CN109521114B - 银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法 - Google Patents

银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法,按照重量计算，银丹心脑通软胶囊是用银杏叶500g、丹参500g、灯盏细辛300g、绞股蓝300g、山楂400g、大蒜400g、三七200g、艾片10g制成1000粒胶囊剂，检测方法包括黄酮类成分、酚酸类成分等的定量分析，所述定量分析方法为高效液相色谱质谱联用法。本发明中银丹心脑通软胶囊中主要成分定量分析的灵敏度更高、精确度好、鉴别能力强，可检出的成分多，检测数据准确度好；银丹心脑通软胶囊的定性分析的批间相似度好，可以更好地反映银丹心脑通软胶囊的整体化学轮廓。

Description

银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法
技术领域
本发明涉及银丹心脑通软胶囊的检测方法技术领域，特别是一种银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法。
背景技术
银丹心脑通软胶囊由银杏叶、丹参、绞股蓝、灯盏细辛、大蒜、三七、山楂、天然冰片8味中药制成，具有活血化瘀、行气止痛、消食化滞等功效。现有的银丹心脑通软胶囊中的主要效应成分检测方法，包括银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的定量分析和对银丹心脑通软胶囊的定性分析。银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的定量分析一般采用色谱法检测，灵敏度不够高、精确度较差、鉴别能力差，可检出的成分少，检测数据准确度差。银丹心脑通软胶囊的定性分析的批间相似度差，不能很好的反映银丹心脑通软胶囊的整体化学轮廓。
因此现有的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法，银丹心脑通软胶囊中主要效应成分定量分析的灵敏度不够高、精确度较差、鉴别能力差，可检出的成分少，检测数据准确度差；银丹心脑通软胶囊的定性分析的批间相似度差，不能很好的反映银丹心脑通软胶囊的整体化学轮廓。
发明内容
本发明的目的，在于提供了一种银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法。本发明中银丹心脑通软胶囊中主要效应成分定量分析的灵敏度更高、精确度好、鉴别能力强，可检出的成分多，检测数据准确度好；银丹心脑通软胶囊的定性分析的批间相似度好，可以更好地反映银丹心脑通软胶囊的整体化学轮廓。
本发明的技术方案：银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法,按照重量计算，银丹心脑通软胶囊是用银杏叶500g、丹参500g、灯盏细辛300g、绞股蓝300g、山楂400g、大蒜400g、三七200g、艾片10g制成1000粒胶囊剂，包括黄酮类成分和酚酸类成分的定量分析，所述黄酮类成分为，蝶豆素，芦丁，异槲皮苷，野黄芩苷，山奈酚-7-O-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷，山奈酚-3-O-芸香糖苷，水仙苷，芹菜素-7-O-葡萄糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷，杨梅素，槲皮素-3-(6-对香豆酰葡萄糖基)-p-1,4-鼠李糖甙，野黄芩素，山柰酚-3-(6-对香豆酰葡萄糖基)-p-1,2-鼠李糖苷，山奈酚，槲皮素，芹菜素，木犀草素和异鼠李素，所述酚酸类成分为，枸橼酸，没食子酸，丹参素，儿茶素，原儿茶酸，绿原酸，原儿茶醛，隐绿原酸，咖啡酸，表儿茶素，异绿原酸B，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A，丹酚酸D和丹酚酸C,所述黄酮类成分和酚酸类成分的定量分析方法为，
标准品溶液和内标溶液的制备：称取各黄酮类成分和酚酸类成分的标准品，分别用75％的甲醇水溶液制备成混合标准品母液；称取柚皮苷，用90％的甲醇水溶液制成终浓度为25.6μg/mL的内标溶液；混合标准品母液中加入内标溶液后用75％的甲醇制成系列浓度的混合对照品工作液，所述混合对照品工作液中柚皮苷的终浓度为2.56μg/mL，所述系列浓度为混合对照品工作液中各黄酮类成分和酚酸类成分标准品的终浓度；以上所配溶液分析前均于-20℃保存；
样品溶液的制备：将银丹心脑通软胶囊样品除去胶囊壳，称取除去胶囊壳后的银丹心脑通软胶囊样品0.6g至100mL锥形瓶中，加入60mL的75％的甲醇水溶液，于100Hz下超声30min；冷却至室温，用75％的甲醇水溶液补足失重；于13000rpm/min离心10min，取上清转移到1.5mL离心管中，于-20℃保存；分析前将上清稀释10倍，加入内标溶液，内标溶液加入后柚皮苷终浓度为2.56μg/mL，离心取上清待分析；
检验设备：高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统；
色谱条件：负离子模式检测，采用多重反应监测(multiple reactionmonitoring，MRM)模式进行定量分析，Zorbax Eclipse Plus C18，150×4.6cm、1.8μm；流动相：A相为0.1％的甲酸水溶液，B相为甲醇溶液；洗脱程序为：0min，10％B；3min，45％B；10min，45％B；18min，90％B，21min，90％B；22min，10％B；28min，10％B；流速为0.3mL/min；柱温为30℃；进样量为2μL；
质谱条件：雾化器流速为3L/min，气体温度为350℃，加热器和干燥器流速皆为10L/min，DL温度为250℃，界面温度为300℃，界面电压为4000V；
含量测定：分析系列浓度的混合对照品工作液，建立各黄酮类成分和酚酸类成分的标准曲线，对银丹心脑通软胶囊样品进行测定，通过标准曲线计算样品中各黄酮类成分和酚酸类成分的含量。
前述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法中,所述黄酮类成分和酚酸类成分的定量分析方法中，所述质谱条件还包括扫描质量范围m/z为100-760，碰撞能量CE为13-42V。
前述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法中,所述黄酮类成分和酚酸类成分的定量分析方法中，所述标准品溶液和内标溶液的制备中，所述系列浓度为4.50ng/mL-18000.00ng/mL。
前述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法中,还包括皂苷类成分、银杏内酯类成分和丹参酮类成分的定量分析，所述皂苷类成分为，三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rd，人参皂苷Rb1，三七皂苷R2，人参皂苷Rh1，人参皂苷Re，人参皂苷Rg6，人参皂苷Rg3，人参皂苷F2和山楂酸，所述银杏内酯类成分为，白果内酯，银杏内酯J，银杏内酯C，银杏内酯A，银杏内酯B和银杏内酯K，所述丹参酮类成分为，丹参二醇C，丹参二醇B，紫丹参甲素，二氢丹参酮I，丹参酮I，隐丹参酮，丹参酮ⅡA和丹参新酮，所述皂苷类成分、银杏内酯类成分和丹参酮类成分的定量分析方法为，
标准品溶液和内标溶液的制备：称取各皂苷类成分、银杏内酯类成分和丹参酮类成分标准品，分别用75％的甲醇水溶液制备成混合标准品母液；称取黄芪甲苷和非诺贝特，用90％的甲醇水溶液分别制成终度为25.2μg/mL和508.0ng/mL的内标溶液；混合标准品母液中加入内标溶液后用75％的甲醇制成系列浓度的混合对照品工作液，所述混合对照品工作液中黄芪甲苷和非诺贝特的终浓度分别为2.52μg/mL和50.80ng/mL，所述系列浓度为混合对照品工作液中各皂苷类成分、银杏内酯类成分和丹参酮类成分标准品的终浓度；以上所配溶液分析前均于-20℃保存；
样品溶液的制备：将银丹心脑通软胶囊样品除去胶囊壳，称取除去胶囊壳后的银丹心脑通软胶囊样品0.6g至100mL锥形瓶中，加入60mL75％的甲醇水溶液，于100Hz下超声30min；冷却至室温，用75％的甲醇水溶液补足失重；于13000rpm/min离心10min，取上清转移到1.5mL离心管中，于-20℃保存待测；分析前将上清稀释10倍，加入内标溶液，加入内标溶液后黄芪甲苷和非诺贝特的终浓度分别为2.52μg/mL和50.80ng/mL，离心取上清待分析；
检验设备：高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统；
色谱条件：负离子模式检测，采用多重反应监测(multiple reactionmonitoring，MRM)模式进行定量分析，Zorbax Eclipse Plus C18，150×4.6cm、1.8μm；流动相：A相为0.1％的甲酸水，B相为乙腈溶液；洗脱程序为：0min，30％B；3min，30％B；10min，60％B；14min，90％B；16min，90％B；18min，10％B；24min，10％B；流速为0.3mL/min；柱温为30℃；进样量为2μL；
质谱条件：雾化器流速为3L/min，气体温度为350℃，加热器和干燥器流速皆为10L/min，DL温度为250℃，界面温度为300℃，界面电压为4000V；
含量测定：分析系列浓度的混合对照品工作液，建立各皂苷类成分、银杏内酯类成分和丹参酮类成分的标准曲线，对银丹心脑通软胶囊样品进行测定，通过标准曲线计算样品中各皂苷类、银杏内酯类成分和丹参酮类成分的含量。
前述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法中，所述皂苷类成分、银杏内酯类成分和丹参酮类成分的定量分析方法中，所述质谱条件还包括扫描质量范围m/z为150-1110，碰撞能量CE为16-45V。
前述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法中，所述皂苷类成分、银杏内酯类成分和丹参酮类成分的定量分析方法中，所述标准品溶液和内标溶液的制备中，所述系列浓度为1.60ng/mL-4000.00ng/mL。
前述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法中,还包括挥发性成分的定量分析，所述挥发性成分为龙脑、樟脑、二烯丙基单硫醚、二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚，所述挥发性成分的定量分析方法为，
标准品溶液和内标溶液的制备：称取各挥发性成分标准品，分别用石油醚制备成混合标准品母液；称取癸酸乙酯，用石油醚制成终浓度为20.3μg/mL的内标溶液；混合标准品母液加入内标溶液后用石油醚制成系列浓度的混合对照品工作液，所述混合对照品工作液中癸酸乙酯的终浓度为2.03μg/mL，所述系列浓度为混合对照品工作液中各挥发性成分标准品的终浓度；以上所配溶液分析前均于-20℃保存；
样品溶液的制备：将银丹心脑通软胶囊样品除去胶囊壳，称取除去胶囊壳后的银丹心脑通软胶囊样品0.6g至25mL锥形瓶中，加入15mL的石油醚，于100Hz下超声5min；冷却至室温，用石油醚补足失重；于13000rpm/min离心10min，取上清转移到1.5mL离心管中，于-20℃保存待测；分析前将上清加入内标溶液，加入内标溶液后癸酸乙酯的终浓度为2.03μg/mL，离心取上清待分析；
检验设备：气相色谱-串联质谱系统；
色谱条件：Agilent HP-5毛细管柱，30m×0.25mm、0.25mm；程序升温：柱起始温度为60℃，保持3min，以5℃/min升温至95℃，保持4min，以5℃/min升温至115℃，保持2.5min，以10℃/min升温至210℃，保持5min；进样口温度为230℃，不分流，进样量为2μL；载气节省流量为20mL/min，载气为氮气，体积流量为0.5mL/min；氢气体积流量为40mL/min，空气体积流量为400mL/min，尾吹氮气体积流量为25mL/min；
质谱条件：EI离子源温度为230℃，接口温度为250℃，电离电压为70eV，扫描质量范围为m/z50～500，溶剂延迟3min，碰撞气：氩气，氩气纯度≥99.999％，岛津GC Solution工作站；选择离子监测SIM模式分析5个挥发性成分，其SIM模式下定量的条件为：3.50min，二烯丙基单硫醚，114.00,99.00,73.00；9.00min，二烯丙基二硫醚，81.00,105.00,146.00；11.2min，樟脑，152.00,95.00,81.00；12.8min，龙脑，154.00,100.00,95.00；17.5min，二烯丙基三硫醚，178.00,113.00,73.00；20.5min，癸酸乙酯，200.00,101.00,88.00，每个离子的dwell time皆为50；
含量测定：分析系列浓度的混合对照品工作液，建立各挥发性成分的标准曲线，对银丹心脑通软胶囊样品进行测定，通过标准曲线计算样品中各挥发性成分的含量。
前述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法中,所述挥发性成分的定量分析方法中，所述标准品溶液和内标溶液的制备中，所述系列浓度为1.80ng/mL-7200.00ng/mL。
前述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法中,还包括银丹心脑通软胶囊的指纹图谱测定方法，所述银丹心脑通软胶囊的指纹图谱测定方法为，
样品溶液的制备：将银丹心脑通软胶囊样品除去胶囊壳，称取除去胶囊壳后的银丹心脑通软胶囊样品0.6g，加入48mL75％的甲醇，称重，20℃下超声提取30min，以75％的甲醇溶液补足失重；混匀后以13000rpm高速离心10min，取上清液作为样品溶液；
色谱条件：高效液相色谱系统，含在线真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器；色谱柱：Eclipse plus C-18 column，150mm×2.1mm、1.8μm；柱温：25℃；流动相：A相为0.1％的甲酸溶液，B相为乙腈；进样体积5μL，流速1.0mL/min；0min，8％B；2min，8％B；6min，16％B；8min，18％B；16min，18％B；18min，20％B；22min，23％B；25min，24％B；28min，28％B；33min，35％B；34min，40％B；39min，70％B；43min，95％B；46min，95％B；样品溶液进样体积5μL，流速0.3mL/min；检测波长：254nm；
指纹图谱的测定：按高效液相色谱法《中华人民共和国药典》2015版一部附录Ⅵ，吸取5μL银丹心脑通样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照3.3项下的分析方法进行样品分析，记录色谱峰保留时间和峰面积，并吸取甲醇溶液，注入高效液相色谱仪，记录46分钟色谱，确定在此条件下，空白无干扰。
前述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法中,所述银丹心脑通软胶囊的指纹图谱测定方法的批间相似度为0.999。
与现有技术比较，本发明中银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的定量分析包括采用色谱质谱联用法银丹心脑通软胶囊中主要效应成分进行定量分析，通过大量的实验确定色谱和质谱参数，使得定量分析的灵敏度提高，精确度更好，鉴别能力更强，可检出成分更多，检测数据准确度更好。本发明还对银丹心脑通软胶囊中酚酸类成分、皂苷类成分、内酯类成分和丹参酮类成分、挥发性成分进行了定量分析，通过大量实验确定了各部分色谱条件和质谱条件，可准确测出67个有效成分的含量。本发明还对银丹心脑通软胶囊的指纹图谱测定参数也经过大量实验进行优化，该指纹图谱中共有26个共有峰，并以此计算批间相似度，测得不同批次间的银丹心脑通软胶囊的指纹图谱相似性度高达0.999，更好地反映了银丹心脑通软胶囊的整体化学轮廓。本发明中银丹心脑通软胶囊中主要效应成分定量分析的灵敏度更高、精确度好、鉴别能力强，可检出的成分多，检测数据准确度好。银丹心脑通软胶囊的定性分析的批间相似度好，可以更好地反映银丹心脑通软胶囊的整体化学轮廓。
附图说明
图1为银丹心脑通软胶囊中67个成分的MRM和SIM色谱图(图中：A.38个酚酸和黄酮类成分的MRM色谱图；B.24个丹参酮、皂苷类和内酯类成分的MRM色谱图；C.5个挥发性成分的SIM色谱图)；
图2为30个批次的银丹心脑通软胶囊的指纹图谱。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。
以下是本发明的实施例。
样品信息：
30个不同批次的银丹心脑通软胶囊样品(批号：20170725-20170754)。
枸橼酸(Citric Acid,P2)，没食子酸(Gallic acid,P4)，丹参素(Danshensu,P5)，儿茶素(Catechin,P11)，原儿茶酸(Protocatechuic acid,P6)，绿原酸(Chlorogenicacid,P8)，原儿茶醛(Protocatechualdehyde,P9)，隐绿原酸(Cryptochlorogenic acid,P10)，咖啡酸(Caffeic acid,P12)，表儿茶素(Epicatechin,P13)，异绿原酸B(Isochlorogenic acid B,P20)，迷迭香酸(Rosmarinic acid,P23)，紫草酸(Lithospermicacid,P24)，丹酚酸B(Salvianolic acid B,P26)，丹酚酸A(Salvianolic acid A,P28)，丹酚酸D(Salvianolic acid D,P31)，丹酚酸C(Salvianolic acid C,P30)，蝶豆素(Clitorin,F7)，芦丁(Rutin,F9)，异槲皮苷(Isoquercitrin,F15)，野黄芩苷(Scutellarin,F16)，山奈酚-7-O-葡萄糖苷(Kaempferol7-O-glucoside,F17)，槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷(Quercetin-3-O-D-glucosyl-(1-2)-L-rhamnoside,F19)，山奈酚-3-O-芸香糖苷(Kaempferol-3-O-rutinose,F20)，水仙苷(Narcissoside,F21)，芹菜素-7-O-葡萄糖苷(Apigenin-7-O-β-D-glucopyranoside,F25)，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷(Isorhamnetin-3-O-glucoside,F26)，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷(Apigenin7-O--glucuronide,F27)，杨梅素(Myricetin,F29)，槲皮素-3-(6-对香豆酰葡萄糖基--1,4-鼠李糖甙(Quercetin3-O-2”-(6”-p-coumaroyl)glucosyl rhamnoside,F34)，野黄芩素(Scutellarein,F35)，山柰酚-3-(6-对香豆酰葡萄糖基-1,2-鼠李糖甙(Kaempferol 3-O-2”-(6”-p-coumaroyl)glucosyl rhamnoside,F36)，山奈酚(Kaempferol,F39)，槲皮素(Quercetin,F40)，芹菜素(Apigenin,F42)，木犀草素(Luteolin,F43)，异鼠李素(Isorhamnetin,F44)，三七皂苷R1(Notoginsenoside R1,S1)，人参皂苷Rg1(GinsenosideRg1,S2)，人参皂苷Rd(Ginsenoside Rd,S3)，人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1,S4)，三七皂苷R2(Notoginsenoside R2,S5)，人参皂苷Rh1(Ginsenoside Rh1,S6)，人参皂苷Re(Ginsenoside Re,S8)，人参皂苷Rg6(Ginsenoside Rg6,S9)，人参皂苷Rg3(GinsenosideRg3,S12)，人参皂苷F2(Ginsenoside F2,S11)，山楂酸(Maslinic acid,S16)，白果内酯(Bilobalide,G1)，银杏内酯J(Ginkgolide J,G2)，银杏内酯C(Ginkgolide C,G3)，银杏内酯A(Ginkgolide A,G4)，银杏内酯B(Ginkgolide B,G5)，银杏内酯K(Ginkgolide K,G6)，丹参二醇C(Tanshindiol C,T1)，丹参二醇B(Tanshindiol B,T2)，紫丹参甲素(Przewaquinone A,T5)，二氢丹参酮I(Dihydrotanshinone I,T11)，丹参酮I(TanshinoneI,T15)，隐丹参酮(Cryptotanshinone,T16)，丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA,T19)，丹参新酮(Miltirone,T20)，二烯丙基硫醚(Diallyl sulfide,V1)，二烯丙基二硫醚(Diallyldisulfide,V2)，樟脑(Camphor,V3)，龙脑(Borneol,V4)，二烯丙基三硫醚(Diallyltrisulfide,V7)，柚皮素(Naringenin,IS1)，黄芩甲苷(Astragaloside A,IS2)，非诺贝特(Fenofibrate,IS3)，癸酸乙酯(Ethyl caprate,IS4)。以上标准品的纯度均≥98％。
1定量分析
利用高效液相色谱质谱联用技术，对提取物中62个主要效应成分进行定量分析，包括21个黄酮类物质，17个酚酸类物质，10个皂苷类物质，8个二萜醌类(即丹参酮类)物质，和6个银杏内酯类成分。此外，采用气相质谱联用技术，对提取物中的5个挥发性成分进行了定量分析，分别是龙脑、樟脑、二烯丙基单硫醚、二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚。
1.1试剂、仪器
HPLC级乙腈；色谱甲醇(江苏汉邦科技)；HPLC级甲酸；去离子水(18MΩCM-1)。Milli-Q去离子水系统(Millipore,Milford,MA,USA)；SHB-III循环水式多用真空泵；高速冷冻离心机；KH-500DB型数控超声仪。银丹心脑通样品和标准品的信息同上。
岛津LC-30AD高效液相色谱系统(Shimadzu,Kyoto,Japan)，含在线真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、WAD检测器；岛津LCMS-8050三重四级杆串联质谱检测器(Kyoto,Japan)，含电喷雾离子源(ESI源)，Labsolutions工作站(Shimadzu Technologies)；色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18(150×2.1mm,1.8μm,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)。Agilent 7890B气相色谱系统(Agilent,USA)，质量选择性检测器(MSD)，GC-Solution工作站，自动进样器；色谱柱：Agilent HP-5毛细管柱(30m×0.25mm，0.25mm)。
1.2非挥发性成分的定量分析
1.2.1黄酮和酚酸类成分的定量分析
1.2.1.1标准品溶液和内标溶液的制备
精密称定38个标准品，包括21个黄酮类和17个酚酸类成分，用75％甲醇水制备成混合标准品母液；精密称取柚皮苷适量，用90％甲醇水制成终度为25.6μg/mL的内标溶液。混合标准品母液中加入内标溶液后用75％甲醇制成系列浓度的混合对照品工作液，混合对照品工作液中柚皮苷终浓度为2.56μg/mL，系列浓度为混合对照品工作液中各标准品的终浓度,所述系列浓度为4.50ng/mL-18000.00ng/mL。所有样品分析前均于-20℃保存。
1.2.1.2样品溶液的制备
30个批次的银丹心脑通软胶囊样品(S1-S30)，除去胶囊壳，精密称定银丹心脑通软胶囊样品0.6g至100mL锥形瓶中，加入60mL的75％甲醇水，100Hz下超声30min。冷却至室温，75％甲醇水补足失重。将提取液于13000rpm/min离心10min，取上清转移到1.5mL离心管中，-20℃保存待测。分析前将上清稀释10倍，加入内标溶液(柚皮苷终浓度为2.56μg/mL)后，离心取上清待分析。
1.2.1.3色谱条件
岛津LC-30AD高效液相色谱系统(Shimadzu,Kyoto,Japan)，Zorbax Eclipse PlusC18(150×4.6cm,1.8μm，Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)；流动相：0.1％的甲酸水(A)和甲醇溶液(B)。洗脱程序为：0min，10％B；3min，45％B；10min，45％B；18min，90％B，21min，90％B；22min，10％B；28min，10％B。流速为0.3mL/min，柱温30℃，进样量为2μL。
1.2.3质谱条件
岛津LCMS-8050三重四级杆串联质谱检测器(Kyoto,Japan)，负离子模式检测，雾化器流速为3L/min，气体温度为350℃，加热器和干燥器流速皆为10L/min，DL温度为250℃，界面温度为300℃，界面电压为4000V。定量采用多重反应监测(MRM)模式，优化后的MRM条件如表1-1所示。
表1-1银丹心脑通软胶囊中黄酮和酚酸的MRM参数
Figure GDA0003100874610000131
Figure GDA0003100874610000141
1.2.2皂苷类、银杏内酯类和丹参酮类成分的定量分析
1.2.2.1标准品溶液和内标溶液的制备
精密称定24个标准品，包括10个皂苷类、8个丹参酮类和6个银杏内酯类成分，用75％甲醇水制备成混合标准品母液；精密称取黄芪甲苷和非诺贝特适量，用90％甲醇水制成终度分别为25.2μg/mL和508.0ng/mL的内标溶液。混合标准品母液中加入内标溶液后用75％甲醇制成系列浓度的混合对照品工作液，混合对照品工作液中黄芪甲苷和非诺贝特的终浓度分别为2.52μg/mL和50.80ng/mL，系列浓度为混合对照品工作液中各标准品的终浓度，所述系列浓度为1.60ng/mL-4000.00ng/mL。所有样品分析前均于-20℃保存。
1.2.2.2样品溶液的制备
30个批次的银丹心脑通软胶囊样品(S1-S30)，除去胶囊壳，精密称定银丹心脑通软胶囊样品0.6g至100mL锥形瓶中，加入60mL的75％甲醇水，100Hz下超声30min。冷却至室温，75％甲醇水补足失重。将提取液于13000rpm/min离心10min，取上清转移到1.5mL离心管中，-20℃保存待测。分析前将上清稀释10倍，加入内标溶液后(黄芪甲苷和非诺贝特的终浓度分别为2μg/mL和100ng/mL)，离心取上清待分析。
1.2.2.3色谱条件
岛津LC-30AD高效液相色谱系统，Zorbax Eclipse Plus C18(150×4.6cm,1.8μm)；流动相：0.1％的甲酸水(A)和乙腈溶液(B)。洗脱程序为：0min,30％B；3min,30％B；10min,60％B；14min,90％B；16min,90％B；18min,10％B；24min,10％B。流速为0.3mL/min，柱温30℃，进样量为2μL。
1.2.3质谱条件
岛津LCMS-8050三重四级杆串联质谱检测器(Kyoto,Japan)，负离子模式检测，雾化器流速为3L/min，气体温度为350℃，加热器和干燥器流速皆为10L/min，DL温度为250℃，界面温度为300℃，界面电压为4000V。定量采用多重反应监测(MRM)模式，优化后的MRM条件如表1-2所示。
表1-2银丹心脑通软胶囊中皂苷类、银杏内酯类和丹参酮类成分的MRM参数
Figure GDA0003100874610000151
Figure GDA0003100874610000161
1.3挥发性成分的定量分析
1.3.1标准品溶液和内标溶液的制备
精密称定龙脑、樟脑、二烯丙基单硫醚、二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚适量，用石油醚制备成混合标准品母液；精密称取癸酸乙酯适量，用石油醚制成终度为20.3μg/mL的内标溶液。混合标准品母液加入内标溶液后用石油醚制成系列浓度的混合对照品工作液，混合对照品工作液中癸酸乙酯的终浓度为2.03μg/mL，系列浓度为混合对照品工作液中各标准品的终浓度，所述系列浓度为1.80ng/mL-7200.00ng/mL。所有样品分析前均于-20℃保存。
1.3.2样品溶液的制备
30个批次的银丹心脑通软胶囊样品(S1-S30)，除去胶囊壳，精密称定银丹心脑通软胶囊样品0.6g至25mL锥形瓶中，加入15mL的石油醚，100Hz下超声5min。冷却至室温，石油醚补足失重。将提取液于13000rpm/min离心10min，取上清转移到1.5mL离心管中，-20℃保存待测。分析前将上清加入内标溶液后(癸酸乙酯的终浓度分别为2.03μg/mL)，离心取上清待分析。
1.3.3色谱条件
Agilent HP-5毛细管柱(30m×0.25mm，0.25mm)；程序升温：柱起始温度60℃，保持3min，以5℃/min升温至95℃，保持4min，以5℃/min升温至115℃，保持2.5min，以10℃/min升温至210℃，保持5min；进样口温度230℃，不分流，进样量2μL；载气节省流量为20mL/min，载气为氮气，体积流量0.5mL/min；氢气体积流量40mL/min，空气体积流量400mL/min，尾吹氮气体积流量25mL/min。
1.3.4质谱条件
EI离子源温度230℃，接口温度250℃，电离电压70eV，扫描质量范围m/z50～500，溶剂延迟3min，碰撞气：氩气(纯度≥99.999％)，岛津GC Solution工作站。SIM模式分析5个挥发性成分，其SIM模式下定量条件为：3.50min，二烯丙基单硫醚(114.00,99.00,73.00)；9.00min，二烯丙基二硫醚(81,105,146)；11.2min，樟脑(152.00,95.00,81.00)；12.8min，龙脑(154.00,100.00,95.00)；17.5min，二烯丙基三硫醚(178.00,113.00,73.00)；20.5min，癸酸乙酯(200.00,101.00,88.00)，每个离子的dwell time皆为50。
1.4样品含量测定
根据上面建立的LC-MS和GC-MS方法，分别分析系列浓度的混合对照品工作液，建立各黄酮类、酚酸类、皂苷类、银杏内酯类、丹参酮类和挥发性成分的标准曲线。对30批银丹心脑通软胶囊进行测定，通过标准曲线计算待测成分的含量。不同分析物的MRM及SIM色谱图如图1所示，其含量结果如表1-3，提取物中该67个化合物在银丹心脑通中的浓度在0.001-5.478μg/mg范围内。不同批次中67个分析物的总含量的百分比在2.77-4.23％。其中含量较高的是龙脑、枸橼酸、野黄芩苷、丹酚酸B、丹参素、QCGR、白果内酯、碟豆素等。银杏叶提取物中较高含量成分有QCGR和白果内酯；丹参中含量较高的成分是丹酚酸B、丹参素；灯盏细辛中含量较高的成分是野黄芩苷；三七中含量较高的成分是人参皂苷Rb1；山楂中含量较高的成分是枸橼酸；冰片中含量较高的成分是龙脑；大蒜中含量较高的成分是二烯丙基二硫醚。
表1-3 30个批次的银丹心脑通样品中67个分析物的含量测定结果(μg/mg,n＝3)
Figure GDA0003100874610000181
Figure GDA0003100874610000191
Figure GDA0003100874610000201
Figure GDA0003100874610000211
Figure GDA0003100874610000221
表1-3(续)30个批次的银丹心脑通样品中67个分析物的含量测定结果(μg/mg，n＝3)
Figure GDA0003100874610000222
Figure GDA0003100874610000231
Figure GDA0003100874610000241
Figure GDA0003100874610000251
Figure GDA0003100874610000261
Figure GDA0003100874610000271
表1-3(续)30个批次的银丹心脑通样品中67个分析物的含量测定结果(μg/mg,n＝3)
Figure GDA0003100874610000272
Figure GDA0003100874610000281
Figure GDA0003100874610000291
Figure GDA0003100874610000301
Figure GDA0003100874610000311
Figure GDA0003100874610000321
2银丹心脑通制剂指纹图谱
2.1实验材料
2.1.1实验仪器
Aglient 1290高效液相色谱仪(Agilent,USA)，由四元泵、自动进样器、柱温箱、真空脱气机、WAD检测器组成；KH-500DB型数控超声仪；Milli-Q去离子水系统(Millipore,Milford,MA,USA)；SHB-III循环水式多用真空泵；高速冷冻离心机。
2.1.2实验试药
HPLC级乙腈(Merck,LiChrosolv Reag.Ph Eur,Acetonitrile,DarmstadtGermany)；色谱甲醇(江苏汉邦科技)；
30批次银丹心脑通软胶囊，批号为：170725-170754。
2.2供试品溶液制备
分别精密称取30批次的银丹心脑通内容物0.6g，加入48mL75％甲醇，称重，20℃下超声提取30min，以75％甲醇补足失重。混匀后以13000rpm高速离心10min，取上清液作为供试品溶液。
2.3色谱条件
色谱条件：Aglient 1290高效液相色谱系统(Agilent Corp.,Santa Clara,CA,USA)，含在线真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、WAD检测器；色谱柱：Eclipse plusC-18column(150mm×2.1mm,1.8μm,Agilent Technologies,Santa Clara,CA,USA)。柱温：25℃；流动相：A相为0.1％甲酸，B相为乙腈；进样体积5μL，流速1.0mL/min；0min，8％(B)；2min，8％(B)；6min，16％(B)；8min，18％(B)；16min，18％(B)；18min，20％(B)；22min，23％(B)；25min，24％(B)；28min，28％(B)；33min，35％(B)；34min，40％(B)；39min，70％(B)；43min，95％(B)；46min，95％(B)。进样体积5μL，流速0.3mL/min。检测波长：254nm。
2.4指纹图谱方法学考察
精密度：精密称定样品，按照“供试品溶液制备”方法制备一份供试品溶液(170749)，重复进5样次。以色谱图上色谱峰相对保留时间和相对峰面积为指标计算RSD值。精密度考察结果见表2-1～2。
表2-1精密度考察—出峰时间
Figure GDA0003100874610000331
表2-2精密度考察—峰面积
Figure GDA0003100874610000332
Figure GDA0003100874610000341
稳定性：精密称定样品，按照“供试品溶液制备”方法制备一份供试品溶液(170749)，分别于0、2、4、8、12、24h检测指纹图谱。以色谱图上色谱峰相对保留时间和相对峰面积为指标计算RSD值。稳定性考察结果见表2-3、2-4。
表2-3稳定性考察—出峰时间
Figure GDA0003100874610000342
Figure GDA0003100874610000351
表2-4稳定性考察—峰面积
Figure GDA0003100874610000352
Figure GDA0003100874610000361
重现性：取同一批药物5份，精密称定，按“供试品溶液制备”方法制备供试液(170749)，以色谱图上色谱峰保留时间和峰面积为指标计算RSD值。重现性考察结果见表2-5。
表2-5重现性考察—出峰时间
Figure GDA0003100874610000362
Figure GDA0003100874610000371
2.5指纹图谱的测定
按照高效液相色谱法(《中华人民共和国药典》2015版一部附录Ⅵ，吸取5μL银丹心脑通供试品溶液，注入高效液相色谱仪，按照3.3项下的分析方法进行样品分析，记录色谱峰保留时间和峰面积。并精密吸取甲醇溶液，注入高效液相色谱仪，记录46分钟色谱，确定在此条件下，空白无干扰。三十个批次的样品，精密称定，按上述方法制备供试品溶液，分别取各样品注入液相色谱仪，三十个批次的银丹心脑通软胶囊指纹图谱。
采用国家药典委员会编写的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版”。参数设置：(1)参照谱图：本品采用S1色谱图作为相似度计算时校正的参照谱图；(2)时间窗宽度：0.10；(3)数据剪切：0-46min；(4)校正方式：由于采用梯度洗脱的方式，各批次供试品指纹图谱中色谱峰保留时间可能不一致，故相似度计算时不宜采用自动校正方式，而应进行多点校正；校正色谱峰的确定：本品色谱图中主要色谱峰在0-46min分钟内基本分布均匀，为保证不同批次制剂提取物指纹图谱匹配时校正的准确性，选择了26个共有峰(峰组)作为校正的Mark峰。对照谱图的生成：采用平均算法，由30个批次制剂提取物指纹图谱生成见图2。指纹图谱相似度计算结果以对照谱图为参照，各样品指纹图谱与对照谱图进行比较，计算得各批次制剂提取物指纹图谱相似度，结果如表2-6所示。30批银丹心脑通软胶囊相似度较高。
表2-6 30批银丹心脑通软胶囊指纹图谱相似度
Figure GDA0003100874610000372
Figure GDA0003100874610000381
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (10)

1.银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法,按照重量计算，银丹心脑通软胶囊是用银杏叶500g、丹参500g、灯盏细辛300g、绞股蓝300g、山楂400g、大蒜400g、三七200g、艾片10g制成1000粒胶囊剂，其特征在于：包括黄酮类成分和酚酸类成分的定量分析，所述黄酮类成分为，蝶豆素，芦丁，异槲皮苷，野黄芩苷，山奈酚-7-O-葡萄糖苷，槲皮素-3-O-葡萄糖-7-O-鼠李糖苷，山奈酚-3-O-芸香糖苷，水仙苷，芹菜素-7-O-葡萄糖苷，异鼠李素-3-O-葡萄糖苷，芹菜素-7-O-葡萄糖醛酸苷，杨梅素，槲皮素-3-(6-对香豆酰葡萄糖基)-p-1,4-鼠李糖甙，野黄芩素，山柰酚-3-(6-对香豆酰葡萄糖基)-p-1,2-鼠李糖苷，山奈酚，槲皮素，芹菜素，木犀草素和异鼠李素，所述酚酸类成分为，枸橼酸，没食子酸，丹参素，儿茶素，原儿茶酸，绿原酸，原儿茶醛，隐绿原酸，咖啡酸，表儿茶素，异绿原酸B，迷迭香酸，紫草酸，丹酚酸B，丹酚酸A，丹酚酸D和丹酚酸C,所述黄酮类成分和酚酸类成分的定量分析方法为，
标准品溶液和内标溶液的制备：称取各黄酮类成分和酚酸类成分的标准品，分别用75％的甲醇水溶液制备成混合标准品母液；称取柚皮苷，用90％的甲醇水溶液制成终浓度为25.6μg/mL的内标溶液；混合标准品母液中加入内标溶液后用75％的甲醇制成系列浓度的混合对照品工作液，所述混合对照品工作液中柚皮苷的终浓度为2.56μg/mL，所述系列浓度为混合对照品工作液中各黄酮类成分和酚酸类成分标准品的终浓度；以上所配溶液分析前均于-20℃保存；
样品溶液的制备：将银丹心脑通软胶囊样品除去胶囊壳，称取除去胶囊壳后的银丹心脑通软胶囊样品0.6g至100mL锥形瓶中，加入60mL的75％的甲醇水溶液，于100Hz下超声30min；冷却至室温，用75％的甲醇水溶液补足失重；于13000rpm/min离心10min，取上清转移到1.5mL离心管中，于-20℃保存；分析前将上清稀释10倍，加入内标溶液，内标溶液加入后柚皮苷终浓度为2.56μg/mL，离心取上清待分析；
检验设备：高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统；
色谱条件：负离子模式检测，采用多重反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式进行定量分析，Zorbax Eclipse Plus C18，150×4.6cm、1.8μm；流动相：A相为0.1％的甲酸水溶液，B相为甲醇溶液；洗脱程序为：0min，10％B；3min，45％B；10min，45％B；18min，90％B，21min，90％B；22min，10％B；28min，10％B；流速为0.3mL/min；柱温为30℃；进样量为2μL；
质谱条件：雾化器流速为3L/min，气体温度为350℃，加热器和干燥器流速皆为10L/min，DL温度为250℃，界面温度为300℃，界面电压为4000V；
含量测定：分析系列浓度的混合对照品工作液，建立各黄酮类成分和酚酸类成分的标准曲线，对银丹心脑通软胶囊样品进行测定，通过标准曲线计算样品中各黄酮类成分和酚酸类成分的含量。
2.根据权利要求1所述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法,其特征在于：所述质谱条件中，扫描质量范围m/z为100-760，碰撞能量CE为13-42V。
3.根据权利要求1或2所述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法,其特征在于：所述标准品溶液和内标溶液的制备中，所述系列浓度为4.50ng/mL-18000.00ng/mL。
4.根据权利要求1所述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法,其特征在于：还包括皂苷类成分、银杏内酯类成分和丹参酮类成分的定量分析，所述皂苷类成分为，三七皂苷R1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rd，人参皂苷Rb1，三七皂苷R2，人参皂苷Rh1，人参皂苷Re，人参皂苷Rg6，人参皂苷Rg3，人参皂苷F2和山楂酸，所述银杏内酯类成分为，白果内酯，银杏内酯J，银杏内酯C，银杏内酯A，银杏内酯B和银杏内酯K，所述丹参酮类成分为，丹参二醇C，丹参二醇B，紫丹参甲素，二氢丹参酮I，丹参酮I，隐丹参酮，丹参酮ⅡA和丹参新酮，所述皂苷类成分、银杏内酯类成分和丹参酮类成分的定量分析方法为，
标准品溶液和内标溶液的制备：称取各皂苷类成分、银杏内酯类成分和丹参酮类成分标准品，分别用75％的甲醇水溶液制备成混合标准品母液；称取黄芪甲苷和非诺贝特，用90％的甲醇水溶液分别制成终度为25.2μg/mL和508.0ng/mL的内标溶液；混合标准品母液中加入内标溶液后用75％的甲醇制成系列浓度的混合对照品工作液，所述混合对照品工作液中黄芪甲苷和非诺贝特的终浓度分别为2.52μg/mL和50.80ng/mL，所述系列浓度为混合对照品工作液中各皂苷类成分、银杏内酯类成分和丹参酮类成分标准品的终浓度；以上所配溶液分析前均于-20℃保存；
样品溶液的制备：将银丹心脑通软胶囊样品除去胶囊壳，称取除去胶囊壳后的银丹心脑通软胶囊样品0.6g至100mL锥形瓶中，加入60mL75％的甲醇水溶液，于100Hz下超声30min；冷却至室温，用75％的甲醇水溶液补足失重；于13000rpm/min离心10min，取上清转移到1.5mL离心管中，于-20℃保存待测；分析前将上清稀释10倍，加入内标溶液，加入内标溶液后黄芪甲苷和非诺贝特的终浓度分别为2.52μg/mL和50.80ng/mL，离心取上清待分析；
检验设备：高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统；
色谱条件：负离子模式检测，采用多重反应监测(multiple reaction monitoring，MRM)模式进行定量分析，Zorbax Eclipse Plus C18，150×4.6cm、1.8μm；流动相：A相为0.1％的甲酸水，B相为乙腈溶液；洗脱程序为：0min，30％B；3min，30％B；10min，60％B；14min，90％B；16min，90％B；18min，10％B；24min，10％B；流速为0.3mL/min；柱温为30℃；进样量为2μL；
质谱条件：雾化器流速为3L/min，气体温度为350℃，加热器和干燥器流速皆为10L/min，DL温度为250℃，界面温度为300℃，界面电压为4000V；
含量测定：分析系列浓度的混合对照品工作液，建立各皂苷类成分、银杏内酯类成分和丹参酮类成分的标准曲线，对银丹心脑通软胶囊样品进行测定，通过标准曲线计算样品中各皂苷类、银杏内酯类成分和丹参酮类成分的含量。
5.根据权利要求4所述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法,其特征在于：所述质谱条件中，扫描质量范围m/z为150-1110，碰撞能量CE为16-45V。
6.根据权利要求4或5所述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法,其特征在于：所述标准品溶液和内标溶液的制备中，所述系列浓度为1.60ng/mL-4000.00ng/mL。
7.根据权利要求1所述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法,其特征在于：还包括挥发性成分的定量分析，所述挥发性成分为龙脑、樟脑、二烯丙基单硫醚、二烯丙基二硫醚和二烯丙基三硫醚，所述挥发性成分的定量分析方法为，
标准品溶液和内标溶液的制备：称取各挥发性成分标准品，分别用石油醚制备成混合标准品母液；称取癸酸乙酯，用石油醚制成终浓度为20.3μg/mL的内标溶液；混合标准品母液加入内标溶液后用石油醚制成系列浓度的混合对照品工作液，所述混合对照品工作液中癸酸乙酯的终浓度为2.03μg/mL，所述系列浓度为混合对照品工作液中各挥发性成分标准品的终浓度；以上所配溶液分析前均于-20℃保存；
样品溶液的制备：将银丹心脑通软胶囊样品除去胶囊壳，称取除去胶囊壳后的银丹心脑通软胶囊样品0.6g至25mL锥形瓶中，加入15mL的石油醚，于100Hz下超声5min；冷却至室温，用石油醚补足失重；于13000rpm/min离心10min，取上清转移到1.5mL离心管中，于-20℃保存待测；分析前将上清加入内标溶液，加入内标溶液后癸酸乙酯的终浓度为2.03μg/mL，离心取上清待分析；
检验设备：气相色谱-串联质谱系统；
色谱条件：Agilent HP-5毛细管柱，30m×0.25mm、0.25mm；程序升温：柱起始温度为60℃，保持3min，以5℃/min升温至95℃，保持4min，以5℃/min升温至115℃，保持2.5min，以10℃/min升温至210℃，保持5min；进样口温度为230℃，不分流，进样量为2μL；载气节省流量为20mL/min，载气为氮气，体积流量为0.5mL/min；氢气体积流量为40mL/min，空气体积流量为400mL/min，尾吹氮气体积流量为25mL/min；
质谱条件：EI离子源温度为230℃，接口温度为250℃，电离电压为70eV，扫描质量范围为m/z50～500，溶剂延迟3min，碰撞气：氩气，氩气纯度≥99.999％，岛津GC Solution工作站；选择离子监测SIM模式分析5个挥发性成分，其SIM模式下定量的条件为：3.50min，二烯丙基单硫醚，114.00,99.00,73.00；9.00min，二烯丙基二硫醚，81.00,105.00,146.00；11.2min，樟脑，152.00,95.00,81.00；12.8min，龙脑，154.00,100.00,95.00；17.5min，二烯丙基三硫醚，178.00,113.00,73.00；20.5min，癸酸乙酯，200.00,101.00,88.00，每个离子的dwell time皆为50；
含量测定：分析系列浓度的混合对照品工作液，建立各挥发性成分的标准曲线，对银丹心脑通软胶囊样品进行测定，通过标准曲线计算样品中各挥发性成分的含量。
8.根据权利要求7所述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法,其特征在于：所述标准品溶液和内标溶液的制备中，所述系列浓度为1.80ng/mL-7200.00ng/mL。
9.根据权利要求1所述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法,其特征在于：还包括银丹心脑通软胶囊的指纹图谱测定方法，所述银丹心脑通软胶囊的指纹图谱测定方法为，
样品溶液的制备：将银丹心脑通软胶囊样品除去胶囊壳，称取除去胶囊壳后的银丹心脑通软胶囊样品0.6g，加入48mL75％的甲醇，称重，20℃下超声提取30min，以75％的甲醇溶液补足失重；混匀后以13000rpm高速离心10min，取上清液作为样品溶液；
色谱条件：高效液相色谱系统，含在线真空脱气机、四元泵、自动进样器、柱温箱、紫外检测器；色谱柱：Eclipse plus C-18 column，150mm×2.1mm、1.8μm；柱温：25℃；流动相：A相为0.1％的甲酸溶液，B相为乙腈；进样体积5μL，流速1.0mL/min；0min，8％B；2min，8％B；6min，16％B；8min，18％B；16min，18％B；18min，20％B；22min，23％B；25min，24％B；28min，28％B；33min，35％B；34min，40％B；39min，70％B；43min，95％B；46min，95％B；流速0.3mL/min；检测波长：254nm；
指纹图谱的测定：吸取5μL银丹心脑通样品溶液，注入高效液相色谱仪，记录色谱峰保留时间和峰面积，并吸取甲醇溶液，注入高效液相色谱仪，记录46分钟色谱，确定在此条件下，空白无干扰。
10.根据权利要求9所述的银丹心脑通软胶囊中主要效应成分的检测方法,其特征在于：所述银丹心脑通软胶囊的指纹图谱测定方法的批间相似度为0.999。
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