CN113552273A - 一种猪苓汤物质基准的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药品质量控制技术领域，具体涉及一种猪苓汤物质基准的质量控制方法，包括确立制备工艺和建立质量评价体系。该质量控制方法采用薄层色谱鉴别、含量测定、特征图谱方法相结合，具体包括建立氨基酸类、三萜类高效液相色谱特征图谱以及氨基酸类含量的检测方法、测定待测多糖含量和薄层鉴别等方面，通过特征图谱中特征峰的相对保留时间以及氨基酸类含量等来控制和评价其质量。本发明建立了全面控制猪苓汤物质基准的质量评价体系，为猪苓汤复方制剂的合理开发应用提供了研究基础。
Description
技术领域
本发明涉及药品质量控制技术领域，具体地说，涉及一种猪苓汤物质基准的质量控制方法。
背景技术
猪苓汤，首见于汉·张仲景的《伤寒论》，其药物组成为：“猪苓（去皮）、茯苓、泽泻、阿胶、滑石（碎）各一两” 。主治水热互结伤阴证。症见小便不利，发热，口渴欲饮，或心烦不寐，或兼有咳嗽，呕恶，下利。舌红苔白或微黄，脉细数者。又治血淋，小便涩痛，点滴难出，小腹满痛者。临床还应用于治疗水热互结所致的瘟疫，脚气，淋病，血痢，痰饮，黄疸，麻疹、痘疹兼证，以及目有黑花等疾病。猪苓汤在现代临床中主要用于治疗治疗泌尿系统如肾病综合征、泌尿感染、术后排尿困难、慢性肾炎、慢性肾小球肾炎、尿路结石等疾病，以及肝硬化腹水、急性腹泻等。猪苓汤所治疗疾病的范围虽广，但总以利水消肿为主要治疗大法。猪苓汤被列入首批公布的经典名方100首中，表明其具有较高的开发应用价值。
猪苓汤在《伤寒论》中已有煎煮、服用方法，但由于现代和汉代的计量单位存在较大的差异，需要对计量单位换算进行考证，且《中国药典》中只有单味药的检测方法，其复方（汤剂及物质基准）尚无源于传统制法且符合现代制备技术的制备方法，缺乏客观的复方（汤剂及物质基准）质量评价体系。
专利文献CN110946761A，公开日2020.04.03，公开了一种猪苓汤基准物质的制备方法和定性检测方法。所述定性检测方法包括：取猪苓药材、茯苓药材、泽泻药材和23-乙酰泽泻醇B分别制作对照溶液，取猪苓汤基准物质制备两种不同的供试品溶液，采用薄层色谱法、高效液相色谱法对猪苓汤物质基准中的猪苓、茯苓、泽泻进行定性鉴别。
然而目前未见如本发明的猪苓汤物质基准的质量控制方法。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种猪苓汤物质基准的质量控制方法，为经典名方猪苓汤复方制剂开发提供可靠的质量属性的研究方法和评价体系。
为实现上述目的，本发明采用如下的技术方案：
一种猪苓汤物质基准的质量控制方法，包括建立氨基酸类、三萜类高效液相色谱特征图谱以及氨基酸类含量的检测方法，通过特征图谱中特征峰的相对保留时间以及氨基酸类含量来控制和评价其质量；具体包括如下步骤：
（1）氨基酸类含量的检测方法和氨基酸类高效液相色谱特征图谱建立，具体如下：
①高效液相色谱检测条件为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1mol/L醋酸钠溶液（用醋酸调节pH值至6.5）为流动相B；以水为流动相C，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm，柱温为43℃；进样量5μl，理论板数按L-羟脯氨酸峰计算应不低于4000；
②制备参照物溶液和供试品溶液，然后分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的含量，同时供试品色谱中应呈现12个特征峰，并应与对照品参照物色谱中的12个特征峰保留时间相对应；
③测定15批猪苓汤物质基准供试品溶液，记录图谱，选定稳定、重现性好的12个共有峰作为特征峰，以L-羟脯氨酸色谱峰为参照峰，计算色谱图中各特征峰的相对保留时间，建立对照特征图谱，得到由其共有特征峰构成的特征图谱，所得图谱中，特征峰有12个， 2号峰为L-羟脯氨酸；所述12个特征峰的相对保留时间如下：峰1：0.684，峰2：1.000 ，峰3：1.237，峰4：1.338，峰5：1.623，峰6：1.770，峰7：1.891，峰8：2.064，峰9：3.113，峰10：3.756，峰11：3.834，峰12：4.671；
（2）建立三萜类高效液相色谱特征图谱，具体如下：
①高效液相色谱检测条件为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为2.5μm），以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.8ml/min；柱温为30℃；检测波长为248nm，进样量10μl，理论板数按猪苓酮B峰计算应不低于10000；
②制备参照物溶液和供试品溶液，分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，供试品色谱中应呈现9个特征峰，并应与对照品参照物色谱中的4个特征峰保留时间相对应；与猪苓酮B参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内；
③测定17批猪苓汤物质基准供试品溶液，记录图谱，以9个共有峰作为特征峰，以猪苓酮B参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，建立对照特征图谱，得到由其共有特征峰构成的特征图谱，所得图谱中，特征峰有9个，峰1（S）为猪苓酮B，峰2为猪苓酮A，峰6为23-乙酰泽泻醇C，峰8为去氢土莫酸；所述9个特征峰的相对保留时间如下： 峰1：1.00，峰2：1.13 ，峰3：1.41，峰4：1.67，峰5：1.77 ，峰6：2.20；峰7：2.55，峰8：2.58，峰9： 2.61。
上述的猪苓汤物质基准的质量控制方法，步骤（1）所述氨基酸类含量的检测方法和氨基酸类高效液相色谱特征图谱建立中，所述的参照物溶液和供试品溶液的制备方法是：
参照物溶液的制备：取L-羟脯氨酸对照品、甘氨酸对照品、丙氨酸对照品、L-脯氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml分别含L-羟脯氨酸80μg、甘氨酸0.16mg、丙氨酸70μg、L-脯氨酸0.12mg的溶液，作为对照品参照物溶液1；取苏氨酸对照品、精氨酸对照品、盐酸赖氨酸对照品、丝氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml分别含以上4个对照品各90μg的溶液，作为对照品参照物溶液2；取缬氨酸对照品、谷氨酸对照品、亮氨酸对照品、异亮氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml分别含以上4个对照品各90μg的溶液，作为对照品参照物溶液3；
供试品溶液的制备：取本品粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸补足减失的重量，摇匀，精密量取5ml至具塞锥形瓶中，加入盐酸5ml，加热回流水解3h，放冷，移至蒸发皿，用水10ml分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。
上述的猪苓汤物质基准的质量控制方法，步骤（2）建立三萜类高效液相色谱特征图谱中，所述的参照物溶液和供试品溶液的制备方法是：
参照物溶液的制备：取猪苓酮B、猪苓酮A、23-乙酰泽泻醇C、去氢土莫酸对照品适量，配制成每1ml分别含20μg、20μg、5μg、30μg的混合对照品溶液，作为对照品参照物溶液；
供试品溶液的制备：取本品粉末约5g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过蒸干，残渣用15ml水溶解，转移至分液漏斗，氯仿振摇萃取3次，每次15ml，合并氯仿液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至2ml容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
进一步的，所述的猪苓汤物质基准的质量控制方法，通过氨基酸类、三萜类特征峰的相对保留时间以及氨基酸的含量来控制和评价猪苓汤物质基准的质量：
（1）真伪鉴定：
氨基酸类：供试品色谱中应呈现12个特征峰，并应与对照品参照物色谱中的12个特征峰保留时间相对应。
三萜类：供试品色谱中应呈现9个特征峰，并应与对照品参照物色谱中的4个特征峰保留时间相对应；与猪苓酮B参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，规定值为： 峰1：1.00，峰2：1.13 ，峰3：1.41，峰4：1.67，峰5：1.77 ，峰6：2.20；峰7：2.55，峰8：2.58，峰9： 2.61；
（2）质量评价：
每1g物质基准含L-羟脯氨酸不得少于60 mg，甘氨酸不得少于120 mg，丙氨酸不得少于50 mg，L-脯氨酸不得少于70 mg；以L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的总量评价猪苓汤物质基准的优劣。
进一步的，所述的猪苓汤物质基准的质量控制方法，还包括测定待测猪苓汤浸膏粉中多糖含量的步骤，测定的色谱条件和质量评价具体为：
（1）以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（推荐色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C182.1*50mm 1.8μm）；以乙腈-磷酸盐缓冲液（14:86）为流动相，检测波长为245nm，流速为每分钟0.25ml，柱温25℃，进样量3μl，理论板数按葡萄糖峰计算应不低于10000；磷酸盐缓冲液配制：25mmol/L磷酸二氢钾溶液1000ml内含5mol/L氢氧化钠溶液0.4ml，摇匀，即得；
（2）供试品溶液的制备：取本品粉末0.15g，置于50ml离心管，加水3ml完全溶解，再边搅拌边缓慢滴加乙醇30ml，摇匀，在4℃放置12小时以上，4000rpm离心10分钟，弃去上清液，用5ml无水乙醇洗涤沉淀表面，离心，弃去上清液，重复3次，沉淀物用热水溶解并转移至10ml量瓶，放却，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml置顶空瓶中，精密加入4mol/L三氟乙酸溶液5ml，加盖密封，于115℃烘箱水解5小时，取出，冷却，溶液转移至烧瓶中，用适量水洗涤容器，洗液并入同一烧瓶中，于60℃旋干，再加4ml甲醇洗涤后旋干，重复3次，残渣用水溶解，转移至5ml量瓶，加水至刻度，摇匀；精密量取0.5ml，至具塞试管中，精密加入浓氨0.5ml、0.3mol/L PMP甲醇溶液0.5ml，密封，于70℃衍生化1小时，溶液转移至蒸发皿中，用适量水洗涤容器，洗液并入同一蒸发皿中，蒸干，再加4ml水洗涤，蒸干，重复2次，残渣精密加入水5ml、三氯甲烷4ml，超声，使充分溶解，转移到15ml离心管，用少量三氯甲烷洗涤容器，洗液并入同一离心管中，摇匀，4000rpm离心5分钟，取水层，滤过，取续滤液，即得；
（3）对照品溶液的制备：取D-甘露糖对照品，D-无水葡萄糖对照品，半乳糖对照品，L-（±）-阿拉伯糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含甘露糖12μg，含葡萄糖0.2mg，半乳糖45μg，阿拉伯糖7μg的混合溶液，即得；取混合溶液1ml，按上述步骤（2）供试品溶液的制备方法中自“精密加入浓氨0.5ml”起，同法制备；
（4）分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，测定，本品每1g含多糖以甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖总量计算，不得少于5.0mg。
进一步的，所述的猪苓汤物质基准的质量控制方法，还包括泽泻、阿胶薄层鉴别的步骤，具体为：
（1）取本品粉末1g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取23-乙酰泽泻醇B对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；再取阿胶对照药材1g，加入到10ml热水中，搅拌溶解，蒸干，残渣加甲醇25ml超声30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；
（2）照薄层色谱法（中国药典2020年版四部通则0502）试验，吸取上述对照药材溶液和供试品溶液各10μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8:2:0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，用2%香草醛的20%硫酸乙醇溶液显色，在105℃加热至斑点清晰，日光检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则质量合格。
进一步的，所述的猪苓汤物质基准，其制备方法为：称取猪苓饮片、茯苓饮片、泽泻饮片、滑石饮片，各13.8g，置一枚王保健壶中，加水800ml，武火，煮沸后改文火，煎煮时间1.5h，300目过滤，趁热加入13.8g阿胶饮片，搅拌使其完全溶化，冷冻干燥，即得。
本发明的优点在于：
1、2020年版《中国药典》中未收载猪苓、茯苓、泽泻中多糖成分的含量测定方法，经文献查阅，猪苓、茯苓、泽泻水提取物中主要含有多糖类成分，故本发明测定猪苓、茯苓、泽泻中总多糖的HPLC方法，填补了现行版药典中缺乏对猪苓、茯苓、泽泻主成分多糖含量测定的空白。
2、本发明建立了猪苓汤物质基准氨基酸类、三萜类的特征图谱，弥补了单一成分无法反映整体复方的缺点，从整体上评价猪苓汤物质基准的内在化学物质的种类及其含量。
3、本发明所建立的猪苓汤物质基准的质量控制方法的精密度、稳定性及重复性均良好。
4、本发明以猪苓汤为研究对象，按照《古代经典名方中药复方制剂简化注册审批管理规定》、《古代经典名方中药复方制剂物质基准的申报资料要求(征求意见稿)》、《药品注册管理办法》等文件的技术要求，建立了猪苓汤物质基准的制备方法和质量评价体系，为该复方制剂的合理开发应用提供了研究工作基础。
附图说明
图1为猪苓汤物质基准中泽泻、阿胶鉴别的薄层色谱图；图2 为猪苓汤物质基准氨基酸含量测定色谱图；图3为猪苓汤物质基准多糖含量测定色谱图；图4 为对照品参照物溶液、供试品溶液氨基酸类特征图谱；图5为15批猪苓汤物质基准氨基酸特征图谱；图6 为猪苓汤物质基准与阿胶药味氨基酸类特征图谱对比色谱图；图7 为猪苓汤物质基准氨基酸类对照特征图谱；图8 为三萜类特征图谱不同提取方法色谱图比较；图9为三萜类特征图谱不同提取溶剂色谱图比较；图10为三萜类特征图谱专属性色谱图；图11 为17批猪苓汤物质基准三萜类特征图谱；图12为猪苓汤物质基准三萜类对照特征图谱；图13 为猪苓汤物质基准与对照品定位特征图谱。
具体实施方式
本发明的制备方法和色谱条件以及质量控制方法是经过大量的试验筛选得到的最佳方案，下面的实验例用于进一步说明本发明的技术方案和技术效果。
实施例1
1. 猪苓汤物质基准的制备
1.1 药材产地、剂量、炮制：猪苓产地选用陕西，泽泻产地选用四川、福建、广西，茯苓产地选用云南、贵州、安徽、湖南，阿胶产地选用山东、河南，滑石产地选用山东、山西、广西、河南、河北、广东、湖南；参考“经典名方古今剂量折算原则专家共识”，猪苓汤用药剂量按照汉代1两相当于现代的13.8g，1升相当于现代的200ml，1 合=20ml进行剂量单位的换算；处方中猪苓去皮、滑石打碎，经考察研究，最终按照现行版《中国药典》的炮制方法进行炮制。
1.2 物质基准的制备
称取猪苓饮片、茯苓饮片、泽泻饮片、滑石饮片，各13.8g，置一枚王保健壶中，加水800ml，武火（500W）煮沸后改文火（300W），煎煮时间1.5h，300目过滤，趁热加入13.8g阿胶饮片，搅拌使其完全溶化，冷冻干燥，即得。
2. 猪苓汤物质基准的质量属性研究
采用出膏率、薄层鉴别、含量测定、特征图谱进行关键质量属性研究，建立质量控制方法。
2.1 出膏率的测定
猪苓汤水提液冷却，称取水提液总重，称取部分提取液，蒸干后，105℃干燥至恒重，称定干膏重量，计算出膏率。18批猪苓汤的出膏率在20.1-23.3%之间，平均得膏率为21.7％，采用均值的70%-130%即15.0%~28.0%作为物质基准出膏率上下限范围。
2.2 薄层鉴别
取本品粉末1g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取23-乙酰泽泻醇B对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液。再取阿胶对照药材1g，加入到10ml热水中，搅拌溶解，蒸干，残渣加甲醇25ml超声30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液。照薄层色谱法（中国药典2020年版四部 通则0502）试验，吸取上述对照药材溶液和供试品溶液各10μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8:2:0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，用2%香草醛的20%硫酸乙醇溶液显色，在105℃加热至斑点清晰，日光检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。且阴性无干扰，结果见图1。
注：1：23-乙酰泽泻醇B 2μl；2：供试品10μl；3：泽泻阴性10μl；4：阿胶阴性8μl；5：供试品4μl；6：阿胶阴性8μl；7：阿胶对照药材8μl。
2.3 含量测定
猪苓汤处方主要由猪苓、茯苓、泽泻、滑石、阿胶等5味中药组成，阿胶在方中属于烊化处理，约占物质基准的85%，主要为氨基酸、蛋白质、多糖类成分。而其他药味水提取后主要有效成分为多糖类、三帖类，但三萜类含量很低，几乎未检出。因此，选取4种响应值比较高的氨基酸、总多糖作为猪苓汤物质基准的含量指标成分，以期对其物质基准的质量控制提供依据。
2.3.1 4种氨基酸的含量测定
2.3.1.1 色谱条件
色谱柱为SHISEIDO CAPCELL PAK C18 MGII（4.6×250mm，5μm），以乙腈为流动相A，以0.1mol/L醋酸钠溶液（用醋酸调节pH值至6.5）为流动相B；以水为流动相C，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm，柱温为43℃，进样量5μl。理论板数按L-羟脯氨酸峰计算应不低于4000。
2.3.1.2 溶液的制备
对照品溶液的制备：取L-羟脯氨酸对照品、甘氨酸对照品、丙氨酸对照品、L-脯氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml分别含L-羟脯氨酸80μg、甘氨酸0.16mg、丙氨酸70μg、L-脯氨酸0.12mg。
供试品溶液的制备：取物质基准约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸补足减失的重量，摇匀，精密量取5ml至具塞锥形瓶中，加入盐酸5ml，加热回流水解3h，放冷，移至蒸发皿，用水10ml分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶，0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。
分别精密量取上述对照品溶液和供试品溶液各5ml、2ml，分别置25ml量瓶中，各加0.1mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5ml，1mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5ml，摇匀，室温放置1h后，加水至刻度，摇匀。取10ml，加正己烷10ml，振摇，放置10分钟，取下层溶液，滤过，取续滤液，即得。
含量测定色谱图见图2。图2中，1、L-羟脯氨酸，2、甘氨酸，3、丙氨酸，4、L-脯氨酸；A、溶剂空白，B、混合对照，C、供试品。
2.3.1.3 供试品溶液制备方法的考察
（1）定容溶剂的考察
衍生化后，采用50%乙腈作为溶剂定容时，L-羟脯氨酸的色谱峰会有分裂行为，考虑到溶剂效应，考察用水作为溶剂，结果表明可行。
（2）提取方法的考察
分别考察了回流酸解时长、封管酸解时长两种方法对测定结果的影响。
回流水解时长：取物质基准约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸补足减失的重量，摇匀，精密量取5ml至具塞锥形瓶中，加入盐酸5ml，分别加热回流水解1、2、3h，放冷，移至蒸发皿，用水10ml分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶，0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。精密量取上述溶液2ml，置25ml量瓶中，各加0.1mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5ml，1mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5ml，摇匀，室温放置1h后，加水至刻度，摇匀。取10ml，加正己烷10ml，振摇，放置10分钟，取下层溶液，滤过，取续滤液，即得。
封管水解时长：取物质基准约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸补足减失的重量，摇匀，精密量取2ml至具塞锥形瓶中，加入盐酸2ml，分别置150℃封管水解1、2、3h，放冷，移至蒸发皿，用水10ml分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶，0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。精密量取上述溶液5ml，置25ml量瓶中，各加0.1mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5ml，1mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5ml，摇匀，室温放置1h后，加水至刻度，摇匀。取10ml，加正己烷10ml，振摇，放置10分钟，取下层溶液，滤过，取续滤液，即得。
结果如下，见表2。
结果表明：回流酸水解1小时结果偏小，3小时与2小时的差异不大，表明回流3小时水解已趋于完全；150℃封管水解，药典规定为1小时，结果显示3小时与1小时的结果无明显差异，且与回流酸解3小时的结果无明显差异。考虑到实验室的仪器以及操作等因素，选择回流酸解3小时作为本次考察实验的结果。
（3）衍生化时长的考察
取物质基准约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸补足减失的重量，摇匀，精密量取5ml至具塞锥形瓶中，加入盐酸5ml，加热回流水解3h，放冷，移至蒸发皿，用水10ml分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶，0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。精密量取上述溶液2ml，置25ml量瓶中，各加0.1mol/L异硫氰酸苯酯（PITC）的乙腈溶液2.5ml，1mol/L三乙胺的乙腈溶液2.5ml，摇匀，分别室温放置1、2、3小时后，加水至刻度，摇匀。取10ml，加正己烷10ml，振摇，放置10分钟，取下层溶液，滤过，取续滤液，即得。结果见表3。
2.3.1.4 方法学考察
（1）专属性试验：按照上述供试品溶液制备方法制备空白溶剂的阴性样品溶液，进样测定分析，并与供试品溶液、对照品溶液进行比对，其中表明阴性无干扰。
（2）线性关系考察：精密称取上述对照品L-羟脯氨酸0.01306g，甘氨酸0.01755g，丙氨酸0.01222g，L-脯氨酸0.01125g，置25ml量瓶中，加0.1mol/L HCl溶液溶解并稀释至刻度，作为混合对照储备液。
线1：精密量取储备液3ml置15ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，再精密量取1ml置25ml量瓶衍生化1h，加水稀释至刻度，即得；线2：精密量取储备液3ml置15ml量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，再精密量取3ml置25ml量瓶衍生化1h，加水稀释至刻度，即得；线3：精密量取储备液3ml置15ml量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，再精密量取5ml置25ml量瓶衍生化1h，加水稀释至刻度，即得；线4：精密量取储备液3ml置10ml量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，再精密量取5ml置25ml量瓶衍生化1h，加水稀释至刻度，即得；线5：精密量取储备液2ml置25ml量瓶衍生化1h，加水稀释至刻度，即得；线6：精密量取储备液5ml置10ml量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，再精密量取5ml置25ml量瓶衍生化1h，加水稀释至刻度，即得；备注：取不满5ml衍生化的对照品溶液用0.1mol/L盐酸溶液补足至5ml的量。
按上述色谱条件测得峰面积积分值，以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值（mAμ）为纵坐标，绘制标准曲线，计算回归方程得：L-羟脯氨酸：Y =6268.4X +6.79（r=0.999，n=6）；甘氨酸：Y =10148.8X -26.87（r=0.999，n=6）；丙氨酸：Y =8427.4X -31.62（r=0.999，n=6）；L-脯氨酸：Y =7157.9X -2.22（r=0.999，n=6）。结果表明：L-羟脯氨酸在在0.0209μg～0.2612μg、甘氨酸在0.0281μg～0.3510μg、丙氨酸在0.0195μg～0.2442μg、L-脯氨酸在0.0180μg～0.2248μg范围内时，进样量与峰面积呈良好的线性关系。
（3）仪器精密度试验
精密吸取含20.90μg/ml L-羟脯氨酸、28.08μg/ml 甘氨酸、19.54μg/ml丙氨酸和17.98μg/ml L-脯氨酸的对照品溶液，连续进样6次，根据峰面积计算RSD值。L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸分别为0.82％、0.16％、0.43％、0.17％，表明仪器精密度良好。
（4）重复性试验
取本品，研细，取6份，每份约0.2g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，精密吸取供试品溶液各5μl进样，测定，计算含量的RSD值。结果见表4。
表明该方法重复性较好。
（5）加样回收率试验：取已知含量的本品6份，每份约0.12g，精密称定，根据重复性结果，按照1:1的量分别精密加入对照品，按供试品溶液制备方法操作，进样分析。L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸平均回收率分别为101.32%、100.89%、94.38%、103.65%，均在药典所规定的范围内(90-110％)。
（6）溶液稳定性考察：取上述供试品溶液，分别在0、4、10、17、25、36h按2.3.1.1中所述色谱条件进行检测，计算RSD值分别为2.05%、1.22%、3.93%、0.69%，表明供试品溶液中丙氨酸36小时内不稳定，在17小时表现可以是稳定，RSD为3.19%，其余几个氨基酸在36小时内稳定。
（7）重现性的考察：考察3台不同仪器条件下、不同日期，对样品含量测定结果的影响。结果表明，采用不同仪器、不同日期测定本品含量时，各指标成分含量的RSD均小于3.0%，说明本法重现性良好。
（8）系统耐用性试验：分别考察不同柱温（40、43、45oC）、不同流速（0.9、1.0、1.1ml/min）、不同色谱柱对色谱图的影响，结果表明，在色谱条件较小的变动及采用不同品牌色谱柱时，各指标成分的含量的RSD均小于3.0%，说明本法耐用性良好。
（9）15批物质基准含量的测定：15批物质基准的氨基酸含量为，L-羟脯氨酸在79.17~89.94mg/g，甘氨酸在154.7~179.8%，丙氨酸在64.43~75.63mg/g，L-脯氨酸在91.87~103.1mg/g之间，表明不同的饮片组合得到的猪苓汤物质基准的氨基酸含量有一个范围值，该范围值可反映原汤剂中的质量参数，为后续的成型制剂质量控制提供参考。
2.3.2 多糖的含量测定
2.3.2.1色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（推荐色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C182.1*50mm 1.8μm）；以乙腈-磷酸盐缓冲液（14:86）为流动相，检测波长为245nm，流速为每分钟0.25ml，柱温25℃，进样量3μl。理论板数按葡萄糖峰计算应不低于10000。
注：磷酸盐缓冲液配制：25mmol/L磷酸二氢钾溶液1000ml内含5mol/L氢氧化钠溶液0.4ml，摇匀，即得。
2.3.2.2溶液的制备方法
对照品溶液的制备： 取D-甘露糖对照品，D-无水葡萄糖对照品，半乳糖对照品，L（+）-阿拉伯糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含甘露糖12μg，含葡萄糖0.2mg，半乳糖45μg，阿拉伯糖7μg的混合溶液，即得。取混合溶液1ml，按供试品溶液制备方法自“精密加入浓氨0.5ml”起，同法制备。
供试品溶液的制备：精密称取本品粉末0.15g置于50ml离心管，加水3ml并完全溶解，再加入乙醇30ml（边加边摇），冷藏过夜，离心（4000rpm）10分钟，弃去上清液，用无水乙醇洗涤沉淀表面3次，每次5ml，热风吹干沉淀，沉淀用热水溶解并转移至10ml量瓶，冷却，加水至刻度；精密吸取水溶液5ml置顶空瓶中，精密加入4mol/L三氟乙酸溶液5ml，加盖密封，于115℃烘箱水解5小时，取出，冷却，全部溶液（含水洗液），于水温60℃的旋转蒸发仪旋干，再加甲醇旋干3次，每次4ml，残渣用水溶解并定容至5ml量瓶；精密吸取水溶液0.5ml，精密加入浓氨0.5ml、0.3mol/L PMP甲醇溶液0.5ml，加盖密封，于70℃烘箱衍生化1小时，全部溶液（含水洗液）水浴蒸干，再加水蒸干2次，每次4ml，残渣精密加入水5ml、三氯甲烷约4ml，超声使充分溶解，全部转移到15ml离心管，用少量三氯甲烷洗涤器皿（补至5ml），密封摇匀，松盖离心（4000rpm）5分钟，取水层，即得。
定容溶剂考察：直接采用50%乙腈溶解残渣，色谱图峰形差，而直接用20%乙腈溶解，残渣不能全部溶解，60%乙腈ml溶解+水1ml定容，结果峰形良好，但是溶剂峰干扰较大，故最终选择用水5ml-三氯甲烷5ml萃取，取水层。
含量测定色谱图见图3，A：空白溶剂；B：供试品溶液；C：混合对照品溶液
2.3.2.2方法学考察
（1）专属性试验：按照上述供试品溶液制备方法制备空白溶剂的阴性样品溶液，进样测定分析，并与供试品溶液、对照品溶液进行比对，其中表明阴性无干扰。
（2）线性关系考察：精密称取D-甘露糖对照品1.3mg（99.6%计），D-无水葡萄糖对照品20.09mg（99.9%计），半乳糖对照品4.75mg（100%计），L（+）-阿拉伯糖对照品适量0.66mg（100%计），置于同一10ml量瓶，加水溶解并定容至刻度，摇匀，即得每1ml含甘露糖0.12948mg，含葡萄糖2.00699mg，半乳糖0.475mg，阿拉伯糖0.066mg的混合对照品储备液。
取混合溶液1ml，按供试品溶液制备方法自“精密加入浓氨0.5ml”起，同法操作。
分别精密吸取上述混合对照品储备液1ml、2ml、1ml、1ml、0.25ml、0.25ml，分别置于2ml、5ml、5ml、10ml、5ml、10ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得线性1~线性6母液；分别精密吸取各线性母液1ml，置西林瓶中，按供试品溶液制备方法自“精密加入浓氨0.5ml”起，同法操作。最终得到线性1～线性6对照品溶液各成分浓度。
分别精密吸取上述线性1～线性6对照品溶液各3μl，注入液相色谱仪进行测定。按上述色谱条件测得峰面积积分值，以进样量(μg)为横坐标，峰面积积分值（mAμ）为纵坐标，绘制标准曲线。计算回归方程：甘露糖：y = 33.756x - 21.294（r=0.999，n=6）；葡萄糖：y =22.5x - 40.374（r=0.999，n=6）；半乳糖：y = 27.172x - 88.558（r=0.999，n=6）；阿拉伯糖：y =34.64x - 30.881（r=0.998，n=6）。结果表明：甘露糖在1.94~38.84μg、葡萄糖在30.10~602.10μg、半乳糖在7.13~142.50μg、阿拉伯糖在0.99~19.80μg范围内时，进样量与峰面积呈良好的线性关系。
（3）仪器精密度试验：精密吸取含1.29μg/ml甘露糖、40.14μg/ml 葡萄糖、9.50μg/ml半乳糖和0.66μg/ml 阿拉伯糖的对照品溶液，连续进样6次，根据峰面积计算RSD值。甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖分别为0.96％、0.83％、1.38％、3.95％，表明仪器精密度良好。
（4）重复性试验：取本品，研细，取6份，每份约0.15g，精密称定，按供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，精密吸取供试品溶液各3μl进样，测定，计算含量的RSD值。结果见表5。
表明该方法重复性较好。
（5）加样回收率试验：取已知含量的本品，按一般中间浓度加入量与所取供试品中待测定成分量之比控制在1:1左右，按下述方法进行试验。
取已知含量的本品6份，每份约0.15g，精密称定，按供试品溶液制备方法操作到“精密吸取水溶液0.5ml，分别精密加入混合对照品溶液0.5ml（浓度同线性4母液），再精密加入浓氨0.5ml……”。分别精密吸取供试品溶液、对照品溶液各3µl，采用上述色谱条件，测定峰面积，计算加样回收率。甘露糖、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖平均回收率分别为97.2%、100.8%、102.9%、97.8%，均在药典所规定的范围内(90-110％)。
（6）溶液稳定性考察：取上述供试品溶液，分别在0、5、10、15、19、24h按2.3.2.1中所述色谱条件进行检测，计算RSD值分别为1.63%、0.61%、0.96%、2.47%，各目标峰峰面积RSD值均小于3.0%，说明供试品溶液在24h内稳定性良好。
（7）15批物质基准含量的测定：15批物质基准的甘露糖在1.39~6.82mg/g，葡萄糖在24.8~182.8%，半乳糖在2.9~21.9mg/g，阿拉伯糖在0.45~3.05mg/g，总糖在26.6~211.0mg/g之间，表明不同的饮片组合得到的猪苓汤物质基准的多糖含量有一个范围值，该范围值可反映原汤剂中的质量参数，为后续的成型制剂质量控制提供参考。
2.4 特征图谱的建立
2.4.1氨基酸类
阿胶，猪苓、茯苓、泽泻水提取物，均含有氨基酸类成分，故除了测定4种氨基酸的含量，同时建立氨基酸类成分的特征图谱。色谱条件、供试品溶液制备同氨基酸含量项下方法。对照品参照物溶液制备方法如下：
（1） 取L-羟脯氨酸对照品、甘氨酸对照品、丙氨酸对照品、L-脯氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml分别含L-羟脯氨酸80μg、甘氨酸0.16mg、丙氨酸70μg、L-脯氨酸0.12mg；
（2） 取苏氨酸对照品、精氨酸对照品、盐酸赖氨酸对照品、丝氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml分别含以上4个对照品各90μg；
（3） 取缬氨酸对照品、谷氨酸对照品、亮氨酸对照品、异亮氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml分别含以上4个对照品各90μg；
对照品参照物溶液、供试品溶液特征图谱详见图4。图4中，A混合对照1：L-羟脯氨酸，甘氨酸，丙氨酸，L-脯氨酸；B混合对照2：丝氨酸，苏氨酸，精氨酸，盐酸赖氨酸；C混合对照3：谷氨酸，缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；D猪苓汤物质基准供试品。
2.4.1.1方法学考察
（1）重复性试验
平行制备6份供试品溶液，并进行测定，考察实验方法的重复性。结果测得的各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，RSD均小于3%，说明重复性良好。结果见表6、表7。
（2）仪器精密度试验
制备1份供试品溶液，连续进样6针，考察仪器的精密度。结果测得的各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，RSD均小于3%，说明仪器精密度良好。结果见表8、表9。
（3）溶液稳定性
取供试品溶液，在不同的时间点0、4、10、17、25、36h进样，测定峰面积，判断其溶液稳定性。结果表明相对保留时间在36小时内稳定，相对峰面积在17小时内稳定。见表10、11。
（4）重现性的考察
考察在不同仪器条件下对样品特征图谱测定结果的影响。由结果可以看出，在采用不同仪器进行测定时，各共有峰相对保留时间与相对峰面积没有较显著差异。详见表12、13。
（5）方法耐用性的考察
采用不同柱温、不同流速、不同品牌色谱柱测定供试品溶液，考察方法的耐用性。统计各峰的出峰时间，并计算相对保留时间RSD%，结果表14至19。由结果可以看出，在色谱条件较小的变动时，各共有峰相对保留时间与相对峰面积没有较显著差异。
2.4.1.2特征图谱的采集
按照“供试品溶液”项下的方法制备15批猪苓汤物质基准供试品溶液，精密吸取对照品溶液、供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定，记录图谱。色谱图见图5。
统计各特征峰的出峰时间及峰面积，并计算相对保留时间和相对峰面积的RSD%，结果见表20、21。
2.4.1.3参照物峰、特征峰的确认
现行版的《中国药典》将L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸和L-脯氨酸作为阿胶质量控制的指标成分，实验表明，在总方中， L-羟脯氨酸可归属为阿胶药味，该峰保留时间适中，响应值稳定，与相邻色谱峰的分离度良好，可选择作为参照峰（（S）峰）。结果见图6。A：缺阿胶的猪苓汤物质基准，圈中色谱峰为：L-羟脯氨酸；B：阿胶药材；C：猪苓汤物质基准。
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》，选择批号为S1的猪苓汤物质基准图谱为参照图谱，以中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，设定时间窗宽度为0.50min，建立对照特征图谱。根据数据分析结果最终选定稳定、重现性好的12个共有峰作为特征峰，生成的标准图谱见图7，选择L-羟脯氨酸为参照峰，计算色谱图中特征峰的相对保留时间。其中，通过对照品对12个特征峰进行指认，1：谷氨酸，2：L-羟脯氨酸，3：丝氨酸，4：甘氨酸，5：苏氨酸，6：精氨酸，7：丙氨酸，8：L-脯氨酸，9：缬氨酸，10：异亮氨酸，11：亮氨酸，12：盐酸赖氨酸。
2.4.2 三萜类
猪苓药材中的利尿成分麦角甾醇和麦角甾酮，为甾体类；茯苓中的利尿成分茯苓酸、猪苓酸C、去氢土莫酸等，为三萜类；泽泻药材中的利尿成分23-乙酰泽泻醇B和24-乙酰泽泻醇A，为三萜类。由于含量太低，几乎检测不出，故考虑建立三萜类成分的特征图谱进行整体的质量控制。
2.4.2.1色谱条件
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂【推荐色谱柱：Waters XSelect®HSS T3（4.6×150mm，粒径2.5μm）】；以乙腈为流动相A，0.05%磷酸溶液为流动相B，按表22中的规定进行梯度洗脱；检测波长为248nm，柱温30℃，进样量10μl。理论板数按猪苓酮B峰计算应不低于10000。
2.4.2.2溶液的制备
参照物溶液的制备 取猪苓酮B、猪苓酮A、23-乙酰泽泻醇C、去氢土莫酸对照品适量，配制成每1ml分别含20μg、20μg、5μg、30μg的混合对照品溶液，作为对照品参照物溶液。
供试品溶液的制备 取本品粉末约5g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过蒸干，残渣用15ml水溶解，转移至分液漏斗，氯仿振摇萃取3次，每次15ml，合并氯仿液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至2ml容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4.2.3供试品溶液制备方法考察
（1）提取方法考察：以甲醇为提取溶剂，分别比较了超声提取30分钟及回流提取30分钟两种方法对特征图谱的影响，结果见图8。结果表明，不同的提取方法提取后的色谱图形状及色谱峰的数目基本一致，超声提取特征峰的响应值稍高，故确定提取方法为超声提取。
（2）提取溶剂的考察：不同的溶剂对供试品中活性成分的溶出能力不同，因此考察了不同极性的溶剂（水、甲醇、80%甲醇、50%甲醇）对供试品的提取效果，从色谱峰的特征性、色谱峰的数目和吸收强度来选择最佳的提取溶剂。色谱图见图9。结果表明，含醇比例越高的溶剂提取的色谱峰的数目约多且峰响应值越高，选择以甲醇作为提取溶剂。
2.4.2.4方法学考察
（1）专属性试验：取空白溶剂（甲醇）、缺猪苓、缺茯苓、缺泽泻、缺阿胶猪苓汤作为阴性样品，分别吸取供试品溶液与阴性样品各10μl，注入液相色谱仪，按2.4.2.1色谱条件进样分析，结果见图10。结果显示，空白溶剂在供试品待测成分色谱峰相应位置无对应色谱峰，表明溶剂不干扰检测；缺猪苓阴性样品缺少峰1（猪苓酮B）、峰2（猪苓酮A）；缺茯苓阴性样品缺少峰8（去氢土莫酸）；缺泽泻阴性样品缺少峰3、峰6（23-乙酰泽泻醇C），表明本方法专属性较好。
（2）重复性试验：平行制备6份供试品溶液，并进行测定，考察实验方法的重复性。结果测得的各特征峰的相对保留时间RSD值小于2.0%，相对峰面积RSD值小于5.0%，说明重复性良好，其中峰8由于峰面积较小，造成RSD值波动较大。结果见表23。
（3）精密度试验
取重复性试验项下的供试品溶液，连续进样6次，考察仪器的精密度。结果连续迸样6次测得的各特征峰的相对保留时间和相对峰面积，RSD值均小于2.0%，表明仪器精密度良好。结果见表24。
（4）稳定性试验：取重复性试验项下的供试品溶液，分别在0、7、12、16.5、20、24h检测，考察样品溶液的稳定性。结果测得的各特征峰的相对保留时间RSD值小于2.0%和相对峰面积RSD值小于5.0%，表明供试品在24小时内稳定性良好。结果见表25。
（5）方法耐用性考察：采用改变柱温、流速测定供试品溶液，考察色谱条件的耐用性。统计各峰的出峰时间，并计算相对保留时间及相对峰面积的RSD，结果见表26。
由结果可以看出，在色谱条件较小的变动时，各共有峰相对峰面积有显著差异，因此，建议标准正文只对相对保留时间做规定，暂不对相对峰面积做规定。
根据17批猪苓汤物质基准特征图谱的相对保留时间均值，分别设立±10%限度（见上表）。色谱条件较小变动时，峰1~9的相对保留时间均在±5%的范围内，考虑到在不同实验室重现时存在差异，或许会超出±5%的限度，故为了提高特征图谱相对保留时间适用性，建议相对保留时间规定值范围为±10%。峰8因柱温不同影响其分离度，为保证峰8的分离度和峰形良好，建议规定柱温为30℃。
（6）重现性试验
分别使用不同仪器进样进行考察，考察方法中间精密度。统计各峰的出峰时间，并计算相对保留时间及相对峰面积的RSD值。结果见表27。由结果可以看出，共有峰相对保留时间的RSD值均小于2.0%，相对峰面积有较显著差异，由于不规定相对峰面积，故本法中间精密度良好。
（7）特征图谱的采集
按照“供试品溶液”项下的方法制备17批含阿胶猪苓汤和17批缺阿胶猪苓汤物质基准供试品溶液，精密吸取参照物溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，记录图谱。色谱图见图11。统计各特征峰的出峰时间及峰面积，并计算相对保留时间和相对峰面积的RSD，结果见表28、29。
结果表明，17批含阿胶猪苓汤和17批缺阿胶猪苓汤物质基准相对保留时间RSD小于2%，说明各批次间各峰的出峰时间一致；各特征峰的相对峰面积RSD均大于10%，说明各批次间各峰的相对峰面积存在较大差异，故建议正文只对相对保留时间做规定，而相对峰面积不做规定。
（8）共有特征峰的标定
采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》，选择猪苓汤物质基准作为参照图谱，以中位数法作为对照指纹图谱的生成方法，设定时间窗宽度为0.10min，建立对照特征图谱。根据数据分析结果最终选定9个共有峰作为特征峰，生成的标准图谱见图12，选择猪苓酮B为参照峰，计算色谱图中特征峰的相对保留时间。
通过与对照品色谱图比对，可知猪苓汤基准物质特征图谱9个特征峰中，峰1（S）为猪苓酮B，峰2为猪苓酮A，峰6为23-乙酰泽泻醇C，峰8为去氢土莫酸。见图13。
结合17批含阿胶猪苓汤和17批缺阿胶猪苓汤物质基准的测定结果，规定：供试品色谱中应呈现9个特征峰，并应与参照物色谱中的9个特征峰保留时间相对应，其中峰1、峰2、峰6、峰8应与猪苓酮B、猪苓酮A、23-乙酰泽泻醇C、去氢土莫酸对照品参照物峰保留时间相对应。与猪苓酮B对照品参照物峰相对应的峰为S峰，计算峰2~9与S峰的相对保留时间；其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内。规定值为1.13（峰2）、1.41（峰3）、1.67（峰4）、1.77（峰5）、2.20（峰6）、2.55（峰7）、2.58（峰8）、2.61（峰9）。
以上实验结果表明：本发明的猪苓汤物质基准的测定方法具有良好的精密度、稳定性、重复性，能整体反映猪苓汤物质基准整体的质量属性信息，可以为后续猪苓汤复方制剂的开发提供物质基准的质量参考信息。
需要说明的是，本发明在长期大量的实验研究中，做了大量关于色谱条件的研究实验，但不能在此一一赘述，以上仅以典型的实验作为说明。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种猪苓汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，建立氨基酸类、三萜类高效液相色谱特征图谱以及氨基酸类含量的检测方法，通过特征图谱中特征峰的相对保留时间以及氨基酸类含量来控制和评价其质量；具体包括如下步骤：
（1）氨基酸类含量的检测方法和氨基酸类高效液相色谱特征图谱建立，具体如下：
①高效液相色谱检测条件为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A，以0.1mol/L醋酸钠溶液（用醋酸调节pH值至6.5）为流动相B；以水为流动相C，按下表1中的规定进行梯度洗脱；检测波长为254nm，柱温为43℃；进样量5μl，理论板数按L-羟脯氨酸峰计算应不低于4000；
②制备参照物溶液和供试品溶液，然后分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的含量，同时供试品色谱中应呈现12个特征峰，并应与对照品参照物色谱中的12个特征峰保留时间相对应；
③测定15批猪苓汤物质基准供试品溶液，记录图谱，选定稳定、重现性好的12个共有峰作为特征峰，以L-羟脯氨酸色谱峰为参照峰，计算色谱图中各特征峰的相对保留时间，建立对照特征图谱，得到由其共有特征峰构成的特征图谱，所得图谱中，特征峰有12个， 2号峰为L-羟脯氨酸；所述12个特征峰的相对保留时间如下：峰1：0.684，峰2：1.000 ，峰3：1.237，峰4：1.338，峰5：1.623，峰6：1.770，峰7：1.891，峰8：2.064，峰9：3.113，峰10：3.756，峰11：3.834，峰12：4.671；
（2）建立三萜类高效液相色谱特征图谱，具体如下：
①高效液相色谱检测条件为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（柱长为150mm，内径为4.6mm，粒径为2.5μm），以乙腈为流动相A，以0.05%磷酸溶液为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；流速为0.8ml/min；柱温为30℃；检测波长为248nm，进样量10μl，理论板数按猪苓酮B峰计算应不低于10000；
②制备参照物溶液和供试品溶液，分别精密吸取参照物溶液和供试品溶液，注入高效液相色谱仪，测定，供试品色谱中应呈现9个特征峰，并应与对照品参照物色谱中的4个特征峰保留时间相对应；与猪苓酮B参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内；
③测定17批猪苓汤物质基准供试品溶液，记录图谱，以9个共有峰作为特征峰，以猪苓酮B参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，建立对照特征图谱，得到由其共有特征峰构成的特征图谱，所得图谱中，特征峰有9个，峰1（S）为猪苓酮B，峰2为猪苓酮A，峰6为23-乙酰泽泻醇C，峰8为去氢土莫酸；所述9个特征峰的相对保留时间如下：峰1：1.00，峰2：1.13 ，峰3：1.41，峰4：1.67，峰5：1.77 ，峰6：2.20；峰7：2.55，峰8：2.58，峰9： 2.61。
2.根据权利要求1所述的猪苓汤物质基准的质量控制方法，其特征在于：步骤（1）所述氨基酸类含量的检测方法和氨基酸类高效液相色谱特征图谱建立中，所述的参照物溶液和供试品溶液的制备方法是：
参照物溶液的制备：取L-羟脯氨酸对照品、甘氨酸对照品、丙氨酸对照品、L-脯氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml分别含L-羟脯氨酸80μg、甘氨酸0.16mg、丙氨酸70μg、L-脯氨酸0.12mg的溶液，作为对照品参照物溶液1；取苏氨酸对照品、精氨酸对照品、盐酸赖氨酸对照品、丝氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml分别含以上4个对照品各90μg的溶液，作为对照品参照物溶液2；取缬氨酸对照品、谷氨酸对照品、亮氨酸对照品、异亮氨酸对照品适量，精密称定，加0.1mol/L盐酸溶液制成每1ml分别含以上4个对照品各90μg的溶液，作为对照品参照物溶液3；
供试品溶液的制备：取本品粉末约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入0.1mol/L盐酸溶液25ml，密塞，称定重量，超声处理30分钟，放冷，再称定重量，用0.1mol/L盐酸补足减失的重量，摇匀，精密量取5ml至具塞锥形瓶中，加入盐酸5ml，加热回流水解3h，放冷，移至蒸发皿，用水10ml分次洗涤，洗液并入蒸发皿中，蒸干，残渣加0.1mol/L盐酸溶液溶解，转移至25ml量瓶，加0.1mol/L盐酸溶液至刻度，摇匀，即得。
3.根据权利要求1所述的猪苓汤物质基准的质量控制方法，其特征在于：步骤（2）建立三萜类高效液相色谱特征图谱中，所述的参照物溶液和供试品溶液的制备方法是：
参照物溶液的制备：取猪苓酮B、猪苓酮A、23-乙酰泽泻醇C、去氢土莫酸对照品适量，配制成每1ml分别含20μg、20μg、5μg、30μg的混合对照品溶液，作为对照品参照物溶液；
供试品溶液的制备：取本品粉末约5g，加甲醇50ml，超声处理30分钟，放冷，滤过蒸干，残渣用15ml水溶解，转移至分液漏斗，氯仿振摇萃取3次，每次15ml，合并氯仿液，蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至2ml容量瓶，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.根据权利要求1所述的猪苓汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，通过氨基酸类、三萜类特征峰的相对保留时间以及氨基酸的含量来控制和评价猪苓汤物质基准的质量：
（1）真伪鉴定：
氨基酸类：供试品色谱中应呈现12个特征峰，并应与对照品参照物色谱中的12个特征峰保留时间相对应；
三萜类：供试品色谱中应呈现9个特征峰，并应与对照品参照物色谱中的4个特征峰保留时间相对应；与猪苓酮B参照物峰相对应的峰为S峰，计算各特征峰与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%范围之内，规定值为： 峰1：1.00，峰2：1.13 ，峰3：1.41，峰4：1.67，峰5：1.77 ，峰6：2.20；峰7：2.55，峰8：2.58，峰9： 2.61；
（2）质量评价：每1g物质基准含L-羟脯氨酸不得少于60 mg，甘氨酸不得少于120 mg，丙氨酸不得少于50 mg，L-脯氨酸不得少于70 mg；以L-羟脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-脯氨酸的总量评价猪苓汤物质基准的优劣。
5.根据权利要求1所述的猪苓汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，还包括测定待测猪苓汤浸膏粉中多糖含量的步骤，测定的色谱条件和质量评价具体为：
（1）以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂（推荐色谱柱：ZORBAX Eclipse Plus C18 2.1*50mm 1.8μm）；以乙腈-磷酸盐缓冲液（14:86）为流动相，检测波长为245nm，流速为每分钟0.25ml，柱温25℃，进样量3μl，理论板数按葡萄糖峰计算应不低于10000；磷酸盐缓冲液配制：25mmol/L磷酸二氢钾溶液1000ml内含5mol/L氢氧化钠溶液0.4ml，摇匀，即得；
（2）供试品溶液的制备：取本品粉末0.15g，置于50ml离心管，加水3ml完全溶解，再边搅拌边缓慢滴加乙醇30ml，摇匀，在4℃放置12小时以上，4000rpm离心10分钟，弃去上清液，用5ml无水乙醇洗涤沉淀表面，离心，弃去上清液，重复3次，沉淀物用热水溶解并转移至10ml量瓶，放却，加水至刻度，摇匀，精密量取5ml置顶空瓶中，精密加入4mol/L三氟乙酸溶液5ml，加盖密封，于115℃烘箱水解5小时，取出，冷却，溶液转移至烧瓶中，用适量水洗涤容器，洗液并入同一烧瓶中，于60℃旋干，再加4ml甲醇洗涤后旋干，重复3次，残渣用水溶解，转移至5ml量瓶，加水至刻度，摇匀；精密量取0.5ml，至具塞试管中，精密加入浓氨0.5ml、0.3mol/L PMP甲醇溶液0.5ml，密封，于70℃衍生化1小时，溶液转移至蒸发皿中，用适量水洗涤容器，洗液并入同一蒸发皿中，蒸干，再加4ml水洗涤，蒸干，重复2次，残渣精密加入水5ml、三氯甲烷4ml，超声，使充分溶解，转移到15ml离心管，用少量三氯甲烷洗涤容器，洗液并入同一离心管中，摇匀，4000rpm离心5分钟，取水层，滤过，取续滤液，即得；
（3）对照品溶液的制备：取D-甘露糖对照品，D-无水葡萄糖对照品，半乳糖对照品，L-（±）-阿拉伯糖对照品适量，精密称定，加水制成每1ml含甘露糖12μg，含葡萄糖0.2mg，半乳糖45μg，阿拉伯糖7μg的混合溶液，即得；取混合溶液1ml，按上述步骤（2）供试品溶液的制备方法中自“精密加入浓氨0.5ml”起，同法制备；
（4）分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，测定，本品每1g含多糖以甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖总量计算，不得少于5.0mg。
6.根据权利要求1所述的猪苓汤物质基准的质量控制方法，其特征在于，还包括泽泻、阿胶薄层鉴别的步骤，具体为：
（1）取本品粉末1g，加甲醇25ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取23-乙酰泽泻醇B对照品，加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液，作为对照品溶液；再取阿胶对照药材1g，加入到10ml热水中，搅拌溶解，蒸干，残渣加甲醇 25ml超声30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，作为对照药材溶液；
（2）照薄层色谱法，中国药典2020年版四部通则0502，试验，吸取上述对照药材溶液和供试品溶液各10μl，对照品溶液2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8:2:0.2）为展开剂，展开，取出，晾干，用2%香草醛的20%硫酸乙醇溶液显色，在105℃加热至斑点清晰，日光检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的主斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，则质量合格。
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