CN114965809B - 一种易黄汤中盐黄柏有效成分的鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种易黄汤中盐黄柏有效成分的鉴别方法，包括以下步骤：(1)取易黄汤样品，加入有机溶剂加热回流，再加入增溶剂，滤过、浓缩得到供试品溶液；(2)制备对照样品溶液；(3)将供试品溶液和对照样品溶液点样于氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板，置于展开剂展开，晾干后置于紫外灯下检视，所述的展开剂为聚乙二醇‑甲苯‑石油醚‑乙酸乙酯。本发明采用薄层层析法以盐酸小檗碱作为易黄汤中盐黄柏有效成分来进行定性分析，采用吐温80增溶，同时结合体积比为1：7～16：4～12：1～4的聚乙二醇‑甲苯‑石油醚‑乙酸乙酯展开剂进行分离，斑点清晰度高且Rf在较优区间内、鉴别结果准确。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析领域，具体涉及一种易黄汤中盐黄柏有效成分的鉴别方法。
背景技术
易黄汤是一种主治肾虚湿热带下症的中药方剂，原料包括：山药、芡实、黄柏、车前子、白果。具体配方为山药(炒)、芡实(炒)各30g，黄柏(盐水炒)6g，车前子(酒炒)3g、白果(碎，十枚)12g。易黄汤的用法为用水煎服，主治肾虚湿热带下、带下粘稠量多、色黄如浓茶汁、其气腥秽、舌红、苔黄腻者。现代临床主要用于(1)宫颈糜烂；(2)慢性盆腔炎；(3)阴道炎等的治疗。
黄柏与盐黄柏属于同种药物，黄柏指生黄柏，盐黄柏是由生黄柏用盐炮制后制得，用盐炮制黄柏可以增加入肾的功效。黄柏性味苦寒，有清热燥湿，泻火除蒸，解毒疗疮之功效，作为传统中药在市场流通和临床治疗应用广泛。黄柏的主要有效成分为盐酸小柴碱和盐酸黄柏碱等生物碱类化合物，吴珊珊等人利用HPLC法同时测定不同等级黄柏饮片中多指标成分的含量，研究发现盐酸小檗碱含量>5.5％，盐酸黄柏碱含量>0.55％，即黄柏中的生物碱类化合物以盐酸小檗碱含量最多(吴珊珊,胡麟,龚晓猛,等.HPLC法同时测定不同等级黄柏饮片中多指标成分的含量[J].中国药房,2016,27(15):2135-2137.)。
目前关于黄柏的鉴别方法，《中国药典》2015版中是以醋酸甲醇溶液为溶解液，超声处理，并用三氯甲烷-甲醇-水(30：15：4)展开，稀碘化铋钾试液显色，但使用其方法鉴别时，因需另外喷显色剂，步骤繁琐；且用醋酸甲醇溶解时盐黄柏中的盐酸小檗碱可能会出现溶解度低从而导致斑点不清晰等问题。另外，在其他公开文献的报道中，该方法也会因为药材成分不同导致干扰严重、斑点不清晰的问题。
公开号为CN113252836A的中国专利文献公开了一种黄柏及黄柏酒炙品的薄层层析鉴别方法，包括如下步骤：(1)将样品制成提取液；(2)将步骤(1)所得提取液固液分离，向所得液体中加入溶剂，制备得到供试品溶液；(3)将步骤(2)所得供试品溶液与对照品溶液于硅胶板点样，展开，取出，干燥后于紫外灯下检视。该发明使用乙酸乙酯、甲醇、三氯甲烷、氨水和三乙胺按体积比为4-8：1-3：1-3：0.5-1.5：1组成的混合溶液作为展开剂，组分较为复杂。
公开号为CN103134895A的中国专利文献公开了一种复方黄柏制剂的鉴别方法，该复方黄柏制剂包括黄柏、虎杖、萹蓄、瞿麦、白茅根、野菊花、淫羊藿和车前子，利用薄层色谱鉴别其中的黄柏药材，溶解液选用甲醇，展开剂选用乙酸乙酯：无水乙醇：甲酸(6-8.5：0.5-1.5：1-2.5)，在365nm紫外光灯下检视出现黄色荧光斑点。但该发明中测试溶液的稳定性有待提高。
基于上述现有技术存在的缺陷，开发一种操作简单、易于显色、准确度高、适用于易黄汤中盐黄柏有效成分的鉴别方法至关重要。
发明内容
本发明提供了一种易黄汤中盐黄柏有效成分的鉴别方法，该方法适用性好、易于实施，且鉴定结果准确，不需要显色剂的作用，斑点清晰度高且Rf值在较优区间内，避免了假阳性和假阴性结果。
具体采用的技术方案如下：
一种易黄汤中盐黄柏有效成分的鉴别方法，包括以下步骤：
(1)取易黄汤样品，加入有机溶剂加热回流，再加入增溶剂，滤过得到滤液，浓缩后得到供试品溶液；
(2)制备对照样品溶液；所述的对照样品溶液为阴性样品溶液和阳性样品溶液，阴性样品溶液为缺盐黄柏样品溶液，阳性样品溶液为盐黄柏样品溶液和盐酸小檗碱对照品溶液；
(3)将供试品溶液和对照样品溶液点样于氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板，置于展开剂展开，晾干后置紫外灯下检视，所述的展开剂为聚乙二醇-甲苯-石油醚-乙酸乙酯。
优选的，步骤(1)中，易黄汤样品的用量为0.2～0.6g，有机溶剂的加入量为40～120mL，浓缩后得到2～6mL浓缩液作为供试品溶液。
所述的缺盐黄柏样品溶液的制备方法为：取0.2～0.6g缺盐黄柏阴性样品，加入40～120mL有机溶剂加热回流，再加入增溶剂，滤过得到滤液，浓缩后得到2～6mL浓缩液作为缺盐黄柏样品溶液。
所述的盐黄柏样品溶液的制备方法为：取0.1～0.3mg盐黄柏对照药材，加40～120mL水煎煮，滤过得到滤液，进一步蒸干得到残渣；残渣加入20～60mL有机溶剂加热回流，再加入增溶剂，滤过得到滤液，浓缩后得到1～3mL浓缩液作为盐黄柏样品溶液。
所述的盐酸小檗碱对照品溶液的制备方法为：取盐酸小檗碱对照品，加甲醇溶解后再加入增溶剂得到盐酸小檗碱对照品溶液；所述的盐酸小檗碱对照品溶液的浓度为1～3mg/mL。
优选的，在供试品溶液、缺盐黄柏样品溶液以及盐黄柏样品溶液的制备过程中，所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、醋酸乙酯中的至少一种，加热回流时间为10～20min。
优选的，所述的增溶剂为吐温80，加入增溶剂后溶液体系中的吐温80浓度为1％～2％。
本发明采用薄层层析法以盐酸小檗碱作为易黄汤中盐黄柏有效成分来进行定性分析，结果准确；采用增溶剂吐温80不仅可以提高盐酸小檗碱在甲醇、乙醇、醋酸乙酯等溶剂中的溶解度，使制得的溶液浓度较高且澄清，还可以提高盐黄柏中的盐酸小檗碱在溶剂中的稳定性，同时结合聚乙二醇-甲苯-石油醚-乙酸乙酯展开剂进行分离，斑点清晰度高且Rf值在较优区间内。
优选的，步骤(3)中，供试品溶液和对照样品溶液的点样量为1～5μL。
所述的硅胶G薄层板为1％～3％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板。
展开剂选用体积比为1：7～16：4～12：1～4的聚乙二醇-甲苯-石油醚-乙酸乙酯。当吐温80在1％～2％的浓度范围下，结合体积比为1：7～16：4～12：1～4的聚乙二醇-甲苯-石油醚-乙酸乙酯展开剂进行分离，斑点清晰度高且Rf值在较优区间内。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明采用薄层层析法以盐酸小檗碱作为易黄汤中盐黄柏有效成分来进行定性分析，采用吐温80不仅可以提高盐酸小檗碱在甲醇、乙醇、醋酸乙酯等溶剂中的溶解度，使制得的溶液浓度较高且澄清，还可以提高盐黄柏中的盐酸小檗碱在溶剂中的稳定性，同时结合体积比为1：7～16：4～12：1～4的聚乙二醇-甲苯-石油醚-乙酸乙酯展开剂进行分离，斑点清晰度高且Rf值在较优区间内。
(2)本发明方法适用性好、易于实施，在对易黄汤中盐黄柏有效成分进行鉴别时，鉴定结果准确，避免假阳性或假阴性结果。
(3)本发明提供的易黄汤中盐黄柏有效成分鉴别方法，主斑点清晰，阴性无干扰，且操作简单。
附图说明
图1为实施例1的薄层色谱鉴别效果图。
图2为对比例2的薄层色谱鉴别效果图。
具体实施方式
下面结合附图与实施例，进一步阐明本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。
本发明实施例中，易黄汤样品来源于海南葫芦娃药业集团股份有限公司。
实施例1
(1)供试品溶液：取易黄汤0.2g，加40mL乙醇加热回流15min，再加吐温80增溶(加入吐温80后溶液体系中吐温80的浓度为1％)，滤过得到滤液，浓缩至2mL后作为供试品溶液；
(2)盐酸小檗碱对照品溶液：取盐酸小檗碱对照品，加甲醇溶解再加吐温80增溶(加入吐温80后溶液体系中吐温80的浓度为1％)后制成盐酸小檗碱对照品溶液，其中，盐酸小檗碱浓度为1mg/mL；
(3)缺盐黄柏样品溶液：取缺盐黄柏阴性样品0.2g，加入40mL乙醇加热回流15min，再加吐温80增溶(加入吐温80后溶液体系中吐温80的浓度为1％)，滤过得到滤液，浓缩至2mL后作为缺盐黄柏样品溶液；
(4)盐黄柏样品溶液：取盐黄柏对照药材0.1g，加水40mL，煎煮30分钟，滤过得到滤液，进一步蒸干得到残渣；残渣加20mL乙醇加热回流15min，再加吐温80增溶(加入吐温80后溶液体系中吐温80的浓度为1％)滤过得到滤液，浓缩至2mL后作为盐黄柏样品溶液；
(5)分别取2μL上述步骤制得的供试品溶液、盐酸小檗碱对照品溶液、缺盐黄柏样品溶液和盐黄柏样品溶液，分别点样于同一1％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以体积比为1：14：8：2的聚乙二醇-甲苯-石油醚-乙酸乙酯展开剂展开后，晾干，置于紫外光灯(365nm)下检视，薄层色谱检测结果如图1所示，图1中的色谱条带从左至右分别为盐酸小檗碱对照品溶液、盐黄柏样品溶液、供试品溶液(分别重复测试三次)和缺盐黄柏样品溶液，由图中结果可知，本发明方法荧光点清晰度高、无明显拖尾，阴性无干扰，能够实现易黄汤中盐黄柏有效成分的准确鉴别，且与对比例薄层色谱检测结果相比较，实施例中的Rf值约为0.48，在0.3～0.7的较优区间内，这也是增溶剂吐温80结合体积比为1：7～16：4～12：1～4的聚乙二醇-甲苯-石油醚-乙酸乙酯展开剂的优异效果之一。
实施例2
(1)供试品溶液：取易黄汤0.6g，加120mL醋酸乙酯加热回流20min，再加吐温80增溶(加入吐温80后溶液体系中吐温80的浓度为2％)，滤过得到滤液，浓缩至6mL后作为供试品溶液；
(2)盐酸小檗碱对照品溶液：取盐酸小檗碱对照品，加甲醇溶解再加吐温80增溶(加入吐温80后溶液体系中吐温80的浓度为2％)，其中，盐酸小檗碱浓度为3mg/mL；
(3)缺盐黄柏样品溶液：取缺盐黄柏阴性样品0.6g，加入120mL醋酸乙酯加热回流20min，再加吐温80增溶(加入吐温80后溶液体系中吐温80的浓度为2％)，滤过得到滤液，浓缩至6mL后作为缺盐黄柏样品溶液；
(4)盐黄柏样品溶液：取盐黄柏对照药材0.3g，加水120mL，煎煮30分钟，滤过得到滤液，进一步蒸干得到残渣；残渣加60mL醋酸乙酯加热回流20min，再加吐温80增溶(加入吐温80后溶液体系中吐温80的浓度为2％)，滤过得到滤液，浓缩至3mL后作为盐黄柏样品溶液；
(5)分别取5μL上述步骤制得的供试品溶液、盐酸小檗碱对照品溶液、缺盐黄柏样品溶液和盐黄柏样品溶液，分别点样于同一2％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以体积比为1：8：6：2的聚乙二醇-甲苯-石油醚-乙酸乙酯展开剂展开后，晾干，置于紫外光灯(365nm)下检视。
实施例3
(1)供试品溶液：取易黄汤0.4g，加甲醇80mL加热回流10min，再加吐温80增溶(加入吐温80后溶液体系中吐温80的浓度为1％)，滤过得到滤液，浓缩至4mL后作为供试品溶液；
(2)盐酸小檗碱对照品溶液：取盐酸小檗碱对照品，加甲醇溶解再加吐温80增溶(加入吐温80后溶液体系中吐温80的浓度为1％)后制成盐酸小檗碱对照品溶液，其中，盐酸小檗碱浓度为2mg/mL；
(3)缺盐黄柏样品溶液：取缺盐黄柏阴性样品0.4g，加甲醇80mL加热回流10min，再加吐温80增溶(加入吐温80后溶液体系中吐温80的浓度为1％)，滤过得到滤液，浓缩至4mL后作为缺盐黄柏样品溶液；
(4)盐黄柏样品溶液：取盐黄柏对照药材0.2g，加水80mL，煎煮30分钟，滤过得到滤液，进一步蒸干得到残渣；残渣加甲醇40mL加热回流10min，再加吐温80增溶(加入吐温80后溶液体系中吐温80的浓度为1％)滤过得到滤液，滤过得到滤液，浓缩至2mL后作为盐黄柏样品溶液；
(5)分别取1μL上述步骤制得的供试品溶液、盐酸小檗碱对照品溶液、缺盐黄柏样品溶液和盐黄柏样品溶液，分别点样于同一3％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以体积比为1：16：8：4的聚乙二醇-甲苯-石油醚-乙酸乙酯展开剂展开后，晾干，置于紫外光灯(365nm)下检视。
对比例1
对比例1的检测方法与实施例1相同，区别仅在于供试品溶液和对照样品溶液制备时，不添加1％～2％吐温80增溶，其他步骤与实施例1相同。
对比例2
对比例2的检测方法与实施例1相同，区别仅在于展开剂选用体积比为1：6：2：0.3的聚乙二醇-甲苯-石油醚-乙酸乙酯。薄层色谱检测结果如图2所示，图2中的色谱条带从左至右分别为盐酸小檗碱对照品溶液、盐黄柏样品溶液(分别重复测试两次)、供试品溶液(分别重复测试两次)和缺盐黄柏样品溶液，由图中结果可知，选用体积比为1：6：2：0.3的聚乙二醇-甲苯-石油醚-乙酸乙酯使得荧光点颜色很浅，且Rf值较高，约为0.75，拖尾现象明显。
对比例3
对比例3的检测方法与实施例1相同，区别仅在于展开剂选用体积比为1：20：23：10的聚乙二醇-甲苯-石油醚-乙酸乙酯。
样品分析
实施例1-3及对比例1-3的检视结果如表1所示：
表1实施例1-3及对比例1-3的检视结果
从表1数据可知，实施例中的供试品溶液、阳性样品溶液(盐黄柏样品溶液或盐酸小檗碱对照品溶液)在相应位置上，均显示清晰的斑点，阴性样品溶液不显示斑点，且无明显拖尾，Rf值在较优的区间内；对比例1-3中斑点颜色很浅，拖尾现象明显，且斑点的Rf值较高，本发明方法定性结果准确。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述的仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种易黄汤中盐黄柏有效成分的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）取易黄汤样品，加入有机溶剂加热回流，再加入增溶剂，滤过、浓缩得到供试品溶液；
（2）制备对照样品溶液；所述的对照样品溶液为阴性样品溶液和阳性样品溶液，阴性样品溶液为缺盐黄柏样品溶液，阳性样品溶液为盐黄柏样品溶液和盐酸小檗碱对照品溶液；
（3）将供试品溶液和对照样品溶液点样于氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板，在展开剂中展开，晾干后置于紫外灯下检视；
所述的增溶剂为吐温80，加入增溶剂后溶液体系中的吐温80浓度为1%~2%；
步骤（3）中，所述的硅胶G薄层板为1%~3%氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板；展开剂选用体积比为1：7~16：4~12：1~4的聚乙二醇-甲苯-石油醚-乙酸乙酯；
所述的有机溶剂为甲醇、乙醇、醋酸乙酯中的至少一种，加热回流时间为10~20min。
2.根据权利要求1所述的易黄汤中盐黄柏有效成分的鉴别方法，其特征在于，步骤（1）中，易黄汤样品的用量为0.2~0.6g，有机溶剂的加入量为40~120mL，浓缩后得到2~6mL浓缩液作为供试品溶液。
3.根据权利要求1所述的易黄汤中盐黄柏有效成分的鉴别方法，其特征在于，所述的缺盐黄柏样品溶液的制备方法为：取0.2~0.6g缺盐黄柏阴性样品，加入40~120mL有机溶剂加热回流，再加入增溶剂，滤过得到滤液，浓缩后得到2~6mL浓缩液作为缺盐黄柏样品溶液。
4.根据权利要求1所述的易黄汤中盐黄柏有效成分的鉴别方法，其特征在于，所述的盐黄柏样品溶液的制备方法为：取0.1~0.3mg盐黄柏对照药材，加40~120mL水煎煮，滤过得到滤液，进一步蒸干得到残渣；残渣加入20~60mL有机溶剂加热回流，再加入增溶剂，滤过得到滤液，浓缩后得到1~3mL浓缩液作为盐黄柏样品溶液。
5.根据权利要求1所述的易黄汤中盐黄柏有效成分的鉴别方法，其特征在于，所述的盐酸小檗碱对照品溶液的制备方法为：取盐酸小檗碱对照品，加甲醇溶解后再加入增溶剂得到盐酸小檗碱对照品溶液；所述的盐酸小檗碱对照品溶液的浓度为1~3mg/mL。
6.根据权利要求1所述的易黄汤中盐黄柏有效成分的鉴别方法，其特征在于，步骤（3）中，供试品溶液和对照样品溶液的点样量为1~5μL。
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