CN112451513A - 丹酚酸a在制备防治可见光性视网膜损伤药物中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了丹酚酸A在制备防治可见光性视网膜损伤药物中的用途。利用蓝光损伤HRPE‑19和BN大鼠，建立在体和体外模型，评价丹酚酸A对防治视网膜光损伤的效果。结果显示，丹酚酸A能抑制视网膜细胞经蓝光照射后的凋亡和紧密连接蛋白表达降低，并能显著改善大鼠视网膜病理损伤，表明丹酚酸A对视网膜光损伤具有显著的保护作用，其作用机制可能是丹酚酸A提高了紧密连接蛋白的表达。本项发明为丹酚酸A用于防治视网膜光损伤的制备提供了新用途。

Description

丹酚酸A在制备防治可见光性视网膜损伤药物中的用途

技术领域

本发明属于中药领域，具体是一种丹酚酸A在制备防治可见光性视网膜损伤药物中的用途。

背景技术

先前的研究认为，紫外线是引起视网膜光损伤的主要光线，但人类眼球的某些特定结构对紫外线有较强的吸收作用，如角膜可以吸收远紫外光线，而晶体则可以吸收近紫外光线，且人们在阳光强烈的条件下，往往会佩戴防紫外的太阳眼镜，因此到达视网膜结构的紫外线量非常有限。但是，可见光和红外光可直达视网膜，且人们经常忽略对可见光的防护，因此，视网膜部位的光损伤主要是由可见光波段范围的光线引起的。

蓝光损伤是在现在LED照明技术和电子产品显示屏大规模普及后提出的一种区别与自然条件下的光损伤，在原理上属于可见光损伤的一种。由于LED等等冷光源的产生，目前常用的照明设备和电子显示屏等很大一部分比例都是LED系统。LED灯与白炽灯不同，其发射光谱是不连续的，而且蓝光强度在发射光谱中的比例是最高的，因此，现代人们受到蓝光的刺激远高于自然界中的蓝光比例。视网膜对蓝光敏感性较高，故蓝光对视网膜产生的光化损伤作用最强，因此许多学者认为蓝光对视网膜最具有危害性。

可见光主要对视网膜色素上皮细胞造成损伤，是年龄相关性黄斑变性(AMD)的一种重要病因，通常引起干性AMD。干性AMD目前仍未有有效的治疗方案，也未有获批的药物。与湿性AMD不同，干性AMD病情较轻，但若不提早预防和控制，也会走向晚期AMD，导致失明。细胞间连接的缺乏在AMD的发展中也发挥了重要作用。视网膜细胞间连接主要包括紧密连接、粘附连接和缝隙连接。ZO-1蛋白在维持紧密连接的功能中发挥着重要作用，当视网膜收到可将光性损伤时，ZO-1表达会显著下降，导致细胞间通透性增加，紧密连接破坏。

丹参是活血化瘀之要药，《景岳全书》中提到，丹参可“生新血，行宿血，经脉不匀可调，疗眼疼”。其中丹酚酸A(Salvianolic acid A,SAA)是丹参中重要的水溶性多酚类药效物质，具有广泛的药理作用。SAA在保护心血管功能、抗肺纤维化、抗糖尿病肾脏疾病以及溃疡性结肠炎的治疗中，均有显著的改善作用，主要依赖SAA具有强大的抗氧化、抗炎作用。此外，SAA对糖尿病大鼠视网膜病变有显著的改善作用，主要体现在减少糖尿病引起的白内障、视网膜水肿、维持血-视网膜屏障正常通透性和减少新生血管生成。然而，SAA对于可见光引起的视网膜损伤的保护作用和作用机制均未见报道。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种丹酚酸A在制备防治可见光性视网膜损伤药物中的用途。

本发明的技术方案如下：

丹酚酸A在制备防治可见光性视网膜损伤药物中的用途。

所述的可见光性视网膜损伤为可见光损伤引起的年龄相关性黄斑变性，包括但不限于视网膜黄斑水肿、视网膜脉络膜萎缩、玻璃膜疣形成、视网膜色素上皮脱离和黄斑内或者周围的视网膜下出血。

所述的用途，丹酚酸A或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体组成临床可接受的制剂。

所述载体包括药学领域的常规稀释剂，赋形剂，填充剂，粘合剂，湿润剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体，润滑剂等，必要时还可以加入香剂，甜味剂等。本发明药物可以制成片剂，粉剂，粒剂，胶囊，擦剂，滴眼液，眼膏，凝胶，口服液及注射用药等多种形式，上述各剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明的SAA结构式，见图1。

分子式：C26H22O10

分子量：494.45

申请人使用LED蓝光灯泡照射HRPE-19细胞与BN大鼠，建立视网膜可见光损伤在体与离体模型，观察SAA对可见光性视网膜损伤的干预作用。所述的可见光性视网膜损伤选自可见光损伤引起的视网膜色素上皮细胞凋亡，视网膜黄斑变性和视网膜水肿。

本发明利用蓝光损伤HRPE-19和BN大鼠，建立在体和体外模型，评价丹酚酸A对防治视网膜光损伤的效果。结果显示，丹酚酸A能抑制视网膜细胞经蓝光照射后的凋亡和紧密连接蛋白表达降低，并能显著改善大鼠视网膜病理损伤，表明丹酚酸A对视网膜光损伤具有显著的保护作用，其作用机制可能是丹酚酸A提高了紧密连接蛋白的表达。本项发明为丹酚酸A用于防治视网膜光损伤的制备提供了新用途。

附图说明

图1为SAA分子式；

图2为SAA对蓝光损伤HRPE-19细胞活性的影响；

图3为SAA对蓝光损伤HRPE-19细胞凋亡的影响；

图4为SAA对蓝光损伤HRPE-19细胞紧密连接蛋白的影响；

图5为SAA对蓝光损伤大鼠眼球病理的影响；

图6为SAA对蓝光损伤大鼠视网膜紧密连接蛋白表达的影响。

具体实施方式

实施例1：

1.材料：

丹酚酸A钠粉末，人视网膜色素上皮细胞系(HRPE-19细胞)，RPMI 1640培养基，胎牛血清，科锐LED蓝光灯珠(功率3w，蓝光波长465nm)。

2.实验方法：

2.1蓝光损伤模型建立和药物干预

在LED铝基板上每个灯珠的位置上加上导热硅胶，然后将LED灯珠放置到LED灯板上，用电烙铁将锡丝加热至融化，然后渗入并填充LED灯珠的连接处间隙，将LED灯珠焊接到铝基板的电路上。将LED铝基板与驱动电源连接后，通过一根开关线连接到培养箱中紫外灯座，同时去掉金属支架，用玻璃板作为支架，避免金属支架阻碍蓝光照射。

取传代4代～8代的HRPE-19细胞进行铺板，铺在底部透明、四周为黑色的细胞培养皿中，设置空白对照组、单独蓝光照射组和SAA各剂量干预组。空白对照组的区域用锡箔纸包裹，其余各孔不包裹。

提前在SAA干预组的细胞培养孔中加入不同浓度的SAA，空白对照孔和单独蓝光照射孔中加入等体积的溶剂，预培养12小时。随后将培养板转移到蓝光装置的培养箱中，光照强度为2500lux，光照损伤时间为24h。

2.2观察指标

2.2.1SAA对蓝光损伤HRPE-19细胞活性的影响

利用CCK8试剂盒检测SAA对蓝光损伤HRPE-19细胞活性的影响，重复3次试验。

2.2.2SAA对蓝光损伤HRPE-19细胞凋亡的影响

将消化下来的细胞入离心管，使用AnnexinV-FITC与PI试剂盒，检测各组细胞的凋亡情况，具体步骤按说明书操作。

2.2.3SAA对蓝光损伤HRPE-19细胞紧密连接蛋白ZO-1表达的影响

使用细胞免疫荧光染色法，标记HRPE-19细胞。共聚焦荧光显微镜下拍照，红色为ZO-1，蓝色为细胞核。

3结果

3.1SAA对蓝光损伤HRPE-19细胞活性的影响

在正常培养的HRPE-19细胞中，SAA在0.25μg/mL～32μg/mL浓度区间对细胞增殖活性无显著抑制作用(P>0.05)，当SAA浓度达到64μg/mL时，细胞增殖显著受到抑制(P<0.05)，可见，SAA在32μg/mL浓度以内时，对HRPE-19细胞增殖无明显影响。

蓝光损伤后，HRPE-19细胞增殖显著受到抑制(P<0.01)，给与不同浓度的SAA后，细胞损伤得到改善，在4μg/mL～32μg/mL浓度区间时，SAA能显著提高细胞增殖，降低蓝光对HRPE-19细胞的损伤。见图2。

3.2SAA对蓝光损伤HRPE-19细胞凋亡的影响

空白对照组HRPE-19细胞早期凋亡率为0.17％，晚期凋亡率为0.47％；蓝光照射组HRPE-19细胞早期凋亡率为1.69％，晚期凋亡率为4.41％；各剂量SAA预保护后，HRPE-19细胞经蓝光照射后的凋亡率有不同程度的下降，其中，2.5μg/mL SAA预保护后，经蓝光照射后HRPE-19细胞早期凋亡率为0.84％，晚期凋亡率为1.20％；5μg/mL SAA预保护的早期凋亡率为0.51％，晚期凋亡率为0.84％；10μg/mL SAA预保护的早期凋亡率为0.35％，晚期凋亡率为0.51％。见图3。

3.3SAA对蓝光损伤HRPE-19细胞紧密连接蛋白(ZO-1)表达的影响

经细胞免疫荧光抗体标记后的HRPE-19细胞表达的ZO-1蛋白发红色荧光，荧光强度越大，说明细胞表达ZO-1的水平越高。激光共聚焦显微镜下可见，与空白对照组比较，蓝光照射损伤的HRPE-19细胞表达红色荧光降低，说明ZO-1蛋白表达明显下降；与蓝光照射组比较，10mg/mL SAA预保护的HRPE-19细胞表达红色荧光增强，表明ZO-1蛋白表达上升。见图4。

实施例2：

1.材料：

丹酚酸A钠粉末，BN大鼠，科锐LED蓝光灯珠(功率3w，蓝光波长465nm)，HM335E半自动石蜡切片机(德国Microm公司)；Nana Zoomer 2.0RS数字切片扫描设备(日本滨松公司)；Step One Plus实时荧光定量PCR仪(美国Thermo Fisher公司)，自动染色机(德国Leica公司)。

2.实验方法：

2.1蓝光损伤大鼠模型建立和药物干预

取7～8周龄雄性BN大鼠24只，饲喂普通全价营养饲料，适应性饲养1周后，将大鼠随机分为正常组、蓝光损伤组和蓝光损伤+SAA组。正常组大鼠不做处理，蓝光损伤组和蓝光损伤+SAA组大鼠连续7天，每天照射6h蓝光，光照强度为2500lux，同时，蓝光损伤+SAA组大鼠连续7天在眼睛中滴入等渗的10mg/mL SAA生理盐水溶液，蓝光损伤组大鼠滴入等量生理盐水。

2.2SAA对蓝光损伤大鼠模型眼球病理的影响

给药7天后，各组大鼠施行安死术，立即小心地取下眼球，直接置于改良FAA固定液(70％酒精90mL，冰醋酸5mL，40％甲醛5mL混合配制而成)，固定24h后，以视乳头为中心，垂直于虹膜切开，固定、包埋、切片，切多张石蜡切片以备后续研究，取一张进行HE染色并观察。

2.3SAA对蓝光损伤大鼠模型视网膜紧密连接蛋白ZO-1基因表达的影响

大鼠眼球中取新鲜的视网膜组织，用于总RNA的提取。总RNA反转录成cDNA后待用，查找大鼠claudin-1、occludin和GAPDH mRNA序列，设计各引物序列如下：

ZO-1：F-CGCAGCCAGTTCAAACAAAGTTCC，

R-GCAACATCAGCAATCGGTCCAAAG；

GAPDH：F-ATGCTGGTGCCGAGTATGTTGTG，

R-GCAGAAGGTGCGGAGATGATGAC。

使用Step One Plus实时荧光定量PCR仪进行RT-PCR反应。反应体系为20μL，包括1μg cDNA溶液8μL，10μL TB green染料以及上下游引物个1μL。循环次数为40次，反应条件按试剂盒说明书推荐条件进行。GADPH内参基因内标对照，并以对照组大鼠视网膜作为参照，目的基因转录水平通过公式

计算。

3.结果

3.1SAA对蓝光损伤大鼠模型眼球病理的影响

利用HE病理染色可见，正常组大鼠视网膜各层细胞排列紧密，边界清晰；蓝光损伤组大鼠视网膜神经细胞核层区排列疏松、紊乱，视网膜丛区水肿，而蓝光损伤+SAA组大鼠视网膜病变有显著改善，细胞排列稍紧密，边界较清晰，见图5。

3.2SAA对蓝光损伤大鼠模型视网膜紧密连接蛋白ZO-1基因表达的影响

与正常对照组比较，蓝光损伤组大鼠视网膜组织中ZO-1mRNA表达水平显著降低(P<0.01)；与蓝光损伤组比较，蓝光损伤+SAA组大鼠视网膜组织ZO-1mRNA表达水平显著提高(P<0.05)，见图6。进一步证实了SAA能通过提高紧密连接蛋白的表达，改善可见光性的视网膜损伤。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.丹酚酸A在制备防治可见光性视网膜损伤药物中的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的可见光性视网膜损伤为可见光损伤引起的年龄相关性黄斑变性，包括但不限于视网膜黄斑水肿、视网膜脉络膜萎缩、玻璃膜疣形成、视网膜色素上皮脱离和黄斑内或者周围的视网膜下出血。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于丹酚酸A或其药学上可接受的盐与药学上可接受的载体组成临床可接受的制剂。

4.如权利要求3所述的用途，其特征在于所述载体包括药学领域的常规稀释剂，赋形剂，填充剂，粘合剂，湿润剂，崩解剂，吸收促进剂，表面活性剂，吸附载体，润滑剂，香剂，甜味剂，所述临床可接受的制剂包括片剂，粉剂，粒剂，胶囊，擦剂，滴眼液，眼膏，凝胶，口服液及注射用药，上述各剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

Images