CN102764233A

CN102764233A - 3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物脂质体注射剂及制备工艺

Info

Publication number: CN102764233A
Application number: CN2011101166814A
Authority: CN
Inventors: 郑瑀; 杨黎; 魏于全; 赵瀛兰
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2011-05-06
Filing date: 2011-05-06
Publication date: 2012-11-07

Abstract

本发明公开了2个3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物化合物1和化合物2脂质体注射剂及其制备工艺。化合物具有体内外特异性肝癌抑制作用，但它们在水中不溶，口服吸收差，血药浓度低。将它们制成脂质体注射剂，各组分的重量百分含量为：化合物1（或2）0.01~0.6%、大豆卵磷脂或氢化大豆卵磷脂0.01~5%、胆固醇0.001~1.5%和聚乙二醇化脂0~1.5%。其制备工艺包括以下步骤：1）脂相冻干；2)脂质成膜；3）脂相水化；4）脂质体反复冻融；5）脂质体匀质。所得脂质体中化合物溶解度较其在水中的溶解度增加了3个数量级，且粒径小，粒径分布窄，经静脉给药后初始血药浓度较相应的口服制剂提高了约30倍，是该系列化合物的理想制剂。

Description

3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物脂质体注射剂及制备工艺

技术领域

本发明涉及3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物脂质体注射剂及其制备工艺。

背景技术

原发性肝癌（简称肝癌，90%为肝细胞型肝癌，即Hepatocellular carcinoma，HCC）是消化系统常见恶性肿瘤，恶性程度高、对放化疗不敏感、预后极差。中国是HCC高发国家，由于我国有上亿乙肝病毒感染者的特殊国情，病毒性肝炎如乙肝是我国肝癌发生的主要原因。目前临床上常用的治疗肝癌的方法有外科手术切除或肝移植、介入治疗（TACE）、化疗、放疗等。其中肝切除术是治疗肝癌的有效方法，适用于早期患者，但由于大部分病人确诊时已为中晚期而无法接受根治性手术治疗。虽然肝移植适合于部分中晚期肝硬化合并肝癌的患者，但由于肝供体短缺，大部分患者无法承受巨额医疗费用，使得该疗法也存在很大的局限性。

全身化疗在肝癌的治疗中所占的地位一直不突出，主要由于肝癌对大多数化疗药物不敏感且易产生耐药性。少数化疗药物，如阿霉素，顺铂，5-氟尿嘧啶等虽有较低的有效率，但对晚期肝癌患者无显著的生存获益，且大剂量下常伴随副作用。因此，迫切需要开发新的针对肝癌的化疗药物。2007 年发现小分子多靶点抑制剂Sorafenib可明显延长晚期患者生存（安慰组为7.9个月，而用药组为10.7 个月），被FDA 批准用于治疗晚期肝癌目前已有Sorafenib、Sunitinib、Vatalanib、Brivanib等多个多靶点小分子化合物在进行肝癌的临床研究，这充分反映了靶向小分子，尤其是多靶点小分子药物在肝癌治疗中的良好前景。

在之前的研究中, 我们发现具有3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺母体的化合物1(3-氨基-6-(3-氟苯基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺）和2(3-氨基-6-(3-甲氧苯基)噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺)，体外对人肝癌细胞株HepG2具有显著的增殖抑制作用。值得注意的是，该化合物不仅具有良好的体内外抗肿瘤活性，还具有独特的肝癌细胞特异性，即：体外对3 种肝癌细胞(Bel-7402,SMMC-7721和HepG2)具有很强的增殖抑制作用，而对其它五种类型的非肝癌肿瘤细胞的活性很差(相关工作已申请中国专利，专利申请号为：200910167054.5)。

Figure 2011101166814100002DEST_PATH_IMAGE001

图1：3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物1和2的结构式。

虽然该系列化合物具有很强的基础研究价值和良好的应用前景，但该类化合物在水和常规有机溶剂中的溶解度差，经口服给药后吸收差，血药浓度极低。为解决这个问题，我们对化合物1和2进行了制剂优化。脂质体(liposome)是一种新型的药物载体，具有增加难溶性药物溶解度，延长体内半衰期，减小毒性等许多优点，目前已有多种药物脂质体在临床上应用，如阿霉素脂质体和紫杉醇脂质体。专利CN101889982A和专利CN101897667A中公开了用聚乙二醇化脂制备隐形脂质体，利用聚乙二醇覆盖于脂质体的表面，从而躲避体内调理素的识别，起到降低脂质体清除速率。另外，对于抗肿瘤脂质体，由于在体内循环时间延长，利用其在肿瘤组织透过性增强及滞留效应，进一步增强其抗肿瘤作用。

旋转薄膜分散法是实验室制备脂质体常用的方法，专利CN1846692和CN1660410采用了该方法制备脂质体。在脂质体产业化生产中常常采用的是先将脂相冻干，得到质地疏松的脂质块，再加入水相在水浴振摇下水化的方法制备的，专利CN101897667A中就采用的这种方法。

发明内容

本发明提供了一种3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物脂质体注射剂及其制备工艺。

该脂质体注射剂含有：1）化合物1（或2）；2）脂相成分：氢化大豆卵磷脂/胆固醇/聚乙二醇化脂;3)其他用于制备脂质体的辅料。

其中各组分的重量百分含量为：

化合物1（或2） 0.01~0.6%

大豆卵磷脂或氢化大豆卵磷脂 0.01~5%

胆固醇 0.001~1.5%

聚乙二醇化脂 0~1.5%

其余为注射用水，

同时满足：化合物和大豆卵磷脂或氢化卵磷脂的重量比为0.02~2：1，胆固醇和大豆卵磷脂或氢化卵磷脂的重量比为0.05~0.5：1，聚乙二醇化脂和大豆卵磷脂或氢化卵磷脂的重量比为0~3.5：1。

上述3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物脂质体注射剂，其优选方案中各组分的重量百分含量为：

化合物1（或2） 0.1~0.5%

大豆卵磷脂或氢化大豆卵磷脂 0.5~3%

胆固醇 0.2~0.5%

聚乙二醇化脂 0~0.8%

其余为注射用水，

其中，聚乙二醇化脂选自聚乙二醇化二硬脂酸酰脂酰乙醇胺、聚乙二醇-胆固醇、聚乙二醇-甘油二酯、二硬脂酸酰脂酰乙醇胺多臂聚乙二醇或二硬脂酸酰脂酰乙醇胺树状聚乙二醇。

该系列脂质体注射剂的制备工艺包含以下步骤：

1）脂相冻干：将大豆卵磷脂或氢化大豆卵磷脂/胆固醇/聚乙二醇化脂溶解于乙醇/叔丁醇混合溶剂中，冻干，除去有机溶剂，得到疏松的脂相混合物a1，乙醇与叔丁醇的体积比大于0，小于等于1:9；

2）脂相成膜：将大豆卵磷脂或氢化大豆卵磷脂/胆固醇/聚乙二醇化脂溶解于乙醇或氯仿/甲醇混合溶剂中，减压旋转蒸发成膜a2；其中氯仿/甲醇的体积比大于5，小于10；

3）脂相水化：将注射用水加到冻干后的脂相混合物a1中，在35~70⁰C的水浴中保温振荡，得到脂质体混悬液b1; 或将注射用水加到脂相薄膜a2中，在35~70⁰C的水浴中旋转容器进行水化，得到有少量团块的脂质体b2；

4）脂质体反复冻融：将b2反复冻融5次，得无团块的脂质体b3；

5）脂质体匀质：将b1和b3用微射流或高压均质机减小脂质体粒径，操作压力为5000~30000psi，得到平均粒度为70~150nm的脂质体。

本发明的优点

采用脂相冻干法和薄膜分散法制备了2个3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物脂质体注射剂，所得脂质体中各种药物的溶解度均较其在水中的溶解度增加了3个数量级以上，该剂型显著提高了这2个化合物在水中的溶解度，且粒径小，粒径分布窄，经静脉给药后初始血药浓度较口服制剂提高了约30倍，是该系列化合物理想的剂型。

具体实施方式

下面所述实施例的目的是为了更好地说明本发明，但不应对本发明的范围构成限定。

第一部分：冻融对薄膜分散法制备脂质体的影响

实施例1

将化合物1或化合物2/大豆卵磷脂/胆固醇/聚乙二醇化二硬脂酸酰脂酰乙醇胺（下简称PEG-DSPE）按照（0.5:5:1:1）的重量比溶解于乙醇中，减压旋转蒸发成膜，加入注射用水在37⁰C的水浴中旋转容器进行水化，得到有少量团块的脂质体，反复冻融5次后得到脂质体混悬液,用高压均质机减小粒径，得到粒度为70~150nm的脂质体。

实施例2

将化合物1或化合物2/大豆卵磷脂/胆固醇/PEG-DSPE按照（0.5:5:1:1）的重量比溶解于乙醇中，减压旋转蒸发成膜，加入注射用水在37⁰C的水浴中旋转容器进行水化，得到有少量团块的脂质体混悬液。

经过反复冻融后的样品无肉眼可见的团块，而不经冻融的样品有少量团块。

第二部分：不同脂质对包封率的影响

实施例3

将化合物1或化合物2/氢化大豆卵磷脂/胆固醇/PEG-DSPE按照（0.5:5:1:1）的重量比溶解于乙醇中，减压旋转蒸发成膜，加入注射用水在37⁰C的水浴中旋转容器进行水化，得到有少量团块的脂质体，反复冻融5次后得到脂质体混悬液,用高压均质机减小粒径，得到粒度为70~150nm的脂质体。

取脂质体液0.1 mL，加入乙醇1.9 mL，涡旋30秒使脂质体溶解，化合物被释放出来，12000 RPM高速离心后采用RP-HPLC法测定上清液中游离化合物，根据投药量即可算得包封率。精确称取冻干后的脂质体适量，扣除其中冻干保护剂的量，可计算得脂质体干重。用水溶解冻干的脂质体，取适量参考上述方法用乙醇消解释放化合物，测定得化合物的含量后根据脂质体干重计算出载药量。色谱条件：反相C18柱（5 mm×250 mm），甲醇-水（75-25，体积比）为流动相，流速1 mL/min,进样量20 μL，检测波长297nm。

比较实施例1和实施例3所得的脂质体的包封率，每组实验重复三次，所得包封率无显著性差异（p﹤0.05）。从该结果可见，氢化大豆卵磷脂和大豆卵磷脂对化合物1和化合物2包封率无明显影响。

第三部分：脂质体在小鼠体内的药代动力学

实施例4

将化合物1或化合物2/大豆卵磷脂/胆固醇按照（0.5:5:1）的重量比溶解于乙醇中，减压旋转蒸发成膜，加入注射用水在37⁰C的水浴中旋转容器进行水化，得到有少量团块的脂质体，反复冻融5次后得到脂质体混悬液,用高压均质机减小粒径，得到粒度为70~150nm的脂质体。

由于3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物在水中不溶，故制成含1%羧甲基纤维素钠的混悬剂对大鼠进行灌胃，给药剂量为100mg/kg。另外，化合物脂质体经大鼠颈静脉给药，给药剂量为8mg/kg。给药后于15，30，45，60，90和120min从大鼠颈静脉采血，取血用肝素抗凝，离心分离血浆0.1 mL。在血浆样品中加入乙醇0.9mL,漩涡混合后，13000RPM离心10分钟取上清液0.8 mL移至离心管，在室温下用氮气吹干。残留物用100 μL甲醇溶解后，用RP-HPLC测定。色谱条件同第二部分。

表1：化合物1羧甲基纤维素钠混悬剂与其脂质体不同时间点血药浓度对比。

Figure 2011101166814100002DEST_PATH_IMAGE002

表2：化合物2羧甲基纤维素钠混悬剂和其脂质体不同时间点血药浓度对比。

Figure 2011101166814100002DEST_PATH_IMAGE003

上述结果表明化合物1和化合物2大剂量口服给药后，吸收差，血药浓度低。采用脂质体静脉给药后，初始血药浓度提高了约30倍，有望提高药效。

表3：实施例1为含有PEG-DSPE的脂质体，实施例4为不含PEG-DSPE的脂质体，两者分别经大鼠颈静脉给药后不同时间点血药浓度对比

Figure 2011101166814100002DEST_PATH_IMAGE004

。

Claims

1.3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物脂质体注射剂，其特征在于其组分的重量百分含量为：

化合物1（或2） 0.01~0.6%

大豆卵磷脂或氢化大豆卵磷脂 0.01~5%

胆固醇 0.001~1.5%

聚乙二醇化脂 0~1.5%

其余为注射用水，

2.根据权利要求1所述的3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物脂质体注射剂，其特征在于其中各组分的重量百分含量为：

化合物1（或2） 0.1~0.5%

大豆卵磷脂或氢化大豆卵磷脂 0.5~3%

胆固醇 0.2~0.5%

聚乙二醇化脂 0~0.8%

其余为注射用水。

3.根据权利要求1所述的3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物脂质体注射剂，其特征在于聚乙二醇化脂选自聚乙二醇化二硬脂酸酰脂酰乙醇胺、聚乙二醇-胆固醇、聚乙二醇-甘油二酯、二硬脂酸酰脂酰乙醇胺多臂聚乙二醇或二硬脂酸酰脂酰乙醇胺树状聚乙二醇。

4.根据权利要求1所述的3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物脂质体注射剂的制备工艺，其特征在于包含以下步骤：

1)脂相冻干：将大豆卵磷脂或氢化大豆卵磷脂/胆固醇/聚乙二醇化脂溶于乙醇/叔丁醇混合溶剂中，冻干，除去有机溶剂，得到疏松的脂相混合物a1；

2)脂相成膜：将大豆卵磷脂或氢化大豆卵磷脂/胆固醇/聚乙二醇化脂溶于有机溶剂中，减压旋转蒸发形成薄膜a2；

3)脂相水化：注射用水加到冻干后脂相混合物a1，在35~70⁰C的水浴中保温振荡进行水化，得到粒度不均匀的脂质体b1；或将注射用水加到脂相薄膜a2中，在35~70⁰C的水浴中旋转容器进行水化，得到有少量团块的脂质体b2;

4)脂质体反复冻融：将b2反复冻融数次，得无团块的脂质体b3;

5)脂质体匀质：将b1和b3用微射流或高压均质机匀质，控制操作压力在3000~30000psi，得平均粒径在70~150nm的脂质体注射剂。

5.根据权利要求4所述的3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物脂质体，其特征在于步骤1）中乙醇与叔丁醇的体积比大于0，小于等于1:9。

6.根据权利要求4所述3-氨基-6-芳基-噻吩并[2,3-b]吡啶-2-甲酰胺类衍生物脂质体，其特征在于步骤2）中所用有机溶剂为乙醇或氯仿/甲醇混合溶剂，氯仿与甲醇的体积比大于5，小于10。