CN105152921A - 一种三环二萜类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

一种三环二萜类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种三环二萜类化合物及其制备方法与应用，所述的三环二萜类化合物是以黑果土当归茎为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C20H32O4 ，命名为dumetorumane？A，具有下述结构式：。制备方法是以黑果土当归茎为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得。应用为三环二萜类化合物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用和在制备预防和/或治疗人肺腺癌、人急性早幼粒白血病或人乳腺癌药物中的应用。所述的三环二萜类化合物对人肺腺癌、人急性早幼粒白血病或人乳腺癌细胞株有显著的抑制作用，提示其具有良好的抗癌活性，可以作为抗癌活性成分或先导化合物。

Description

一种三环二萜类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于植物有效成分提取技术领域，具体涉及一种三环二萜类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
黑果土当归(AraliadumetorumHand.-Mazz)系五加科(Araliaceae)楤木属植物，民间以其根入药，入脾、胃二经。该植物有补中益气、托毒外出、消炎的功效，用于淋巴腺炎、慢性化脓性骨髓炎和疖痈等症。该属植物化学成分主要含二萜、三萜皂苷、香豆素、黄酮、木脂素及甾醇。文献报道其中的二萜类化合物有抗肿瘤活性(ChangL.C.,SongL.L.,ParkE.J.,LuyengiL.,LeeK.J.,FarnsworthN.R.,PezzutoJ.M.,andKinghornA.D.BioactiveConstituentsofThujaoccidentalis.JournalofNaturalProducts.2000,63,1235-1238;YangN.Y.,LiuL.,TaoW.W.,DuanJ.A.,TianL.J.DiterpenoidsfromPinusmassonianaresinandtheircytotoxicityagainstA431andA549cells.Phytochemistry2010,71,1528–1533)。目前对黑果土当归植物化学成分以及药理活性的研究报道较少。本发明试图对黑果土当归中具有抗肿瘤作用的化合物做深入研究，以期发现其中的细胞毒活性天然产物，为筛选高效、低毒的抗肿瘤药物提供依据。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种三环二萜类化合物；第二目的在于提供所述三环二萜类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述三环二萜类化合物的应用。
本发明的第一目的是这样实现的，所述的三环二萜类化合物是以黑果土当归茎为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C20H32O4，命名为dumetorumaneA，具有下述结构式：
。
本发明的第二目的是这样实现的，是以黑果土当归茎为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将黑果土当归茎晾干粉碎得到0.05~0.15cm粒径大小的颗粒，加入黑果土当归茎重量比4~8倍的体积百分浓度80~95%乙醇溶液于65~74℃下回流提取3~5次，每次1~3h，合并提取液，提取液过滤，减压浓缩提取液至比重为1.1~1.3得到浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比2~4倍量的水，依次用与水等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取4~6次，蒸去溶剂分别得到石油醚萃取物b、乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d；
C、硅胶柱层析：
1）将乙酸乙酯萃取物c上硅胶柱，装柱硅胶为100~200目，用量为萃取物c重量6~8倍量；用体积比为30:1~0:1的氯仿-甲醇有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
2）将1）中以10:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液e上硅胶柱，装柱硅胶为200~300目，用量为洗脱液e体积6~8倍量；用体积比25:1~0:1的氯仿甲醇有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC检测，合并相同的部分；
D、高效液相色谱分离：将C步骤2）中以8:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的三环二萜类化合物dumetorumaneA。
本发明三环二萜类化合物是首次被分离出来的，通过核磁共振和其他波谱技术测定方法确定为三环二萜类化合物，并表征其具体结构为：
化合物dumetorumaneA，为白色无定型粉末(溶剂为氯仿)，+60.0(c0.50,CHCl3);IR(KBr)谱在3381,2968,1710,1655,1124,1068,863cm-1有吸收，表明分子中存在羧基、羟基和双键。HRESI-MS(附图1)显示其准分子离子峰m/z359.2193(calcd.forC20H32O4Na+:359.2198)，结合NMR谱确定其分子式为C20H32O4，不饱和度为5。1HNMR(附图2，数据归属见表1)显示分子中有3个甲基单峰，分别为δH1.21(3H,s),1.16(3H,s)及0.82(3H,s))，有1个三取代双键信号（δ4.71(1H,d,J=4.8）;13CNMR(附图3，数据归属见表1)显示分子中有20个碳，其中有5个季碳(含一个羧基碳和1个烯碳)，4个次甲基(含1个烯碳)，8个亚甲基(含1个连氧碳)及3个甲基。结合HSQC相关谱(附图4)，并对比文献数据可证实，该化合物与已知的对映海松烷型二萜结构相似，区别在于分子中的C环是一个七元环而不是六元环。在HMBC谱(附图5)中可看到H-14(δ H4.71)与C-16(δ C64.8)有相关，H-16(δ H3.69-3.81)与C-13(δ C77.8)及C-14(δ C118.6)有相关，在COSY谱(附图6)中可看到H-14与H-15有相关，证明式Ⅰ化合物的C环是一个七元环。进一步经HMBC相关(附图5)、COSY相关(附图6)和ROESY(附图7)及与文献(JungH.A.,LeeE.J.,KimJ.S.,KangS.S.,LeeJ.H.,MinB.S.,ChoiJ.S.CholinesteraseandBACE1inhibitoryditerpenoidsfromAraliacordata.ArchPharmRes.2009,32:1399-1408;DangN.H.,ZhangX.F.,ZhengM.S.,SonK.H.,ChangH.W.,KimH.P.,BaK.H.,andKangS.S.InhibitoryConstituentsagainstCyclooxygenasesfromAraliacordataThunb.ArchPharmRes.2005,28:28-33.)对比证实，使化合物的结构最终得到确认，化合物具有下述结构式：
通过SCIFINDER数据库检索和文献查询证实该化合物为新化合物。
表1本发明化合物的1H-和13C-NMR(CDCl3)数据
本发明的第三目的是这样实现的，所述的三环二萜类化合物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
所述的三环二萜类化合物在制备预防和/或治疗人肺腺癌、人急性早幼粒白血病或人乳腺癌药物中的应用。
本发明所述的三环二萜类化合物对人肺腺癌、人急性早幼粒白血病或人乳腺癌细胞株有显著的抑制作用，提示其具有良好的抗癌活性，可以作为抗癌活性成分或先导化合物。
本发明所述的三环二萜类化合物可为天然存在的有机化合物，原料来源广泛，并且化合物制备操作流程简单，所获得的化合物纯度高。
附图说明
图1是本发明化合物高分辨质谱（HRESI-MS)；
图2是本发明化合物的核磁共振氢谱（1HNMR)；
图3是本发明化合物的核磁共振碳谱（13CNMR)；
图4是本发明化合物的HSQC相关谱；
图5是本发明化合物的HMBC相关谱；
图6是本发明化合物的COSY相关谱；
图7是本发明化合物的ROESY相关谱。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或改进，均落入本发明的保护范围。
本发明所述的三环二萜类化合物是以黑果土当归茎为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C20H32O4，命名为dumetorumaneA，具有下述结构式：
。
本发明所述的三环二萜类化合物的制备方法，是以黑果土当归茎为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将黑果土当归茎晾干粉碎得到0.05~0.15cm粒径大小的颗粒，加入黑果土当归茎重量比4~8倍的体积百分浓度80~95%乙醇溶液于65~74℃下回流提取3~5次，每次1~3h，合并提取液，提取液过滤，减压浓缩提取液至比重为1.1~1.3得到浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比2~4倍量的水，依次用与水等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取4~6次，蒸去溶剂分别得到石油醚萃取物b、乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d；
C、硅胶柱层析：
1）将乙酸乙酯萃取物c上硅胶柱，装柱硅胶为100~200目，用量为萃取物c重量6~8倍量；用体积比为30:1~0:1的氯仿-甲醇有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
2）将1）中以10:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液e上硅胶柱，装柱硅胶为200~300目，用量为洗脱液e体积6~8倍量；用体积比25:1~0:1的氯仿甲醇有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC检测，合并相同的部分；
D、高效液相色谱分离：将C步骤2）中以8:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的三环二萜类化合物dumetorumaneA。
A步骤所述的过滤是经80~120μm的滤纸进行过滤。
A步骤所述的减压浓缩是在50℃以下的温度条件下用旋转蒸发仪进行减压浓缩。
B步骤中所述的蒸去溶剂是采用旋转蒸发仪蒸去溶剂。
C步骤1）中所述的氯仿-甲醇有机溶剂的体积配比为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1和0:1。
C步骤2）中所述的氯仿-甲醇有机溶剂的体积配比为25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、0:1。
D步骤所述的高效液相色谱分离纯化包括以下具体步骤：
1）将C步骤2）中以8:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液以体积配比为65:35的乙腈-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，分别收集5~15min，17~23min，26~33min，34~38min，42~48min的色谱峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5个流分；
2）将C步骤2）中17~23min色谱峰的流分以体积配比为62:38的乙腈-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5m的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集28~30min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到所述的三环二萜类化合物dumetorumaneA；
本发明的应用为所述的三环二萜类化合物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
本发明的应用为所述的三环二萜类化合物在制备预防和/或治疗人肺腺癌、人急性早幼粒白血病或人乳腺癌药物中的应用。
下面以具体实施例对本发明做进一步说明：
实施例1化合物的制备
材料来源：黑果土当归采于云南昆明，经云南民族大学民族医药学院杨青松副教授鉴定为AraliadumetorumHand.-Mazz，标本保存于云南民族大学民族医药学院标本馆。
采用以下步骤：
（1）将10Kg黑果土当归茎晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，将黑果土当归粉在65℃的温度下每次用60Kg80%浓度的乙醇回流提取4次，每次2小时，合并乙醇提取液，备用；
（2）将步骤（1）制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1380g，备用；
（3）将（2）中的1380g浸膏混悬于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物390g、112g、405g；
（4）将（3）中制得的乙酸乙酯萃取物经100-200目硅胶柱色谱，用体积比30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为8.8g，Fr.2为8.1g，Fr.3为3.2g，Fr.4为15.7g，Fr.5为34.3g，Fr.6为6.2g，Fr.7为5.1g，Fr.8为21.5g，取Fr.5（3.5g）经200-300目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.5-1-7共7个组分，Fr.5-1为0.2g，Fr.5-2为0.4g，Fr.5-3为0.4g，Fr.5-4为0.6g，Fr.5-5为0.5g，Fr.5-6为0.6g，Fr.5-7为0.4g，Fr.5-5经半制备高效液相色谱仪，以乙腈-水(体积比65:35)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，分别收集5~15min，17~23min，26~33min，34~38min，42~48min的色谱峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5个流分（Fr.5-5-1-5)，Fr.5-5-1为0.1g，Fr.5-5-2为0.1g，Fr.5-5-3为0.05g，Fr.5-5-4为0.15g，Fr.5-5-5为0.05g，Fr.5-5-2用半制备高效液相色谱，乙腈-水(体积比62:38)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集28~30min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物dumetorumaneA(15mg)。
实施例2化合物的制备
采用以下步骤：
（1）将10Kg黑果土当归茎晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，将黑果土当归粉在67℃的温度下每次用60Kg84%浓度的乙醇回流提取3次，每次2.5小时，合并乙醇提取液，备用；
（2）将步骤（1）制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1340g，备用；
（3）将（2）中的1340g浸膏混悬于4000ml水中，依次用4000ml石油醚、4000ml乙酸乙酯以及4000ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取4次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物372g、103g、396g；
（4）将（3）中制得的乙酸乙酯萃取物经100-200目硅胶柱色谱，用体积比30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为7.6g，Fr.2为6.8g，Fr.3为3.0g，Fr.4为14.5g，Fr.5为32.4g，Fr.6为5.3g，Fr.7为4.8g，Fr.8为18.7g，取Fr.5（3.5g）经200-300目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.5-1-7共7个组分，Fr.5-1为0.4g，Fr.5-2为0.2g，Fr.5-3为0.5g，Fr.5-4为0.6g，Fr.5-5为0.5g，Fr.5-6为0.7g，Fr.5-7为0.2g，Fr.5-5经半制备高效液相色谱仪，以乙腈-水(体积比65:35)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，分别收集5~15min，17~23min，26~33min，34~38min，42~48min的色谱峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5个流分（Fr.5-5-1-5)，Fr.5-5-1为0.1g，Fr.5-5-2为0.1g，Fr.5-5-3为0.05g，Fr.5-5-4为0.1g，Fr.5-5-5为0.1g，Fr.5-5-2用半制备高效液相色谱，乙腈-水(体积比62:38)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集28~30min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物dumetorumaneA(17mg)。
实施例3化合物的制备
采用以下步骤：
（1）将10Kg黑果土当归茎晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，将黑果土当归粉在69℃的温度下每次用60Kg88%浓度的乙醇回流提取5次，每次2小时，合并乙醇提取液，备用；
（2）将步骤（1）制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1410g，备用；
（3）将（2）中的1410g浸膏混悬于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物395g、117g、411g；
（4）将（3）中制得的乙酸乙酯萃取物经100-200目硅胶柱色谱，用体积比30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为9.1g，Fr.2为8.4g，Fr.3为3.4g，Fr.4为15.9g，Fr.5为35.6g，Fr.6为6.4g，Fr.7为5.3g，Fr.8为22.6g，取Fr.5（3.5g）经200-300目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.5-1-7共7个组分，Fr.5-1为0.3g，Fr.5-2为0.2g，Fr.5-3为0.5g，Fr.5-4为0.6g，Fr.5-5为0.6g，Fr.5-6为0.6g，Fr.5-7为0.2g，Fr.5-5经半制备高效液相色谱仪，以乙腈-水(体积比65:35)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，分别收集5~15min，17~23min，26~33min，34~38min，42~48min的色谱峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5个流分（Fr.5-5-1-5)，Fr.5-5-1为0.15g，Fr.5-5-2为0.1g，Fr.5-5-3为0.05g，Fr.5-5-4为0.15g，Fr.5-5-5为0.1g，Fr.5-5-2用半制备高效液相色谱，乙腈-水(体积比62:38)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集28~30min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物dumetorumaneA(20mg)。
实施例4化合物的制备
采用以下步骤：
（1）将10Kg黑果土当归茎晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，将黑果土当归粉在71℃的温度下每次用60Kg92%浓度的乙醇回流提取4次，每次2小时，合并乙醇提取液，备用；
（2）将步骤（1）制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1480g，备用；
（3）将（2）中的1480g浸膏混悬于5000ml水中，依次用5000ml石油醚、5000ml乙酸乙酯以及5000ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取6次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物387g、111g、408g；
（4）将（3）中制得的乙酸乙酯萃取物经100-200目硅胶柱色谱，用体积比30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为8.2g，Fr.2为7.5g，Fr.3为3.0g，Fr.4为16.2g，Fr.5为34.4g，Fr.6为6.1g，Fr.7为5.0g，Fr.8为22.3g，取Fr.5（3.5g）经200-300目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.5-1-7共7个组分，Fr.5-1为0.4g，Fr.5-2为0.2g，Fr.5-3为0.5g，Fr.5-4为0.7g，Fr.5-5为0.6g，Fr.5-6为0.5g，Fr.5-7为0.2g，Fr.5-5经半制备高效液相色谱仪，以乙腈-水(体积比65:35)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，分别收集5~15min，17~23min，26~33min，34~38min，42~48min的色谱峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5个流分（Fr.5-5-1-5)，Fr.5-5-1为0.1g，Fr.5-5-2为0.1g，Fr.5-5-3为0.1g，Fr.5-5-4为0.15g，Fr.5-5-5为0.1g，Fr.5-5-2用半制备高效液相色谱，乙腈-水(体积比62:38)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集28~30min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物dumetorumaneA(21mg)。
实施例5化合物的制备
采用以下步骤：
（1）将10Kg黑果土当归茎晾干粉碎成粒径0.1cm大小的颗粒，得黑果土当归粉，将黑果土当归粉在74℃的温度下每次用60Kg95%浓度的乙醇回流提取5次，每次2小时，合并乙醇提取液，备用；
（2）将步骤（1）制得的乙醇提取液经80-120微米滤纸过滤并在50℃的温度下用旋转蒸发仪进行减压浓缩，至比重为1.2时，得浸膏1520g，备用；
（3）将（2）中的1520g浸膏混悬于4500ml水中，依次用4500ml石油醚、4500ml乙酸乙酯以及4500ml正丁醇进行萃取，每种溶剂萃取5次，再用旋转蒸发仪蒸去溶剂，分别得石油醚、乙酸乙酯以及正丁醇萃取物420g、130g、450g；
（4）将（3）中制得的乙酸乙酯萃取物经100-200目硅胶柱色谱，用体积比30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.1-Fr.8共8个组分，Fr.1为10.5g，Fr.2为8.8g，Fr.3为3.5g，Fr.4为17.0g，Fr.5为38.5g，Fr.6为7.0g，Fr.7为5.6g，Fr.8为25.3g，取Fr.5（3.5g）经200-300目硅胶柱色谱，用体积比25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、0:1的氯仿-甲醇梯度洗脱得到Fr.5-1-7共7个组分，Fr.5-1为0.4g，Fr.5-2为0.2g，Fr.5-3为0.5g，Fr.5-4为0.3g，Fr.5-5为0.7g，Fr.5-6为0.4g，Fr.5-7为0.4g，Fr.5-5经半制备高效液相色谱仪，以乙腈-水(体积比65:35)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，分别收集5~15min，17~23min，26~33min，34~38min，39~42min，43~48min的色谱峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5个流分（Fr.5-5-1-5)，Fr.5-5-1为0.2g，Fr.5-5-2为0.15g，Fr.5-5-3为0.05g，Fr.5-5-4为0.15g，Fr.5-5-5为0.1g，Fr.5-5-2用半制备高效液相色谱，乙腈-水(体积比62:38)作为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集28~30min的色谱峰，多次累加后蒸干，制备得到目标化合物dumetorumaneA(25mg)。
实施例6化合物的结构鉴定
取实施例1制备的化合物dumetorumaneA（黑果土当归二萜酸A），为白色无定型粉末（溶剂为氯仿）；测定方法为：用核磁共振，结合其它波谱技术鉴定结构。
+60.0(c0.50,CHCl3);IR(KBr)谱在3381,2968,1710,1655,1124,1068,863cm-1有吸收，表明分子中存在羧基、羟基和双键。HRESI-MS(附图1)显示其准分子离子峰m/z359.2193(calcd.forC20H32O4Na+:359.2198)，结合NMR谱确定其分子式为C20H32O4，不饱和度为5。1HNMR(附图2，数据归属见表1)显示分子中有3个甲基单峰，分别为δH1.21(3H,s),1.16(3H,s)及0.82(3H,s))，有1个三取代双键信号（δ4.71(1H,d,J=4.8）;13CNMR(附图3，数据归属见表1)显示分子中有20个碳，其中有5个季碳(含一个羧基碳和1个烯碳)，4个次甲基(含1个烯碳)，8个亚甲基(含1个连氧碳)及3个甲基。结合HSQC相关谱(附图4)，并对比文献数据可证实，该化合物与已知的对映海松烷型二萜结构相似，区别在于分子中的C环是一个七元环而不是六元环。在HMBC谱(附图5)中可看到H-14(δ H4.71)与C-16(δ C64.8)有相关，H-16(δ H3.69-3.81)与C-13(δ C77.8)及C-14(δ C118.6)有相关，在COSY谱(附图6)中可看到H-14与H-15有相关，证明式Ⅰ化合物的C环是一个七元环。进一步经HMBC相关(附图5)、COSY相关(附图6)和ROESY(附图7)及与文献(JungH.A.,LeeE.J.,KimJ.S.,KangS.S.,LeeJ.H.,MinB.S.,ChoiJ.S.CholinesteraseandBACE1inhibitoryditerpenoidsfromAraliacordata.ArchPharmRes.2009,32:1399-1408;DangN.H.,ZhangX.F.,ZhengM.S.,SonK.H.,ChangH.W.,KimH.P.,BaK.H.,andKangS.S.InhibitoryConstituentsagainstCyclooxygenasesfromAraliacordataThunb.ArchPharmRes.2005,28:28-33.)对比证实，使化合物的结构最终得到确认，命名为dumetorumaneA。
实施例7
取实施例2制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C20H32O4。确认实施例2制备的化合物为所述的三环二萜类化合物dumetorumaneA。
实施例8
取实施例3制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C20H32O4。确认实施例3制备的化合物为所述的三环二萜类化合物dumetorumaneA。
实施例9
取实施例4制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C20H32O4。确认实施例4制备的化合物为所述的三环二萜类化合物dumetorumaneA。
实施例10
取实施例5制备的化合物，为黄色胶状物；按实施例6中的方法进行结构测定，结果为：其结构同实施例6，分子式为C20H32O4。确认实施例5制备的化合物为所述的三环二萜类化合物dumetorumaneA。
实施例11化合物抗肿瘤活性检测
取实施例1~5所制备的任一三环二萜类化合物进行抗肿瘤活性检测试验，试验情况如下：
采用改良MTT法评价本发明所述的化合物对肿瘤细胞的增值抑制作用。
取备用的肿瘤细胞悬液接种于96孔培养板，90μL/孔，继续培养24h后加入不同浓度的受试样品，10μL/孔，使其终浓度为100、10、1、0.1、0.01μg/mL，每个浓度均设3个复孔。顺铂（DDP）为阳性对照，等体积RPMI1640培养基为阴性对照。同时设化合物100、10μg/mL时相应的DMSO浓度为溶媒对照，以消除DMSO对细胞生长的影响。加药后继续置于37℃，5%CO2培养箱培养72h，每孔加入MTT（5mg/mL）20μL，继续培养4h，每孔加入三联液[10%SDS-5%异丁醇—0.012mol/LHCl（W/V/V）]100μL溶解甲臜。用酶标仪在570nm波长下测定各孔的OD值。
按下列公式计算细胞增值抑制率：
抑制率（%）=（OD值对照孔—OD值给药孔）/OD值对照孔×100%
数据统计分析：采用MicrosoftExcel2003计算抑制率，采用logit法，SPSS11.5软件包计算半数抑制浓度IC50。
计算半数抑制浓度IC50，对人肺腺癌细胞株(A549)、人急性早幼粒白血病细胞株(NB4)及人乳腺癌细胞株(MCF7)的半数抑制浓度(IC50)测定结果分别为7.6±0.6μM，8.2±0.8μM，5.7±0.7μM，表明本发明所述的化合物具有较好的抗肿瘤活性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种三环二萜类化合物，其特征在于所述的三环二萜类化合物是以黑果土当归茎为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离得到的，该化合物分子式为C20H32O4，命名为dumetorumaneA，具有下述结构式：
。
2.一种权利要求1所述的三环二萜类化合物的制备方法，其特征在于是以黑果土当归茎为原料，经浸膏提取、有机溶剂萃取、硅胶柱层析、高压液相色谱分离获得，具体为：
A、浸膏提取：将黑果土当归茎晾干粉碎得到0.05~0.15cm粒径大小的颗粒，加入黑果土当归茎重量比4~8倍的体积百分浓度80~95%乙醇溶液于65~74℃下回流提取3~5次，每次1~3h，合并提取液，提取液过滤，减压浓缩提取液至比重为1.1~1.3得到浸膏a；
B、有机溶剂萃取：浸膏a中加入重量比2~4倍量的水，依次用与水等体积的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇溶剂进行萃取，每种溶剂萃取4~6次，蒸去溶剂分别得到石油醚萃取物b、乙酸乙酯萃取物c和正丁醇萃取物d；
C、硅胶柱层析：
1）将乙酸乙酯萃取物c上硅胶柱，装柱硅胶为100~200目，用量为萃取物c重量6~8倍量；用体积比为30:1~0:1的氯仿-甲醇有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC监测，合并相同的部分；
2）将1）中以10:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液e上硅胶柱，装柱硅胶为200~300目，用量为洗脱液e体积6~8倍量；用体积比25:1~0:1的氯仿甲醇有机溶剂梯度洗脱，收集梯度洗脱液、浓缩，经TLC检测，合并相同的部分；
D、高效液相色谱分离：将C步骤2）中以8:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液经高效液相色谱分离纯化，即得所述的三环二萜类化合物dumetorumaneA。
3.根据权利要求2所述的三环二萜类化合物的制备方法，其特征在于A步骤所述的过滤是经80~120μm的滤纸进行过滤。
4.根据权利要求2所述的三环二萜类化合物的制备方法，其特征在于A步骤所述的减压浓缩是在50℃以下的温度条件下用旋转蒸发仪进行减压浓缩。
5.根据权利要求2所述的三环二萜类化合物的制备方法，其特征在于所述B步骤中所述的蒸去溶剂是采用旋转蒸发仪蒸去溶剂。
6.根据权利要求2所述的三环二萜类化合物的制备方法，其特征在于C步骤1）中所述的氯仿-甲醇有机溶剂的体积配比为30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、2:1和0:1。
7.根据权利要求2所述的三环二萜类化合物的制备方法，其特征在于C步骤2）中所述的氯仿-甲醇有机溶剂的体积配比为25:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、0:1。
8.根据权利要求2所述的三环二萜类化合物的制备方法，其特征在于D步骤所述的高效液相色谱分离纯化包括以下具体步骤：
1）将C步骤2）中以8:1配比的氯仿-甲醇有机溶剂进行洗脱得到的洗脱液以体积配比为65:35的乙腈-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，分别收集5~15min，17~23min，26~33min，34~38min，42~48min的色谱峰，多次累加后蒸干，依次合并相同部分得到5个流分；
2）将C步骤2）中17~23min色谱峰的流分以体积配比为62:38的乙腈-水为流动相，流速2.5ml/min，250×10mm，5μm的C18为固定相，紫外检测器检测波长为210nm，每次进样50μL，收集28~30min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到所述的三环二萜类化合物dumetorumaneA。
9.一种权利要求1所述的三环二萜类化合物在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。
10.一种权利要求1所述的三环二萜类化合物在制备预防和/或治疗人肺腺癌、人急性早幼粒白血病或人乳腺癌药物中的应用。
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