CN101716175B - 3-氨基-6-（4-甲氧基苯基）噻吩[2,3-b]并吡啶-2-甲酰胺的新用途 - Google Patents
3-氨基-6-（4-甲氧基苯基）噻吩[2,3-b]并吡啶-2-甲酰胺的新用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于医药技术领域，特别涉及3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺的新用途。本发明经药理实验证明式I所示的3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺对人肝癌细胞HepG2，Bel-7402及SMMC-7721等具有明显的增殖抑制作用，并且这种增殖抑制作用是通过诱导细胞凋亡而实现，为肿瘤的治疗提供了新的选择。
Description
技术领域
本发明属于医药技术领域，特别涉及3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺的新用途。
背景技术
高效安全抗肿瘤药物的开发一直是世界性的难题。近年，随着对恶性肿瘤发病机制的深入研究，针对肿瘤特异性分子靶点设计抗肿瘤治疗药物因其确切疗效和低毒副作用而成为抗肿瘤药物开发的新方向和热点。
肿瘤细胞周期调控异常在实体瘤的发生发展中具有重要的作用，肿瘤细胞周期靶向新药的研发已成为当今肿瘤研究的热点领域。目前研究已证实许多与肿瘤细胞周期相关的靶点，包括Aurora激酶家族。Aurora激酶家族是近年发现的在细胞有丝分裂中起重要作用的丝-苏氨酸蛋白激酶。迄今发现人类Aurora激酶有3种：Aurora-A、B和C。研究表明Aurora-A与恶性肿瘤具有明显相关性，在多种肿瘤包括乳腺癌、结肠直肠癌、卵巢癌和肝细胞癌中都有表达。Aurora-A不仅参与细胞周期的调节，同时还是p53和Ras信号通路的调节因子。小分子抑制剂可以通过抑制上述激酶的活性，使细胞阻滞在G2/M期，细胞发生死亡，从而达到抑制肿瘤生长的目的。所以，Aurora激酶已经成为近年抗肿瘤药物开发的一个新的靶点，针对Aurora激酶的小分子拮抗剂有可能为肿瘤治疗提供新的希望。
本发明的发明人使用计算机辅助药物设计和筛选技术，得到具有Aurora激酶抑制活性的骨架结构，然后通过有机合成获得了一系列小分子化合物，通过体外抗肿瘤活性测试发现其具有抗肿瘤活性。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供式I所示结构的3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺在医药领域的新用途，尤其是在制备抗肿瘤药物中的用途。
3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺的用量为19～80mg/kg.d时有明显的抑瘤作用。进一步的，3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺的用量为35～75mg/kg.d时能显著的抑制肿瘤的生长。
本发明的有益效果在于，创造性地发现式I所示的3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺具有好的抗肿瘤作用，并通过实验表明其是通过导致肿瘤细胞凋亡起到抗肿瘤作用，为抗肿瘤药物的制备提供了一种新的选择。
附图说明
图1为3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺对人肝癌细胞株HepG2的体内增殖抑制实验结果，1是生理盐水对照组，2是溶剂对照组，3是19mg/kg处理组，4是37.5mg/kg处理组，5是75mg/kg处理组。
具体实施方式
实施例1 3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺的制备
将对甲氧基苯乙酮(式II)(5g，33.3mmol)与N，N-二甲基甲酰胺二甲缩醛(DMF-DMA)(9.2ml，69.3mmol)加热回流，直至原料反应完全(薄层色谱监测)，冰浴冷却反应液，抽滤析出固体，用冷石油醚和冷乙醇洗涤滤饼，干燥得到烯胺酮(式III)(黄色固体5.2克，产率75％)，直接用于下一步反应。
将上述烯胺酮(式III)(1g，4.9mmol)，2氰基硫代乙酰胺(0.74g，7.35mmol)，1，4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷(DABCO)(0.54g，2.45mmol)溶于8ml无水乙醇中，加热回流至反应完全(薄层色谱监测)，冷却反应液至室温，用稀盐酸调节反应体系至中性，抽滤析出固体，滤饼用无水乙醇洗涤，干燥得到产物(式IV)(黄色固体1.0克，产率85％)，直接用于下一步反应。
将上述黄色固体(式IV)(1g，4.2mmol)悬浮于6mlDMF之中，加入10％KOH水溶液(3ml)，室温搅拌下加入氯乙酰胺(0.5g，5.0mmol)，室温搅拌20分钟，再加入10％KOH水溶液(3ml)，升温至85℃，直至反应完全，冷却反应液，过滤，滤饼用无水乙醇洗涤，干燥得到黄色固体0.95克，产率75％。该化合物即为式I所示3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺，相对分子质量为299.35。纯度为98.5％，性状为浅黄色粉末，在水，乙醇等溶剂中溶解性差。其它性质检定数据如下所示：
Mp：255～257℃.
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ8.45(d，J＝8.4Hz，1H)，8.15(d，J＝8.8Hz，2H)，7.98(d，J＝8.0Hz，1H)，7.19(br，2H)，7.15(br，2H)，7.08(d，J＝8.8Hz，2H)，3.84(s，3H)；
13C NMR(100MHz，DMSO-d6)：δ167.02，160.55，158.78，156.17，145.67，131.48，130.35，128.35(2C)，124.50，115.41，114.19(2C)，96.93，55.20；
ESI-MS：m/z 334.16(M+Cl-).
药效学实验部分
主要试剂：RPMI-1640、胎牛血清、胰酶等购自Gibco BRL公司(InvitrogenCorporation，USA)，溴化噻唑蓝四唑(MTT)、碘化丙啶(PI)、二甲亚砜(DMSO)为Sigma公司(USA)产品。3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺(按照实例1方法制备)用DMSO配制成40mM溶液，置4℃冰箱避光保存备用，临用时用完全培养液稀释至所需浓度。
本实验所用的人肝癌细胞株HepG2、Bel-7402、SMMC-7721购于美国ATCC公司，常规保存。上述细胞均用含10％胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI-1640完全培养基于5％CO2、37℃条件下培养。
1、细胞增殖抑制实验
用完全培养基调整细胞浓度为2×104/ml，接种于96孔板，每孔200μl，培养过夜，次日分别用不同剂量的3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺(浓度分别为40、20、10、5、2.5、1.25、0.625μM)处理细胞，同时用等体积的空白溶剂作为对照组，对照组的DMSO浓度为0.1％(0.1％的DMSO对细胞增殖没有影响)。每个组设5个复孔，于37℃、5％CO2培养。培养48小时后，每孔加入5mg/mlMTT试剂20μl，继续培养2～4h，弃上清，再加DMSO 150μl，振荡混匀15min，用酶标仪(λ＝570nm)测定吸光度(A)值(A值与活细胞数成正比)，取其平均值。相对细胞增殖抑制率(％)＝(对照组A570-实验组A570)/对照组A570×100％。实验至少重复3次。同时，根据相对细胞增殖抑制率计算出半数抑制浓度(IC50)来表示化合物对肿瘤细胞增殖抑制作用。
3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺在对人肝癌细胞株的相对细胞增殖抑制作用见表1：
表1
表1说明了随着3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺药物浓度增大，细胞增殖抑制越明显，各剂量组与对照组相比，细胞增殖抑制率差异均有统计学意义(P＜0.05)。3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺处理HepG2、Bel-7402及SMMC-7721细胞48h的半数抑制浓度(IC50)分别为0.13μM、7.4μM及2.6μM。
细胞增殖抑制试验结果显示3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺能显著性抑制各种人肝癌细胞的增殖。
2、流式细胞仪分析检测细胞凋亡实验
取对数生长期的HepG2细胞，按每孔1×105个细胞接种于6孔板中，培养24小时后，加入3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺，使其终浓度分别为10、5、2.5、1.25、0.625？M，每个剂量组设3个复孔，于37℃，5％CO2培养。培养72小时后，收集不同处理组和空白溶剂对照组的细胞，用4℃预冷的磷酸盐缓冲液洗涤3次，加入70％冷乙醇固定细胞。离心之后加入含RNase的PI染料，半小时后上流式细胞仪检测。
HepG2经3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺作用后经流式细胞仪检测时发现，在G0/G1期峰前出现一亚二倍体，使用凋亡程序软件去除细胞碎屑后分析确认其为凋亡峰，此峰随药物浓度增大而升高呈现出较明显的剂量依赖性。处理组和空白溶剂对照组相比有显著性差异(P＜0.05)，说明3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺对HepG2细胞的增殖抑制作用可能是通过诱导细胞凋亡而实现，具体实验数据见表2。
表2
3、体内抗肿瘤实验
收集HepG2细胞株，每只BALB/C裸鼠后肋部皮下注入1×107细胞悬液，建立荷瘤小鼠模型。待肿瘤长100～200mm3时，将小鼠随机分成五个组：生理盐水对照组，溶剂对照组(含0.5％tween 80的0.5％羧甲基纤维素钠溶液)，3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺75、37.5、19mg/kg处理组。3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺溶于含0.5％tween 80的0.5％羧甲基纤维素钠溶液，口服给药，每天给药一次，连续给药28天。每三天测量肿瘤体积和小鼠体重。肿瘤体积采用以下公式计算：肿瘤体积＝肿瘤长径(mm)×肿瘤短径(mm)2×0.52。
体内抗癌增殖抑制实验具体实验数据见图1，图1表明3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺对人肝癌HepG2有明显的抑瘤作用，各剂量组肿瘤与对照组比较有明显差异。而且这种抑制效应有明显的剂量依赖关系，当3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺用量为75mg/(kg.d)和37.5mg/(kg.d)时，抑瘤率分别达到55.2％和42％，显著的抑制了肿瘤的生长。实验期间裸鼠体重无明显变化，小鼠一般情况良好，表明3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺无明显毒副作用。
Claims (3)
1.式I所示结构的3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺在制备抗肿瘤药物中的用途，
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺的用量为每天19～80mg/kg。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：3-氨基-6-(4-甲氧基苯基)噻吩[2，3-b]并吡啶-2-甲酰胺的用量为每天35～75mg/kg。
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