（Corning公司），普通冰箱（河南新飞电器有限公司），超低温冰箱（海尔集团），AB204-N万分之一精密分析天平（梅特勒－托利多仪器有限公司），KDC-160HR高速低温冷冻离心机（科大创新股份有限公司中佳分公司），SK6200H超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），电热恒温水浴锅（北京市长风仪器仪表公司），90-3型磁力搅拌器，（上海振捷实验设备有限公司），HZS-H型水浴振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司），ZRD-7080全自动新型鼓风干燥箱（上海智城分析仪器制造有限公司），AE240十万分之一电子天平（瑞士Mettler公司）。 

4.试剂及配制 

4.1常用试剂 

胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)，RPMI-1640培养粉(美国GIBCO公司)，PBS缓 冲液等为自配(试剂均为市售分析纯)，四甲基偶氮唑盐(MTT)(美国Sigma公司产品)，二甲基亚砜(DMSO)(Amresco公司生产)，水为超纯水德国Sartorius611VF产品制的，链霉素、青霉素，NaHCO₃,NaCl,KCl,Na₂HPO₄,NaH₂PO₄,KH₂PO₄等试剂购买于郑州鼎国生物技术有限公司。 

4.2试剂配制方法 

4.2.10.01mol·L^-1磷酸盐缓冲液（PBS，pH7.2） 

分别称取NaCl8.0g、Na₂HPO₄·H₂O1.44g、KCl0.2g、KH₂PO₄0.24g，溶于1000mL超纯水中，充分溶解并混匀，用盐酸调pH值至7.2，分装后高压灭菌，置于4℃保存。 

4.2.2双抗（青霉素+链霉素） 

青霉素160万单位，溶解于4mL的无菌PBS液中，制成的终浓度为40万单位每毫升；链霉素100万单位，溶于5mL的无菌PBS液中，制成的终浓度为20万单位每毫升，分装存于-20℃冰箱。 

4.2.30.25%胰蛋白酶溶液 

取250mg胰蛋白酶粉末，加入到PBS液中，先用少量的PBS将胰蛋白酶粉末调成糊状，再用PBS溶液定容至100mL，充分混匀搅拌，调成终浓度为0.25%，于4℃冰箱保存过夜后，先用滤纸过滤，再用0.22μm的微孔滤膜过滤除菌，分装以后存放于-20℃冰箱中保存。 

4.2.4RPMI-1640培养基 

RPMI-1640干粉培养基一袋，将DMEM粉溶解于1000mL超纯水中，搅拌混匀溶解，加入NaHCO₃2.0g，Hepes2.38g，然后再加入40万单位的青霉素0.25mL，20万单位的链霉素0.5mL,用1mol/LNaOH调PH7.0-7.2，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，置于4℃存放。 

4.2.5MTT溶液 

称取MTT粉末250mg，溶于50mL pH7.2的PBS中，充分混匀，配成浓度为5mg/mL的MTT液，用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后外包锡箔纸避光保存于-20℃。 

5.细胞培养 

5.1HepG2细胞的体外培养 

人肝癌HepG2细胞呈贴壁生长，以10%胎牛血清的RPMI-1640为培养液，于37℃，5%CO₂培养箱中进行常规培养，24h换液一次，48h传代。 

5.2MCF-7细胞的体外培养 

人乳腺癌MCF-7细胞呈贴壁生长，以10%胎牛血清的RPMI-1640为培养液，于37℃，5%CO₂培养箱中进行常规培养，24h换液一次，48h传代。 

5.3MG63细胞的体外培养 

人成骨肉瘤MG63细胞呈贴壁生长，以10%胎牛血清的RPMI-1640为培养液，于37℃，5%CO₂培养箱中进行常规培养，24h换液一次，48h传代。 

6.细胞的传代 

当细胞超过培养皿贴壁面表面面积的80%以上时，进行传代培养。具体方法为：倒掉旧的培养基，拿PBS缓冲液清洗2-3遍后，加入1～2mL0.25%胰蛋白酶进行常规消化，让细胞贴壁朝下，来回轻轻的晃动，让胰蛋白酶和细胞充分接触，消化约2min后放在显微镜下观察，细胞的间隙增大、细胞突起回缩、细胞缩成圆形，此时弃去胰酶，加入新鲜的体积分数是10%胎牛血清的DMEM培养基，用移液枪反复吹培养皿的底部，使消化了的细胞从培养皿底壁脱离，此过程要有序进行，吹打操作要从培养皿的一端到另一端。吹打后得到的细胞悬液，标记实验时间和细胞种类，放入CO₂培养箱，继续培养，每3天传代1次。 

7.MTT比色法测定两个新三萜内酯对三种肿瘤细胞的生长抑制作用 

7.1对HepG2细胞的抑制作用 

选取对数生长期HepG2细胞，PBS洗两次，用0.25%胰蛋白酶消化后，加入含10%胎牛血清DMEM吹打均匀，细胞以1×10⁴个/孔的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为200μL。待细胞贴壁后，分别加入含不同浓度的三个化合物培养基继续培养，每组设置6个平行板，空白对照孔，实验重复3次，37℃、5%CO₂培养连续培养实验72h。培养结束前4h每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL继续于37℃培养4h后，小心用注射器吸净培养基，每孔加入150μL的DMSO，置于振荡器上震荡5～10分钟，使结晶物完全溶解。用酶免免疫检测仪在490nm下测定各孔吸光度（OD）值。OD值的高低主要代表活细胞数的多寡，是反映细胞活力的指标，计算生长抑制率。 

抑制率（%）=（对照组吸光光度值-样品的吸光光度值）/对照组吸光光度值×100% 

7.2对MCF-7细胞的抑制作用 

选取对数生长期MCF-7细胞，PBS洗两次，用0.25%胰蛋白酶消化后，加入含10%胎牛血清RPMI-1640吹打均匀，细胞以1×10⁴个/孔的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为200μL。待细胞贴壁后，分别加入含不同浓度的三个化合物培养基继续培养，每组设置6个 平行板，空白对照孔，实验重复3次，37℃、5%CO₂培养连续培养实验72h。培养结束前4h每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL继续于37℃培养4h后，小心用注射器吸净培养基，每孔加入150μL的DMSO，置于振荡器上震荡5～10分钟，使结晶物完全溶解。用酶免免疫检测仪在490nm下测定各孔吸光度（OD）值。OD值的高低主要代表活细胞数的多寡，是反映细胞活力的指标，计算生长抑制率。 

抑制率（%）=（对照组吸光光度值-样品的吸光光度值）/对照组吸光光度值×100% 

7.3对MG63细胞的抑制作用 

选取对数生长期MG63细胞，PBS洗两次，用0.25%胰蛋白酶消化后，加入含10%胎牛血清RPMI-1640吹打均匀，细胞以1×10⁴个/孔的浓度接种于96孔板内，每孔培养总体积为200μL。待细胞贴壁后，分别加入含不同浓度的三个化合物培养基继续培养，每组设置6个平行板，空白对照孔，实验重复3次，37℃、5%CO₂培养连续培养实验72h。培养结束前4h每孔加入MTT溶液（5mg/mL）20μL继续于37℃培养4h后，小心用注射器吸净培养基，每孔加入150μL的DMSO，置于振荡器上震荡5～10分钟，使结晶物完全溶解。用酶免免疫检测仪在490nm下测定各孔吸光度（OD）值。OD值的高低主要代表活细胞数的多寡，是反映细胞活力的指标，计算生长抑制率。 

抑制率（%）=（对照组吸光光度值-样品的吸光光度值）/对照组吸光光度值×100% 

（二）统计处理 

各组实验结果用SPSS17.0统计软件one-way ANNOVA方法进行统计分析处理，实验数据用平均值±标准差表示。 

（三）实验结果 

1.两个新三萜内酯对HepG2细胞的抑制作用的实验结果 

结果显示，Glutinosalactone A的剂量在10～200μM/mL时与空白对照组比较对HepG2细胞有极显著抑制作用（P＜0.01），见表3，图21。 

表3Glutinosalactone A对HepG2细胞的抑制作用

与正常组相比，☆P<0.05，★P<0.01;与阳性组相比△P<0.05,▲P<0.01. 

结果显示，Glutinosalactone C的剂量在10～200μM/mL时与空白对照组比较对HepG2细胞有极显著抑制作用（P＜0.01）。见表4，图22。 

表4  Glutinosalactone C对HepG2细胞的抑制作用

与正常组相比，☆P<0.05，★P<0.01;与阳性组相比△P<0.05,▲P<0.01. 

2.两个新三萜内酯对MCF-7细胞的抑制作用的实验结果 

结果显示，Glutinosalactone A的剂量在10～200μM/mL时与空白对照组比较对MCF-7细胞有极显著抑制作用（P＜0.01），见表5，图23。 

表5  Glutinosalactone A对MCF-7细胞的抑制作用

与正常组相比，☆P<0.05，★P<0.01;与阳性组相比△P<0.05,▲P<0.01. 

结果显示，Glutinosalactone C的剂量在10～200μM/mL时与空白对照组比较对MCF-7细胞有极显著抑制作用（P＜0.01），见表6，图24。 

表6 Glutinosalactone C对MCF-7细胞的抑制作用

与正常组相比，☆P<0.05，★P<0.01;与阳性组相比△P<0.05,▲P<0.01. 

3.两个新三萜内酯对MG63细胞的抑制作用的实验结果 

结果显示，Glutinosalactone A的剂量在10～200μM/mL时与空白对照组比较对MG63细胞有极显著抑制作用（P＜0.01），见表7，图25。 

表7  Glutinosalactone A对MG63细胞的抑制作用

与正常组相比，☆P<0.05，★P<0.01;与阳性组相比△P<0.05,▲P<0.01. 

结果显示，Glutinosalactone C的剂量在10～200μM/mL时与空白对照组比较对MG63细 胞有极显著抑制作用（P＜0.01），见表8，图26。 

表8  Glutinosalactone C对MG63细胞的抑制作用

与正常组相比，☆P<0.05，★P<0.01;与阳性组相比△P<0.05,▲P<0.01. 

三次平行实验结果显示，两个新的三萜内酯类化合物对三种肿瘤细胞的均有很好的抑制作用。运用SPSS17.0统计软件线性回归计算Glutinosalactone A抑制HepG2细胞、MCF-7细胞和MG63细胞增殖的IC₅₀药物浓度分别为45.361±1.615μM/mL、74.6541±0.6034μM/mL、89.2731±0.9325μM/mL，Glutinosalactone C抑制HepG2细胞、MCF-7细胞和MG63细胞增殖的IC₅₀药物浓度分别为17.295±2.162μM/mL、8.3847±0.1652μM/mL、39.2925±0.2131μM/mL（见表9），说明二者均一定的抗肿瘤活性。 

表9  两个新三萜内酯对三种肿瘤细胞的IC₅₀

三、结论 

细胞生物学、分子药理学、分子生物学、生物化学等学科的发展为药物筛选提供了新的方向。细胞水平的抗肿瘤药物筛选模型具有药材用量少、药物作用机制比较明确和大规模筛选等优点。 

MTT实验结果显示地黄叶中的两个新三萜内酯类化合物可极显著抑制肿瘤细胞的生长，证明两个新三萜内酯类化合物具有抗肿瘤活性。 

上述试验反复进行多次，重现性好，均取得了相同或相近的结果，提示地黄叶中两个新 三萜内酯类化合物具有抗肿瘤活性，并且性质稳定。 

随着生命科学的迅猛发展，对肿瘤深入的认识和成功的防治，肿瘤药物治疗已经取得很多重大成果，抗肿瘤药物研究已经提高到一个全新的水平，不断研制高效低毒副作用的新型抗肿瘤药物将成为一个主要方向。 

Claims (1)

1.一种地黄叶中两个三萜内酯类化合物的制备方法，其特征在于，所述的两个三萜内酯类化合物分别是地黄三萜内酯A和地黄三萜内酯C，地黄三萜内酯A的分子式为： 

地黄三萜内酯C的分子式为： 

其制备方法是，将地黄叶粉碎，在室温25℃下用闪式提取器提取三次，每3kg地黄叶粉中加入体积浓度50％的丙酮水溶液作溶剂提取，每次丙酮水溶液加入量为25L，每次15-20分钟，合并三次提取液，于45℃减压回收溶剂，真空干燥后得干粉，干粉用水分散溶解，离心，得上清液，上清液上大孔吸附树脂柱Diaion HP-20，用水冲洗至洗脱液无色，然后依次用体积浓度为10％甲醇的冲洗至洗脱液无色、用体积浓度为20％的甲醇冲洗至洗脱液无色、用体积浓度为30％的甲醇冲洗至洗脱液无色，最后用体积浓度为40％的甲醇冲洗至洗脱液无色，收集体积浓度为40％的甲醇洗脱液，减压回收甲醇，真空干燥得甲醇洗脱液洗脱后的干粉，干粉用水溶解，离心，得上清液，上清液上凝胶Toyopearl HW-40柱，用水洗脱，经薄层色谱检识，收集含有相同成分的流份，得到流份1-8，其中流份3通过以下步骤制成地黄三萜内酯C： 

先以Toyopearl HW-40柱，用体积计的氯仿︰甲醇＝1︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第一次干粉； 

第一次干粉用silica gel柱，以体积计乙酸乙酯︰乙醇︰水＝20︰2︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第二次干粉； 

第二次干粉用RP-18柱，以体积计甲醇︰水＝4︰1作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变 色，洗脱液浓缩、干燥，得第三次干粉； 

第三次干粉以MCI gel CHP-20柱，用体积计甲醇︰水、7︰3作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得第四次干粉； 

第四次干粉以Sephadex LH-20柱，以体积计甲醇︰水＝7︰3作洗脱液进行洗脱至经薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，纯化得到白色针状结晶三萜内酯C； 

流份5采用MCI gel柱层析纯化，以体积计的甲醇︰水＝1︰1作洗脱液对流份5洗脱至薄层色谱检识变色，洗脱液浓缩、干燥，得到白色针状结晶地黄三萜内酯A。