CN110960617B - 一种用于关节保护的药用组合物的制备方法及其质量分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于关节保护的尪痹制剂的质量分析方法，包括：对尪痹制剂中独活、白芍、知母、防风分别进行薄层鉴别；采用一标多测法，以淫羊藿苷为内标物，检测尪痹制剂中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的质量；采用高效液相法测定白芍中芍药苷含量；采用凯氏定氮法对尪痹制剂中的蛋白质的含量进行测定。对该组合物进行质量标准研究，明确其活性成名，可以更好地控制该组合物的质量，使其药用效果发挥稳定。

Description

一种用于关节保护的药用组合物的制备方法及其质量分析 方法
技术领域
本发明属于中药质量分析领域，特别涉及一种用于关节保护的药用组合物的制备方法及其质量分析方法。
背景技术
尪痹制剂的药物组合物是由地黄、熟地黄、防风、淫羊藿、白芍、狗脊、骨碎补、附子(制)、知母、当归红花等17味药材组成的复方制剂，该组合物由5个组分组成，分别通过超微粉碎、高压提取、挥发油包合、水提醇沉等工艺制备的药用组合物，并应用高压微射流匀质技术将各部分的混合物均匀均质。具有关节保护作用，可以用于治疗类风湿性关节炎等骨关节症。该产品作用明显，临床实验及患者使用情况很好。为更好的控制该组合物的质量，使其药用效果发挥稳定，我们对该组合物进行质量标准研究，明确其活性成名，使其质量稳定可控。
除了上述限制外，因为在机械加工，冶金，运输，石油工业等中通常遇到乳液，所以设计机械性能稳定和对复杂环境具有抵抗性的材料用于分离乳化油/水混合物也是非常重要的。 Feng等制备了一种水凝胶涂附的滤纸，可以在高度酸性，碱性和盐的环境中分离油/水乳液。然而，该膜的主要缺点是其环境适应性弱，这是因为水凝胶吸水后，容易溶胀并变软。Kanamori 等合成了各种棉花糖状的凝胶基于烷氧基硅烷上，用于在相对高的温度下吸收有机溶剂。但是这种凝胶不能分离油水乳液。尽管Jin等制备了一种单壁碳纳米管膜用于分离油包水乳液，通量高达100 000L m-2h-1bar-1且分离效率>99.95％。但是单壁碳纳米管的高成本和外加的压力限制了这种薄膜仅适用于实验室分离装置。因此，通过经济有效和简单的制造工艺制备新颖稳定的超疏水表面仍然是重要的需求，其预期不仅在恶劣的实际条件下是稳定的，而且还要完全分离油/水混合物，特别是用于表面活性剂稳定的油/水乳液。
发明内容
为了克服上述不足，本发明提供一种用于关节保护的药用组合物的制备方法及其质量分析方法。对该组合物进行质量标准研究，明确其活性成名，可以更好地控制该组合物的质量，使其药用效果发挥稳定。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的目的之一是提供了一种用于关节保护的尪痹制剂的质量分析方法，包括：
对尪痹制剂中独活、白芍、知母、防风分别进行薄层鉴别；
采用一标多测法，以淫羊藿苷为内标物，检测尪痹制剂中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷的质量；
采用高效液相法测定白芍中芍药苷含量；
采用凯氏定氮法对尪痹制剂中的蛋白质的含量进行测定。
在一些实施例中，所述一标多测法的具体步骤为：
1)制取尪痹制剂供试品溶液；
2)分别制取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷对照品溶液；
3)分别吸取步骤2)所述的对照品溶液，注入高效液相进行测试，记录相对保留时间、峰面积，绘制相应的标准曲线，计算出朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的校正因子F；
4)吸取步骤1)制取尪痹制剂供试品溶液，注入高效液相，测定，根据步骤3)的相对保留时间和校正因子F对供试品溶液朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷进行定量测定。
在一些实施例中，所述朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的校正因子F分别为0.7691、0.7906、0.8545和1.0000。
在一些实施例中，所述高效液相检测条件为：采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱、流动相为乙腈-0.1％磷酸水(24:76)、等度洗脱、流速1.0ml/min、柱温30℃、检测波长为270nm。
在一些实施例中，用于测定白芍中芍药苷含量的供试品溶液采用超声提取法提取。
在一些实施例中，所述高效液相法的具体检测条件为；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱、以乙腈为流动相A，以0.01％三氟乙酸水为流动相B，流速1.0ml/min、柱温30℃，按下表中的规定进行梯度洗脱；
Figure BDA0001819662940000021
在一些实施例中，所述尪痹制剂的采用如下方法制备：
将白芍、知母超微粉碎、混合均匀，记为超微粉组合物；
将地黄、熟地黄、骨碎补、狗脊分别进行水提，将得到的水提物混合均匀，记为组合物Ⅰ；
分别提取独活、桂枝的挥发油，包合、再制成纳米乳，记为组合物Ⅱ；
将羊骨破碎成小段，在高温高压提取，过滤，离心，浓缩，制成纳米乳，记为组合物Ⅲ；
将白芍、知母、制附子、续断、淫羊藿、防风、威灵仙、皂角刺、伸筋草及红花分别进行水提醇沉，混合均匀，制成纳米乳，记为组合物Ⅳ；
将上述组合物Ⅰ和超微粉组合物混合、制粒制成颗粒；
将组合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ，做成微丸；
最后将颗粒及微丸整粒后压片，即得。
本发明的有益效果
(1)本发明对该尪痹制剂的药物组合物进行质量标准研究，明确其活性成名，可以更好地控制该组合物的质量，使其药用效果发挥稳定。
(2)本发明质量分析方法简单、药效高、实用性强，易于推广。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1独活薄层鉴别图谱。1：组合物2：对照药材3：蛇床子素4：二氢欧山芹醇当归酸酯 5：阴性对照
图2防风薄层鉴别图谱。1：组合物2：对照药材3：5-O-甲基维斯阿米醇苷4：阴性对照
图3白芍薄层鉴别图谱。A：组合物B：芍药苷C：阴性对照
图4知母薄层鉴别图谱。1：菝葜皂苷元对照品2：组合物3：阴性对照
图5色谱柱考察结果；图6色谱柱考察结果；图7柱流速考察结果；图8柱温考察结果；图9检测波长的考察结果；图10阴性考察结果；图11朝藿定A标准曲线；图12朝藿定B 标准曲线；图13朝藿定C标准曲线；图14淫羊藿苷标准曲线；图15色谱柱考察结果；图 16流动相的考察结果；图17柱流速考察结果；图18柱温考察结果；图19芍药苷标准曲线；图20组合物的阴性对照图谱。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1
一、制备方法
1.1制法
组分1：取1/2处方量的白芍和知母用粉碎机粉碎，再用振动式超微粉碎机粉碎1.5小时即得。
组分2：取羊骨破碎成小段，进过高温高压提取，提取条件为压力0.10MPa、时间2小时、 2倍水，过滤，离心，浓缩，得羊骨提取浓缩液。羊骨提取浓缩液有油脂层和水溶液采用高压微射流均质机(800bar，重复均质4次)进行匀质处理，即得。
组分3：取独活、桂枝，加6倍水，直通蒸汽进行提取，提取4-6小时，收集得到挥发油，剩余药液过滤浓缩备用。取纯化水，β-环糊精(β环糊精：挥发油10:1)置容器中搅拌均匀，倒入胶体磨中，在研磨状态下加入挥发油，包合时间为30-60分钟，接冷凝水，包合温度控制在30-40℃之间，即得挥发油包合物。
组分4：取地黄、熟地黄、骨碎补、狗脊加水煎煮2次，8倍量、2h，6倍量、1h。过滤，合并滤液，浓缩，得到水提取浓缩液。将水提取浓缩液与组分3中挥发油提取的剩余药液浓缩液混合均匀，即得水提取组合物。
组分5：附子(制)、淫羊藿、防风、以及剩余的1/2处方量的白芍和知母药材水提取后浓缩成水煎液：生药量＝1:1，调节药液PH值为5，加入到高压匀质机设定压力600bar，匀质 4次，然后加3倍乙醇搅拌，静置过夜，取上清回收乙醇浓缩成浸膏即得。
1.3该组合物的应用
应用本组合物可以制备得到适用于多种剂型，内服剂型如片剂、胶囊等，外用剂型如药浴液等。通过内服，外用熏蒸泡浴等方式来达到抑制炎症、保护骨关节，治疗骨关节疾病的目的。
1.3.1片剂
取水提取组合物，超微粉组分作为底粉，用一步制粒机制成颗粒，其他组分干燥，制成微丸，将颗粒、微丸整粒后压片，包衣，即得。
详细实例(待补充)
1.3.2胶囊
取该组合物，加入糊精1份、淀粉1份，混匀制粒，干燥，分装于胶囊中即得。
1.3.3纳米乳药浴液制备方法
(1)称取卵磷脂0.5-4g，蔗糖酯0.5-4g，丙二醇0.5-4g，组合物稠膏2.0-8.0g，用水补足10.0g 备用。
(2)将卵磷脂、蔗糖酯、组合物稠膏和水放入烧杯，混合得到粗乳液，再利用动态超高压微射流均质机对粗乳液进行均质处理，得到组合物纳米乳药浴液。
二、质量标准研究
对该组合物进行质量标准研究，建立该药用组合物的质量标准。针对淫羊藿、白芍、防风、知母等处方中的主要原料的成分进行薄层鉴别和含量测定等定性定量分析，建立该药用组合物的质量控制方法。
2.1薄层鉴别标准研究
2.1.1鉴别药味的选择
方中共有17味药组成，针对具有祛风湿、强筋骨和活血作用的重要药味，如独活、白芍、知母、防风建立了TLC鉴别。
2.2.2独活的薄层鉴别研究
根据独活含有的化学成分，以独活为对照药材，以二氢欧山芹醇当归酸酯对照品、蛇床子素为对照品，鉴别组合物中的独活药味。并按工艺方法制备缺独活药材的阴性对照液同时进行鉴别。
鉴别方法：取经干燥的药用组合物粉末，5g，加热水50ml使溶化，放冷，转移至分液漏斗中，用乙醚提取2次(30ml，20ml)，合并乙醚提取液，减压蒸干，残渣加乙酸乙酯1ml 使溶解，作为供试品溶液。另取独活对照药材0.1g，加水50ml，煎煮30min，滤过，滤液转移至分液漏斗中，自“用乙醚提取”起同法制成对照药材溶液。取二氢欧山芹醇当归酸酯、蛇床子素，加甲醇分别制成每1ml含0.4mg的溶液，作为对照品溶液。分别取供试品溶液4μl，对照药材溶液和对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(15：5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，在105℃加热至条带显色清晰。置紫外光灯(365nm)下检视。
结果显示供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光的条带。阴性对照溶液在供试品溶液和对照药材溶液相应的位置上无相同颜色的条带显现，无干扰，证明方法对独活药材有一定的专属性，结果见图1。
2.1.3防风的薄层鉴别研究
防风中含有多种化学成分，主要有色原酮类、香豆素类、有机酸类、聚乙炔类、甘油脂类、多糖类等多种有机成分。其色原酮类的化学成分升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷鉴别特征性较强，具有一定的专属性，因此本实验采用对照品升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷鉴别组合物中的防风药味。按工艺方法制备缺防风药材的阴性对照溶液，同时进行鉴别。
鉴别方法：取经干燥的药用组合物粉末，5g，加热水50ml使溶化，放至室温，先用乙醚萃取两次，每次加30ml后，分离乙醚萃取物，水层再用正丁醇萃取，每次加30ml，合并二次正丁醇萃取液，减压蒸干，残渣加2ml甲醇使溶解，滤过，作为供试品溶液。取防风对照药材1g，加丙酮20ml，超声处理20分钟，滤过，滤液减压蒸干，残渣加甲醇1ml使溶解，制成对照药材溶液。再取5-O-甲基维斯阿米醇苷对照品，加甲醇制成每1m1含1mg的溶液，作为对照品溶液。供试品溶液5μl，对照药材溶液和对照品溶液各2μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-乙酸乙酯-水-冰醋酸(10:10:20:5:1)下层液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇试液，在105℃加热至条带显色清晰。置紫外光灯(365nm)下检视。
结果表明，供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光的条带。阴性对照溶液在供试品溶液和对照药材溶液相应的位置上无相同颜色的条带显现，无干扰，证明该方法对防风药材有一定的专属性，结果见图2。
2.1.4白芍的薄层鉴别研究
芍药苷为白芍中标志性成分，因此以芍药苷为对照品，鉴别组合物中的白芍药味。按工艺方法制备缺白芍药材的阴性对照液，同时进行鉴别。
鉴别方法：取经干燥的药用组合物粉末，5g，加水30ml，超声处理1小时，离心，取上清液，用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次20ml，合并正丁醇液，蒸干，残渣加甲醇1ml 使溶解，作为供试品溶液。另取芍药苷对照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各 10-15μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯 -甲醇-甲酸(40：5：10：0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，置 105℃加热至斑点显色清晰。
结果表明，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的蓝紫色斑点。阴性对照液在对照品相应的位置上无斑点显现，证明该方法对白芍药材有一定的专属性，结果见图3。
2.1.5知母薄层鉴别研究
菝葜皂苷元为知母中标志性成分之一，因此以菝葜皂苷元为对照品，鉴别组合物中的知母药味。按工艺方法制备缺知母药材的阴性对照液，同时进行鉴别。
鉴别方法：取经干燥的药用组合物粉末，5g，加乙醇30ml，加热回流1小时，滤过，取滤液加盐酸2ml，再加热回流1小时，置水浴上浓缩至约5ml，加水10ml，转移至分液漏斗中用甲苯振摇提取2次，每次10ml，合并甲苯层，先用1％的氢氧化钠溶液10ml洗涤，再用水洗涤3次，每次10ml，分取甲苯层蒸干，残渣加甲苯1ml使溶解，作为供试品溶液。另取菝葜皂苷元对照品，加甲苯制成每1ml含3mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(《中国药典》2005年版一部附录VI B)试验，吸取上述两种溶液各10-15μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以甲苯：丙酮(9：1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色清晰。
结果显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。阴性对照液在对照品相应的位置上无斑点显现，证明该方法对知母药材有一定的专属性，结果见图4。
2.2“一标多测”法测定淫羊藿中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的含量
淫羊藿为该药用组合物处方中的主要原料，淫羊藿中的淫羊藿苷等黄酮类成分也具有关节保护作用，为该药用组合物的主要活性成分，所以首先针对淫羊藿中的指标性成分进行研究，建立“一标多测”的质量控制方法。
2.2.1检测方法：
照高效液相色谱法(附录ⅥD)测定。
色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈-0.1％磷酸水 (24:76)为流动相；检测波长270nm；理论塔板数按淫羊藿苷峰计算应不低于3000。
对照品溶液的制备精密称取淫羊藿苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含0.08mg 的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液的制备取本药用组合物经干燥后的粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇20ml，称定重量，超声处理1小时，再称定重量，用稀乙醇补充减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，以淫羊藿苷对照品的含量为对照，分别计算朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的含量，校正因子F分别为0.7691、0.7906、0.8545和1.0000。
本品按干燥品计算，含朝藿定A不低于0.08％、朝藿定B不低于0.49％、朝藿定C不低于0.48％、淫羊藿苷含量不低于0.22％。
2.2.2指标性成分的选择
参考中国药典(2015年版)一部中淫羊藿药材的质量标准，并结合淫羊藿药材自身的化学成分特点，选取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷为其指标性成分，含量测定的指标性成分，采用高效液相色谱法进行测定。
2.2.3仪器与试药
高效液相色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱系统；紫外检测器：VWD G1314A。
朝藿定A对照品：成都曼思特生物科技有限公司，MUST-14060312；
朝藿定B对照品：成都曼思特生物科技有限公司，MUST-14062312；
朝藿定C对照品：成都曼思特生物科技有限公司，MUST-14022312
淫羊藿苷对照品：成都曼思特生物科技有限公司，MUST-13120510；
乙腈：色谱纯，Caledon in Canada产品；
甲醇：色谱纯，天津市大茂化学试剂厂产品；
水：超纯水；
2.2.4分析方法
本实验拟采用以“一种标准品测定多种成分含量(one single standardsubstancefor determination of multiple components)”，即“一标多测(One for M)”的方法，解决中药多成分含量测定中对照品缺乏问题，并以淫羊藿苷为标准品，建立了朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C 和淫羊藿苷四个指标性成分的含量测定方法。
2.2.5供试品溶液的制备方法
参照《中国药典》2015年版中淫羊藿药材淫羊藿苷的含量测定项下的供试品溶液的制备方法，方法如下：
取经干燥后的本药用组合物粉末约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇 20ml，称定重量，超声处理1小时，再称定重量，用稀乙醇补充减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.2.6色谱条件与系统适用性试验
(1)色谱柱的考察：选择了Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱、AgelaDurashell C18色谱柱和 KromasilAKZONOBEL100-5-C18色谱柱三种色谱柱进行了考察，结果Agilent ZORBAXSB-C18色谱柱分离效果好，峰形较好，故选用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱。色谱图见图5。
(2)流动相的考察：选择三种流动相系统，乙腈-0.1％磷酸水(24:76)、乙腈-、水(24:76)、乙腈-0.5％磷酸水(24:76)等度洗脱。结果以乙腈-0.1％磷酸水(24:76)等度洗脱系统为佳，色谱峰分离度好，峰型好，保留时间适中，故选择乙腈-0.1％磷酸水(24:76)等度洗脱系统为流动相。色谱图见图6。
(3)流速的考察：选择三种流速0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min，进行考察，结果流速对分离影响不大，以1.0ml/min各色谱峰保留和分离效果最合适宜，峰形较好，故选用1.0ml/min流速较为合适。色谱图见图7。
(4)柱温的考察：选择三种柱温25℃、30℃和35℃，进行考察，结果温度对分离影响不大，故选用30℃柱温较为合适。色谱图见图8。
(5)检测波长的考察：选择全波长扫描进行波长考察，结果检测波长为270nm时各色谱峰响应值较大，分离度好，保留时间最适中，故选用270nm，色谱图见图9。
(6)阴性：按工艺方法制备缺淫羊藿药材的阴性对照样品，并同法制备阴性样品供试品溶液，结果显示阴性无干扰，色谱图见图10。
(7)方法学考察
标准曲线与线性范围
精密称取朝藿定A对照品1.70mg，置于25ml容量瓶，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀；再精密量取2.5ml置于5ml容量瓶，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，备用。
精密称取朝藿定B对照品2.08mg，置于10ml容量瓶，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀；再精密量取2.5ml置于5ml容量瓶，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，备用。
精密称取朝藿定C对照品2.18mg，置于25ml容量瓶，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀。
精密称淫羊藿苷对照品2.30mg，置于25ml容量瓶，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，备用。
精密吸取各对照品溶液2、4、6、8、10、12μl进样，记录峰面积，以进样量(ug)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线(见图11-图14)，测定结果见表1、表2。
表1朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的回归方程
Figure BDA0001819662940000091
Figure BDA0001819662940000101
表2朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷的标准曲线结果
Figure BDA0001819662940000102
精密度考察：取该药用组合物，按供试品溶液的制备方法制备，制备供试品溶液，连续进样6次，测定峰面积，计算RSD，结果见表8，结果表明仪器精密度良好。
表8精密度试验结果
Figure BDA0001819662940000103
稳定性考察：取该药用组合物，按供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，分别在0、 2、4、6、8、12小时进样，结果见表9。
表9样品稳定性试验结果
Figure BDA0001819662940000111
结果表明，样品溶液在12小时内测定能够满足含量测定的误差要求。
重复性试验：分取该药用组合物供试品6份，按供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，测定峰面积，计算含量。结果见表10。
表10重复性试验结果
Figure BDA0001819662940000112
结果表明RSD％值均小于3％，方法的重复性较好。
准确性试验：即加样回收试验，选取含量已知的该药用组合物，该药用组合物含量朝藿定A0.09％、朝藿定B 0.55％、朝藿定C 0.56％和淫羊藿苷0.25％。
加样回收试验供试品溶液的制备：精密称取样品0.25g，按1:1浓度分别精密加入对照品溶液，按供试品溶液的制备方法，制成6份同浓度的供试品溶液。
按【含量测定】方法测定，计算出回收率，见表11-表14。
表11朝藿定A加样回收率试验结果
Figure BDA0001819662940000121
表12朝藿定B加样回收率试验结果
Figure BDA0001819662940000122
表13朝藿定C加样回收率试验结果
Figure BDA0001819662940000123
Figure BDA0001819662940000131
表14淫羊藿苷加样回收率试验结果
Figure BDA0001819662940000132
结果表明方法准确性符合含量测定的要求。
样品的测定
参照正文的方法，对6批该药用组合物中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的含量进行了测定，结果见表15，表16。
确定本品含朝藿定A不低于0.08％、朝藿定B不低于0.49％、朝藿定C不低于0.48％、淫羊藿苷含量不低于0.22％。
表15标准曲线的含量测定结果
Figure BDA0001819662940000133
Figure BDA0001819662940000141
表16一标多测(One for M)法的含量测定结果
Figure BDA0001819662940000142
2.3测定白芍中芍药苷含量
2.3.1指标性成分的选择
选取药用组合物主要成分白芍中芍药甘为含量测定指标性成分，并采用高效液相色谱法进行测定。
2.3.2仪器与试药
高效液相色谱仪：Agilent 1100高效液相色谱系统；紫外检测器：VWD G1314A。芍药苷对照品：中国药品生物制品检定所，批号110736-201438；淫羊藿苷对照品：中国药品生物制品检定所，批号110737-200415；乙腈：色谱纯，Caledon in Canada产品；甲醇：色谱纯，天津市大茂化学试剂厂产品；水：超纯水；
2.3.3供试品溶液的制备方法
取经干燥的组合物粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，称定重量，加热回流1小时，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3.3.1提取方法的考察
拟采用超声、回流和温浸作为提取方法进行了考察。方法为：取干燥后的组合物粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，6份，分别精密加入稀乙醇25ml，称定重量，分别按上述3种提取方法提取，时间1h，每种方法平行两份。计算芍药苷的提取量，结果见表3。
表17提取方法的考察
Figure DEST_PATH_IMAGE001
结果表明，超声对组合物中芍药苷提取量稍大，并且方法比较简单，所以选用超声作为提取方法。
2.3.3.2提取溶剂的考察
拟采用不同溶剂95％乙醇、稀乙醇、50％甲醇、甲醇和水作为提取溶剂进行了考察。方法为：取经干燥后的组合物粉末1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，8份，分别加上述4种溶剂超声提取1h，每个溶剂平行两份。计算芍药苷的提取量，结果见表4。
表18提取溶剂的考察
Figure DEST_PATH_IMAGE002
结果表明，稀乙醇对组合物中芍药苷的提取量稍大，选用稀乙醇作为提取溶剂。
2.3.3.3样品量的考察
拟对样品不同的称量量0.2g，0.5g，0.8g，1.0g进行了考察。方法为：取干燥后的组合物粉末，分别按上述称量量称取，精密称定，置具塞锥形瓶中，6份，分别精密加入稀乙醇25ml，称定重量，超声提取1h，平行两份。计算芍药苷的提取量，结果见表19。
表19样品量的考察
Figure BDA0001819662940000161
结果表明，0.2g-1.0g的样品量对组合物中芍药苷的提取量影响较大，考虑到实际峰面积的大小，所以选用1.0g作为样品的称量量。
2.3.3.4提取时间的考察
拟对不同的提取时间0.5h，1h，1.5h，2.0h进行了考察。方法为：取干燥后的组合物粉末 1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，6份，分别精密加入稀乙醇25ml，称定重量，分别按上述3种提取时间超声提取，每种提取时间平行两份。计算芍药苷的提取量，结果见表20。
表20提取时间的考察
Figure BDA0001819662940000162
Figure BDA0001819662940000171
结果表明，超声提取1h对组合物中芍药苷的提取量影响较大，所以选用1h作为提取时间。
2.3.3.5确定供试品溶液的制备方法
取干燥后的组合物1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25ml，称定重量，超声处理(功率200W，频率40kHz)1小时，取出，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.3.3.6色谱条件与系统适用性试验
(1)色谱条件与系统适用性试验
色谱柱的考察：选择了Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱、Durashell C18色谱柱和Unitiry C18色谱柱三种色谱柱进行了考察，结果以Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱分离效果好，峰形较好，保留时间短，故选用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱。色谱图见图15。
流动相的考察：选择三种流动相系统，方法如下：
方法一：以乙腈为流动相A，以0.01％三氟乙酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；
Figure BDA0001819662940000172
方法二：以乙腈为流动相A，以0.01％三氟乙酸水为流动相B，按下表中的规定进行梯度洗脱；
Figure BDA0001819662940000173
方法三：乙腈-0.1％磷酸水(11:89)等度洗脱。
结果以方法一的洗脱系统为佳，色谱峰分离度好，峰型好，保留时间适中，方法二的分离度差，方法三有小峰干扰，故选择方法一的梯度洗脱系统为流动相。色谱图见图16。
流速的考察：选择三种流速0.8ml/min、1.0ml/min和1.2ml/min，进行考察，结果流速对芍药苷的分离影响不大，以1.0ml/min各色谱峰保留和分离效果最合适宜，峰形较好，故选用 1.0ml/min流速较为合适。色谱图见图17。
柱温的考察：选择三种柱温25℃、30℃和35℃，进行考察，结果温度对芍药苷的分离影响不大，故选用30℃柱温较为合适。色谱图见图18。
(2)方法学考察
标准曲线与线性范围
精密称取芍药苷对照品2.97mg，置于25ml量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。精密吸取对照品溶液1、2、4、6、8、10μl进样，记录峰面积，以进样量(ug)为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线(见图19)，测定结果见表21。
回归方程为：芍药苷：Y＝1353.5X-0.0742R2＝1
结果表明：芍药苷对照品在0.119～1.186μg范围内呈良好的线性关系。
表21芍药苷标准曲线结果
Figure BDA0001819662940000181
精密度考察：取该药用组合物，按供试品溶液的制备方法制备，制备供试品溶液，连续进样6次，测定峰面积，计算RSD，结果见表22，结果表明仪器精密度良好。
表22精密度试验结果
Figure BDA0001819662940000182
稳定性考察：取该药用组合物，按供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，分别在0、 2、4、8、12、24小时进样，结果见表23。
表23样品稳定性试验结果
Figure BDA0001819662940000191
结果表明，样品溶液在24小时内测定能够满足含量测定的误差要求。
重复性试验：取该药用组合物样品6份，按供试品溶液的制备方法，制备供试品溶液，测定峰面积，计算含量。结果见表24。
表24重复性试验结果
Figure BDA0001819662940000192
结果表明方法的重复性较好。
准确性试验：即加样回收试验，选取含量已知的药用组合物，芍药苷的含量为1.787mg/g
芍药苷的加样回收试验供试品溶液的制备：精密称取样品0.5g，按1:1浓度分别精密加入对照品溶液，按供试品溶液的制备方法，制成6份同浓度的供试品溶液。
进行测定，计算出回收率，见表25。
表25芍药苷加样回收率试验结果
Figure BDA0001819662940000193
结果表明方法准确性符合含量测定的要求。
专属性试验：
制备药用组合物中除去白芍药材的阴性对照样品，，取1.0g，按上文中供试品溶液的制备方法制备。结果表明组合物的阴性对照对其含量测定无干扰，该含量测定方法具有一定的专属性。结果见图20。
组合物中芍药苷的含量测定
按照上文的方法，对22批药用组合物中芍药苷的含量进行了测定，结果见表26。
根据测定结果，芍药苷含量范围在0.11-0.36％之间，故暂规定本组合物含白芍以芍药苷计，不得少于0.12％。
注：经按白芍药材含芍药苷含量限度1.6％折算制剂转移率为40％
表26药用组合物中芍药苷的含量测定结果
Figure BDA0001819662940000201
2.4芍药苷和淫羊藿苷的HPLC标准方法测定
色谱条件
色谱柱：Lichrospher C18(4.6*250mm)；流动相：A相：0.1％冰醋酸；B相：乙腈；梯度设置：0-15min15％B，5-20min15％-30％B，20-35min30％B；检测波长240nm；温度25℃；流速为1ml/min，进样量为10μl。
对照品溶液制备：分别精密称取芍药苷对照品12.86mg，淫羊藿苷对照品10.45mg，加甲醇制成每1ml含芍药苷102.88μg，淫羊藿苷20.90μg的混合溶液，即得。
供试品的制备：取经药用组合物1.5g，精密称定，精密加入25ml的稀乙醇，超声提取 10min，放冷，用稀乙醇补足失重，过0.45μm的滤液，即得。
2.5羊骨指标性成分含量测定方法
羊骨中含有大量的蛋白质等营养成分，现应用凯氏定氮法对药用组合物中的蛋白质的含量进行测定。
2.5.1试剂
硫酸铜、硫酸钾、硫酸、2％硼酸溶液。
混合指示液：1份0.1％甲基红乙醇溶液与5份0.1％溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。也可用2份0.1％甲基红乙醇溶液与1份0.1％次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。
30％氢氧化钠溶液。
0.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。
2.5.2检测方法
(1)样品处理：精密称取2g经干燥后的组合物粉末，移入干燥的100ml定氮瓶中，加入0.2g 硫酸铜，6g硫酸钾及20ml硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。也用消解仪进行样品处理，消解温度240℃。组装凯氏定氮装置，于水蒸气发生器内装水2/3处加甲基红指示液数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防止爆沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。向接受瓶内加入10ml2％硼酸溶液剂混合指示剂1滴，并使冷凝管下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml40％氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，不能立即将玻璃盖塞紧，这样易使玻璃塞粘在进样口，应先用蒸馏水冲洗然后再盖，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸汽通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.05N硫酸或0.05N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。同时吸取10.0ml试剂空白消化液按上法操作。
(2)计算：
X＝[(V1-V2)×N×0.014]/[M×(10/100)]×F×100％
X：样品中蛋白质的百分含量，g；
V1：样品消耗硫酸或颜色标准液的体积，ml；
V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；
N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014:1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m：样品的质量(体积)，g(ml)；
F：氮换算为蛋白质的系数。蛋白质中的氮含量一般为15-17.6％，系数按16％
计算乘以6.25即为蛋白质。
2.5.3药用组合物中蛋白质含量测定
按上法测定6批组合物中蛋白质含量，测定结果见表27。根据测定结果限定该组合物中蛋白质含量不低于7.0％。
表27药用组合物中蛋白质的含量测定结果
Figure BDA0001819662940000221
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (2)

1.一种用于关节保护的尪痹制剂的质量分析方法，其特征在于，包括：
对尪痹制剂中独活、白芍、知母、防风分别进行薄层鉴别；
采用一标多测法，以淫羊藿苷为内标物，检测尪痹制剂中朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的质量；
采用高效液相法测定白芍中芍药苷含量；
采用凯氏定氮法对尪痹制剂中的蛋白质的含量进行测定；
所述一标多测法的具体步骤为：
1)制取尪痹制剂供试品溶液；
2)分别制取朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷对照品溶液；
3)分别吸取步骤2)所述的对照品溶液，注入高效液相进行测试，记录相对保留时间、峰面积，绘制相应的标准曲线，计算出朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的校正因子F；所述高效液相检测条件为：采用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱、流动相为乙腈-0.1％磷酸水、等度洗脱、流速1.0ml/min、柱温30℃、检测波长为270nm；流动相中乙腈：0.1％磷酸水为24:76；
4)吸取步骤1)制取尪痹制剂供试品溶液，注入高效液相，测定，根据步骤3)的相对保留时间和校正因子F对供试品溶液朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷进行定量测定；
所述采用高效液相法测定白芍中芍药苷含量中，用于测定白芍中芍药苷含量的供试品溶液采用超声提取法提取；所述高效液相法的具体检测条件为；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱、以乙腈为流动相A，以0.01％三氟乙酸水为流动相B，流速1.0ml/min、柱温30℃，按下表中的规定进行梯度洗脱；
Figure FDA0003306025490000011
所述尪痹制剂采用如下方法制备：
组分1：取1/2处方量的白芍和1/2处方量的知母用粉碎机粉碎，再用振动式超微粉碎机粉碎1.5小时即得；
组分2：取羊骨破碎成小段，高温高压提取，提取条件为压力0.10MPa、时间2小时、2倍水，过滤，离心，浓缩，得羊骨提取浓缩液；羊骨提取浓缩液有油脂层和水溶液采用高压微射流均质机进行匀质处理，800bar，重复均质4次，即得；
组分3：取独活、桂枝，加6倍水，直通蒸汽进行提取，提取4-6小时，收集得到挥发油，剩余药液过滤浓缩备用；取纯化水，β-环糊精置容器中搅拌均匀，倒入胶体磨中，在研磨状态下加入挥发油，包合时间为30-60分钟，接冷凝水，包合温度控制在30-40℃之间，即得挥发油包合物；β环糊精：挥发油为10:1；
组分4：取地黄、熟地黄、骨碎补、狗脊加水煎煮2次，8倍量、2h，6倍量、1h；过滤，合并滤液，浓缩，得到水提取浓缩液；将水提取浓缩液与组分3中挥发油提取的剩余药液浓缩液混合均匀，即得水提取组合物；
组分5：制附子、续断、淫羊藿、防风、威灵仙、皂角刺、伸筋草、红花以及剩余的1/2处方量的白芍和剩余的1/2处方量的知母药材水提取后浓缩成水煎液：生药量＝1:1，调节药液pH值为5，加入到高压匀质机设定压力600bar，匀质4次，然后加3倍乙醇搅拌，静置过夜，取上清回收乙醇浓缩成浸膏即得；
取组分4、组分1作为底粉，用一步制粒机制成颗粒，其他组分干燥，制成微丸，将颗粒、微丸整粒后压片，包衣，即得尪痹制剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷的校正因子F分别为0.7691、0.7906、0.8545和1.0000。
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