KR101378433B1 - 세스퀴터핀 락톤계 위장 질환 치료용 의약 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 세스퀴터핀 락톤계 위장 질환 치료용 의약 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 파테놀라이드(Parthenolide)에서 유래된 세스퀴터핀 락톤계 유도체를 활성 성분으로 포함하는 위염 또는 위궤양 예방 또는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 세스퀴터핀 락톤계 위장 질환 치료용 의약 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 파테놀라이드(Parthenolide)에서 유래된 세스퀴터핀 락톤계 유도체를 활성 성분으로 포함하는 위염 또는 위궤양 예방 또는 치료용 의약 조성물에 관한 것이다.
백합나무 (Liriodendron tulipifera L., Yellow-poplar) 수피 추출물에는 epi-Tulipinolide를 포함한 Parthenolide, Costunolide, Tulipinolide, Liferolide, Dihydrochrysanolide등 많은 세스퀴터핀 락톤류의 성분들을 함유하는 것으로 보고되어왔다(Doskotch R W, Keely S L, Hufford C D, El-Feraly F S, 1975, Phytochemistry, 14:769-773; Doskotch R W, Wilton J H, Harraz F M, Fairchild E H, Huang C-T, El-Feraly F S, 1983, J. Nat . Prod, 46:923-929).
특히 파테놀라이드의 경우 백합나무 수피 추출물에서 유용한 생리활성 물질로 알려져 있으며 또한 다양한 질병의 치료용도로서 사용되어 왔다. 파테놀라이드의 시험관내 생리활성을 살펴보면 NF-κB 매개된 염증 질환의 조절, 급성 골수성 백혈병에서 아폽토시스의 유도 및 각종 항염증 활성이 알려져 있다(Feltenstein, MW et al. Pharmacology Biochemistry and Behavior 79 (2): 299-302 (2004)). 또한 NF-κB의 활성 억제를 통해 리포폴리사카라이드 유도된 비만의 치료에도 효과적임이 알려져 있다(Zunino, SJ et al. Cancer letters 254 (1): 119-127 (2007)).
따라서 백합나무 수피 추출물 중에 파테놀라이드계 화합물의 경우 항염증 및 NF-κB 매개된 염증 질환의 치료에 효과적임을 예측할 수 있으며 본 발명자들은 이와 같은 가정 하에 위염 및 소화성 위궤양에 우수한 치료 및 예방 효과가 있는 화합물을 발명하기 위해 다양한 치환기 및 환 구조를 지닌 파테놀라이드계 유도체를 합성하고 이들의 위염 및 소화성 위궤양 치료 효과를 측정하였다.
그러나, 통상 세스퀴터핀 락톤계 화합물은 지용성 성분으로 체내 흡수 과정에서 나타나는 낮은 용해도 문제로 인해 생체 이용률이 충분하지 못한 문제가 제기되었다.
또한 최근 백합나무 추출물에서 활성 성분으로 알려진 Costunolide, Tulipinolide계 화합물의 경우 위염 또는 위궤양 치료에는 효과적이나 이들이 지니고 있는 세포 독성, 즉 염색체 독성을 지닌 것으로 나타나고 있어 그 안전성 및 독성에 문제가 있어 신약으로 개발하는데는 결정적 장애가 발견되었던 것이다.
따라서 본 발명자들은 염색체 독성과 같은 세포 독성을 지니지 않고 효과적으로 위염 또는 위궤양 치료에 적합한 화합물을 개발하기 위해 다양한 환 구조를 지닌 화합물을 합성하고 그 화합물 등의 유효성인 위염 또는 위궤양 치료 및 예방 효과를 동물 실험을 통해 그 유효성과 안전성을 측정하였다.
이에 따라 본 발명자들은 epi-Tulipinolide와 Parthenolide와 같은 세스퀴터핀 락톤의 10 멤버-링 구조 (A)가 폐환되어 비-시클릭(bi-cyclic) 링의 형성을 통한 비-시클릭 세스퀴터핀 락톤(B) 또는 비-시클릭 세스퀴터핀 락톤(C)계 화합물이 유효성을 지닌 위염 또는 위궤양 치료 및 예방 효과를 지님과 동시에 염색체 독성과 같은 세포 독성을 저하시킴을 발견하고 본 발명을 완성하게 된 것이다.
따라서 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 epi-Tulipinolide와 Parthenolide와 같은 세스퀴터핀 락톤의 10 멤버-링 구조 (A)가 폐환되어 비-시클릭(bi-cyclic) 링의 형성을 통한 비-시클릭 세스퀴터핀 락톤(B) 또는 비-시클릭 세스퀴터핀 락톤(C)계 화합물의 위염 또는 위궤양 치료 및 예방 효과 등의 유효성과 염색체 독성과 같은 세포 독성을 측정하고 유효성이 향상되고 독성이 저하된 화합물을 개발코자 한 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 파테놀라이드(Parthenolide)에서 유래된 하기 CD-103으로 명명된 화학구조식을 지닌 세스퀴터핀 락톤계 화합물을 활성 성분으로 포함하는 위염 또는 위궤양 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것이다.
한편 상기 CD-103의 염산-에탄올 유발 위염 래트 모델의 항위염 ED50는 2.55±0.1mg/kg임을 특징으로 한다.
또한 상기 CD-103의 인도메타신 유발 위궤양 래트 모델의 항위궤양 ED50는 2.06±0.1mg/kg임을 특징으로 한다.
한편 상기 CD-103 화합물은 차이니즈 햄스터 폐세포를 이용한 대사 활성계 직접 염색체 이상 시험에서 차이니즈 햄스터 폐세포의 염색체 변화를 야기시키지 않는 염색체 이상 세포 독성이 없음을 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 목적은 ⅰ) 파테놀라이드를 메탄올에 용해시킨 후 p-토실산(tosylic acid)과 반응시켜 생성된 반응 혼합물을 수득하고 제2인산나트륨(Na2HPO4)으로 중화시키는 단계;
ⅱ) 에틸아세테이트를 첨가 수층과 에틸아세테이트 층으로 층분리 시킨 후 에틸아세테이트 층을 수득하여 용매를 건조시키는 단계;
ⅲ) 건조된 수득물을 용출액에 녹여 컬럼크로마토그래피와 HPLC를 사용하여 분리 정제 수득하는 단계;
로 이루어진 CD-103으로 명명된 화학구조식을 지닌 세스퀴터핀 락톤계 화합물의 제조 정제 방법을 제공하는 것이다.
또한 이때 상기 컬럼크로마토그래피의 용출액은 헥산 : 에틸아세테이트(v/v 3:1)이고, HPLC의 용출액은 물과 메탄올을 혼합하여 사용함을 특징으로 한다.
본 발명의 효과는 epi-Tulipinolide와 Parthenolide와 같은 세스퀴터핀 락톤의 10 멤버-링 구조 (A)가 폐환되어 비-시클릭(bi-cyclic) 링의 형성을 통한 비-시클릭 세스퀴터핀 락톤(B) 또는 비-시클릭 세스퀴터핀 락톤(C)계 화합물의 위염 또는 위궤양 치료 및 예방 효과 등의 유효성과 염색체 독성과 같은 세포 독성을 측정하고 유효성이 향상되고 독성이 저하된 화합물인 CD-101, CD-102 및 CD-103 화합물을 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 화합물 CD-101의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 2는 본 발명의 화합물 CD-101의 2D-COSY NMR 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 화합물 CD-102의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 화합물 CD-102의 2D-COSY NMR 스펙트럼이다.
도 5는 본 발명의 화합물 CD-103의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 화합물 CD-103의 2D-COSY NMR 스펙트럼이다.
도 7은 본 발명의 화합물 CD-101, CD-102 및 CD-103의 HPLC 분리를 나타내는 크로마토그래피이다.
도 2는 본 발명의 화합물 CD-101의 2D-COSY NMR 스펙트럼이다.
도 3은 본 발명의 화합물 CD-102의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 4는 본 발명의 화합물 CD-102의 2D-COSY NMR 스펙트럼이다.
도 5는 본 발명의 화합물 CD-103의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 6은 본 발명의 화합물 CD-103의 2D-COSY NMR 스펙트럼이다.
도 7은 본 발명의 화합물 CD-101, CD-102 및 CD-103의 HPLC 분리를 나타내는 크로마토그래피이다.
본 발명은 수용성이 증가되고 항궤양 효과를 유지함과 동시에 염색체 독성 등의 세포 독성이 없는 세스퀴터핀 락톤계 위장 질환 치료용 의약 조성물 및 그의 제조 정제 방법을 제공하는데 목적이 있다.
따라서 본 발명은 파테놀라이드(Parthenolide)에서 유래된 하기 CD-101, CD-102, CD-103으로 명명된 화학구조식을 지닌 세스퀴터핀 락톤계 화합물을 활성 성분으로 포함하는 위염 또는 위궤양 예방 또는 치료용 의약 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 화합물중 CD-101, CD-102, CD-103의 제조 방법은 다음과 같다.
Scheme
I
1-1: 화합물 합성
Parthenolide (1000mg, 4.02mmol) 을 메탄올 (40 mL) 에 녹였다. P-TsOH (1.529mg, 8.04 mmol) 을 넣어준 후 24h 실온에서 교반 시켜 주었다. 반응 혼합물을 포화 Na2HPO4 로 중화시킨 후 에틸아세테이트(10mLx3)로 수층과 용매층으로 층분리 시킨 후, 에틸아세테이트 층에 MgSO4로 넣은후 용매를 건조하였다. 건조된 혼합 샘플 시료는 Hexane : EA (v/v 3:1)로 컬럼크로마토그래피시킨 후, 단일 성분의 화합물 분리는 HPLC를 사용하여 각각 CD-101 (60mg, 10% ), CD-102 (100mg, 20% ), CD-103 (30mg, 5% ) 을 얻었다.
1-2: 화합물 분리
단일 성분 화합물 분리 조건은 300mg/ml의 농도로 메탄올에 녹여 HPLC (Agilent 1200series, U.S.A)를 사용하여 분취하였다. 컬럼은 C18 ( Luna 250ㅧ10.00mm 5um 100Å, U.S.A)을 사용하였고 온도는 27℃로 유지하였다. HPLC 이동상조건은 물과 메탄올 비율을 0분에서 40:60 (v/v), 이후 5분까지는 10:90(v/v), 그리고 같은 비율10:90 (v/v)을 10분까지 유지 후, 13분까지 100% 메탄올, 그리고 15분까지 100% 메탄올을 유지하는 그라디언트 조건을 사용하였다. 이러한 조건으로 RT 8.16분에서 CD-101, 8.99분에서 CD-102, 9.53분에서 CD-103의 세 가지 물질을 분리하였다. 상기 분리된 물질의 HPLC 데이터는 도 7에 나타난 바와 같다. 샘플시료 투입량은 30ul, 유속은 3ml/min으로 하고 213nm UV파장으로 분석하였다.
화합물 (CD-101) 구조 분석 확인 (400 MHz Bruker NMR):
1H NMR (CDCl3): 6.25 (1H, d, J= 3.25Hz), 5.58 (1H, d, J= 2.78Hz), 4.19 (1H, dd, J= 9.74, 3.25Hz), 3.59 (1H, d, J= 9.79Hz), 3.17 (3H, s), 3.15~3.12 (1H, m), 2.53 (1H, dd, J= 11.09, 8.25Hz), 2.32~2.08 (2H, m), 1.93~1.37 (6H, m), 1.29 (3H, s), 1.25 (3H, s); MS (LCQ Fleet Ion Trap LC-MS): m/z [M+H]+ = 281
화합물 CD-101의 1H NMR 스펙트럼을 도 1에 나타내었다. 또한 도 2는 CD-101의 2D-COSY NMR 스펙트럼이다.
화합물 (CD-102) 구조 분석 확인 (400 MHz Bruker NMR):
1H NMR (CDCl3): 6.23 (1H, d, J= 3.39Hz), 5.22 (1H, d, J= 3.38Hz), 4.99(2H, d, J= 14.19Hz), 4.06 (1H, dd, J= 11.51, 9.12Hz), 2.99 (1H, m), 2.79~2.66 (2H, m), 2.29~2.23 (1H, m), 1.98~1.70 (6H, m), 1.43~1.33 (1H, m), 1.32 (3H, s); MS (LCQ Fleet Ion Trap LC-MS): m/z [M+H]+ = 249
화합물 CD-102의 1H NMR 스펙트럼을 도 3에 나타내었다. 또한 도 4는 CD-102의 2D-COSY NMR 스펙트럼이다.
화합물 (CD-103) 구조 분석 확인 (400 MHz Bruker NMR):
1H NMR (CDCl3): 6.22 (1H, d, J= 3.39Hz), 5.50 (1H, d, J= 3.15Hz), 4.21 (1H, dd, J= 11.63, 9.79Hz), 3.20 (3H, s), 2.88~2.74 (2H, m), 2.21~2.13 (1H, m), 2.05~1.40(8H, m), 1.38 (3H, s), 1.16 (3H, s); MS (LCQ Fleet Ion Trap LC-MS): m/z [M+H]+ = 281
화합물 CD-103의 1H NMR 스펙트럼을 도 5에 나타내었다. 또한 도 6은 CD-103의 2D-COSY NMR 스펙트럼이다.
상기 방법으로 제조된 화합물에 대한 약리활성 및 안전성을 실시예를 통해 다음과 같이 시험하였다.
(실시예 1) 염산-에탄올 유발 위염 모델에서의 CD-101, CD-102, CD-103의 항위염 효과
흰쥐를 24시간 절식시킨 다음 Mizui 등(Jap. J. Pharmacol. 33: 939-945, 1983)의 방법에 준하여 상기에서 제조된 CD-101, CD-102, CD-103를 각각 경구 투여하고 1시간 후에 150 mM HCl-60% 에탄올을 마리당 1.5 ㎖씩 경구 투여하였다. 1시간 후에 경추 탈골하여 동물을 치사시킨 후 즉시 위를 적출하여 2% 포르말린 13 ㎖를 위 내로 주입하여 1시간 이상 고정하였다. 고정된 위의 대만부를 따라 절개하여 펼친 후 디지털 카메라로 사진을 찍은 후 컴퓨터 프로그램 이미지J 1.38(NIH, Bethesda, MD)을 이용하여 위병변 면적(gastric lesion, mm2)을 측정하고 하기의 수학식 1을 이용하여 위병변 억제율을 산출하였다. 50% 유효용량(50% effective dose, ED50)은 회귀 분석(regression analysis)을 통하여 계산하였다.
수학식 1
상기에서 제조된 CD-101, CD-102과 CD-103의 염산-에탄올 유발 위염 모델에서의 효과는 표 1에 나타내었다.
대조군의 위병변 면적은 234.2±30.8 이었으며 참고 물질로 사용된 Rebamipide 50mg/Kg 투여군의 경우 위병변 억제율은 30%로 나타났다.
CD-101 투여군에서는 1, 3, 10 ㎎/㎏ 투여군 모두 에서 용량 의존적인 항위염 효과가 관찰되었고, 10 ㎎/㎏ 투여군의 경우 위병변 억제율은 91.8%로 나타났다. CD-101의 50% 유효용량은 1.24 ㎎/㎏으로 확인되었다.
CD-102 투여군의 경우에도 1, 3, 10 ㎎/㎏ 투여군 모두에서 용량 의존적인 항위염 효과가 관찰되었으며 10 ㎎/㎏ 투여군의 경우 위병변 억제율은 94.9%로 나타났고 50% 유효용량은 1.31 ㎎/㎏으로 확인되었다.
CD-103 투여군은 3, 10, 30 ㎎/㎏ 투여군 모두에서 용량의존적인 항위염 효과가 관찰되었으며 30 ㎎/㎏ 투여군의 경우 위병변 억제율은 99.5%로 나타났고 50% 유효용량은 2.55 ㎎/㎏으로 확인되었다. 한편 개환 10-멤버 링 저마크롤라이드 락톤 구조를 갖은 화합물들과 10-멤버 링 저마크롤라이드 락톤 구조가 비시클릭 링을 지니더라도 말단 메틸렌이 변형된 화합물들은 염산-에탄올 유발 위염 모델에서 모두 효과가 없음을 관찰되었다(표 2).
(실시예 2) 인도메타신 유발 위궤양 모델에서의 CD-101, CD-102, CD-103의 항궤양효과
흰쥐를 24시간 절식시킨 다음 Yamasaki 등(Jap. J. Pharmacol. 49, 441-448, 1989)의 방법으로 실험하였다. 상기 방법으로 얻어진 CD-101, CD-102, CD-103을 각각 경구 투여하고 1시간 후에 인도메타신 (50㎎/㎏)을 마리당 0.5 ㎖씩 경구 투여하였다. 절식 절수 하에서 5시간 방치 후 경추 탈골하여 동물을 치사시킨 후 즉시 위를 적출하여 2% 포르말린 13㎖를 위 내로 주입하여 1시간 이상 고정하였다. 고정된 위의 대만부를 따라 절개하여 펼친 후 디지털카메라로 사진을 찍은 후 컴퓨터 프로그램 이미지J 1.38 (NIH, Bethesda, MD)을 이용하여 위병변 면적(gastric lesion, mm2)을 측정하고 염산-에탄올 유발 위염 모델에서와 동일한 방법으로 위병변 억제율과 50% 유효용량(50% effective dose, ED50)을 계산하였다.
상기 방법으로 수득된 CD-101, CD-102, CD-103의 인도메타신 유발 위궤양 모델에서의 효과는 표 3에 나타내었다. 대조군의 위병변 면적은 59.9±8.7 이었다.
CD-101 투여군에서는 1, 3, 10 ㎎/㎏ 투여군 모두에서 용량 의존적인 항궤양효과가 관찰되었고, 10 ㎎/㎏ 투여군의 경우 위병변 억제율은 73.1%로 나타났다. CD-101의 50% 유효용량은 2.78 ㎎/㎏으로 확인되었다.
CD-102투여군의 경우에도 1, 3, 10 ㎎/㎏ 투여군 모두에서 용량 의존적인 항궤양효과가 관찰되었으며 10 ㎎/㎏ 투여군의 경우 위병변 억제율은 77.2%로 나타났고 50% 유효용량은 1.82 ㎎/㎏으로 확인되었다.
CD-103 투여군은 1, 3, 10 ㎎/㎏ 투여군 모두에서 용량 의존적인 항궤양 효과가 관찰되었으며 10 ㎎/㎏ 투여군의 경우 위병변 억제율은 74.0%로 나타났고 50%유효용량은 2.06 ㎎/㎏으로 확인되었다.
(실시예 3) CD-101, CD-102, CD-103의 염색체 이상 시험
본 발명의 시료로 인한 염색체 이상 유발성 여부를 평가하기 위하여 Chinese hamster lung(CHL) 세포를 이용하여 대사 활성계를 적용한 대사 활성화법(+S9) 및 적용하지 않은 직접법(-S9)에서 염색체 이상 실험을 수행하였다.
1: 처리 농도 결정
시험물질의 처리 농도를 결정하기 위해 세포 증식 억제 실험을 수행하였다. 시험물질은 디메틸 술폭사이드(DMSO)에 용해한 후 희석하여 조제하였으며, 대사 활성계 적용 여부에 관계없이 12개의 농도단계 (2.43, 4.87, 9.75, 19.5, 39.1, 78.1, 156.3, 312.5, 625, 1250, 2500, 5000㎍/㎖)를 적용하여 본시험과 동일 한 방법으로 처리한 후 24시간 배양하였다. 대사 활성계 적용군은 시료 처리 6시간 후에 정상 배지로 교체한 후 18시간 추가 배양하였다.
세포증식 억제 실험의 결과를 토대로 상대 세포 수 기준 50% 이상의 세포 수 감소를 나타내는 농도를 본시험의 최고 농도로 결정하여 공비2의 3단계 농도군으로 하기 표4 와 같이 결정하였다.
2: 본시험
대사활성 여부에 관계없이 모두 시험 개시로부터 24시간 후에 검체를 제작하여 염색체 이상을 계수하였다. 그 결과 CD-101, CD-102와 CD-103의 대사 활성계를 적용시키지 않은 직접법의 경우 이상중기상의 빈도가 음성 대조군과 비교하여 모든 처리 농도에서 유의한 증가를 나타내지 않았으며 대사 활성계를 적용하여 6시간 시험물질 처리, 18시간 회복군에서도 이상중기상의 빈도가 음성 대조군과 비교하여 모든 처리농도에서 유의한 증가를 나타내지 않았다(표 4).
이상의 결과로부터 CD-101, CD-102와 CD-103은 본실험 조건 하에서 CHL 세포에 대해 염색체 이상을 유발하지 않는다는 것을 확인하였다. 한편 개환 10-멤버 링 저마크롤라이드 락톤 구조를 갖은 화합물들은 CHL 세포에 대해 염색체 이상을 유발한다는 것을 확인하였다. 이것은 염색체 이상을 유발하지 않기 위해서는 10-멤버 링 저마크롤라이드 락톤 구조가 비시클릭 링 형성됨이 필요하다는 사실을 말하여 준다(표 5).
Claims (6)
- 파테놀라이드(Parthenolide)에서 유래된 하기 CD-103으로 명명된 화학구조식을 지닌 세스퀴터핀 락톤계 화합물을 활성 성분으로 포함하는 위염 또는 위궤양 예방 또는 치료용 의약 조성물
- 제 1항에 있어서, 상기 CD-103의 염산-에탄올 유발 위염 래트 모델의 항위염 ED50는 2.55±0.1mg/kg임을 특징으로 하는 위염 또는 위궤양 예방 또는 치료용 의약 조성물
- 제 1항에 있어서, 상기 CD-103의 인도메타신 유발 위궤양 래트 모델의 항위궤양 ED50는 2.06±0.1mg/kg임을 특징으로 하는 위염 또는 위궤양 예방 또는 치료용 의약 조성물
- 제 1항에 있어서, 상기 CD-103 화합물은 차이니즈 햄스터 폐세포를 이용한 대사 활성계 직접 염색체 이상 시험에서 차이니즈 햄스터 폐세포의 염색체 변화를 야기시키지 않는 염색체 이상 세포 독성이 없음을 특징으로 하는 위염 또는 위궤양 예방 또는 치료용 의약 조성물
- ⅰ) 파테놀라이드를 메탄올에 용해시킨 후 p-토실산(tosylic acid)과 반응시켜 생성된 반응 혼합물을 수득하고 제2인산나트륨(Na2HPO4)으로 중화시키는 단계;
ⅱ) 에틸아세테이트를 첨가 수층과 에틸아세테이트 층으로 층분리 시킨 후 에틸아세테이트 층을 수득하여 용매를 건조시키는 단계;
ⅲ) 건조된 수득물을 용출액에 녹여 컬럼크로마토그래피와 HPLC를 사용하여 분리 정제 수득하는 단계;
로 이루어진 CD-103으로 명명된 화학구조식을 지닌 세스퀴터핀 락톤계 화합물의 제조 정제 방법
- 제 5항에 있어서, 상기 컬럼크로마토그래피의 용출액은 헥산 : 에틸아세테이트(v/v 3:1)이고, HPLC의 용출액은 물과 메탄올을 혼합하여 사용함을 특징으로 하는 세스퀴터핀 락톤계 화합물의 제조 정제 방법
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