CN103588785A

CN103588785A - 一种银杏内酯a与银杏内酯b的精制方法

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Publication number: CN103588785A
Application number: CN201310624971.9A
Authority: CN
Inventors: 肖志勇; 于垂亮; 吕署一; 徐继红; 尹小华; 周力军
Original assignee: SHANGHAI SINE PROMD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI SINE PROMD PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2013-11-28
Filing date: 2013-11-28
Publication date: 2014-02-19
Anticipated expiration: 2033-11-28
Also published as: CN103588785B

Abstract

本发明公开了一种银杏内酯A、B的精制方法，包括以下步骤：（1）萃取；（2）过柱制备银杏内酯A与银杏内酯B的粗品；（3）结晶纯化：分别将银杏内酯A、B粗品用含水乙醇结晶后制备高纯度银杏内酯A与银杏内酯B的精制品。所得银杏内酯A与银杏内酯B的纯度均为95%-98%。本方法用银杏叶提取物为原料，工艺简单，减少损失，同时分离纯化银杏内酯A与银杏内酯B。全过程除乙醇和乙酸乙酯外，不用其它有机溶剂，可实现重结晶母液回收利用。产品纯度高，适于工业化生产，有较大的应用价值。

Description

一种银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法

技术领域

本发明涉及中药，尤其涉及中药有效成分单体的纯化，具体涉及一种银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法。

背景技术

银杏内酯A与银杏内酯B是银杏中二萜内酯类化合物，是一类特异有效的血小板活化因子受体拮抗剂。此外，银杏总内酯还包括银杏内酯C、银杏内酯J、银杏内酯M和白果内酯等。银杏总内酯中各单体的药效和功用存在一定差异。银杏内酯A、银杏内酯B对治疗心脑血管疾病具有显著疗效。为开发高效新药，控制药品质量，有必要对银杏内酯A和银杏内酯B进行高纯度分离。

文献报道的银杏内酯A、银杏内酯B单体分离方法主要有醇类提取―溶剂萃取―柱色谱分离法，醇类提取―溶剂萃取―反相色谱分离法，色谱分离―重结晶法和超临界流体萃取法(SCFE)等。

ZL00117758.3（《由银杏叶或银杏叶浸膏制备药物银杏内酯A,B的方法》）：该方法是向银杏叶或其浸膏加入乙醇等浸取剂，得到的浸取液经过滤、分层，取出有机相去杂，然后经浓缩、干燥获得富集银杏内酯A和B，采用制备型液相色谱再分离A与B。该方法运用制备色谱进行分离，缺点在于制备银杏内酯A与银杏内酯B生产能力小，难于实现工业化。

ZL201010536023.6（《一种银杏内酯A的制备方法》）：其特征在于包含下列步骤:将银杏叶粗提物用大孔反相吸附树脂进行柱层析分离，即可；其中，所述的大孔反相吸附树脂的参数如下:粒径为50-l00μm，孔径为90-110A，树脂骨架为聚苯乙烯―二乙烯苯。该制备方法缺点在于只分离得到银杏叶中银杏内酯A，其它内酯类成分被舍弃，提高了该工艺的成本，浪费原料。

ZL201010608847.X（《一种从银杏内酯混合物中分离银杏内酯B的方法》）：本发明公开了一种从银杏内酯混合物中分离银杏内酯B的方法，该方法以离子液体或者由离子液体水组成的二元混合溶剂为萃取剂，采用分馏萃取法高效地从含有银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C等银杏内酯同系物的混合物中分离银杏内酯B。该制备工艺缺点在于使用离子液体萃取，成本较高。

ZL200710050245.5（《从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法》）：本发明将公开一种从银杏叶中提取分离银杏内酯B的方法，其步骤如下：1)取银杏叶，用由高到低不同浓度的乙醇进行提取，合并提取液，回收乙醇，得到浓缩后的提取液；2)向浓缩后的提取液中加入乙酸乙酯萃取，回收有机相后浓缩至浸膏；3)将步骤2)所得浸膏稀释后上选择性极性无孔吸附树脂柱，用乙醇洗脱，所得洗脱液回收乙醇后，再用乙醇结晶得到银杏内酯类化合物；4)将银杏内酯类化合物结晶上硅胶柱，用正己烷和乙酸乙酯的混合液洗脱，收集洗脱液，得到富集银杏内酯B的洗脱液；5)回收步骤4)中收集的洗脱液中的溶剂，再用乙醇结晶，得到银杏内酯B单体。该制备工艺缺点在于只制备分离得到银杏内酯B，原料利用率不高，且制备工艺中使用多种有机试剂，难于回收，对环境易产生污染。

上述方法中，有的只是得到一种银杏内酯A或银杏内酯B的单体成分，有的工艺流程较长，不易实现工业化。因此，需要研究能同时纯化银杏内酯A与银杏内酯B，适于工业化生产的精制方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究能同时纯化银杏内酯A与银杏内酯B，并适于工业化生产的精制方法。

本发明提供一种银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法。

本发明方法包括下列步骤：

（1）萃取：取银杏叶提取物浸膏，加入有机溶剂进行多次萃取，合并萃取液，回收溶剂至干，用含水乙醇定容至浓度为0.2-1.0g/ml；

（2）过柱层析富集：将上述药液通过反相吸附树脂柱进行富集，依次用不同浓度的含水乙醇进行除杂、洗脱，分段收集洗脱液，分别将洗脱液浓缩至浸膏，分别得到银杏内酯A与银杏内酯B粗品；

（3）结晶：将上述银杏内酯A与银杏内酯B粗品浸膏用含水乙醇进行多次重结晶，即得到高纯度的银杏内酯A与银杏内酯B精制品。

步骤（3）的重结晶母液合并后可作为上样药液，用于下一批药液中步骤（2）过柱分离。

本方法所得银杏内酯A、银杏内酯B精制品含量各为95%-98%。

本发明方法所述步骤（1）中银杏叶提取物浸膏为市售，含量标准为总内酯含量≥6%，总黄酮含量≥24%，银杏酸含量≤10ppm。

步骤（1）所用有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酮、甲基乙基酮、正丁醇或异丁醇中的一种或多种溶剂,优选乙酸乙酯，溶剂用量为银杏叶提取物浸膏的1-10倍（V/W），萃取次数为1-5次，所用含水乙醇为10-20%乙醇，优选10%乙醇。

步骤（2）中所用反相树脂为MCI或NM-100树脂，除杂溶剂为10-30%乙醇，优选30%乙醇进行除杂，以除去水溶性和大极性杂质，再用35-40%乙醇分段进行洗脱；所述除杂溶剂洗脱体积为1-5BV，分段收集为前1-2BV（该段主要含有银杏内酯A），后3-5BV（该段主要含有银杏内酯B）的富集物。

所述BV为本领域公认的洗脱柱体积单位。

步骤（2）中MCI树脂填料为MCI-GEL CHP系列反相吸附树脂，其技术参数为：粒径为75-150μm，平均粒径为120μm，PH范围为0-14，孔径为450埃，基体为聚苯乙烯和二乙烯基共聚物。NM-100树脂技术参数为粒度范围为30-50μ，平均孔径120埃，比表面积800m²/g。

步骤(3)中银杏内酯A与银杏内酯B粗品分别用4-50倍粗品重量（V/W）的50-80%乙醇结晶1-3次，结晶时间1-48h，结晶及重结晶温度为-20-25℃。

本发明所得银杏内酯A与银杏内酯B含量分别为95-98%。

本发明的优点主要在于：

①本方法通过乙酸乙酯萃取后，萃取液一次过柱即可分离银杏内酯A与银杏内酯B，提高原料的利用效率，节约成本。

②对银杏内酯A和银杏内酯B的粗品分别进行重结晶，提高了银杏内酯A和银杏内酯B单体的纯度。

③将结晶后的母液合并后并入下一批药液中继续过柱富集，提高了银杏内酯A与银杏内酯B的回收率。

本方法用银杏叶提取物为原料，工艺简单，减少损失，同时分离纯化银杏内酯A与银杏内酯B。全过程除乙醇和乙酸乙酯外，不用其它有机溶剂，可实现溶剂回收利用的绿色生产。产品纯度高，适于工业化生产，有较大的应用价值。

具体实施方式

参考下列实施例将更易于理解本发明，给出实施例是为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。

实施例所用原料通过市售得到。

银杏叶提取物浸膏为市售，含量标准为总内酯含量≥6%，总黄酮含量≥24%，银杏酸含量≤10ppm。

检测方法参考文献^[1]（刘晓谦,王跃生,罗晓健等.HPLC-ELSD法测定不同厂家银杏叶提取物中4种银杏内酯的含量研究[J],江西中医学院学报,2008,(20)1:89-90.即流动相：甲醇-水（25∶75），流速1.0ml/min，ELSD检测器：漂移管温度104℃，载气流速2.9L/min，柱温25℃）。

实施例1

取银杏叶提取物浸膏1000g，用水溶液稀释至0.5g生药/mL，加入1000ml乙酸乙酯进行萃取，共萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，于45℃减压浓缩至无溶剂，加入10%乙醇使浓缩液浓度为0.5g/mL，湿法装柱，使药液通过MCI树脂，先用30%乙醇洗脱树脂除杂，以除去水溶性和大极性杂质，共洗脱3BV，洗脱速度1BV/h，再用40%乙醇以同样流速洗脱树脂，分别收集前2BV洗脱液和后2BV洗脱液，分别于45℃减压浓缩至1g/ml的浸膏，加入500ml80%乙醇，70℃加热至溶解，4℃冰箱静置24h析晶，析出晶体后，抽滤，分别得到银杏内酯A与银杏内酯B的粗品，将得到的银杏内酯A与银杏内酯B粗品分别用50ml的80%乙醇重结晶1次，温度4℃，静置时间24h。析出结晶，抽滤，母液合并，结晶分别于80℃烘干，最终得到银杏内酯A0.76g、银杏内酯B1.07g。经HPLC-ELSD检测（检测方法参考文献^[1]）银杏内酯A含量为95.6%，银杏内酯B含量为96.2%。

实施例2

取银杏叶提取物浸膏500g，用水溶液稀释至0.2g/mL，加入1000ml乙酸乙酯进行萃取，共萃取四次，合并乙酸乙酯萃取液，将实施例1中结晶后母液与萃取液合并，45℃减压浓缩合并液至无溶剂，加入20%乙醇240ml使浓缩液浓度为0.5g/mL，湿法装柱，使药液通过MCI树脂，先用30%乙醇洗脱树脂除杂，以除水溶性和大极性杂质，共洗脱4BV，洗脱速度2BV/h，再用40%乙醇以同样流速洗脱树脂，分别接取前2BV洗脱液和后3BV洗脱液，分别于45℃减压浓缩至无溶剂后，加入800ml70%乙醇，70℃加热至溶解，4℃冰箱静置12h析晶，析出晶体后，抽滤，分别得到银杏内酯A与银杏内酯B，将得到的银杏内酯A与银杏内酯B继续用50ml70%乙醇重结晶2次，静置温度4℃，静止时间24h。待析出结晶后，抽滤，将结晶后的各份母液合并，并入下一批药液中，作为上样药液继续过柱分离，另存。结晶分别于80℃烘干，最终得到银杏内酯A0.46g、银杏内酯B0.67g。经HPLC-ELSD检测（检测方法参考文献^[1]）银杏内酯A含量为97.1%，银杏内酯B含量均为95.8%。

实施例3

取银杏叶提取物浸膏800g，用水溶液稀释至0.4g/mL，加入4000ml乙酸乙酯进行萃取，共萃取五次，合并乙酸乙酯萃取液，将实施例2中结晶后母液与萃取液合并，于45℃减压浓缩至无溶剂，加入20%乙醇350ml使浓缩液浓度为0.5g/mL，湿法装柱，使药液通过MCI树脂，先用30%乙醇洗脱树脂除杂，以除去水溶性和大极性杂质，共洗脱4BV，洗脱速度1BV/h，再用40%乙醇以同样流速洗脱树脂，分别接取前2BV洗脱液和后3BV洗脱液，分别于45℃减压浓缩至无溶剂后，加入500ml60%乙醇，70℃加热至溶解，4℃冰箱静置24h析晶，待析出晶体后，抽滤，分别得到银杏内酯A与银杏内酯B，将得到的银杏内酯A与银杏内酯B继续用150ml70%乙醇重结晶2次，室温静置48h。待析出结晶后，抽滤，将结晶后的各份母液合并，并入下一批药液中，作为上样药液继续过柱分离，另存。结晶分别于80℃烘干，最终得到银杏内酯A0.66g、银杏内酯B0.96g。经HPLC-ELSD检测（检测方法参考文献^[1]）银杏内酯A含量为98.1%，银杏内酯B含量均为96.8%。

实施例4

取银杏叶提取物浸膏1000g，用水溶液稀释至0.8g/mL，加入250ml乙酸乙酯进行萃取，共萃取五次，合并乙酸乙酯萃取液，将实施例3中结晶后母液与萃取液合并，于45℃减压浓缩至无溶剂，加入20%乙醇200ml使浓缩液浓度为1.0g/mL，湿法装柱，使药液通过NM-100树脂，先用30%乙醇洗脱树脂除杂，以除去水溶性和大极性杂质，共洗脱3BV，洗脱速度2BV/h，再用35%乙醇以同样流速洗脱树脂，分别接取前2BV洗脱液和后3BV洗脱液，分别于45℃浓缩至无溶剂后，加入1000ml80%乙醇，70℃加热至溶解，4℃冰箱静置24h析晶，析出晶体后，抽滤，分别得到银杏内酯A与银杏内酯B，将得到的银杏内酯A与银杏内酯B继续用80ml乙醇重结晶1次，室温静置48h。待析出晶体后，将母液合并，将结晶后的各份母液合并，并入下一批药液中，作为上样药液继续过柱分离，另存。结晶分别于80℃烘干，最终得到银杏内酯A0.86g、银杏内酯B1.17g。经HPLC-ELSD检测（检测方法参考文献^[1]）银杏内酯A含量为97.5%，银杏内酯B含量均为96.7%。

实施例5

取银杏叶提取物浸膏500g，用水溶液稀释至0.5g/mL，加入1500ml1.5倍药液体积的乙酸乙酯进行萃取，共萃取三次，合并乙酸乙酯萃取液，将实施例4中结晶后母液与萃取液合并，于45℃浓缩至无溶剂，加入10%乙醇220ml使浓缩液浓度为0.5g/mL，湿法装柱，使药液通过NM-100反相树脂，先用30%乙醇洗脱树脂除杂，以除去水溶性和大极性杂质，共洗脱5BV，洗脱速度2BV/h，再用35%乙醇以同样流速洗脱树脂，分别接取前2BV洗脱液和后3BV洗脱液，分别于45℃浓缩至无溶剂后，加入600ml5倍干固物重量的80%乙醇，加热溶解，4℃冰箱静置48h析晶，析出晶体后，抽滤，分别得到银杏内酯A与银杏内酯B，将得到的银杏内酯A与银杏内酯B继续用150ml20倍结粗晶重量的80%乙醇重结晶2次，结晶温度4℃，静置12h。待析出结晶后，抽滤，将母液合并，将结晶后的各份母液合并，并入下一批药液中，作为上样药液继续过柱分离，另存。结晶分别于80℃烘干，最终得到银杏内酯A0.77g、银杏内酯B0.96g，经HPLC-ELSD检测（检测方法参考文献^[1]）银杏内酯A含量为95.9%，银杏内酯B含量为98.1%。

实施例6

取银杏叶提取物浸膏800g，用水溶液稀释至0.4g/mL，加入1000ml0.5倍药液体积的乙酸乙酯进行萃取，共萃取四次，合并乙酸乙酯萃取液，将实施例5中结晶后母液与萃取液合并，浓缩合并液至无溶剂，加入10%160ml乙醇使浓缩液浓度为1.0g/mL，湿法装柱，使药液通过NM-100树脂，先用30%乙醇洗脱树脂除杂，以除去水溶性和大极性杂质，共洗脱4BV，洗脱速度1BV/h，再用35%乙醇以同样流速洗脱树脂，分别接取前2BV洗脱液和后2BV洗脱液，分别于45℃浓缩至无溶剂后，加入900ml10倍干固物重量的60%乙醇，70℃加热至溶解，4℃冰箱静置8h析晶，析出晶体后，抽滤，分别得到银杏内酯A与银杏内酯B，将得到的银杏内酯A与银杏内酯B继续用120ml15倍粗结晶重量的80%乙醇重结晶1次，结晶温度4℃，静置24h。待析出结晶后，抽滤，将结晶后的各份母液合并，并入下一批药液中，作为上样药液继续过柱分离，另存。结晶分别于80℃烘干，最终得到银杏内酯A0.71g、银杏内酯B1.02g，经HPLC-ELSD检测（检测方法参考文献^[1]）银杏内酯A含量为96.6%，银杏内酯B含量为98.3%。

Claims

1.一种银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

(1)萃取：取银杏叶提取物浸膏，加入有机溶剂进行多次萃取，合并萃取液，回收溶剂至干，用含水乙醇定容至浓度为0.2-1.0g/ml；

(2)过柱层析富集：将上述药液通过反相吸附树脂柱进行富集，依次用不同浓度的含水乙醇进行除杂、洗脱，分段收集洗脱液，分别将洗脱液浓缩至浸膏，分别得到银杏内酯A与银杏内酯B粗品；

(3)结晶：将上述银杏内酯A与银杏内酯B粗品浸膏用含水乙醇进行多次重结晶，即得到高纯度的银杏内酯A与银杏内酯B精制品。

2.根据权利要求1所述银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法，其特征在于，所述步骤（1）中银杏叶提取物浸膏为市售，含量标准为总内酯含量≥6%，总黄酮含量≥24%，银杏酸含量≤10ppm；所用有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙酸丙酯、乙酸丁酯、丙酮、甲基乙基酮、正丁醇或异丁醇中的一种或多种溶剂，溶剂用量为银杏叶提取物浸膏的1-10倍V/W，萃取次数为1-5次，所述含水乙醇为10-20%乙醇。

3.根据权利要求2所述银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法，其特征在于，所述步骤（1）有机溶剂溶剂为乙酸乙酯；含水乙醇为10%乙醇。

4.根据权利要求1所述银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法，其特征在于，所述步骤（2）中所述反相树脂为MCI或NM-100树脂，除杂溶剂为10-30%乙醇，再用35-40%乙醇分段进行洗脱；所述除杂溶剂洗脱体积为1-5BV，分段收集前1-2BV和后3-5BV的富集物；所述BV为本领域公认的洗脱柱体积单位。

5.根据权利要求4所述银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法，其特征在于，所述步骤（2）除杂溶剂为30%乙醇。

6.根据权利要求1所述银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法，其特征在于，所述步骤（2）中MCI树脂填料为MCI-GEL CHP反相吸附树脂，其技术参数为：粒径为75-150μm，平均粒径为120μm，PH范围为0-14，孔径为450埃，基体为聚苯乙烯和二乙烯基共聚物；NM-100树脂技术参数为粒度范围为30-50μ，平均孔径120埃，比表面积800m²/g。

7.根据权利要求1所述银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法，其特征在于，所述步骤(3)中银杏内酯A与银杏内酯B粗品分别用4-50倍粗品重量V/W的50-80%乙醇结晶1-3次，结晶时间1-48h，结晶及重结晶温度为-20-25℃。

8.根据权利要求1所述银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法，其特征在于，所述步骤（3）的重结晶母液合并后可作为上样药液，用于下一批药液中步骤（2）过柱分离。

9.根据权利要求1所述银杏内酯A与银杏内酯B的精制方法，其特征在于，所述步骤（3）得到的银杏内酯A和银杏内酯B精制品含量各为95%-98%。