JP3816504B2

JP3816504B2 - 新規化合物および医薬組成物

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Publication number: JP3816504B2
Application number: JP2004265620A
Authority: JP
Inventors: 田豊指; 巻祥浩三; 田明平黒; 林亮介小; 藤宏昭神; 坂浩資野; 井浩泰石; 守隆夫矢
Original assignee: 株式会社ヒロインターナショナル
Priority date: 2003-11-27
Filing date: 2004-09-13
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Description

本発明は、新規化合物、特に、キク科植物またはアカバナ科チョウジタデ属植物から抽出単離された新規化合物およびその用途に関する。また、本発明はキク科植物またはアカバナ科チョウジタデ属植物から抽出単離された既知物質の医薬用途に関する。

キク科植物またはアカバナ科チョウジタデ属植物、特に、ニトベギクは、皮膚病（水虫病）、肝炎、黄疸、膀胱炎を抑制する等の薬理効果を有するものとして知られている。例えば、特許第２６０９７８０号公報（特許文献１）および特願平８−１２７５３８号公報（特許文献２）によれば、ニトベギクを煎じたものまたはその抽出エキスを用いた糖尿病治療薬が提案されている。

また、ニトベギク抽出物から単離された化合物と同一の化合物が文献に開示されている。例えば、Raghwendra Pal, et al. Indian Journal of Chemistry, Section B: Organic Chemical Including Medicinal Chemistry, 14B, 259 - 262 (1976)（非特許文献１）、Raghwendra Pal, et al. Indian Journal of Chemistry, Section B: Organic Chemical Including Medicinal Chemistry, 15B, 208 - 211 (1977)（非特許文献２）、Schuster A, et al. Phytochemistry, 31, 3139 - 3141 (1992)（非特許文献３）には、これらの文献順に、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物：

において、Ｒ_１およびＲ_２が水酸基を示す化合物（以下、「ＴＤ−７」という）、Ｒ_１が水素原子を示しＲ_２が水酸基を示す化合物（以下、「ＴＤ−９」という）、Ｒ_１が水素原子を示しＲ_２がメトキシ基を示す化合物（以下、「ＴＤ−１０」という）が開示されている。

Paulo Sergio Pereira, et al. Phytochemistry, 45, 1445-1448 (1997)（非特許文献４）、C. Zdero et al. Phytochemistry, 26, 1999 - 2006 (1987)（非特許文献５）には、下記の一般式（ＩＩ）で表される化合物：

において、Ｒ_３およびＲ_４がメトキシ基を示す化合物（以下、「ＴＤ−１」という）、Ｒ_３がメトキシ基を示しＲ_４が水酸基を示す化合物（以下、「ＴＤ−４」という）が開示されている。

Baruah Nabin C., et al. Journal of Organic Chemistry, 44, 1831 - 1835 (1979)（非特許文献６）には、下記の一般式（IV）：

で表される化合物（以下、「ＴＤ−２」という）が開示されている。
Baruah Nabin C., et al. Journal of Organic Chemistry, 44, 1831 - 1835 (1979)（非特許文献７）には、下記の一般式（Ｖ）：

で表される化合物（以下、「ＴＤ−８」という）が開示されている。
Antonia G. Gonzalez, et al, Journal of Natural Products, 57, 400 - 402 (1994)（非特許文献８）では、（４Ｓ，５Ｒ）−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−［（１Ｅ，３Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｂｕｔｅｎｙｌ］−３，３，５−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｏｎｅ）が開示されている。

一方、Raghwendra Pal., et al. Journal of Phamaceutical Science, 65, 918 - 920 (1976)（非特許文献９）では、ニトベギクの抽出液からタギチニン(Tagitinin）Ａ〜Ｆが単離されたとの報告、およびこれら化合物中で、タギチニンＦのみがＰ３８８マウス白血病を腹腔内移植したマウスに対して延命効果を与えたとの報告がなされている。ここで、タギチニンＡはＴＤ−７に、タギチニンＣはＴＤ−２に、タギチニンＤはＴＤ−９に、タギチニンＥはＴＤ−８にそれぞれ相当するものであるが、タギチニンＦは本願発明におけるＴＤ−１〜１０に相当するものではない。

また、Raghwendra Pal, et al. Indian Journal of Chemistry, Section B: Organic Chemistry Including Medicinal Chemistry, 15B, 208-211 (1977)（非特許文献１０）には、下記の一般式（ＶＩ）：

で表される化合物（以下、「ＴＤ−１１」という）が開示されている。
Isao Agata, et al. Yakugaku zasshi, 101, 1067-1071 (1981)（非特許文献１１）には、下記の一般式（ＶＩＩ）：

で表される化合物（以下、「ＴＤ−１２」という）が開示されている。
S. Shibata, et al. Yakugaku Zasshi, 80, 620-624 (1960)（非特許文献１２）には、下記の一般式（ＶＩＩＩ）：

で表される化合物（以下、「ＴＤ−１３」という）が開示されている。
Christa Zdero, et al. Phytochemistry, 26, 1999-2006 (1987)（非特許文献１３）には、下記の一般式（ＩＸ）：

で表される化合物（以下、「ＴＤ−１４」という）が開示されている。

しかしながら、キク科植物またはアカバナ科チョウジタデ属植物中には未知化合物が存在しており、これら化合物の同定が切望されている。また、これら植物から抽出単離された既知、未知の化合物の新たな用途（薬理効果等）についても解明することが急務とされている。
特許２６０９７８０号公報特願平８−１２７５３８号公報 Raghwendra Pal, et al. Indian Journal of Chemistry, Section B: Organic Chemical Including Medicinal Chemistry, 14B, 259 - 262 (1976)。 Raghwendra Pal, et al. Indian Journal of Chemistry, Section B: Organic Chemical Including Medicinal Chemistry, 15B, 208 - 211 (1977)。 Schuster A, et al. Phytochemistry, 31, 3139 - 3141 (1992)。 Paulo Sergio Pereira, et al. Phytochemistry, 45, 1445 - 1448 (1997)。 C. Zdero et al. Phytochemistry, 26, 1999 - 2006 (1987)。 Raghwendra Pal, et al. Indian Journal of Chemistry, Section B: Organic Chemical Including Medicinal Chemistry, 15B, 208 - 211 (1977)。 Baruah Nabin C, et al. Journal of Organic Chemistry, 44, 1831 - 1835 (1979)。 Antonia G. Gonzalez, et al, Journal of Natural Products, 57, 400 - 402 (1994) Raghwendra Pal, et al. Journal of Phamaceutical Science, 65, 918 - 920 (1976)。 Raghwendra Pal, et al. Indian Journal of Chemistry, Section B: Organic Chemistry Including Medicinal Chemistry, 15B, 208-211 (1977) Isao Agata, et al. Yakugaku zasshi, 101, 1067-1071 (1981) S. Shibata, et al. Yakugaku Zasshi, 80, 620-624 (1960) Christa Zdero, et al. Phytochemistry, 26, 1999-2006 (1987)

発明の概要

本発明者等は、今般、抗癌作用を有する新規化合物と、既知化合物が特定の癌細胞に対して抗癌作用を有することを見出した。本発明はかかる知見によるものである。従って、本発明は、新規化合物と、特定の癌に対して抗癌性を有する既知化合物の医薬用途を提供するものである。
本発明の第一の態様
本発明の第一の態様によれば、新規化合物を提供でき、その化合物は下記の一般式で表されるものである。
下記の一般式（Ｉ）：

［上記式中、Ｒ_１は水酸基を示し、Ｒ_２はメトキシ基を示す］
で表される化合物（以下、「ＴＤ−３」という）。
下記の一般式（ＩＩ）：

［上記式中、Ｒ_３は水酸基を示し、Ｒ_４はメトキシ基を示す］
で表される化合物（以下、「ＴＤ−６」という）。
下記の一般式（III）：

［上記式中、３−ヒドロキシ−１−ブテニル基の３−ヒドロキシ基が３Ｓ立体配座とされてなるものである］
で表される、化合物（以下、「ＴＤ−５」という）。

本発明の第二の態様
本発明の第二の態様によれば、既知である下記の一般式で表される化合物の一種または二種以上を含んでなる抗急性骨髄性白血病剤を提供することができる。
上記した一般式（Ｉ）において、Ｒ_１およびＲ_２が水酸基を示す化合物（ＴＤ−７）、Ｒ_１が水素原子を示しＲ_２が水酸基を示す化合物（ＴＤ−９）、Ｒ_１が水素原子を示しＲ_２がメトキシ基を示す化合物（ＴＤ−１０）、
上記した一般式（ＩＩ）において、Ｒ_３およびＲ_４がメトキシ基を示す化合物（ＴＤ−１）、Ｒ_３がメトキシ基を示しＲ_４が水酸基を示す化合物（ＴＤ−４）、
下記の一般式（IV）：

で表される化合物（ＴＤ−２）、および
下記の一般式（Ｖ）：

で表される化合物（ＴＤ−８）。

本発明の第三の態様
本発明の第三の態様によれば、上記一般式（ＩＩ）において、Ｒ_３およびＲ_４がメトキシ基を示す化合物（ＴＤ−１）を有効成分とする、抗卵巣癌剤または抗前立腺癌剤を提供することができる。また、本発明にあっては、卵巣癌または前立腺癌の治療に使用される、抗卵巣癌剤または抗前立腺癌剤が提供される。

本発明の第四の態様
本発明の第四の態様によれば、ＴＤ−１〜ＴＤ−１４を単離する方法が提案される。

本発明の第一の態様
本発明の第一の態様で提供する新規化合物は、上記一般式（Ｉ）において、式中、Ｒ_１が水酸基を示しＲ_２がメトキシ基を示す化合物（ＴＤ−３）、上記一般式（ＩＩ）において、式中、Ｒ_３が水酸基を示しＲ_４がメトキシ基を示す化合物（ＴＤ−６）、上記一般式（III）で表される化合物（ＴＤ−５）である。
ＴＤ−５は、非特許文献８に記載された化合物と立体配座が異なる異性体化合物であり、具体的には、３−ヒドロキシ−１−ブテニル基のヒドロキシ基が３Ｓ立体配座とされてなる新規化合物である。

新規化合物の用途
本発明による新規化合物ＴＤ−３、ＴＤ−５およびＴＤ−６は、免疫力の向上、新陳代謝機能の活性化、病原菌に対する減殺および殺菌作用、過剰な炎症またはアレルギーの抑制効果、生活習慣病（糖尿病等）、免疫疾患の抑制および治癒等を付与する有効成分としての用途が考えられる。これら新規化合物の中でも、「ＴＤ−３」および「ＴＤ−６」は抗癌性が認められ、好ましくは白血病（より好ましくは急性骨髄性白血病）に抗癌性が認められる。従って、新規化合物の「ＴＤ−３」および「ＴＤ−６」は抗癌剤の有効成分とされ、この抗癌剤は癌治療に使用することができる。

新規化合物の「ＴＤ−３」および「ＴＤ−６」の化合物を癌療用の抗癌剤として使用するには、種々の投与形態に合わせて、これらの新規化合物を公知の医薬品用担体と組合せて製剤化することが可能である。例えば、皮下注射、静脈内注射、筋肉内注射、座薬などによる非経口投与、または錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒剤などによる経口投与の全身投与のほか、軟膏剤、ローション剤、座薬、エアゾール剤などの局所投与の形態を例示することができる。
投与量は、動物および人の年齢、体重、症状に合わせて適宜定めることができる。

本発明の第二の態様
本発明の第二の態様によれば、既知化合物の一種または二種以上を含んでなる抗急性骨髄性白血病剤を提供することができる。先に説明した通り、「ＴＤ−１」、「ＴＤ−２」、「ＴＤ−４」、「ＴＤ−７」、「ＴＤ−８」、「ＴＤ−９」、「ＴＤ−１０」は既知化合物である。これらの既知化合物は、動物または人（好ましい）の急性骨髄性白血病に対して優れた抑制および治療効果があることが今回の実験結果により明らかになったものである。従って、これらＴＤ化合物はこれらを有効成分として含む抗急性骨髄性白血病剤として利用することができる。医薬品としての薬剤および投与形態等は本発明の第一の態様で説明したのと同様であってよい。

本発明の第三の態様
本発明の第三の態様によれば、既知化合物「ＴＤ−１」を有効成分とする、抗卵巣癌剤または抗前立腺癌剤を提供することができる。ＴＤ−１は、動物または人（好ましい）の卵巣癌または前立腺癌に対して優れた抑制および治療効果があることが追加の実験結果により明らかになったものである。従って、ＴＤ−１はこれを有効成分として含む抗卵巣癌または抗前立腺癌剤として利用することができる。医薬品としての薬剤および投与形態等は本発明の第一の態様で説明したのと同様であってよい。

発明の第四の態様
１）ＴＤ−１〜１０を含んでなる組成物の製造方法（抽出）
本発明の第三の態様によれば、ＴＤ−１〜１０を含んでなる組成物を得る方法を提案することができ、その方法は、ＴＤ−１〜１０を含んでなる原料を用意し、
必要に応じて加熱下において、前記原料を溶媒で抽出し、
前記抽出物をカラムクロマトグラフィーに供給し、第１の低級アルコールと、第２の低級アルコールと、必要に応じて低級エステルとをこれらの順により溶媒抽出し、
前記第２の低級アルコール画分中に、ＴＤ−１〜１０を含んでなる組成物を得ることを含んでなるものである。

原料
原料は、ＴＤ−１〜１０（およびＴＤ−１１〜１４）を有意量含んでなるものであればいずれのものであってよいが、好ましくはキク科植物またはアカバナ科チョウジタデ属植物が挙げられる。
キク科植物の好ましい具体例としてはニトベギク〔（ティソニア・ディベルシフォリア（ヘムスル）エー、グレイ：「Ｔｉｔｈｏｎｉａｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉａ（Ｈｅｍｓｌ）Ａ，Ｇｒａｙ」、（同族としてティソニア・フラティコサ・キャンバイ・アンド・ローズ：「ＴｉｔｈｏｎｉａｆｒｕｔｉｃｏｓａＣａｎｂｙ＆Ｒｏｓｅ」）、（ティソニア・スカベリマア・ベンス：「ＴｉｔｈｏｎｉａｓｃａｂｅｒｒｉｍａＢｅｎｔｈ」）、（ティソニア・ロンゲラデイアタ（バートル）ブレイク：「Ｔｉｔｈｏｎｉａｌｏｎｇｅｒａｄｉａｔａ（Ｂｅｒｔｏｌ）Ｂｌａｋｅ」）〕等の約１０種類のもの、また、メキシコヒマワリ〔学名はティソニア・ロタンディフォリア（ミル）ブレイク：「Ｔｉｔｈｏｎｉａｒｏｔｕｎｄｉｆｏｌｉａ（Ｍｉｌｌ）Ｂｌａｋｅ〕）が挙げられる。
アカバナ科チョウジタデ属の植物の好ましい具体例としては、キダチキンバイ〔（ラドウィギア・オクトバルビス・ラーベン：「ＬｕｄｗｉｇｉａｏｃｔｏｖａｌｖｉｓＲａｖｅｎ」）、チョウジタデ（ラドウィギア・プロストラータ・ロックス：「ＬｕｄｗｉｇｉａｐｒｏｓｔｒａｔａＲｏｘｂ」）〕が挙げられる。

抽出手法
ＴＤ−１〜１０を含んでなる原料を抽出する際に使用する溶媒の具体例としては、炭素数１〜５の低級アルコール、好ましくはエタノールを使用する。
また、第１の低級アルコールと、第２の低級アルコールとは同一または異なるものであってよいが好ましくは別のものがよい。第１の低級アルコールと第２の低級アルコールとは炭素数１〜６、好ましくは１〜３のものを挙げることができる。本発明にあっては、第１の低級アルコールがメタノールであり、第２の低級アルコールがエタノールである組合せが好ましくは挙げられる。本発明の好ましい態様によれば、カラムクロマトグラフィーの抽出を迅速に行うために、第二の低級アルコールをカラム内に入れた後に、低級エステルを抽出溶媒として用いることが好ましい。溶媒抽出において、加熱してもよく、その加熱温度は−２０℃以上１００℃以下、好ましくは上限が８０℃以下であり、下限が１℃以上である。
使用するカラムクロマトグラフィーはカラムに多孔質充填剤（好ましくは合成吸着剤：例えば、三菱化学株式会社製「ダイヤイオンＨＰ−２０」）を充填したものが挙げられる。
溶媒抽出後、この溶媒を蒸発し濃縮させて抽出物としてＴＤ−１〜１０の化合物を含んでなる組成物とすることが好ましい。

１−１）ＴＤ−１〜１０の単離
本発明によれば、ＴＤ−１〜１０の化合物を単離する方法を提案することができ、その方法は、ＴＤ−１〜１０を含んでなる組成物を用意し、
前記組成物をクロマトグラフィーで分離することを複数回繰り返すことにより、
ＴＤ−１〜１０の化合物を得るものである。

本発明の好ましい態様によれば、ＴＤ−１〜１０を含んでなる組成物は先に説明したＴＤ−１〜１０を含んでなる組成物の製造方法で得たものを利用することが好ましい。分離溶媒は、水、アセトン、クロロホルム、炭素数５以下の低級アルコール、炭素数５以下の低級エステル、およびこれらの混合溶媒を使用することができる。使用するクロマトグラフィーは順相、逆相のものであってよく、充填剤として多孔質物質（好ましくはシリカゲル）を使用してよい。さらに、（高速）液体クロマトグラフィーを使用することができる。本発明にあっては、これらクロマトグラフィーの組合せによって、ＴＤ化合物を単離することが好ましい。

本発明によるＴＤ−１〜１０の化合物を単離する方法の具体例は、下記の方法が挙げられる。従って、カラム充填剤、クロマトグラフィー、抽出溶媒等は先のＴＤ化合物の単離方法で説明したのと同様であってよい。
１−２）ＴＤ−１〜１０を含む組成物の分画
本発明によれば、ＴＤ−１〜１０を含む組成物からＴＤ−１〜８を含む第１の組成物と、ＴＤ−９および１０を含む第２の組成物それぞれに分離する方法を提供することができ、その方法は、ＴＤ−１〜１０を含んでなる組成物を順相カラムクロマトグラフィー、次いで逆相カラムクロマトグラフィーで分離し、ＴＤ−１〜８を含む第１の組成物と、ＴＤ−９および１０を含む第２の組成物の二種に分離するものである。

本発明によれば、ＴＤ−１〜８を含む第１の組成物と、ＴＤ−９および１０を含む第２の組成物から、ＴＤ−１〜１０をそれぞれ単離する方法が提供される。具体的には以下の通りである。
１−３）ＴＤ−１、２、４および５の単離
ＴＤ−１〜８を含む第１の組成物を順相または逆相の（シリカゲル）カラムクロマトグラフィーを繰り返し行い、さらに（高速）液体クロマトグラフィーを行うことで、ＴＤ−１、ＴＤ−２、ＴＤ−４、ＴＤ−５をそれぞれ単離することができる。
本発明のより好ましい態様によれば、ＴＤ−１〜８を含む第１の組成物を逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相シリカゲルカラムを装着した高速液体クロマトグラフィーにより、順次分離精製することにより、ＴＤ−１、ＴＤ−２、ＴＤ−４、ＴＤ−５をそれぞれ単離することができる。

１−４）ＴＤ−３および７の単離
ＴＤ−１〜８を含む第１の組成物を順相または逆相のシリカゲルカラムクロマトグラフィーを繰り返し行い、ＴＤ−３および７をそれぞれ単離することができる。
本発明のより好ましい態様によれば、ＴＤ−１〜８を含む第１の組成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、順次分離精製することにより、ＴＤ−３およびＴＤ−７をそれぞれ単離することができる。

１−５）ＴＤ−６および８の単離
ＴＤ−１〜８を含む第１の組成物を順相または逆相のシリカゲルカラムクロマトグラフィーを繰り返し行い、ＴＤ−６および８をそれぞれ単離することができる。
本発明のより好ましい態様によれば、ＴＤ−１〜８を含む第１の組成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、順次分離精製することにより、ＴＤ−６およびＴＤ−８をそれぞれ単離することができる。

１−６）ＴＤ−９および１０の単離
ＴＤ−９および１０を含んでなる第２の組成物を順相または逆相のシリカゲルカラムクロマトグラフィーを繰り返し行い、ＴＤ−９および１０をそれぞれ単離することができる。本発明のより好ましい態様によれば、ＴＤ−９および１０を含んでなる第２の組成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより順次精製することにより、ＴＤ−９およびＴＤ−１０をそれぞれ単離することができる。

２）ＴＤ−１１〜１４を含んでなる組成物の製造方法（抽出）
ＴＤ−１１〜１４を含んでなる組成物の製造方法は、１）ＴＤ−１〜１０を含んでなる組成物の製造方法（抽出方法）の項で説明したのと同様であって良い。よって、この１）の項で説明した原料および抽出方法はＴＤ−１１〜１４を含んでなる組成物の製造方法においても同様であってよい。また、この製造方法により、ＴＤ−１１〜１４はＴＤ−１〜１０と混合された組成物として得られるものであってよい。

２−１）ＴＤ−１１〜１４の単離
本発明によれば、ＴＤ−１１〜１４の化合物を単離する方法を提案することができ、その方法は、ＴＤ−１１〜１４を含んでなる組成物を用意し、
前記組成物をクロマトグラフィーで分離することを複数回繰り返すことにより、
ＴＤ−１１〜１４の化合物を得るものである。
本発明にあっては、ＴＤ−１１〜１４の単離はＴＤ−１〜１０の単離で説明したのと同様であって良い。また、この単離により、ＴＤ−１１〜１４はＴＤ−１〜１０と混合された組成物として得られるものであってよい。

２−２）ＴＤ−１１〜１４を含む組成物の分画
本発明によれば、ＴＤ−１１〜１４を含む組成物からＴＤ−１１とＴＤ−１４を含む第３の組成物と、ＴＤ−１２およびＴＤ−１３を含む第４の組成物それぞれに分離する方法を提供することができる。その方法は、ＴＤ−１１〜１４を含んでなる組成物を順相カラムクロマトグラフィー、次いで逆相カラムクロマトグラフィーで分離し、ＴＤ−１１と１４を含む第３の組成物と、ＴＤ−１２および１３を含む第４の組成物に分離するものである。

本発明の好ましい態様によれば、ＴＤ−１〜ＴＤ−１４を含む組成物を用いて第１の組成物〜第４の組成物を得る方法が提案される。この方法は、１−２）ＴＤ−１〜１０を含む組成物の分画と、２−２）ＴＤ−１１〜１４を含む組成物の分画と同様の手法で行うことができる。具体的には、ＴＤ−１〜ＴＤ−１４を含んでなる組成物を順相カラムクロマトグラフィー、次いで逆相カラムクロマトグラフィーで分離することにより、ＴＤ−１〜８を含む第１の組成物と、ＴＤ−９および１０を含む第２の組成物と、ＴＤ−１１とＴＤ−１４を含む第３の組成物と、ＴＤ−１２およびＴＤ−１３を含む第４の組成物をそれぞれ分離することができる。本発明の好ましい態様によれば、これら第１の組成物〜第４の組成物を用いて、上記または後記する方法を用いて、ＴＤ−１〜ＴＤ−１４をそれぞれ単離することができる。

２−３）ＴＤ−１１および１４の単離
ＴＤ−１１および１４を含んでなる第３の組成物を順相または逆相のシリカゲルカラムクロマトグラフィーを繰り返し行い、ＴＤ−１１および１４をそれぞれ単離することができる。本発明のより好ましい態様によれば、ＴＤ−１１および１４を含んでなる第３の組成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、順次分離精製することにより、ＴＤ−１１およびＴＤ−１４をそれぞれ単離することができる。

２−４）ＴＤ−１２および１３の単離
ＴＤ−１２および１３を含んでなる第４の組成物を順相または逆相のシリカゲルカラムクロマトグラフィーを繰り返し行い、ＴＤ−１２および１３をそれぞれ単離することができる。本発明のより好ましい態様によれば、ＴＤ−１２および１３を含んでなる第４の組成物を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィーにより順次精製することにより、ＴＤ−１２および１３をそれぞれ単離することができる。

実施例
ＴＤ−１〜１０の化合物の抽出および分画
ニトベギク（ティソニア・ディベルシフォリア（ヘムスル）エー、グレイ）の地上部分を乾燥した粉末３．０ｋｇを８０％エタノール４５リットルで６５℃、２時間加熱抽出後、濾過し不純物を取り除いた後に溶媒を除去し濃縮エキスとした。
この濃縮エキス（３２０ｇ）をカラムクロマトグラフィー（合成吸着剤：ダイヤイオンＨＰ−２０）に充填した。次に、第１のアルコール溶媒（メタノール：水の比率が５０％以上）を流し、次に、第２のアルコール溶媒（８０％エタノール）４５リットルを流し、最後に低級エステルである酢酸エチルを流して、６５℃、２時間加温抽出し、第２のアルコール画分を得た。この第２のアルコール画分を濾過し不純物を除去した後に第２のアルコール溶媒を蒸発させて濃縮した抽出物を得た。
次に、この抽出物（３２０ｇ）を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルムとメタノールの比率が９：１の溶媒）、次いで逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（充填剤：ＯＤＳシリカゲル、メタノールと水の比率が１：１の溶媒）に付し、２−１画分（ＴＤ−１〜８を含有）、２−２画分、２−３画分（ＴＤ−９および１０を含有）、２−４画分のそれぞれを得た。順相シリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいては固定相であるシリカゲルへの吸着力の差により、逆相ＯＤＳシリカゲルカラムクロマトグラフィーにおいては、オクタデシル基でシリカゲル表面を置換したものを充填剤として使用し、それにより固定相（ＯＤＳシリカゲル）と移動相（溶媒）への分配作用を利用して、上記４つの画分を分離した。
２−１画分と、２−３画分のそれぞれについて下記の処理を行い、各ＴＤ化合物を単離した。

２−１画分／ＴＤ−１、２、４および５の単離
２−１画分の一部を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルムとアセトンとの比率が９：１、４９：１の溶媒）、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトニトリルと水との比率が２：３の溶媒）、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノールと水との比率が１１：９の溶媒）、逆相シリカゲルカラムを装着した高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（メタノールと水との比率が７：３、３：２の溶媒）により、順次精製することにより、ＴＤ−１（２８．０ｍｇ）、ＴＤ−２（１４．０ｍｇ）、ＴＤ−４（３５．３ｍｇ）、ＴＤ−５（１３．０ｍｇ）を単離した。

２−１画分／ＴＤ−３および７の単離
２−１画分の一部を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルムとアセトンとの比率が４９：１の溶媒）、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノールと水との比率が１１：９の溶媒）、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトニトリルと水との比率が１：２の溶媒）により順次精製することにより、ＴＤ−３（５６．２ｍｇ）およびＴＤ−７（５０．０ｍｇ）を単離した。

２−１画分／ＴＤ−６および８の単離
２−１画分の一部を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルムとアセトンの比率が４９：１、１９：１の溶媒）、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノールと水との比率が３：２の溶媒）、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトニトリルと水との比率が１：２の溶媒）により順次精製することにより、ＴＤ−６（１４．０ｍｇ）およびＴＤ−８（８．７ｍｇ）を単離した。

２−３画分／ＴＤ−９および１０の単離
２−３画分を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルムとアセトンとの比率が１９：１、４：１、２：１の溶媒）、順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（ヘキサンとアセトンとの比率が９：１、７：３の溶媒）、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトニトリルと水との比率が９：１、４：１、３：１、２：１、１：１の溶媒）により順次精製することにより、ＴＤ−９（８．４ｍｇ）およびＴＤ−１０（７．８ｍｇ）を単離した。

２−２画分／ＴＤ−１１および１４の単離
２−２画分を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルムとアセトンとの比率が４９：１の溶媒）、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノールと水の比率が１：１の溶媒）、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトニトリルと水の比率が３：１，５：８，１：２の溶媒）により順次精製することにより、ＴＤ−１１（６７．９ｍｇ）およびＴＤ−１４（８．７ｍｇ）を単離した。

２−４画分／ＴＤ−１２および１３の単離
２−４画分を順相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルムとアセトンとの比率が４：１，３：２の溶媒）、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（メタノールと水の比率が１：１の溶媒）、逆相シリカゲルカラムクロマトグラフィー（アセトニトリルと水の比率が１：２，１：１，２：１の溶媒）により順次精製することにより、ＴＤ−１２（１８．８ｍｇ）およびＴＤ−１３（６０．８ｍｇ）を単離した。

ＴＤ−１〜１４の構造決定
上記で得られたＴＤ−１〜ＴＤ−１４の構造を決定した。
（１）新規化合物の構造決定
新規化合物質であるＴＤ−３、ＴＤ−５およびＴＤ−６は下記のスペクトルデータ等により構造を決定した。

ＴＤ−３（Ｃ _２０Ｈ _３０Ｏ _７）
（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１０Ｒ）−１−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙ−３，１０−ｅｐｏｘｙ−８−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｇｅｒｍａｃｒａ−１１（１３）−ｅｎ−６，１２−ｏｌｉｄｅ
１）性状：白色粉末 [α]_D ²⁶ -102度 (メタノール)
２）HR-ESI-MS m/z： 383.2058 (Calcd for C₂₀H₃₁O₇, 383.2070)
３）UV (メタノール)λ_max (log ε)： 216 (log ε = 3.81)
４）IR (film) cm^-1：3446, 2972, 2933, 1761, 1736, 1460, 1317, 1261, 1194, 1155, 1072, 1007, 984.
５）¹H-NMR (重クロロホルム) ppm： 6.19 (1H, d, J=3.4 Hz, H-13a), 5.54 (1H, ddd, J=11.4, 5.3, 2.6 Hz, H-8), 5.47 (1H, d, J=2.9 Hz, H-13b), 4.46 (1H, ddd, J=10.6, 6.9, 1.1 Hz, H-6), 4.06 (1H, dd, J=9.5, 8.6 Hz, H-1), 3.92 (1H, m, H-7), 3.10 (3H, s, OMe), 2.49 (1H, dd, J=14.5, 9.5 Hz, H-2b), 2.37 (1H, m, H-2'), 2.06 (1H, m, H-5b), 1.99 (1H, m, H-4), 1.97 (1H, dd, J=14.5, 5.4 Hz, H-9a), 1.81 (1H, dd, J=14.5, 8.6 Hz, H-2a), 1.72 (1H, br d, J=13.3 Hz, H-5a), 1.63 (1H, dd, J=14.5, 11.4 Hz, H-9b), 1.37 (3H, s, Me-14), 1.01 and 0.99 (each 3H, d, J=7.0 Hz, Me-3' and Me-4'), 0.99 (3H, d, J=7.0 Hz, Me-15).
６）¹³C-NMR (重クロロホルム) ppm：79.7 (C-1), 41.7 (C-2), 108.8 (C-3), 46.4 (C-4), 38.2 (C-5), 82.3 (C-6), 48.2 (C-7), 70.2 (C-8), 35.1 (C-9), 81.3 (C-10), 137.7 (C-11), 169.8 (C-12), 121.7 (C-13), 24.1 (C-14), 18.3 (C-15), 176.7 (C-1'), 34.5 (C-2'), 19.1 (C-3' or C-4’）, 19.6 (C-3’and C-4'), 49.2 (OMe).

ＴＤ−５（Ｃ _１３Ｈ _２2 Ｏ ₃ ）
（４Ｓ，５Ｒ）−４−ｈｙｄｒｏｘｙ−４−［（１Ｅ，３Ｓ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｂｕｔｅｎｙｌ］−３，３，５−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌ−ｃｙｃｌｏｈｅｘａｎｏｎｅ）
１）性状：白色粉末 [α]_D ²⁶ -8度 (メタノール)
２）HR-ESI-MS m/z: 227.1050 (Calcd for C₁₃H₂₂O₃, 227.1647)
３）IR (film) cm^-1: 3415, 2968, 11900, 2877, 1695, 1454, 1412, 1369, 1286, 1140, 1061, 1030, 977, 939.
４）¹H-NMR (重クロロホルム) ppm: 2.77 (1H, d, J=13.6 Hz, H-2ax), 1.84 (1H, dd, J=13.6, 2.2 Hz, H-2ax), 2.35 (1H, t-like, J=12.9 Hz, H-4ax), 2.13 (1H, ddd, J=13.6, 4.5, 2.2 Hz, H-4eq), 2.19 (1H, ddq, J=12.9, 6.5, 4.5 Hz, H-5), 5.63 (1H, dd, J=15.8, 0.8 Hz, H-7), 5.77 (1H, dd, J=15.8, 5.7 Hz, H-8), 4.36 (1H, ddd, J=6.4, 5.7, 0.8 Hz, H-9), 1.25 (3H, d, J=6.4 Hz, Me-10), 0.87 (3H, s, Me-11), 0.90 (3H, s, Me-12), 0.81 (3H, d, J=6.5 Hz, Me-13).
５）¹³C-NMR (重クロロホルム) ppm: 42.5 (C-1), 51.4 (C-2), 211.4 (C-3), 45.1 (C-4), 36.4 (C-5), 77.0 (C-6), 131.8 (C-7), 135.2 (C-8), 68.3 (C-9), 23.9 (C-10), 24.5 (C-11), 24.4 (C-12), 15.9 (C-13).

ＴＤ−６（Ｃ _２０Ｈ _２８Ｏ _７）
（１Ｓ，３Ｒ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ）−１−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｍｅｔｈｏｘｙ−３，１０−ｅｐｏｘｙ−８−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｇｅｒｍａｃｒａ−４，１１（１３）−ｄｉｅｎ−６，１２−ｏｌｉｄｅ
１）性状：白色粉末 [α]_D ²⁶ -110度 (メタノール)
２）HR-ESI-MS m/z: 381.1947 (Calcd for C₂₀H₂₉O₇, 381.1913)
３）UV (メタノール) λ_max (log ε)：213 (log ε= 3.88)
４）IR (film) cm^-1: 3421, 2972, 1763, 1732, 1587, 1282, 1186, 1111, 1064, 991
５）¹H-NMR (重クロロホルム) ppm: 6.20 (1H, d, J=2.8 Hz, H-13a), 5.66 (1H, m, H-5), 5.59 (1H, ddd, J=11.2, 5.0, 4.6 Hz, H-8), 5.55 (1H, d, J=2.3 Hz, H-13b), 5.20 (1H, m, H-6), 4.16 (1H, m, H-7), 3.77 (1H, dd, J=11.1, 3.9 Hz, H-1), 3.11 (3H, s, OMe), 2.91 (1H, br d, J=11.3 Hz, H-2b), 2.34 (1H, m, H-2'), 2.31 (1H, m, H-2a), 1.82 (1H, dd, J=14.1, 5.0 Hz, H-9a), 1.70 (3H, t-like, J=1.8 Hz, Me-15), 1.66 (1H, dd, J=14.1, 11.2 Hz, H-9b), 1.44 (3H, s, Me-14), 1.00 (3H, d, J=7.1 Hz, Me-3' or Me-4'), 0.97 (3H, d, J=7.2 Hz, Me-3' or Me-4').
６）¹³C-NMR (重クロロホルム) ppm: 77.1 (C-1), 45.2 (C-2), 109.7 (C-3), 138.4 C-4), 131.2 (C-5), 75.8 (C-6), 49.6 (C-7), 71.2 (C-8), 39.7 (C-9), 87.5 (C-10), 136.2 (C-11), 169.5 (C-12), 122.7 (C-13), 20.8 (C-14), 21.6 (C-15), 175.9 (C-1'), 334.0 (C-2'), 18.6 (C-3' or C-4'), 19.0 (C-3' or C-4'), 50.1 (OMe).

（２）既知化合物の構造決定
Ａ）ＴＤ−１、ＴＤ−２、ＴＤ−４、ＴＤ−７、ＴＤ−８、ＴＤ−９、ＴＤ−１０は既知化合物であり、各種スペクトルデータを上記した非特許文献１〜１３の記載内容に基づいてこれらの構造を決定した。具体的には下記の通りであった。
ＴＤ−１
（１Ｒ，３Ｒ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ）−１，３−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙ−３，１０−ｅｐｏｘｙ−８−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｇｅｒｍａｃｒａ−４，１１（１３）−ｄｉｅｎ−６，１２−ｏｌｉｄｅ
ＴＤ−２
（６Ｓ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ）−１０−ｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−８−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｇｅｒｍａｃｒａ−１，４，１１（１３）−ｔｒｉｅｎ−６，１２−ｏｌｉｄｅ
ＴＤ−４
（１Ｒ，３Ｒ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−１−ｍｅｔｈｏｘｙ−３，１０−ｅｐｏｘｙ−８−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｇｅｒｍａｃｒａ−４，１１（１３）−ｄｉｅｎ−６，１２−ｏｌｉｄｅ
ＴＤ−７
（１Ｓ，３Ｒ，４Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１０Ｒ）−１，３−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３，１０−ｅｐｏｘｙ−８−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｇｅｒｍａｃｒａ−１１（１３）−ｅｎ−６，１２−ｏｌｉｄｅ
ＴＤ−８
（１Ｒ，３Ｓ，６Ｓ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−１，１０−ｅｐｏｘｙ−８−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｇｅｒｍａｃｒａ−４，１１（１３）−ｄｉｅｎ−６，１２−ｏｌｉｄｅ
ＴＤ−９
（３Ｒ，４Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１０Ｓ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３，１０−ｅｐｏｘｙ−８−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｇｅｒｍａｃｒａ−１１（１３）−ｅｎ−６，１２−ｏｌｉｄｅ
ＴＤ−１０
（３Ｒ，４Ｓ，６Ｒ，７Ｓ，８Ｒ，１０Ｓ）−３−ｍｅｔｈｏｘｙ−３，１０−ｅｐｏｘｙ−８−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｇｅｒｍａｃｒａ−１１（１３）−ｅｎ−６，１２−ｏｌｉｄｅ

Ｂ）ＴＤ−１１〜１４は既知化合物であり、各種スペクトルデータを上記した非特許文献１０〜１３の記載内容に基づいてこれらの構造を決定した。具体的には下記の通りであった。
ＴＤ−１１（一般名：タギチニンＦ）
（３Ｒ，６Ｒ，７Ｒ，８Ｒ，１０Ｒ）−３−ｈｙｄｒｏｘｙ−３，１０−ｅｐｏｘｙ−８−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｇｅｒｍａｃｒａ−１，４，１１（１３）−ｔｒｉｅｎ−６，１２−ｏｌｉｄｅ
ＴＤ−１２（一般名：ルテオリン）
３’，４’５，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−ｆｌａｖｏｎｅ
ＴＤ−１３（一般名：ネペチン）
３’，４’，５，７−ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｘｙ−６−ｍｅｔｈｏｘｙ−ｆｌａｖｏｎｅ
ＴＤ−１４
７ａ，１０ａ−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ−３−ｏｘｏ−８ｂ−ｉｓｏｂｕｔｙｒｙｌｏｘｙｇｕａｉａ−１１（１３）−ｅｎ−１２，６ａ−ｏｌｉｄｅ

評価試験
評価試験１：ＴＤ−１〜１０の評価試験
ＴＤ−１〜１０の抗癌作用を、ヒト急性骨髄性白血病細胞株ＨＬ−６０を用いた細胞毒性活性の数値により検討した。具体的には下記の通りに試験した。
ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地中で前培養したＨＬ−６０細胞数を１ｍＬ中４×１０^４個となるようにＦＢＳ含有ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁させ、懸濁液を９６−ｗｅｌｌマイクロプレートの各ｗｅｌｌに１９６ｍＬずつ分注し、３７℃、５％炭酸ガス中、２４時間プレインキュベートした。続いて、コントロールとしてＥｔＯＨ−Ｈ_２Ｏ（１：１）、サンプルとして各ＴＤ化合物をＥｔＯＨ−Ｈ_２Ｏ（１：１）に溶解したものを各々４ｍＬずつ各ｗｅｌｌに添加した。３７℃、５％炭酸ガス中、７２時間インキュベートした後、ＭＴＴ試薬を１０ｍＬずつ各ｗｅｌｌに添加し、さらに４時間インキュベートした。培地を除去した後、生成したＭＴＴホルマザンを１７５ｍＬＤＭＳＯに溶解させ、マイクロプレートリーダーを用いて、吸光波長５５０ｎｍで検出して、コントロールに対する生細胞数を算出した。ＩＣ_５０値は用量−作用曲線から算出した。
ＴＤ−１〜１０のＩＣ_５０値（μｇ／ｍＬ）は下記の表１の通りであった。

表１
化合物ＩＣ _５０値（μｇ／ｍＬ）
ＴＤ−１（０．６０）
ＴＤ−２（０．３８）
ＴＤ−３（４．９７）
ＴＤ−４（０．０５）
ＴＤ−６（２．５０）
ＴＤ−７（３．８７）
ＴＤ−８（０．９２）
ＴＤ−９（２．５０）
ＴＤ−１０（０．７８）

評価試験２：ＴＤ−１の評価試験（抗癌性試験）
ＴＤ−１の抗癌性を調べるために、ヒト培養癌細胞パネルスクリーニング試験を行った。具体的には、ヒト培養がん細胞パネルスクリーニング試験は、「癌と化学療法（矢守隆夫），２４，１２９−１３５，１９９７」に記載された方法に準じて、ＴＤ−１について全３９種のヒト腫瘍細胞に対する５０％細胞増殖抑制濃度（ＧＩ_５０）を測定することにより行った。その結果は下記表２に記載する通りであった。
表２
ＴＤ−１ＧＩ _５０（μＭ）
全３９種の癌細胞の平均値６．８
卵巣癌細胞系
ＯＶＣＡＲ−３３．３
ＯＶＣＡＲ−４５．６
ＯＶＣＡＲ−５２．９
ＯＶＣＡＲ−８３．６
ＳＫ−ＯＶ−３４．０
前立腺癌細胞系
ＤＵ−１４５４．２
ＰＣ−３３．３

評価結果
表２の結果の通り、ＴＤ−１は卵巣癌細胞系、前立線癌細胞系のＧＩ_５０の値が全３９種癌細胞のＧＩ_５０の平均値より数値が低く、これらの癌細胞系に対して抗癌作用を有することが理解される。

Claims

下記一般式（Ｉ）：

［上記式中、Ｒ_１は水酸基を示し、Ｒ_２はメトキシ基を示す］
で表される、化合物。
下記一般式（ＩＩ）：

［上記式中、
Ｒ_３は水酸基を示し、かつ、Ｓ立体配座とされてなり、
Ｒ_４はメトキシ基を示す］
で表される、化合物。
請求項１または２に記載の化合物を有効成分とする、抗癌剤。
動物または人の癌治療に使用される、請求項３に記載の抗癌剤。
前記癌が白血病である、請求項３または４に記載の抗癌剤。
前記白血病が急性骨髄性白血病である、請求項５に記載の抗癌剤。
請求項１または２に記載された化合物を含んでなる組成物を製造する方法であって、
前記各化合物を含んでなる原料として、キク科植物またはアカバナ科チョウジタデ属植物を用意し、
必要に応じて加熱下において、前記原料を溶媒で抽出し、
前記抽出物をカラムクロマトグラフィーに供給し、
第１の炭素数１〜３の低級アルコール溶媒を供給し、
第２の炭素数１〜３の低級アルコール溶媒を供給し、
前記第２の炭素数１〜３の低級アルコール画分中に、前記各化合物を含んでなる組成物を得ることを含んでなる、製造方法。
請求項１または２に記載された化合物を含んでなる組成物を第１の組成物と第２の組成物とに分離する方法であって、
請求項７の製造方法で得られた前記各化合物を含んでなる組成物を用意し、
前記組成物を順相カラムクロマトグラフィー、次いで逆相カラムクロマトグラフィーで分離し、第１の組成物と第２の組成物とに分離するものであり、
第１の組成物が請求項１または２に記載された化合物を含んでなるものであり、
第２の組成物が上記一般式（Ｉ）において、Ｒ_１が水素原子を示しＲ_２が水酸基を示す化合物と、Ｒ_１が水素原子を示しＲ_２がメトキシ基を示す化合物とを含んでなるものである、方法。
請求項１または２に記載された化合物をそれぞれ得る方法であって、
請求項７の製造方法で得られた前記各化合物を含んでなる第１の組成物を用意し、
前記組成物を順相カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィー、逆相カラムクロマトグラフィーにより順次分離し、
前記各化合物を単離することを含んでなる、方法。
前記組成物が請求項９に記載の方法で得られた、請求項１または２に記載された化合物。