CN108309983B

CN108309983B - 卡马西平在制备治疗黄病毒属病毒感染的药物中的应用

Info

Publication number: CN108309983B
Application number: CN201810039105.6A
Authority: CN
Inventors: 张红雨; 吕博敏; 全源; 张青叶; 黄清
Original assignee: Wuhan Baiyao Association Science And Technology Co Ltd
Current assignee: Wuhan Baiyao Association Science And Technology Co Ltd
Priority date: 2018-01-15
Filing date: 2018-01-15
Publication date: 2019-11-15
Anticipated expiration: 2038-01-15
Also published as: CN108309983A

Abstract

本发明公开了卡马西平在制备治疗黄病毒属病毒感染的药物中的应用，具体地，卡马西平在制备治疗流行性日本乙型脑炎病毒感染的药物、寨卡病毒感染的药物、西尼罗病毒感染的药物、黄热病毒感染的药物以及1‑4型登革病毒感染的药物中的应用。卡马西平能够有效降低感染日本乙型脑炎病毒小鼠的死亡率；此外，卡马西平已在临床中长时间应用，且安全性良好。因此，可进一步地开发卡马西平作为治疗黄病毒属病毒感染的药物，为临床用药提供新的选择。

Description

卡马西平在制备治疗黄病毒属病毒感染的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及卡马西平在制备治疗黄病毒属病毒感染的药物中的应用。

背景技术

黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(Flavivirus)为有包膜的单股正链RNA病毒，该类病毒通过吸血的节肢动物(蚊、蜱、白蛉等)传播而引起感染。黄病毒属病毒包括约70种病毒，其中大多数为人兽共患传染病的病原体，如日本乙型脑炎病毒(Japaneseencephalitis virus，JEV)、西尼罗病毒(West Nile virus，WNV)、黄热病毒(Yellowfevervirus，YFV)、登革病毒(Dengue virus，DENV)1-4型、寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)等。

黄病毒属病毒的基因为单股正链RNA，长约11kb，其5’端和3’端各有一段非编码区(UTR)，5’端有一个甲基化帽子结构，3’端则不含多聚腺苷酸(polyA)尾。该类病毒能够编码十种蛋白，包括病毒颗粒的结构蛋白(C、M/prM和E)和非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。成熟的黄病毒直径40-60nm，核酸位于病毒的中心，衣壳蛋白包绕着核酸，排列成对称的二十面体结构，衣壳外面为病毒包膜。

黄病毒属病毒感染可引起发烧、头痛、关节痛、结膜炎和皮疹瘙痒等症状，严重时还会引起感染者休克，并导致死亡。近年来，随着全球气候的变化，黄病毒属病毒的分布在全球范围内逐步扩大，同时，由于病毒基因某些位点的突变使其适应新的传播媒介，黄病毒属病毒的感染呈现出进一步蔓延的趋势。目前，缺乏针对黄病毒属病毒的疫苗，研发抗黄病毒属病毒感染药物的需求日益迫切。

卡马西平(Carbamazepine)的CA登记号为298-46-4，其化学名为5H-二苯并[b,f]氮杂卓-5-甲酰胺，分子式为C₁₅H₁₂N₂O，分子量为236.27。小鼠口服卡马西平的LD50为3750mg/kg，大鼠为4025mg/kg。卡马西平可透过血脑屏障，在临床上广泛应用于治疗癫痫、三叉神经痛和双相情感障碍等疾病，其主要药理作用包括阻滞各种可兴奋细胞膜上的Na⁺通道、抑制T-型钙通道、增强中枢去甲肾上腺素能神经的活性和促进抗利尿激素(ADH)的分泌或者提高效应器对ADH的敏感性。目前，尚无将卡马西平用于治疗黄病毒属病毒感染的先例。

发明内容

针对目前临床上对黄病毒属病毒感染治疗药物的需求，本发明提供了卡马西平在制备治疗黄病毒属病毒感染的药物中的应用。

为实现上述目的，本发明所采用的技术方案为：

卡马西平在制备治疗黄病毒属病毒感染的药物中的应用。

发明人研究发现，卡马西平能够有效治疗以日本乙型脑炎病毒为代表的黄病毒属病毒感染，可用于制备治疗黄病毒属病毒感染的药物，为临床用药提供了新的选择。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述黄病毒属病毒包括日本乙型脑炎病毒、登革病毒、寨卡病毒、黄热病毒或西尼罗病毒。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述登革病毒包括DENV-1病毒、DENV-2病毒、DENV-3病毒和DENV-4病毒。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述卡马西平还包括药学上可接受的载体或稀释剂。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述载体为葡萄糖、麦芽糖糊精、甘油、甘露醇、山梨醇、糊精、乳糖、明胶、硫酸钙、硬脂酸钠、吐温、琼脂、碳酸钙、淀粉类或其衍生物、纤维素或其衍生物中的至少一种。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述稀释剂为水、林格氏液或缓冲盐水。

作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射液。

本发明还提供了5H-二苯并[b,f]氮杂卓-5-甲酰胺衍生物、其药学上可接受的盐或它们的代谢物在制备治疗黄病毒属病毒感染的药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

卡马西平能够有效降低感染日本乙型脑炎病毒小鼠的死亡率，对日本乙型脑炎等黄病毒属病毒感染具有一定的治疗效果，且卡马西平已在临床中长时间应用，安全性良好。因此，可进一步地开发卡马西平作为治疗黄病毒属病毒感染的药物，为临床用药提供了新的选择。

附图说明

图1是卡马西平对JEV感染小鼠存活率的影响。

图2是卡马西平对JEV感染小鼠脑组织病理症状的影响。

具体实施方式

为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

基于本实验室的药物发现新技术，以new-score所得脑炎致病基因的打分、以score和new-score所得西尼罗热致病基因的打分和以score所得病毒性出血热的致病基因的打分为初始热度，结合PPI网络，基于HotNet2算法构建致病基因互作网络(专利申请号：2017109173122)。从构建的致病基因互作网络出发，通过查询药物-靶标数据库找到靶向同一子网络的多靶标药物，初步获得对同时日本乙型脑炎病毒、西尼罗病毒以及登革病毒都有潜在治疗活性的药物——卡马西平，其有效药物剂量应该根据病程的严重程度、施药途径和其他相关因素决定。

卡马西平的化学名为5H-二苯并[b,f]氮杂卓-5-甲酰胺，其化学结构式如式Ⅰ所示。

卡马西平对黄病毒属病毒感染的治疗机理

卡马西平可靶向多种靶标，其中包括TNF-α、HLA-A、HLA-B等；其中TNF-α被认为是黄病毒属病毒感染过程中主要的神经毒性因子。可溶性TNF-α与其受体TNFR结合后会触发下游一系列信号转导，通过该通路激活下游信号分子引起细胞凋亡。有文献报道，JEV感染所导致的病症越严重，脑脊液与血清中的TNF-α水平越高。而TNF-α与其他炎症因子以及趋化因子导致神经系统的损伤在JEV与HIV感染的案例中也均有报道。另外，感染登革病毒、寨卡病毒病人体内也可检测到过量表达的TNF-α；TNF-α还可刺激细胞间粘附分子和血管细胞粘附分子在神经血管内皮细胞上的表达，导致白细胞向CNS聚集；同时TNF-α也被认为有可能导致血脑屏障通透性的改变从而促进病毒对CNS的入侵。因此，TNF-α在黄病毒属病毒感染过程中起着关键作用，靶向TNF-α的卡马西平对黄病毒属病毒的感染有潜在治疗效果。

基于以上研究内容，以日本乙型脑炎病毒为例，通过建立感染日本乙型脑炎病毒的小鼠动物模型，对用药治疗后小鼠的存活率、临床症状及脑组织病理切片进行分析，同时以健康小鼠、感染日本乙型脑炎病毒后未给药治疗的小鼠作为参比，通过数据统计分析，验证卡马西平对黄病毒属病毒感染的药物活性。

实施例1卡马西平在治疗感染日本乙型脑炎病毒的小鼠中的应用

一、感染日本乙型脑炎病毒小鼠模型的构建

1、实验材料

(1)实验动物：四周龄Balb/c雌鼠。

(2)毒株：JEV P3株

(3)其他试剂：

1)0.01M PBS缓冲液：称取NaH₂PO₄ 0.593g，Na₂HPO₄ 5.802g，NaCl 17.0g，去离子水(ddH₂O)定容至2L，室温保存备用。

2)DMEM基础培养基：DMEM粉末一瓶，称取NaHCO₃ 3.7g，HEPES5.95g，加入800mLddH₂O，充分搅拌溶解，定容至1000mL，0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存备用。

2、实验步骤

小鼠腹腔注射10⁶PFU乙脑病毒，对照组小鼠腹腔注射同等剂量的DMEM培养基。在随后的时间里，观察并记录小鼠的临床症状及死亡数量。

3、实验结果

在攻毒后的5-14天里，部分感染日本乙型脑炎病毒的小鼠死亡，且表现出瘫痪、划水、全身颤抖等临床症状。在感染后第6天症状最为严重，而在感染23天后基本恢复。

二、卡马西平对感染日本乙型脑炎病毒的小鼠的治疗效果评价

1、实验药品

卡马西平，性状：白色或类白色结晶性粉末，使用方法：使用1％DMSO+30％聚乙二醇+1％Tween 80溶解，口服给药。

2、具体实验步骤

(1)动物实验分组与收样

四周龄Balb/c雌鼠分为四组：PBS组(空白对照组，20只)、卡马西平组(药物参照组，20只)、JEV组(P3株感染组，20只)、JEV+卡马西平组(P3株感染治疗组，20只)。

小鼠腹腔注射10⁶PFU乙脑病毒，在接毒第1、2、4、6、8、10、12天分别尾口服25mg/kg的卡马西平。观察并记录小鼠的死亡数量。

在病毒感染后第6天与第23天收样。每组3只取脑组织匀浆，另取2只进行石蜡包埋，剩余15只用于统计死亡率。

(2)脑组织固定与包埋，HE染色检测小鼠脑组织的病理症状

用颈椎脱位法处死小鼠，置70％乙醇中浸泡3-5min，取出后消毒颈背处皮肤，无菌取出脑组织，于基础DMEM中清洗一次，沿正中矢状面垂直横切，放入4％多聚甲醛中固定48h。流水冲洗24h，修块并用梯度酒精脱水，水杨酸甲酯处理透化2h，入蜡包埋。制作石蜡切片(4μm)，并进行HE染色。将制备成功的鼠脑切片依次进行脱蜡、苏木精染色，用50％、75％、80％的酒精脱水后用伊红染色，再分别用95％、100％的酒精对切片进行漂洗，最后用二甲苯做切片透明处理，用中性树胶封存。

3、实验结果

(1)卡马西平对JEV感染小鼠存活率的影响。

攻毒实验持续至感染后23天，存活小鼠基本无明显的神经症状。在感染5-10天，JEV组死亡数量急剧上升，直到第15天才未出现死亡小鼠，最终死亡率达到60％。而JEV+卡马西平组小鼠死亡数量明显少于JEV组，最终死亡率为33.33％，说明卡马西平可有效降低JEV感染引起的小鼠死亡。PBS组与卡马西平组未见任何死亡，说明卡马西平对小鼠的健康无影响。

(2)卡马西平对JEV感染小鼠脑组织病变的影响。

通过对小鼠脑组织切片进行比对分析，在病毒感染后第6天，JEV组脑膜明显有大量炎性细胞聚集，且皮质细胞层紊乱，此外，在其脑皮质还可观察到大量血管袖套、胶质细胞结节、神经元空泡样坏死等现象。同一时间点JEV+卡马西平组的病理变化有所轻缓，而PBS组与卡马西平组都没有明显病变。

实施例2基于黄病毒属病毒感染个性化用药方法的药效预测实验

(1)获取感染日本乙型脑炎病毒病人、感染西尼罗病毒病人和健康人群的基因表达数据。

从NCBI GEO Dataset中下载了日本乙型脑炎病毒病人、感染西尼罗病毒病人及对照组芯片数据(series：GSE57647，GSE43190),得到共6个感染日本乙型脑炎病毒病人和感染18个西尼罗病毒病人的基因表达数据。

(2)计算黄病毒属病毒感染病人的关键基因列表

基于(1)下载的24个芯片数据中的基因名称和从STRING数据库下载的基因互作信息，构建基因互作矩阵，并且计算每个病人每个基因的差异倍数值作为初始重要性输入GeneRank算法计算感染黄病毒属病毒病人和正常人群的重要基因排序列表。最后，将该病人中的所有基因按照其重要性降序排列。

(3)收集已有文献报道的对黄病毒具有治疗活性的药物及其靶标信息

查找药物靶标数据库(包含DGIdb:http://dgidb.genome.wustl.edu/、DrugBank:http://www.drugbank.ca/和TTD:http://bidd.nus.edu.sg/group/ttd/ttd.asp)，得到数据库中所包含的已有文献报道的对黄病毒具有治疗活性的药物以及其对应的靶标数据。

(4)通过统计分析查看该药物的靶基因是否显著地靶向所述关键基因列表

通过Kolmogorov-Smirnov检验来查看该药物的靶基因是否显著地分布在步骤(2)得到的重要基因列表的靠前部分，也就是查看该药物的靶基因是否靶向了该病人发病过程中的那些最重要的基因。如果该统计的P值越小，就说明该药物对于此病人是越合适的药物。

(5)预测性能评估：对收集的已有文献报道的对黄病毒具有治疗活性的药物有效率进行统计分析

对所收集的已有文献报道的对黄病毒具有治疗活性的药物(共8个)的Kolmogorov-Smirnov检验所得的P值进行统计分析。我们通过Wilcoxon秩和检验，得到卡马西平对日本乙型脑炎病毒感染KS检验P值的平均值为0.0002(数据结果见表1)，对西尼罗病毒感染KS检验P值的平均值为5.03e-07(数据结果见表2)，由此可见，卡马西平的KS检验P值的平均值明显低于于文献报道中的日本乙型脑炎病毒和西尼罗病毒感染的有效药物，可以认为卡马西平的药物预测疗效更好。

表1

表2

综上，卡马西平对日本乙型脑炎病毒感染具有一定的治疗效果，且通过黄病毒属感染个性化用药方法预测了卡马西平的药物治疗效果，证实了卡马西平对黄病毒属病毒感染的药物活性。此外，卡马西平已在癫痫、三叉神经痛和双相情感障碍等疾病临床中长时间应用，安全性良好。因此，可进一步地开发卡马西平为治疗黄病毒属病毒感染的药物，为临床用药提供新的选择。由此可见，本专利涉及的卡马西平对于黄病毒属病毒感染确实有一定的治疗效果。

本发明的药物可进一步将卡马西平替换成其它的5H-二苯并[b,f]氮杂卓-5-甲酰胺衍生物、其药学上可接受的盐或它们的代谢物。

本发明的药物可进一步包括一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂，这些载体将适当配制以便于给药，药学上可接受的载体或稀释剂可以为水、林格氏液、缓冲盐水、葡萄糖、麦芽糖糊精、甘油、甘露醇、山梨醇、糊精、乳糖、明胶、硫酸钙、硬脂酸钠、滑石粉、高岭土、吐温、琼脂、碳酸钙、表面活性剂、淀粉类或其衍生物、纤维素或其衍生物中的至少一种，其中，载体或稀释剂的含量可根据临床用药效果进行常规选择调整。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.卡马西平在制备治疗日本乙型脑炎病毒感染的药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物还包括药学上可接受的载体或稀释剂。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述载体为葡萄糖、麦芽糖糊精、甘油、甘露醇、山梨醇、糊精、乳糖、明胶、硫酸钙、硬脂酸钠、吐温、琼脂、碳酸钙、淀粉类或其衍生物、纤维素或其衍生物中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述稀释剂为水、林格氏液或缓冲盐水。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、口服液、缓释制剂、控释制剂、纳米制剂或注射液。