CN109406676A - 一种测定银杏叶提取物中萜类内酯含量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种测定银杏叶提取物中萜类内酯含量的方法，属于化学检测领域，旨在提供一种重现性好、干扰因素少、方便快捷的测定银杏叶中萜类内酯含量的HPLC‑ELSD内标检测方法。该方法采用吡虫啉作为内标物，并采用HPLC‑ELSD法测定萜类内酯中各组分并计算其含量。本发明可代替药典中测定银杏叶或银杏叶提取物中萜类内酯的检测方法。

Description

一种测定银杏叶提取物中萜类内酯含量的方法
技术领域
本发明涉及一种测定银杏叶提取物中萜类内酯含量的方法，属于化学检测领域。
背景技术
银杏叶提取物(Ginkgo biloba extract，GBE)是从银杏科银杏属植物银杏的干燥叶中提取纯化而成的一种淡黄色至棕褐色的粉状物质。其中主要含总黄酮醇苷及萜类内酯。银杏叶提取物具有扩张冠脉血管、脑血管，增加冠脉流量及脑血流量，改善心脑功能的作用。有改善脑缺血所产生的症状和记忆功能。有解除支气管平滑肌痉挛的作用，此作用可能与白果内酯的对血小板活化因子的拮抗有关。本品适用于治疗冠心病心绞痛、脑血管痉挛、脑供血不全、记忆力衰退等。也适用于支气管哮喘、老年性痴呆等疾病。银杏叶提取物中萜类内酯成分的含量测定一般采用药典方法，如中国药典的HPLC-ELSD外标法、欧洲药典的HPLC-RID对照法、美国药典的HPLC-ELSD外标法等。由于ELSD与RID检测器对检测条件要求较高，在一般实验室条件下，其检测结果精密度(峰面积或结果含量)难以达到RSD≤2％的要求，检测器稳定性较差。且对照品使用量较大，价格昂贵，检测成本较高。
发明内容
针对以上不足，本发明旨在提供一种重现性好、干扰因素少、方便快捷的测定银杏叶提取物中萜类内酯含量的HPLC-ELSD内标法。本发明采用吡虫啉作为内标物，内标物峰与供试品中待测成分及杂质峰均不重叠。
为了实现上述技术效果，本发明提供的技术方案是这样的：一种测定银杏叶提取物中萜类内酯含量的方法，依次包括下述步骤：
步骤1：对照品溶液的制备：分别取白果内酯对照品、银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品和银杏内酯C对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含2mg、0.5mg、1.5mg、1mg的混合溶液，作为对照溶液。
步骤2：另称取约60～100mg吡虫啉，精密称定，加80％甲醇溶解至100ml容量瓶中，加80％加醇至刻度，即得内标溶液。
步骤3：供试品溶液的制备：取银杏叶提取物约0.15g，精密称定，加水10ml，置水浴中温热使溶散，加2％盐酸溶液2滴，用乙酸乙酯振摇4次(15ml、10ml、10ml、10ml)，合并提取液，用5％醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，用乙酸乙酯10ml洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗涤液，用水洗涤2次，每次20ml，分取水液，用乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
步骤4：内标测定：分别精密吸取对照品溶液0.5ml及内标溶液0.5ml，混合均匀，作为1#内标校正用对照品溶液；分别精密吸取对照品溶液0.5ml、80％甲醇0.5ml及内标溶液1ml，混合均匀，作为2#内标校正用对照品溶液；分别精密吸取对照品溶液1ml、80％甲醇0.5ml及内标溶液0.5ml，混合均匀，作为3#内标校正用对照品溶液；精密吸取供试品溶液0.5ml及内标溶液0.5ml，混合均匀，作为内标法的供试品溶液。分别精密吸取1#、2#、3#对照溶液5～10μl，供试品溶液5～10μl，注入液相色谱仪，照HPLC-ELSD法测定，用内标三点法对数方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量，总内脂等于白果内酯、银杏内酯A银杏内酯B和银杏内酯C的含量之和。
步骤5：HPLC-ELSD法的检测参数为：色谱条件：十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；正丙醇-四氢呋喃-水(1∶15∶84)为流动相；蒸发光散射检测器，理论板数按白果内酯峰应不低于2500。
本发明的技术特征还在于所选内标物为吡虫啉。
本发明的有益效果是：本发明利用内标法测定银杏叶提取物中萜类内酯的含量，有效减少了药典外标法中由于ELSD检测仪器的不稳定性带来的结果误差。且吡虫啉内标溶液性质稳定，同一内标液一次校正后可多次使用，因此可作为生产企业的内控检测方法，检测成本显著降低。
附图说明
图1为白果内酯的浓度对数log(C样)-峰面积对数比值log(A样)/log(A内)的线性回归图；
图2为银杏内酯A的浓度对数log(C样)-峰面积对数比值log(A样)/log(A内)的线性回归图；
图3为银杏内酯B的浓度对数log(C样)-峰面积对数比值log(A样)/log(A内)的线性回归图；
图4为银杏内酯C的浓度对数log(C样)-峰面积对数比值log(A样)/log(A内)的线性回归图；
图5为银杏叶提取物萜类内酯内标测定法的色谱图；
图6为银杏叶提取物萜类内酯药典外标测定法的色谱图；
具体实施方式
下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。
实施例1
1仪器设备及试剂
1.1仪器
电子分析天平(梅特勒XS105)、Agilent 1260液相色谱仪、Alltech ELSD6000蒸发光散射检测器、色谱柱：Agilent C18-EPS 5μm 4.6mm×250mm。
1.2试剂
甲醇(分析纯)、四氢呋喃(色谱纯)、正丙醇(色谱纯)、二次蒸馏水，除特别注明外，本实验所用试剂均为分析纯。
2方法
2.1对照品溶液的制备
分别取白果内酯对照品、银杏内酯A对照品、银杏内酯B对照品和银杏内酯C对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml各含4mg、1mg、3mg、2mg的混合溶液作为1#对照品溶液、精密移取1#溶液5ml加入5ml甲醇混合均匀作为2#对照品溶液、精密移取2#溶液5ml加入5ml甲醇混合均匀作为3#对照品溶液、精密移取3#溶液5ml加入5ml甲醇混合均匀作为4#对照品溶液、精密移取1#溶液1ml至10ml容量瓶中，加甲醇至刻度，混合均匀作为5#对照品溶液。
2.2内标溶液的制备
取约100mg吡虫啉，精密称定，加80％甲醇溶解至100ml容量瓶中，加80％加醇至刻度，即得内标溶液。
2.3内标校正对照溶液的制备
分别精密移取1#～5#对照品溶液1ml，再分别向对照品溶液中精密加入1ml内标溶液，混合均匀后作为6#～10#内标校正对照品溶液。
2.3内标供试品溶液的制备
取银杏叶提取物约0.15g，精密称定，加水10ml，置水浴中温热使溶散，加2％盐酸溶液2滴，用乙酸乙酯振摇4次(15ml、10ml、10ml、10ml)，合并提取液，用5％醋酸钠溶液20ml洗涤，分取醋酸钠液，用乙酸乙酯10ml洗涤。合并乙酸乙酯提取液及洗涤液，用水洗涤2次，每次20ml，分取水液，用乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯液，回收溶剂至干，残渣用甲醇溶解并转移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过。精密移取1ml滤液，再向其精密加入1ml内标溶液混合均匀作为内标供试品溶液。
2.4色谱条件与系统适应性试验
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；正丙醇-四氢呋喃-水(1∶15∶84)为流动相；蒸发光散射检测器，理论板数按白果内酯峰应不低于2500。
2.5检测参数
色谱柱为Agilent C18-EPS 5μm 4.6mm×250mm；柱温为35℃；流速为0.8mL/min；检测器漂移管温度110℃；雾化气体流量4.0l/min。
2.6测定法
按照高效液相色谱法(通则0512)测定
分别精密吸取6#～10#内标校正对照品溶液与内标供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定。用内标五点对数法方程分别计算白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C的含量。
2.7计算(内标对数法)
log(C样)＝k×log(A样)/log(A内)+b(其中k、b为常数)
式中C样——内标对照供试品溶液中被测组分的浓度，单位为mg/ml
A样——内标对照供试品溶液中被测组分的峰面积
A内——内标对照供试品溶液中内标物的峰面积
3结果
3.1线性关系
依据上述方法测定6#～10#内标校正对照品溶液中内标物、白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C数据分别见表1～表5。
表1：
内标物 6#溶液 7#溶液 8#溶液 9#溶液 10#溶液 5针RSD％
第一针A<sub>内标峰面积</sub> 939.348 973.606 921.649 924.313 928.98 2.27
第二针A<sub>内标峰面积</sub> 954.767 1002.252 938.974 944.012 943.825 2.73
平均A<sub>内标峰面积</sub> 947.0575 987.929 930.3115 934.1625 936.4025 2.49
表2：
白果内酯 6#溶液 7#溶液 8#溶液 9#溶液 10#溶液
第一针A<sub>样品峰面积</sub> 18700.262 7521.758 2351.598 687.742 464.993
第二针A<sub>样品峰面积</sub> 18796.338 7560.179 2398.31 704.711 474.566
平均A<sub>样品峰面积</sub> 18748.3 7540.9685 2374.954 696.2265 469.7795
C<sub>对照浓度</sub>mg/ml 1.993 0.9965 0.49825 0.249125 0.1993
表3：
银杏内酯A 6#溶液 7#溶液 8#溶液 9#溶液 10#溶液
第一针A<sub>样品峰面积</sub> 13570.463 5033.774 1513.335 433.412 286.071
第二针A<sub>样品峰面积</sub> 13846.838 5115.528 1544.061 449.612 309.743
平均A<sub>样品峰面积</sub> 13708.6505 5074.651 1528.698 441.512 297.907
C<sub>对照浓度</sub>mg/ml 1.286 0.643 0.3215 0.16075 0.1286
表4：
银杏内酯B 6#溶液 7#溶液 8#溶液 9#溶液 10#溶液
第一针A<sub>样品峰面积</sub> 5457.984 1749.702 480.658 124.074 89.887
第二针A<sub>样品峰面积</sub> 5568.656 1821.802 484.037 137.125 97.057
平均A<sub>样品峰面积</sub> 5513.32 1785.752 482.3475 130.5995 93.472
C<sub>对照浓度</sub>mg/ml 1.056 0.528 0.264 0.132 0.1056
表5：
银杏内酯C 6#溶液 7#溶液 8#溶液 9#溶液 10#溶液
第一针A<sub>样品峰面积</sub> 1210.377 357.708 93.24 26.933 15.521
第二针A<sub>样品峰面积</sub> 1231.373 381.918 94.434 19.074 14.131
平均A<sub>样品峰面积</sub> 1220.875 369.813 93.837 23.0035 14.826
C<sub>对照浓度</sub>mg/ml 0.395 0.1975 0.09875 0.049375 0.0395
以浓度对数log(C样)-峰面积对数比值log(A样)/log(A内)进行线性回归，详见图1～图4。
其中图1为表1为白果内酯的浓度对数log(C样)-峰面积对数比值log(A样)/log(A内)的线性回归图；图2为银杏内酯A浓度对数log(C样)-峰面积对数比值log(A样)/log(A内)的线性回归图；图3为银杏内酯B浓度对数log(C样)-峰面积对数比值log(A样)/log(A内)的线性回归图；图4为银杏内酯C浓度对数log(C样)-峰面积对数比值log(A样)/log(A内)的线性回归图；
结果白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B、银杏内酯C相对于内标物均呈良好的线性关系。
使用本发明内标法与药典外标法检测结果(含量％)分别见表6～7。
表6：
表7：
结果表明以吡虫啉作为内标物的检测结果较药典外标法的检测结果准确性更高。
以上所述的仅为本发明的较佳实施例，凡在本发明的精神和原则范围内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种测定银杏叶提取物中萜类内酯含量的方法，其特征在于所选内标物为吡虫啉。
2.权利要求1所述的一种测定银杏叶提取物中萜类内酯含量的方法，其特征还在于采用HPLC-ELSD内标法测定。
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