CN117990825A - 一种包含当归和丹参的中药组合物的质量控制方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种包含当归和丹参的中药组合物的指纹图谱构建方法，该构建方法包括如下步骤：中药组合物供试品溶液的制备；对照品溶液的制备；根据高效液相检测该中药组合物供试品溶液和该对照品溶液的结果，获得中药组合物指纹图谱。本发明对包含当归和丹参的中药组合物的化学成分进行了全面系统地解析，为质量控制和药效物质基础的深入研究提供了理论依据。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种包含当归和丹参的中药组合物的质量控制方法及其应用。
背景技术
中药经典名方汤剂作为传统的中医临床用药的最常用的剂型，具有组方合理、起效迅速、疗效显著、易于吸收等优点，深受广大患者的信赖。却因调配、携带、临时煎煮、久置容易发生霉败变质、汤液味苦和量大，以及标准难以统一，严重影响其临床疗效等缺点，不能适应现代人的生活要求。为了保持汤剂的优势，克服汤剂的种种不足，国家药品监督管理局药品审评中心于2021年08月31日发布的《按古代经典名方目录管理的中药复方制剂药学研究技术指导原则(试行)》中明确指出按古代经典名方目录管理的中药复方制剂的质量应与经典名方基准样品的质量基本一致。基准样品代表了制剂的整体内在质量，除了成型工艺外，基准样品与制剂的其余质量控制指标均基本一致。因此基准样品是制剂内在质量的实物对照，是大生产工艺优化及其质量标准制定的参照物。基准样品是经典名方乃至所有中药研发的基准，是保证药物的安全性和有效性的对照物。经典名方复方制剂生产工艺路线制定、参数的优化和质量标准制定要以经典名方基准样品为参照。基准样品是沟通临床-企业-科研的纽带，是传承、应用和发扬传统中医药的基准。
指纹图谱是基于中药物质群整体作用的认识，借助于波谱和色谱技术获得中药化学成分的光谱或色谱图，是实现鉴别中药真实性、评价质量一致性和产品稳定性的可行模式，具有信息量大、特征性强、整体性和模糊性等特点。中药指纹图谱能较全面地反映药材所含化学成分的相对关系，体现了中药成分的复杂性和相关性，与中医药的传统理论相适应，能真正对中药内在质量进行有效表征、综合评价和全面控制，尤其适用于有效成分不完全明确或不需要完全明确的情况下，对中药材及中药产品进行质量控制。中药指纹图谱除能用于考察中药材产地、采收季节、采收部位、炮制加工、储存时间等因素，以提供依据鉴别生产前原料药材的真伪优劣，更可用于中药生产过程的质量控制：追踪制剂中某些化学成分的变化，监测原料药材与成品之间、成品的各批次间质量的一致性及稳定性。与指标成分含量测定的质量分析方法相比，指纹图谱能够比较全面地反映中药化学成分的种类和数量，在中药复方制剂有效成分尚未完全阐明的现状下，可实现对中药内在质量的综合评价和对其整体物质的有效控制，是目前中药及其制剂质量控制的有效手段之一。
目前，尚未见文献报道对本发明所要求保护的包含当归和丹参的中药组合物的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究，现有技术中，仅对该中药复方中的单一成分进行质量分析，尚无较全面、系统的质量控制方法反映本发明的中药复方及成品中主要基准样品成分的质量状况，无法对其生产过程及产品质量有效控制，不能较好地保证其临床疗效，故需采用能全面控制本发明的中药复方整体质量的指纹图谱的质控方法控制其关键质量。
发明内容
基于此，本发明提供了一种包含当归和丹参的中药组合物的指纹图谱构建方法，该构建方法包括如下步骤：
中药组合物供试品溶液的制备：称取适量的包含当归和丹参的中药组合物粉末，置于容量瓶中，加入第一溶剂，密塞，称定重量，超声处理之后放冷，再次称定重量，使用第一溶剂补充损失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到该中药组合物供试品溶液；
对照品溶液的制备：称取适量的阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯对照品，添加甲醇配制成阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯的浓度分别为0.1～500μg/ml的该对照品溶液；
根据高效液相检测该中药组合物供试品溶液和该对照品溶液的结果，获得中药组合物指纹图谱；
该高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～15min，90％B→80％B；15～40min，80％B→75％B；40～50min，75％B→70％B；50～60min，70％B→40％B；60～70min，40％B→30％B；70～80min，30％B→25％B；80～81min，25％B→90％B；81～90min，90％B，流速为0.5～1.5ml/min，柱温为10～40℃，检测波长为150～350nm，进样量为1～20μl。
进一步地，该包含当归和丹参的中药组合物粉末的制备方法包括：(a)称取适量的当归、丹参、乳香和没药，加入第一次水进行第一次浸泡，武火煎煮至沸腾之后继续煎煮一段时间，得到第一煎煮液，过滤得到第一滤液和滤渣；(b)在该滤渣中加入第二次水，武火煎煮至沸腾之后改文火煎煮一段时间，得到第二煎煮液，过滤得到第二滤液；以及(c)将该第一滤液和该第二滤液合并，干燥，得到该包含当归和丹参的中药组合物粉末。
进一步地，该第一次水的体积与该当归、丹参、乳香和没药的质量之和的体积/质量(mL/g)之比值为1～10，例如约8。
进一步地，该第一次浸泡的时间为10～60min，例如约30min。
进一步地，该武火煎煮至沸腾之后继续煎煮的时间为10～60min，例如约30min。
进一步地，该文火煎煮的时间为10～60min，例如约30min。
进一步地，该第二次水的体积与该当归、丹参、乳香和没药的质量之和的体积/质量(mL/g)之比值为1～10，例如约5。
进一步地，该干燥为冷冻干燥。
进一步地，在该中药组合物供试品溶液的制备中，该容量瓶为具塞锥形瓶。
进一步地，该第一溶剂为醇，例如乙醇。
进一步地，该乙醇的体积百分比浓度为10％～90％，进一步70％～90％，例如约80％。
进一步地，该包含当归和丹参的中药组合物粉末与该第一溶剂的质量/体积(mg/ml)之比值为1～10，例如约4。
进一步地，该超声的功率为150～350W，例如约250W。
进一步地，该超声的频率为30～50kHz，例如约40kHz。
进一步地，该超声的时间为5～20min，例如约10min。
进一步地，该对照品溶液中阿魏酸的浓度为约100μg/ml。
进一步地，该对照品溶液中丹酚酸B的浓度为约100μg/ml。
进一步地，该对照品溶液中藁本内酯的浓度为约100μg/ml。
进一步地，该高效液相检测的该流速为0.8～1.2ml/min，例如约1.0ml/min。
进一步地，该柱温为25～35℃，例如约30℃。
进一步地，该检测波长为250～330nm，例如286nm。
进一步地，该进样量为10～20μl，例如约15μl。
进一步地，该对照品对应的色谱峰的理论塔板数不低于5000。
进一步地，其特征在于在该检测波长为286nm时，该指纹图谱包括1-16号峰，其中，9号峰为丹酚酸B作为参照峰，1-16号峰的保留时间平均值分别对应为约6.0min、约9.3min、约10.5min、约13.3min、约20.7min、约25.5min、约30.1min、约32.5min、约38.0min、约42.4min、约44.3min、约64.8min、约67.3min、约69.6min、约76.7min和约78.6min。
进一步地，在该检测波长为286nm时，该指纹图谱包括1-16号峰，其中9号峰为丹酚酸B作为参照峰，1-16号峰的相对保留时间平均值分别对应为约0.16、约0.25、约0.28、约0.35、约0.55、约0.67、约0.79、约0.86、约1.00、约1.11、约1.17、约1.71、约1.77、约1.83、约2.02和约2.07。
进一步地，该当归、该丹参、该乳香和该没药之间的质量之比为(0.1～5):(0.1～5):(0.1～5):(0.1～5)。
进一步地，该当归、该丹参、该乳香和该没药之间的质量之比为(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)。
进一步地，该当归、该丹参、该乳香和该没药之间的质量之比为约1:约1:约1:约1。
进一步地，该当归的质量范围为10～30g，例如约18.65g。
进一步地，该丹参的质量范围为10～30g，例如约18.65g。
进一步地，该乳香的质量范围为10～30g，例如约18.65g。
进一步地，该没药的质量范围为10～30g，例如约18.65g。
进一步地，流动相A为乙腈。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
进一步地，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
进一步地，该酸水溶液为0.01％～1％的酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为0.01％～1％的磷酸水溶液。
进一步地，该酸水溶液为约0.1％的磷酸水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
进一步地，该缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0。
进一步地，该色谱柱为GL InterSuatain C18色谱柱或Agilent 5TC-C18(2)色谱柱或中谱科技RD-C18色谱柱。
进一步地，该色谱柱的规格：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。
进一步地，在该检测波长为286nm时，5号峰为阿魏酸，9号峰为丹酚酸B，13号峰为藁本内脂。
进一步地，在该检测波长为286nm时，1号峰、3号峰、4号峰和12号峰来自当归、丹参、乳香和没药药材，2号峰和5号峰来自当归、丹参和乳香药材，6号峰来自丹参、乳香和没药药材，7号峰和8号峰来自当归、丹参和没药药材，9号峰、10号峰、11号峰和15号峰来自丹参药材，13号峰来自当归、乳香和没药药材，14号峰和16号峰来自乳香和没药药材。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含当归和丹参的中药组合物的质量控制方法，该质量控制方法包括如下步骤：
(1)根据上述指纹图谱构建方法建立中药组合物基准样品标准指纹图谱；
(2)取中药组合物供试品溶液，根据上述指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测，得到中药组合物待测样品指纹图谱；以及
(3)将步骤(2)所得到的该中药组合物待测样品指纹图谱与步骤(1)所得到的该中药组合物基准样品标准指纹图谱进行对比，符合要求的则为合格产品，不符合要求的则为不合格产品。
进一步地，该符合要求包括以下的一种或多种：
(1)该中药组合物待测样品指纹图谱中呈现出16个特征色谱峰，各特征色谱峰的保留时间在该中药组合物基准样品标准指纹图谱中相应的对照品色谱峰的保留时间值的±10％之内；
(2)以丹酚酸B的色谱峰为S峰，中药组合物待测样品指纹图谱中的各特征色谱峰与S峰的相对保留时间在该中药组合物基准样品标准指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10％之内；以及
(3)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，该中药组合物待测样品指纹图谱与该中药组合物基准样品标准指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述构建方法或上述质量控制方法在包含当归和丹参的中药组合物的质量检测和/或质量评价和/或质量控制中的用途。
本发明的有益效果：
简而言之，本发明提供了一种包含当归和丹参的中药复方基准样品的指纹图谱测定和质量控制方法，该方法确认了16个共有特征峰，条件简单，分析时间短，解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题，保证了基准样品的化学组成稳定性和使用安全性，为后续制剂的质量控制提供了重要的参考依据，确保产品的质量稳定，保障中药复方的疗效，让该中药复方更好地为人类生命健康服务。
具体而言，与现有技术相比，本发明的有益效果如下：
(1)建立本发明中药复方基准样品的指纹图谱，克服了单一成分含量测定难以反映整体含量的缺陷，可以从整体上、宏观上控制本发明中药复方基准样品的内在质量，保证了药物的疗效，利用现代药物研究的主要手段，实现精品传承经典，使经典名方得到了更为正规的质量控制。
(2)本发明中药复方基准样品中化学成分复杂，要实现其特征峰的分离难度大，本发明在建立起指纹图谱的过程中，采用了梯度洗脱的方法，解决了指纹特征峰难以分开和杂质峰的干扰问题。
(3)本发明在建立本发明中药复方基准样品的指纹图谱过程中，确认了16个共有特征峰，并对其相对保留时间和相对峰面积和相似度进行了研究，保证了基准样品的化学组成稳定性和使用安全性，为后续复方制剂的质量控制提供重要的参考依据和质量参照。
(4)以本发明中药复方基准样品中各有效成分指纹图谱作为一个整体看待，注重各个特征峰的前后顺序和相互关系，既避免了因只测定一、二个化学成分而判定本发明中药复方基准样品整体质量的片面性，又减少了为质量达标而人为处理的可能性，为完整、准确评价本发明中药复方基准样品的质量提供了新的方法和手段。
(5)本发明方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本发明要求保护的范围。
图1为本品粉末供试品溶液仪器精密度试验相似度匹配图。R：对照指纹图谱；S1：精密度-1；S2：精密度-2；S3：精密度-3；S4：精密度-4；S5：精密度-5；S6：精密度-6。
图2为本申请的中药复方粉末的三批煎液指纹图谱。
图3为本品粉末供试品溶液对照指纹图谱。其中，5号峰为阿魏酸，9号峰为丹酚酸B，13号峰为藁本内脂。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另外说明，本文所用的所有技术和科学术语和缩略语具有本发明领域或该术语应用领域中普通技术人员通常所理解的含义。虽然本发明实施过程中可使用类似于或等价于本文公开的那些的任何方法、条件、物质或材料，但本文描述了优选的方法、条件物质或材料。
本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。
说明书和所附权利要求中所用的单数形式“一个”，“一种”和“所述”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。
在本发明中，术语“包括”与“包含”同义。本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。
正如背景技术部分所描述的，尚未见文献报道对本发明所要求保护的包含当归和丹参的中药组合物的化学成分进行全面地分析以及指纹图谱研究。为了解决上述问题，本发明提供了一种包含当归和丹参的中药组合物的指纹图谱构建方法，该构建方法包括如下步骤：
中药组合物供试品溶液的制备：称取适量的包含当归和丹参的中药组合物粉末，置于容量瓶中，加入第一溶剂，密塞，称定重量，超声处理之后放冷，再次称定重量，使用第一溶剂补充损失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到该中药组合物供试品溶液；
对照品溶液的制备：称取适量的阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯对照品，添加甲醇配制成阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯的浓度分别为0.1～500μg/ml的该对照品溶液；
根据高效液相检测该中药组合物供试品溶液和该对照品溶液的结果，获得中药组合物指纹图谱；
该高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～15min，90％B→80％B；15～40min，80％B→75％B；40～50min，75％B→70％B；50～60min，70％B→40％B；60～70min，40％B→30％B；70～80min，30％B→25％B；80～81min，25％B→90％B；81～90min，90％B，流速为0.5～1.5ml/min，柱温为10～40℃，检测波长为150～350nm，进样量为1～20μl。
在本发明中，时间、流速、柱温、波长、进样量、比值、浓度、功率、频率、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“10～40”时，所描述的范围应被解释为包括范围“10～40”、“10～35”、“10～30”、“10～25”、“10～20”、“10～15”、“15～40”、“15～35”、“15～30”、“15～25”、“15～20”、“20～40”、“20～35”、“20～30”、“20～25”、“25～40”、“25～35”、“25～30”、“30～40”、“30～35”、“35～40”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。
在一种优选的实施方式中，该包含当归和丹参的中药组合物粉末的制备方法包括：(a)称取适量的当归、丹参、乳香和没药，加入第一次水进行第一次浸泡，武火煎煮至沸腾之后继续煎煮一段时间，得到第一煎煮液，过滤得到第一滤液和滤渣；(b)在该滤渣中加入第二次水，武火煎煮至沸腾之后改文火煎煮一段时间，得到第二煎煮液，过滤得到第二滤液；以及(c)将该第一滤液和该第二滤液合并，干燥，得到该包含当归和丹参的中药组合物粉末。
在一种优选的实施方式中，该第一次水的体积与该当归、丹参、乳香和没药的质量之和的体积/质量(mL/g)之比值为1～10，例如约8。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约8”包括8的±5％，或从7.6到8.4。
在一种优选的实施方式中，该第一次浸泡的时间为10～60min，例如约30min。
在一种优选的实施方式中，该武火煎煮至沸腾之后继续煎煮的时间为10～60min，例如约30min。
在一种优选的实施方式中，该文火煎煮的时间为10～60min，例如约30min。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5。
在一种优选的实施方式中，该第二次水的体积与该当归、丹参、乳香和没药的质量之和的体积/质量(mL/g)之比值为1～10，例如约5。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约5”包括5的±5％，或从4.75到5.25。
在一种优选的实施方式中，该干燥为冷冻干燥。
在一种优选的实施方式中，在该中药组合物供试品溶液的制备中，该容量瓶为具塞锥形瓶。
在一种优选的实施方式中，该第一溶剂为醇，例如乙醇。
在一种优选的实施方式中，该乙醇的体积百分比浓度为10％～90％，进一步70％～90％，例如约80％。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约80％”包括80％的±5％，或从76％到84％。
在一种优选的实施方式中，该包含当归和丹参的中药组合物粉末与该第一溶剂的质量/体积(mg/ml)之比值为1～10，例如约4。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约4”包括4的±5％，或从3.8到4.2。
在一种优选的实施方式中，该超声的功率为150～350W，例如约250W。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约250”包括250的±5％，或从237.5到262.5。
在一种优选的实施方式中，该超声的频率为30～50kHz，例如约40kHz。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约40”包括40的±5％，或从38到42。
在一种优选的实施方式中，该超声的时间为5～20min，例如约10min。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约10”包括10的±5％，或从9.5到10.5。
在一种优选的实施方式中，该对照品溶液中阿魏酸的浓度为约100μg/ml。
在一种优选的实施方式中，该对照品溶液中丹酚酸B的浓度为约100μg/ml。
在一种优选的实施方式中，该对照品溶液中藁本内酯的浓度为约100μg/ml。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约100”包括100的±5％，或从95到105。
在一种优选的实施方式中，该高效液相检测的该流速为0.8～1.2ml/min，例如约1.0ml/min。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约1.0”包括1.0的±5％，或从0.95到1.05。
在一种优选的实施方式中，该柱温为25～35℃，例如约30℃。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约30”包括30的±5％，或从28.5到31.5。
在一种优选的实施方式中，该检测波长为250～330nm，例如286nm。
在一种优选的实施方式中，该进样量为10～20μl，例如约15μl。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约15”包括15的±5％，或从14.25到15.75。
在一种优选的实施方式中，该对照品对应的色谱峰的理论塔板数不低于5000。
在一种优选的实施方式中，其特征在于在该检测波长为286nm时，该指纹图谱包括1-16号峰，其中，9号峰为丹酚酸B作为参照峰，1-16号峰的保留时间平均值分别对应为约6.0min、约9.3min、约10.5min、约13.3min、约20.7min、约25.5min、约30.1min、约32.5min、约38.0min、约42.4min、约44.3min、约64.8min、约67.3min、约69.6min、约76.7min和约78.6min。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约6.0”包括6.0的±5％，或从5.7到6.3；“约9.3”包括9.3的±5％，或从8.835到9.765；“约10.5”包括10.5的±5％，或从9.975到11.025；
“约13.3”包括13.3的±5％，或从12.635到13.965；“约20.7”包括20.7的±5％，或从19.665到21.735；“约25.5”包括25.5的±5％，或从24.225到26.775；“约30.1”包括30.1的±5％，或从28.595到31.605；
“约32.5”包括32.5的±5％，或从30.875到34.125；“约38.0”包括38.0的±5％，或从36.1到39.9；“约42.4”包括42.4的±5％，或从40.28到44.52；“约44.3”包括44.3的±5％，或从42.085到45.515；“约64.8”包括64.8的±5％，或从61.56到68.04；“约67.3”包括67.3的±5％，或从63.935到70.665；“约69.6”包括69.6的±5％，或从66.12到73.08；“约76.7”包括76.7的±5％，或从72.865到80.535；“约78.6”包括78.6的±5％，或从74.67到82.53。
在一种优选的实施方式中，在该检测波长为286nm时，该指纹图谱包括1-16号峰，其中9号峰为丹酚酸B作为参照峰，1-16号峰的相对保留时间平均值分别对应为约0.16、约0.25、约0.28、约0.35、约0.55、约0.67、约0.79、约0.86、约1.00、约1.11、约1.17、约1.71、约1.77、约1.83、约2.02和约2.07。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.16”包括0.16的±5％，或从0.152到0.168；“约0.25”包括0.25的±5％，或从0.2375到0.2625；“约0.28”包括0.28的±5％，或从0.266到0.294；“约0.35”包括0.35的±5％，或从0.3325到0.3675；“约0.55”包括0.55的±5％，或从0.5225到0.5775；“约0.67”包括0.67的±5％，或从0.6365到0.7035；“约0.79”包括0.79的±5％，或从0.7505到0.8295；“约0.86”包括0.86的±5％，或从0.817到0.903；“约1.00”包括1.00的±5％，或从0.95到1.05；“约1.11”包括1.11的±5％，或从1.0545到1.1655；“约1.17”包括1.17的±5％，或从1.1115到1.2285；“约1.71”包括1.71的±5％，或从1.6245到1.7955；“约1.77”包括1.77的±5％，或从1.6815到1.8585；“约1.83”包括1.83的±5％，或从1.7385到1.9215；“约2.02”包括2.02的±5％，或从1.919到2.121；“约2.07”包括2.07的±5％，或从1.9665到2.1735。
在一种优选的实施方式中，该当归、该丹参、该乳香和该没药之间的质量之比为(0.1～5):(0.1～5):(0.1～5):(0.1～5)。
在一种优选的实施方式中，该当归、该丹参、该乳香和该没药之间的质量之比为(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)。
在一种优选的实施方式中，该当归、该丹参、该乳香和该没药之间的质量之比为约1:约1:约1:约1。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约1”包括1的±5％，或从0.95到1.05。
在一种优选的实施方式中，该当归的质量范围为10～30g，例如约18.65g。
在一种优选的实施方式中，该丹参的质量范围为10～30g，例如约18.65g。
在一种优选的实施方式中，该乳香的质量范围为10～30g，例如约18.65g。
在一种优选的实施方式中，该没药的质量范围为10～30g，例如约18.65g。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约18.65”包括18.65的±5％，或从17.7175到19.5825。
在一种优选的实施方式中，流动相A为乙腈。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.01％～1％的酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为0.01％～1％的磷酸水溶液。
在一种优选的实施方式中，该酸水溶液为约0.1％的磷酸水溶液。
在本发明中，“约”是指一个特定值的±5％范围的值。例如，“约0.1％”包括0.1％的±5％，或从0.095％到0.105％。
在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液。
在一种优选的实施方式中，该缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0。
在一种优选的实施方式中，该色谱柱为GL InterSuatain C18色谱柱或Agilent5TC-C18(2)色谱柱或中谱科技RD-C18色谱柱。
在一种优选的实施方式中，该色谱柱的规格：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm。
在一种优选的实施方式中，在该检测波长为286nm时，5号峰为阿魏酸，9号峰为丹酚酸B，13号峰为藁本内脂。
在一种优选的实施方式中，在该检测波长为286nm时，1号峰、3号峰、4号峰和12号峰来自当归、丹参、乳香和没药药材，2号峰和5号峰来自当归、丹参和乳香药材，6号峰来自丹参、乳香和没药药材，7号峰和8号峰来自当归、丹参和没药药材，9号峰、10号峰、11号峰和15号峰来自丹参药材，13号峰来自当归、乳香和没药药材，14号峰和16号峰来自乳香和没药药材。
根据本发明的另一个方面，提供了一种包含当归和丹参的中药组合物的质量控制方法，该质量控制方法包括如下步骤：
(1)根据上述指纹图谱构建方法建立中药组合物基准样品标准指纹图谱；
(2)取中药组合物供试品溶液，根据上述指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测，得到中药组合物待测样品指纹图谱；以及
(3)将步骤(2)所得到的该中药组合物待测样品指纹图谱与步骤(1)所得到的该中药组合物基准样品标准指纹图谱进行对比，符合要求的则为合格产品，不符合要求的则为不合格产品。
在一种优选的实施方式中，该符合要求包括以下的一种或多种：
(1)该中药组合物待测样品指纹图谱中呈现出16个特征色谱峰，各特征色谱峰的保留时间在该中药组合物基准样品标准指纹图谱中相应的对照品色谱峰的保留时间值的±10％之内；
(2)以丹酚酸B的色谱峰为S峰，中药组合物待测样品指纹图谱中的各特征色谱峰与S峰的相对保留时间在该中药组合物基准样品标准指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10％之内；以及
(3)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，该中药组合物待测样品指纹图谱与该中药组合物基准样品标准指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
根据本发明的另一个方面，提供了一种上述构建方法或上述质量控制方法在包含当归和丹参的中药组合物的质量检测和/或质量评价和/或质量控制中的用途。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
本发明提到的上述特征，或实施例提到的特征可以任意组合。本专利说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
实施例
本发明的包含当归和丹参的中药组合物制备方法：
处方：当归18.65g、丹参18.65g、生明乳香18.65g、生明没药18.65g。
制法：根据处方分别称取当归、丹参、乳香、没药，加入8倍量水，浸泡30min。武火煮沸后继续煎煮30min，滤出药汁。二煎，加入5倍量的水武火煎煮至沸腾后改文火煎煮30min，滤出药汁。合并2次煎煮滤液，冷冻干燥即得。
1、仪器与试药
仪器：高效液相色谱仪安捷伦1260色谱系统，包括G1322A型脱气机、G1311A型四元泵、G1313A型自动进样器、G1315B型DAD二极管阵列检测器、G1316A型柱温箱、ChemStation色谱工作站；高效液相色谱仪Waters 2695色谱系统，包括四元梯度输液泵(Alliance 2695型)、120位高性能自动进样器、原装进口色谱柱温箱、Waters 2996型DAD二极管阵列检测器、Empower 3色谱管理系统；电子分析天平：Sartorius(赛得利斯)BSA124S、JY2002；超声清洗机：KQ-500DB型昆山市超声仪器有限公司。色谱柱：色谱柱1：GL InterSuatain C18 5μm(250×4.6mm)SN:23A0382302；色谱柱2：Agilent 5TC-C18(2)(250×4.6mm)SN:723797；色谱柱3：中谱科技RD-C18 5μm(250×4.6mm)SN:018023390；乙腈为色谱纯，磷酸为色谱纯，甲醇为色谱纯，水为纯化水。对照品信息：阿魏酸(批号110773-201915，含量99.4％，中国食品药品检定院)；丹酚酸B(批号111562-202318，含量97.5％，中国食品药品检定院)；藁本内酯(批号111737-201910，含量100.0％，中国食品药品检定院)。
2、溶液的制备
(1)对照品溶液的配制
精密称取阿魏酸、丹酚酸B、藁本内酯对照品适量，加甲醇溶解，制成各含阿魏酸、丹酚酸B、藁本内酯0.1mg/ml的混合对照品溶液。
(2)供试品溶液的制备
根据处方分别称取当归18.65g、丹参18.65g、生明乳香18.65g、生明没药18.65g，加入8倍量水，浸泡30min。武火煮沸后继续煎煮30min，滤出药汁。二煎，加入5倍量的水武火煎煮至沸腾后改文火煎煮30min，滤出药汁。合并2次煎煮滤液，冷冻干燥即得。
取本品粉末约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)10分钟，取出，放冷，再称定重量，并用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
(3)阴性溶液的制备
①缺当归的阴性样品溶液的制备：按处方称取当归的其他药味，按供试品制备方法制得缺当归的阴性样品，按“(2)供试品溶液的制备”制备缺当归的阴性样品溶液。
②缺丹参的阴性样品溶液的制备：按处方称取丹参的其他药味，按供试品制备方法制得缺丹参的阴性样品，按“(2)供试品溶液的制备”制备缺丹参的阴性样品溶液。
③缺乳香的阴性样品溶液的制备：按处方称取乳香的其他药味，按供试品制备方法制得缺乳香的阴性样品，按“(2)供试品溶液的制备”制备缺乳香的阴性样品溶液。
④缺没药的阴性样品溶液的制备：按处方称取没药的其他药味，按供试品制备方法制得缺没药的阴性样品，按“(2)供试品溶液的制备”制备缺没药的阴性样品溶液。
(4)单味阴性药材溶液的制备
①当归单味药材阴性样品溶液的制备：按处方称取当归药味，加入8倍量水，浸泡30min。武火煮沸后继续煎煮30min，滤出药汁。二煎，加入5倍量的水武火煎煮至沸腾后改文火煎煮30min，滤出药汁。合并2次煎煮滤液。取本品滤液约10g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％甲醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)10分钟，取出，放冷，再称定重量，并用80％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
②丹参单味药材阴性样品溶液的制备：按处方称取丹参药味，按“(4)①当归单味药材阴性样品溶液的制备”制备丹参单味药材阴性样品溶液。
③乳香单味药材阴性样品溶液的制备：按处方称取丹参药味，按“(4)①当归单味药材阴性样品溶液的制备”制备乳香单味药材阴性样品溶液。
④没药单味药材阴性样品溶液的制备：按处方称取丹参药味，按“(4)①当归单味药材阴性样品溶液的制备”制备没药单味药材阴性样品溶液。
3、色谱条件考察
照高效液相色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0512)测定。
初始色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，0.1％磷酸为流动相B；按表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为286nm。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于6000。
表1初始洗脱梯度
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～15 | 10→20 | 90→80 |
| 15～40 | 20→25 | 80→75 |
| 40～50 | 25→30 | 75→70 |
| 50～60 | 30→80 | 70→20 |
| 60～61 | 80→10 | 20→90 |
| 61～70 | 10 | 90 |
为了使色谱图谱中各主要色谱峰均有较好的分离参数，呈现较优的色谱行为，选用GL Sciences InterSustain C18(4.6×250mm)色谱柱，检测波长为286nm，以乙腈为流动相A；以0.1％磷酸溶液为流动相B；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃，对洗脱梯度进行优化，优化的梯度程序如下。
表2优化的梯度1
表3优化的梯度2
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～15 | 10→20 | 90→80 |
| 15～40 | 20→25 | 80→75 |
| 40～50 | 25→30 | 75→70 |
| 50～51 | 30→65 | 70→35 |
| 51～65 | 65 | 35 |
| 65～70 | 65→70 | 35→30 |
| 70～71 | 70→10 | 30→90 |
| 71～80 | 10 | 90 |
表4优化的梯度3
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～15 | 10→20 | 90→80 |
| 15～40 | 20→25 | 80→75 |
| 40～50 | 25→30 | 75→70 |
| 50～55 | 30→65 | 70→35 |
| 55～65 | 65 | 35 |
| 65～70 | 65→70 | 35→30 |
| 70～71 | 70→10 | 30→90 |
| 71～80 | 10 | 90 |
表5优化的梯度4
表6优化的梯度5
| 时间(分钟) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0～15 | 10→20 | 90→80 |
| 15～40 | 20→25 | 80→75 |
| 40～50 | 25→30 | 75→70 |
| 50～60 | 30→60 | 70→40 |
| 60～70 | 60→70 | 40→30 |
| 70～80 | 70→75 | 30→25 |
| 80～81 | 75→10 | 25→90 |
| 81～90 | 10 | 90 |
结果分析，表1的原洗脱梯度保留时间06-60分钟，洗脱出峰均匀，且峰型较好，但是60-64分钟，未将峰完全分离。表2的优化的梯度1保留时间65-73分钟，洗脱已有所改善，但仍然存在峰未完全分离的情况。表3的优化的梯度2保留时间54-60分钟基线不稳，保留时间60-65分钟色谱峰分离不佳。表4的优化的梯度3保留时间50-60分钟基线问题和保留时间60-65分钟色谱峰分离已有所改善，但仍然存在峰未完全分离的情况。表5的优化的梯度4保留时间50-60分钟基线与梯度3相比改善很多，保留时间65-75分钟色谱峰分离稍好，但仍然存在峰未完全分离的情况。
结果表明，与其他梯度洗脱条件相比，在表6的梯度5的洗脱程序下，基线更加平稳，各主要色谱峰数目较多，且分离更好，故选择表6的梯度5色谱条件用于指纹图谱测定。
确定的色谱条件及系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A；以0.1％磷酸溶液为流动相B；按表6中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为286nm。理论板数按丹酚酸B峰计算应不低于5000。
4、供试品制备方法考察
4.1、取样量考察
不同取样量会影响到各指纹峰的提取效率。因此比较取样量0.1g、0.2g和0.3g供试品指标成分的提取效率，结合各指纹峰的参数综合确定合适的取样量。
结果分析，当取样量为0.2g、0.3g时，共出现17个色谱峰，保留时间大致为6.1min、9.6min、10.8min、13.7min、21.4min、26.2min、31.0min、33.4min、39.0min、43.2min、45.2min、61.4min、65.6min、68.1min、70.4min、77.5min、81.0min，且峰型较好；当取样量为0.1g时，缺少五个色谱峰，猜测为取样量太少提取不完全。对比总峰面积/取样量的结果，取样量为0.2g时总峰面积/取样量最高，表明0.2g取样量提取率较高，故确定供试品制备的取样量为0.2g。
4.2、不同溶剂考察
不同溶剂会影响到各指纹峰的提取效率。因此比较80％乙醇和80％甲醇供试品指标成分的提取效率，结合各指纹峰的参数综合确定合适的溶剂。
结果分析，由不同溶剂种类考察结果可知80％甲醇和80％乙醇均出现17个色谱峰，且峰型较好。对比总峰面积/取样量的结果，溶剂种类为80％乙醇时总峰面积/取样量最高，表明80％乙醇溶剂提取率较高，故确定供试品制备的溶剂种类为80％乙醇。
4.3、溶剂浓度考察
不同比例溶剂会影响到各指纹峰的提取效率。因此比较50％、80％、100％“4.2、不同溶剂考察”确定的溶剂供试品指标成分的提取效率，结合各指纹峰的参数综合确定合适的溶剂浓度。
结果分析，由不同溶剂浓度考察结果可知50％、80％和100％乙醇均出现17个色谱峰，且峰型较好。对比总峰面积/取样量的结果，溶剂种类为80％乙醇时总峰面积/取样量最高，表明80％乙醇溶剂提取率较高，故确定供试品制备的溶剂浓度为80％乙醇。
4.4、进样量考察
比较10、15、20μL超声功率供试品指标成分的提取效率，结合各指纹峰的参数综合确定合适的进样量。
结果分析，由不同进样量考察结果可知进样量为10μL、15μL、20μL均出现16个色谱峰，由于61.4min的色谱峰收到空白溶剂的影响不纳入指纹图谱的统计，且16个峰型均较好。对比总峰面积/进样量的结果，进样量10μL、15μL、20μL相差不大，但进样量15μL时总峰面积/取样量最高，为了确保该方法的重现性较好，故确定供试品制备的进样量为15μL。
4.5、供试品制备方法确认
取本品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)10分钟，取出，放冷，再称定重量，并用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。分别精密吸对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
5、分析方法验证
对上述所建立的指纹图谱，参照《中国药典》2020年版四部9101分析方法验证指导原则及《国家药品标准工作手册》(第四版)等进行系统的方法学验证。
5.1、专属性
按照供试品溶液制备方法依法制备阴性空白样品溶液，按“确定的色谱条件及系统适用性试验”的方法试验，记录色谱图。
结果分析，缺当归阴性样品中出现15个指纹峰，缺少峰5(阿魏酸)，表明峰5(阿魏酸)来自当归药材。缺丹参阴性样品出现9个指纹峰，缺少峰6、峰7、峰8、峰9(丹酚酸B)、峰10、峰11、峰15，表明上述7个峰来自丹参药材。缺乳香阴性样品中出现15个指纹峰，缺少峰7和峰8，表明峰7和峰8来自乳香药材。缺没药阴性样品中出现14个指纹峰，缺峰12和峰14，表明峰12和峰14来自没药药材。
当归单味阴性样品中出现9个指纹峰，分别为峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰7、峰8、峰12、峰13，表明该9个指纹峰来源于当归药材。丹参单味阴性样品中出现13个指纹峰，分别为峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9、峰10、峰11、峰12、峰15，表明该13个指纹峰来源于丹参药材。乳香单味阴性样品中出现10个指纹峰，分别为峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰12、峰13、峰14、峰16，表明该10个指纹峰来源于乳香药材。没药单味阴性样品中出现10个指纹峰，分别为峰1、峰3、峰5、峰6、峰7、峰8、峰12、峰13、峰14、峰16，表明该10个指纹峰来源于没药药材。
综上所述，峰1、峰3、峰4、峰12来源于四味药材；峰2、峰5来源于当归、丹参、乳香；峰6来源于丹参、乳香、没药；峰7和峰8来源于当归、丹参、没药；峰9、峰10、峰11和峰15来源于丹参药材，为丹参的专属峰；峰13来源于当归、乳香、没药；峰14和峰16来源于乳香和没药药材。
结果表明，阴性无干扰，方法专属性好。
5.2、精密度
5.2.1、仪器精密度试验
取同一供试品溶液连续进样6次，记录色谱图，计算各指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。
如图1所示，结果表明，各共有峰相对保留时间RSD为0.61％、0.49％、0.41％、0.31％、0.17％、0.1％、0.07％、0.05％、0、0.03％、0.03％、0.12％、0.12％、0.12％、0.12％、0.12％，小于5％。该方法仪器精密度的相似度均大于0.9，表明该方法仪器精密度良好。
5.2.2、中间精密度(不同操作人员)
取同一批样品，由甲、乙、丙实验人员分开独立操作，按供试品制备方法制备一份供试品，记录色谱图，计算各指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。
结果表明，各共有峰相对保留时间RSD为0.06％、0.08％、0.06％、0.07％、0.08％、0.05％、0.04％、0.020％、0.02％、0.04％、0.24％、0.24％、0.24％、0.23％、0.23％，小于5％。不同操作人员的相似度结果均大于0.9，符合规定。
5.2.3、中间精密度(不同实验仪器)
取同一供试品溶液，按以上确定的条件，分别在Agilent高效液相色谱仪和Waters高效液相色谱仪上进行试验，记录色谱图，计算各指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。
结果表明，各共有峰相对保留时间RSD为2.66％、1.61％、1.61％、2.72％、1.42％、0.5％、0.26％、0.04 0％、0.16％、0.18％、3.07％、3.06％、3.03％、3.01％、2.95％，小于5％。不同仪器的相似度结果大于0.9，符合规定，表明不同仪器对该方法分离效果好。
5.2.4、方法重复性试验
取同一批样品6份，每份0.1g，精密称定，按“(2)供试品溶液的制备”的方法制备供试品，记录色谱图，计算各指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。
结果表明，各共有峰相对保留时间RSD为0.18％、0.19％、0.21％、0.19％、0.16％、0.09％、0.07％、0.040％、0.05％、0.07％、0.21％、0.2％、0.2％、0.19％、0.19％，小于5％。其重复性的相似度结果均大于0.9，符合规定。
5.2.5、耐用性
5.2.5.1、稳定性考察
取同一供试品溶液，在第0、2h、4h、6h、8h、10h、12h、18h、24h、48h和72h进样。记录色谱图，计算各指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，考察供试品溶液的稳定性。
结果表明，其稳定性0～72h内，各共有峰相对保留时间RSD为0.157％、0.242％、0.275％、0.348％、0.544％、0.670％、0.792％、0.856％、1.000％、1.113％、1.167％、1.701％、1.766％、1.826％、2.014％、2.063％，小于5％。相似度结果大于0.9，符合规定，表明在72h内稳定。
5.2.5.2、不同流速的考察
取同一供试品溶液，分别在不同流速0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min下进行试验，记录色谱图，计算各指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。
结果表明，各共有峰相对保留时间RSD为5.72％、4.13％、7.71％、5.46％、3.00％、1.35％、1.24％、0.59％、0.00％、0.89％、0.95％、6.26％、6.03％、5.89％、5.41％、5.46％，偏差较大；不同流速的相似度结果均大于0.9，但为了确保该方法的重现性较好，因此固定流速为1.0ml/min。
5.2.5.3、不同柱温的考察
取同一供试品溶液，分别在25℃﹑30℃和35℃下进行试验，记录色谱图，计算各指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。
结果表明，各共有峰相对保留时间RSD为2.17％、0.28％、0.96％、3.55％、2.17％、0.14％、0.46％、0.05％、0.00％、0.85％、1.20％、6.88％、6.76％、6.86％、6.55％、6.52％，偏差较大；不同柱温的相似度结果均大于0.9，但为了确保该方法的重现性较好，因此固定柱温为30℃。
5.2.5.4不同浓度流动相的考察
取同一供试品溶液，分别在流动相中磷酸溶液浓度为0.08％、0.10％和0.12％下进行试验，记录色谱图，计算各指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，并与本发明的包含当归和丹参的中药组合物标准汤剂对照谱进行相似度匹配计算。
结果表明，各共有峰相对保留时间RSD为0.49％、2.17％、0.45％、0.51％、0.63％、0.19％、0.17％、0.04％、0.00％、0.27％、0.39％、0.98％、0.97％、0.98％、0.97％、0.97％，小于5％，不同酸浓度的相似度结果大于0.90，符合规定。
5.2.5.5、不同色谱柱
取同一供试品溶液，分别在不同色谱柱(色谱柱1：InterSuatain C185μm(250×4.6mm)SN:23A0382302)、(色谱柱2：Agilent 5TC-C18(2)(250×4.6mm)SN:723797)、(色谱柱3：中谱科技RD-C18 5μm(250×4.6mm)SN:018023390)下进行试验，记录色谱图，计算各指纹峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD。
结果表明，各共有峰相对保留时间RSD为2.47％、2.67％、1.87％、2.03％、1.41％、0.82％、1.49％、0.38％、0.00％、1.40％、0.14％、4.55％、4.72％、4.99％、4.40％、4.57％，偏差较大；不同色谱柱的相似度结果均大于0.90，符合规定。
由上述方法学考察结果，建立的指纹图谱的16个共有峰中，各色谱峰受不同品牌高效液相色谱仪、不同色谱柱、不同柱温与流速等因素影响较小，且其余色谱条件影响变化不大，说明该方法耐用性较好，方法稳定可靠，可用于指纹图谱测定。
综合以上的结果，确定指纹图谱方法如下：
色谱条件及系统适用性：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A；以0.1％磷酸溶液为流动相B；按表6中的规定进行梯度洗脱；流速为每分钟1.0ml；柱温为30℃；检测波长为286nm。理论板数按峰计算应不低于5000。
参照物溶液的制备：取阿魏酸、丹酚酸B、藁本内酯适量，精密称定，加80％甲醇制成每1ml各含0.1mg的混合溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备：取本品粉末约0.2g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加80％乙醇50ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)10分钟，放冷，再称定重量，用80％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法：分别精密吸对照品溶液与供试品溶液各15μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
按照上述确定指纹图谱检测方法，对三批包含当归和丹参的中药组合物样品进行检测，结果表明，各共有峰相对保留时间RSD为0.49％、2.17％、0.45％、0.51％、0.63％、0.19％、0.17％、0.04％、0.00％、0.27％、0.39％、0.98％、0.97％、0.98％、0.97％、0.97％，小于5％，三批样品的相似度结果大于0.90，符合规定。相似度匹配图如图2所示。
本品粉末供试品溶液对照指纹图谱如图3所示。
以上对本发明实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本发明的思想，基于本发明的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本发明保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
Claims (10)
1.一种包含当归和丹参的中药组合物的指纹图谱构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
中药组合物供试品溶液的制备：称取适量的包含当归和丹参的中药组合物粉末，置于容量瓶中，加入第一溶剂，密塞，称定重量，超声处理之后放冷，再次称定重量，使用第一溶剂补充损失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到所述中药组合物供试品溶液；
对照品溶液的制备：称取适量的阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯对照品，添加甲醇配制成阿魏酸、丹酚酸B和藁本内酯的浓度分别为0.1～500μg/ml的所述对照品溶液；
根据高效液相检测所述中药组合物供试品溶液和所述对照品溶液的结果，获得中药组合物指纹图谱；
所述高效液相检测的色谱条件为：采用填料为十八烷基硅烷键合硅胶的色谱柱，流动相A选自乙腈、甲醇和四氢呋喃中的一种或多种，流动相B为酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液，梯度洗脱程序为：0～15min，90％B→80％B；15～40min，80％B→75％B；40～50min，75％B→70％B；50～60min，70％B→40％B；60～70min，40％B→30％B；70～80min，30％B→25％B；80～81min，25％B→90％B；81～90min，90％B，流速为0.5～1.5ml/min，柱温为10～40℃，检测波长为150～350nm，进样量为1～20μl。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述包含当归和丹参的中药组合物粉末的制备方法包括：(a)称取适量的当归、丹参、乳香和没药，加入第一次水进行第一次浸泡，武火煎煮至沸腾之后继续煎煮一段时间，得到第一煎煮液，过滤得到第一滤液和滤渣；(b)在所述滤渣中加入第二次水，武火煎煮至沸腾之后改文火煎煮一段时间，得到第二煎煮液，过滤得到第二滤液；以及(c)将所述第一滤液和所述第二滤液合并，干燥，得到所述包含当归和丹参的中药组合物粉末；
优选地，所述第一次水的体积与所述当归、丹参、乳香和没药的质量之和的体积/质量(mL/g)之比值为1～10，例如约8；
更优选地，所述第一次浸泡的时间为10～60min，例如约30min；
更优选地，所述武火煎煮至沸腾之后继续煎煮的时间为10～60min，例如约30min；
更优选地，所述文火煎煮的时间为10～60min，例如约30min；
又优选地，所述第二次水的体积与所述当归、丹参、乳香和没药的质量之和的体积/质量(mL/g)之比值为1～10，例如约5；
尤其优选地，所述干燥为冷冻干燥。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述中药组合物供试品溶液的制备中，所述容量瓶为具塞锥形瓶；
优选地，所述第一溶剂为醇，例如乙醇；
优选地，所述乙醇的体积百分比浓度为10％～90％，优选70％～90％，例如约80％；
更优选地，所述包含当归和丹参的中药组合物粉末与所述第一溶剂的质量/体积(mg/ml)之比值为1～10，例如约4；
又优选地，所述超声的功率为150～350W，例如约250W；
又优选地，所述超声的频率为30～50kHz，例如约40kHz；
又优选地，所述超声的时间为5～20min，例如约10min；
又更优选地，所述对照品溶液中阿魏酸的浓度为约100μg/ml；
又更优选地，所述对照品溶液中丹酚酸B的浓度为约100μg/ml；
又更优选地，所述对照品溶液中藁本内酯的浓度为约100μg/ml。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述高效液相检测的所述流速为0.8～1.2ml/min，例如约1.0ml/min；
优选地，所述柱温为25～35℃，例如约30℃；
优选地，所述检测波长为250～330nm，例如286nm；
优选地，所述进样量为10～20μl，例如约15μl；
优选地，所述对照品对应的色谱峰的理论塔板数不低于5000。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于在所述检测波长为286nm时，所述指纹图谱包括1-16号峰，其中，9号峰为丹酚酸B作为参照峰，1-16号峰的保留时间平均值分别对应为约6.0min、约9.3min、约10.5min、约13.3min、约20.7min、约25.5min、约30.1min、约32.5min、约38.0min、约42.4min、约44.3min、约64.8min、约67.3min、约69.6min、约76.7min和约78.6min；
又特别优选地，在所述检测波长为286nm时，所述指纹图谱包括1-16号峰，其中9号峰为丹酚酸B作为参照峰，1-16号峰的相对保留时间平均值分别对应为约0.16、约0.25、约0.28、约0.35、约0.55、约0.67、约0.79、约0.86、约1.00、约1.11、约1.17、约1.71、约1.77、约1.83、约2.02和约2.07。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述当归、所述丹参、所述乳香和所述没药之间的质量之比为(0.1～5):(0.1～5):(0.1～5):(0.1～5)；
优选地，所述当归、所述丹参、所述乳香和所述没药之间的质量之比为(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5):(0.5～1.5)；
优选地，所述当归、所述丹参、所述乳香和所述没药之间的质量之比为约1:约1:约1:约1；
优选地，所述当归的质量范围为10～30g，例如约18.65g；
优选地，所述丹参的质量范围为10～30g，例如约18.65g；
优选地，所述乳香的质量范围为10～30g，例如约18.65g；
优选地，所述没药的质量范围为10～30g，例如约18.65g。
7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，流动相A为乙腈；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的弱酸及其盐、弱碱及其盐中的一种或多种；
优选地，所述酸水溶液、碱水溶液和/或缓冲盐水溶液选自不同浓度的甲酸、冰乙酸、磷酸、三氟乙酸、甲酸和甲酸铵、乙酸和乙酸钠、乙酸和乙酸铵、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和柠檬酸、柠檬酸和柠檬酸钠、甘氨酸和盐酸、或者邻苯二甲酸和盐酸；
更优选地，所述酸水溶液为0.01％～1％的酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为0.01％～1％的磷酸水溶液；
更优选地，所述酸水溶液为约0.1％的磷酸水溶液；
又优选地，所述缓冲盐水溶液为磷酸盐水溶液和/或醋酸盐水溶液；
又优选地，所述缓冲盐水溶液的PH值不大于7.0；
尤其优选地，所述色谱柱为GL InterSuatain C18色谱柱或Agilent 5TC-C18(2)色谱柱或中谱科技RD-C18色谱柱；
特别优选地，所述色谱柱的规格：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5μm；
特别优选地，在所述检测波长为286nm时，5号峰为阿魏酸，9号峰为丹酚酸B，13号峰为藁本内脂；
特别优选地，在所述检测波长为286nm时，1号峰、3号峰、4号峰和12号峰来自当归、丹参、乳香和没药药材，2号峰和5号峰来自当归、丹参和乳香药材，6号峰来自丹参、乳香和没药药材，7号峰和8号峰来自当归、丹参和没药药材，9号峰、10号峰、11号峰和15号峰来自丹参药材，13号峰来自当归、乳香和没药药材，14号峰和16号峰来自乳香和没药药材。
8.一种包含当归和丹参的中药组合物的质量控制方法，其特征在于，所述质量控制方法包括如下步骤：
(1)根据权利要求1至7中任一项所述的指纹图谱构建方法建立中药组合物基准样品标准指纹图谱；
(2)取中药组合物供试品溶液，根据权利要求1至7中任一项所述的指纹图谱构建方法中的色谱条件进行检测，得到中药组合物待测样品指纹图谱；以及
(3)将步骤(2)所得到的所述中药组合物待测样品指纹图谱与步骤(1)所得到的所述中药组合物基准样品标准指纹图谱进行对比，符合要求的则为合格产品，不符合要求的则为不合格产品。
9.根据权利要求8所述的质量控制方法，其特征在于，所述符合要求包括以下的一种或多种：
(1)所述中药组合物待测样品指纹图谱中呈现出16个特征色谱峰，各特征色谱峰的保留时间在所述中药组合物基准样品标准指纹图谱中相应的对照品色谱峰的保留时间值的±10％之内；
(2)以丹酚酸B的色谱峰为S峰，中药组合物待测样品指纹图谱中的各特征色谱峰与S峰的相对保留时间在所述中药组合物基准样品标准指纹图谱的各特征色谱峰的相对保留时间值的±10％之内；以及
(3)按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，所述中药组合物待测样品指纹图谱与所述中药组合物基准样品标准指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。
10.根据权利要求1至7中任一项所述的构建方法或根据权利要求8或9所述的质量控制方法在包含当归和丹参的中药组合物的质量检测和/或质量评价和/或质量控制中的用途。
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