CN101352445A

CN101352445A - 贝母素类化合物的新用途

Info

Publication number: CN101352445A
Application number: CNA2008101184469A
Authority: CN
Inventors: 唐亚林; 徐筱杰; 李骞; 向俊锋; 周秋菊; 张秀凤; 张虹; 李林; 刘岩
Original assignee: Institute of Chemistry CAS
Current assignee: Institute of Chemistry CAS
Priority date: 2008-08-22
Filing date: 2008-08-22
Publication date: 2009-01-28

Abstract

本发明公开了贝母素类化合物的新用途。式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物学上可接受的盐的新用途包括：在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物中的应用和在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物上可接受的盐可与G－四链体DNA结合，增加G－四链体的稳定性，从而竞争性抑制端粒酶与端粒的结合，抑制端粒酶的活性，减弱细胞的增殖能力，抑制端粒延伸，促进细胞凋亡。将式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物上可接受的盐用于制备预防和/或治疗癌症的药物，具有重大的意义。

Description

贝母素类化合物的新用途

技术领域

本发明涉及贝母素类化合物的新用途。

背景技术

端粒是指真核生物线性染色体末端的非编码DNA区域，其功能为：在重组过程中协助染色体排列；稳定染色体末端结构，防止染色体间末端连接；可补偿滞后链5’末端在消除RNA引物后造成的空缺。端粒DNA序列在体外能形成四链体结构(Wang，Y.and Patel，D.J.，Structure，2，1141-1156(1994).)。

组织培养的细胞证明，端粒在决定细胞的寿命中起着重要作用，经过多代培养的老化细胞端粒变短，染色体也变得不稳定。细胞分裂的时候，因为3’末端在复制过程中是滞后链，DNA聚合酶不能复制染色体3’链的最末端，这种“末端复制问题”导致细胞每倍增一次端粒就缩短约30-200个碱基，大约经过60-70次复制后，端粒达到一个临界长度，此时细胞就进入非分裂状态，叫做衰老期，细胞凋亡直至死亡(Harley，C.B.，et al.，Nature，345，458-460(1990).)。

端粒酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。端粒酶在不同物种细胞中对于保持染色体稳定性和细胞活性有重要作用，能延长缩短的端粒，从而增强体外细胞的增殖能力。端粒酶在正常人体组织中活性被抑制，在肿瘤中被重新激活，可能参与恶性转化。端粒酶在保持端粒稳定、基因组完整、细胞长期的活性和潜在的继续增殖能力等方面有重要作用。Kim等发现，在85-90％的癌细胞中，一种逆转录酶-端粒酶被激活(Kim，N.W.，et al.，Science，266，2011-2015(1994).)，这提供了一种用于治疗癌症的特异的靶。

端粒序列随生物体的不同而不同。在人类和其他脊椎动物中，端粒含有TTAGGG的重复序列。在人体中，端粒酶将TTAGGG重复序列加入到端粒末端，以平衡细胞分裂所带来的端粒缩短，结果端粒的长度被保持住，使得癌细胞永生化。人类端粒具有一段5-15kb的双链区域，一条链富含嘌呤(A链)，一条链富含嘧啶(B链)。在3’末端，A链存在一个200个碱基长度的单链突出，该单链可作为端粒酶的引物。Zahler等发现，G-四链体的形成能阻止端粒酶与端粒的结合，从而抑制端粒酶的活性(Zahler，A.M.，et al.，Nature，350718-720(1991).)。G-四链体DNA是由含有一连串连续鸟嘌呤残基的DNA形成的一种四链DNA结构(Cech，T.R.，Nature，332，777-778(1988).)。因此，关于稳定端粒G-四链体DNA的小分子的研究是目前抗癌药物设计的一个热点领域。

贝母素类化合物具有镇咳平喘的药理特性。其主要来源于浙贝母和川贝母。浙贝母是常用中药，味苦，性寒，归心、肺经，具有清热化痰、解毒散结之功效。临床上常用以止咳化痰平喘，主要与其阿托品样作用，缓解支气管痉挛相关。浙贝母碱(Peimine，又称贝母甲素)和贝母乙素是常用中药浙贝母和川贝母的主要活性成分，属异甾类生物碱。1g浙贝母粉所含该有效成分不低于5mg。

发明内容

本发明的目的是提供贝母素类化合物的新用途。

本发明提供的贝母素累化合物的新用途为：式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物学上可接受的盐在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物中的应用；

所述真核生物为哺乳动物。

所述肿瘤细胞可为癌细胞，如乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、白血病细胞、头颈癌细胞、结肠癌细胞、视网膜癌细胞、膀胱癌细胞、肛门癌细胞或直肠癌细胞。

本发明还保护一种抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物，它的有效成分为式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物学上可接受的盐。

所述真核生物为哺乳动物。

本发明提供的贝母素累化合物的新用途还为：式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

所述肿瘤可为癌，如乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、白血病、头颈癌、结肠癌、视网膜癌、膀胱癌、肛门癌或直肠癌。

有效成分为式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物学上可接受的盐的预防和/或治疗肿瘤的药物，也属于本发明的保护范围。

试验证明，式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物上可接受的盐可与G-四链体DNA结合，增加G-四链体的稳定性，从而竞争性抑制端粒酶与端粒的结合，抑制端粒酶的活性，抑制端粒延伸，减弱细胞的增殖能力，促进细胞凋亡。所以可将式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物上可接受的盐用于制备预防和/或治疗癌症的药物。

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。

附图说明

图1为不同摩尔比的贝母乙素与Telo7的混合物的¹H-NMR谱。

图2为贝母甲素和贝母乙素对Telo7热稳定性的影响。

具体实施方式

以下实施例中所用到贝母甲素、乙素均购自中国药品生物制品检定所。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。

实施例1、贝母甲素和贝母乙素对G-四链体热稳定性的影响

一、贝母乙素与G-四链体的结合

在K⁺离子存在的条件下，溶液中的[d(TTAGGGT)]序列以平行结构四链体状态[d(TTAGGGT)4]存在，¹H-NMR谱的特征为：11.0ppm、11.2ppm和11.6ppm处分别出现四链体结构中的鸟嘌呤、亚氨基和氢的信号峰。[d(TTAGGGT)4]与贝母乙素结合后，¹H-NMR谱中，亚氨基、氢的信号峰的化学位移值发生改变。将G-四链体DNA称为Telo7。

1、配制缓冲液

缓冲液为水溶液，含有以下终浓度的各种物质：17.2mM K⁺(K₂HPO₄/KH₂PO₄)，20％氘代DMSO；pH7.4。

2、将400OD[d(TTAGGGT)]所示的单链Telo7(北京擎科生物技术有限公司)溶解在缓冲液中，得到浓度为300uM的Telo7母液。

3、将5mg贝母乙素(分子量429.64)溶解在缓冲液中，得到浓度为80mM的贝母乙素母液。

4、制备一系列不同的摩尔比的贝母乙素与Telo7的混合溶液，混合溶液中Telo7浓度为250uM不变，贝母乙素与Telo7的摩尔比分别为0∶1、0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、3∶1、4∶1、6∶1、10∶1。

5、将上述混合溶液25℃孵育12h，进行¹H-NMR测定，观察亚氨基、氢的信号峰化学位移值的变化。

由图1可见，加入贝母乙素后，Telo7上一些重要质子的化学位移发生了比较明显的变化，因此确定四链体与贝母乙素发生了结合。

二、与贝母甲素、贝母乙素结合后Telo7的热稳定性

Telo7四链体的熔点是指G4结构分解50％时的温度。DNA的熔点(Tm)反应了它的热稳定性，熔点越高说明该G4结构越稳定，反之，熔点越低说明该G4结构越不稳定。

步骤一制备的贝母乙素与Telo7的混合溶液(摩尔比为10∶1)为溶液乙；用贝母甲素取代贝母乙素，采用相同方法制备的贝母甲素与Telo7的混合溶液(摩尔比为10∶1)为溶液甲。

通过圆二色谱(CD)变温实验测定溶液甲与溶液乙中Telo7的熔点，以浓度为250uM的Telo7溶液作为对照。采用的仪器为Jasco815圆二色谱仪，实验中采用的CD吸收池光程为1cm。在进行实验前用高纯N₂除氧5分钟，且实验中一直用高纯N₂作为保护气以保证没有臭氧出现，实验数据采集前，用缓冲液进行基线校对。在近紫外区220nm-320nm采集CD光谱，扫描速度为500nm/min，采集次数为3次。在变温实验中采用JascoPTC-423S控温仪，升温速度为2℃/min，通过监控262nm CD信号来进行Telo7熔点的测定，结果如图2所示。试验重复3次，数据采用平均值±标准差。

结果表明，对照中，Telo7的熔点为59±1℃；溶液甲中，Telo7的熔点为73±1℃，提高了14℃；溶液乙中，Telo7熔点为72±1℃，提高了13℃。变温结果证实了贝母甲素或贝母乙素的存在可以显著的提高Telo7的稳定性。

实施例2、贝母甲素和贝母乙素对癌细胞增殖能力的影响

MTT法的基本原理为：四甲基偶氮唑盐[MTT，3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl-tetrazolium bromide](购自北京化学试剂公司)是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不溶性的蓝紫色的formazon，而死细胞则无此功能。用DMSO溶解formazon后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。按照公式可计算肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD_对照-OD_实验)/OD_对照×100％，进而计算得到半数抑制浓度(IC₅₀)。

1)贝母甲素对癌细胞增殖能力的影响

具体操作步骤如下：

1)选用对数生长期的贴壁人肝癌细胞HepG-2，用0.25％胰酶消化后，用含10％小牛血清的RPMI 1640培养液配制成5000个/ml的细胞悬液，接种在96孔培养板中，每孔接种100μl，37℃，5％CO₂培养24h。

2)第1-3行的第1-4列孔各加入贝母甲素溶液(分子量431.65)10μl，用RPMI1640培养液补充至每孔终体积为200μl，使每孔中贝母甲素的终浓度为50μg/ml；第1-3行第5列孔为对照组，加入200μl RPMI 1640培养液。37℃，5％CO₂培养7d。其中，在第4天时换液，将孔中培养液吸出，第1-3行的第1-4列孔各加入贝母甲素溶液10μl，用RPMI 1640培养液补充至每孔终体积为200μl，使每孔中贝母甲素的终浓度为50μg/ml；第1-3行第5列孔为对照组，加入200μl RPMI 1640培养液。

3)弃上清液，每孔加入100μl新鲜配制的0.5mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4h。小心弃上清，并加入200μl DMSO溶解MTT formazon沉淀，用微型超声振荡器混匀，在酶标仪上测定波长544nm处的光密度值。按照下述公式计算肿瘤细胞生长抑制率，肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD _对照-OD_实验)/OD_对照×100％(其中OD_对照、OD_实验为已经扣除OD_空白的实验数值)，通过计算求得IC₅₀值。实验结果表明：50μg/ml的贝母甲素，对人肝癌细胞HepG-2的抑制率达到48.2％

2)贝母乙素对癌细胞增殖能力的影响

具体操作步骤如下：

2)第1-3行的第1-4列孔各加入贝母乙素溶液(分子量429.64)10μl，用RPMI1640培养液补充至每孔终体积为200μl，使每孔中贝母乙素终浓度为50μg/ml；第1-3行第5列孔为对照组，加入200μl RPMI 1640培养液。37℃，5％CO₂培养7d。其中，在第4天时换液，将孔中培养液吸出，第1-3行的第1-4列孔各加入贝母乙素溶液(分子量429.64)10μl，用RPMI 1640培养液补充至每孔终体积为200μl，使每孔中贝母乙素的终浓度为50μg/ml；第1-3行第5列孔为对照组，加入200μl RPMI 1640培养液。

3)弃上清液，每孔加入100μl新鲜配制的0.5mg/ml MTT的无血清培养液，37℃继续培养4h。小心弃上清，并加入200μl DMSO溶解MTT formazon沉淀，用微型超声振荡器混匀，在酶标仪上测定波长544nm处的光密度值。按照下述公式计算肿瘤细胞生长抑制率，肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD_对照-OD_实验)/OD_对照×100％(其中OD_对照、OD_实验为已经扣除OD_空白的实验数值)，通过计算求得IC₅₀值。实验结果表明：50μg/ml的贝母乙素，对人肝癌细胞HepG-2的抑制率达到76.8％。

Claims

1、式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物学上可接受的盐在制备抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物中的应用；

2、一种抑制真核生物肿瘤细胞增殖的药物，它的有效成分为式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物学上可接受的盐。

3、如权利要求1所述的应用，如权利要求2所述的药物，其特征在于：所述真核生物为哺乳动物。

4、如权利要求1至3中任一所述的应用和药物，其特征在于：所述肿瘤细胞为癌细胞；所述癌细胞为乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、肺癌细胞、脑癌细胞、卵巢癌细胞、子宫癌细胞、睾丸癌细胞、皮肤癌细胞、白血病细胞、头颈癌细胞、结肠癌细胞、视网膜癌细胞、膀胱癌细胞、肛门癌细胞或直肠癌细胞。

5、式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物学上可接受的盐在制备预防和/或治疗肿瘤药物中的应用。

6、如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为癌。

7、如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述癌为乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、白血病、头颈癌、结肠癌、视网膜癌、膀胱癌、肛门癌或直肠癌。

8、一种预防和/或治疗肿瘤的药物，它的有效成分为式(I)或式(II)所示的贝母素类化合物或其药物学上可接受的盐。

9、如权利要求8所述的药物，其特征在于：所述肿瘤为癌。

10、如权利要求9所述的药物，其特征在于：所述癌为乳腺癌、前列腺癌、肝癌、胰腺癌、肺癌、脑癌、卵巢癌、子宫癌、睾丸癌、皮肤癌、白血病、头颈癌、结肠癌、视网膜癌、膀胱癌、肛门癌或直肠癌。