CN102049012B - 一种治疗儿童性早熟的中药组合物及其制备和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属中药领域，公开了一种治疗肝郁痰阻型儿童性早熟的中药组合物及其制备方法和质量检测方法。本发明依据中医理论，采用黄芩、牡丹皮、栀子、柴胡、茯苓、瓜蒌皮、当归、广郁金、陈皮、浙贝母、生牡蛎、黄柏、香附、三棱、白术、白芍等十几味中药材制成治疗儿童性早熟的中药组合物口服溶液。具有舒肝理气、清热活血、软坚化痰之功，适用于肝郁痰阻型儿童性早熟。可有效抑制性腺过早、过快发育和骨骺快速闭合，延缓骨龄的增长速度，维持儿童的正常生长速度，改善患儿的最终身高。患儿使用后无明显毒副作用发生且价格便宜，患儿和家长普遍反响良好，具有很好的社会效应和经济效应，市场开发前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗肝郁痰阻型儿童性早熟的中药组合物及其制备方法和质量检测方法，属中药领域。
背景技术
儿童性早熟(Child Precocious Puberty.CPP)是小儿常见的一种内分泌疾病，是一种生长发育异常现象，表现为青春期特征提前出现，即女孩子在8岁以前、男孩子在10岁以前出现第二性征、或女孩子月经初潮发生在l0岁以前的一种内分泌疾病。流行病学调查发现，上海地区目前儿童性早熟患病率大约为1000/10万，男女比例约为1：5。而且由于种种原因，近年来发病率有逐年增高的趋势。该症主要由于下丘脑的神经内分泌功能失调致下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamic-pituitary-gonadal axis，HPGA)提前发动、功能亢进，导致第二性征提前出现、骨龄提前、骨骺提早闭合，从而影响患儿的预期最终身高。同时CPP造成患儿青春期提前，而其智力和心理尚未成熟，易引发社会问题；因此CPP日益受到家庭和社会的关注，积极探寻有效的治疗方法，进行早期干预具有非常重要的意义。
当前，国际上推荐治疗女童性早熟所采用的促性腺激素释放激素拟似剂（gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRHa）疗效肯定，但其一般应连续治疗数月至数年，直至接近青春发育的年龄时为止，药价昂贵，不能为中国大多数患儿家庭所接受；也有采用孕酮类激素治疗，使性激素水平降低，性证消退，但对延缓骨骼成熟，控制骨骼生长加速无效，故不能防止身材矮小，临床已很少单独使用。对于治疗临床符合早期性性早熟女童时，中医药治疗疗效明确，且具有独特的价格优势，容易为大多数中国家庭所接受。
中医对儿童性早熟发病机制的认识主要与阴虚火旺、肝郁化火及痰湿凝聚等有关。针对上述病机特点，目前中医界对CPP治疗方法以滋阴降火及疏肝泻火法为主，或结合采用化痰散结法。
本发明的中药组合物全方由黄芩、牡丹皮、栀子、柴胡、茯苓、瓜蒌皮、当归、广郁金、陈皮、浙贝母、生牡蛎、黄柏、香附、三棱、白术、白芍等十几味中药材组成。共奏舒肝理气清热活血，软坚化痰之功，适用于肝郁痰阻型儿童性早熟。
二乳与少腹内肝经所循，肝郁气滞，津失敷布，聚津成痰，致二乳腺增大成块（中医称之为痰核）及卵巢增大。痰为津聚，气行则津行，津行则痰消。方用柴胡味苦微寒，入肝胆经，具舒肝理气之功，香附味苦甘平，入肝经，疏肝理气而止痛，能缓解乳房痰核的触痛和胀痛；陈皮性微温，理气化痰，健脾消食见长，久服诸药而不致败胃，三者共起疏肝理气、宣畅气机、津布复序、消除痰核之功，用为君药。
痰核已成，故用软坚化痰之品以治标，方中浙贝母味甘凉，可化痰散结，常与牡蛎配伍应用，牡蛎咸温凉，入肝肾之经，既能平肝潜阳，又能软坚化痰；瓜蒌清热化痰，宽胸理气，三药合用软坚化痰，可消提前发育所致的乳房痰核及肿大的卵巢，为方中臣药。
肝气久郁而化火，热灼津液而成痰，邪热可导致第二性症的提前出现及症候的加重，故方用丹皮、山栀苦寒泄热，专泻三焦、肝木郁火；黄芩、黄柏助丹栀清热之力，直抒邪热灼津成痰之病机，又有利症候及痰核的消除；津聚痰阻络脉，影响营血运行，甚者瘀阻血脉，故方用当归、芍药、郁金、三棱和营活血、化瘀之品，有助气血流畅，有利痰核软化及消除吸收；白术、茯苓健脾助运，一则有益与诸药吸收，二则运化精微，有利津液正常代谢，而起间接的化痰之功。以上诸药均起佐药的功能。
柴胡既有舒肝理气之效，又有引诸药入肝经之能，使本方发挥最大药效，为使药。
诸药合用，可致舒肝理气、清热活血、软坚化痰，使肝郁痰阻型早熟得以控制及恢复。
发明内容
本发明需要解决的技术问题在于提供一种治疗儿童性早熟的中药组合物及其制备方法和质量检测方法，本发明另一目的在于提供该中药组合物质量检测方法及其用途。
本发明需要解决的技术问题是通过如下技术方案实现的：
本发明中药组合物的原料组成如下：
牡丹皮80-140重量份、 栀子80-140重量份 、 柴胡80-140重量份 、
茯苓 120-210重量份、 瓜蒌皮80-140重量份 、 当归 80-140重量份 、
广郁金 120-210重量份 、陈皮 80-140重量份 、浙贝母80-140重量份 、
生牡蛎 300-700重量份、 黄柏80-140重量份、 香附80-140重量份、
黄芩 80-140重量份、 三棱80-140重量份、 白术80-140重量份、
白芍80-140重量份、 苯甲酸钠 3重量份 、 甜菊总苷 0.5重量份、
柠檬香精 2体积份。
上述原料的优选重量配比如下：
牡丹皮100重量份、 栀子100重量份、 柴胡 100重量份、
茯苓210重量份、 瓜蒌皮100重量份、 当归 100重量份 、
广郁金210重量份 、 陈皮 100重量份、 浙贝母100重量份、
生牡蛎700重量份、 黄柏100重量份、 香附100重量份、
黄芩 100重量份、 三棱100重量份、 白术100重量份、
白芍100重量份 、 苯甲酸钠 3重量份、 甜菊总苷 0.5重量份、
柠檬香精 2体积份。
上述原料的优选重量配比如下：
牡丹皮140重量份、 栀子140重量份、 柴胡140重量份、
茯苓 150重量份、 瓜蒌皮140重量份、 当归 140重量份、
广郁金 150重量份、 陈皮 140重量份、 浙贝母140重量份、
生牡蛎 500重量份、 黄柏140重量份、 香附140重量份、
黄芩 140重量份、 三棱140重量份 、 白术140重量份、
白芍140重量份、 苯甲酸钠 3重量份、 甜菊总苷 0.5重量份、
柠檬香精 2体积份。
上述原料的优选重量配比如下：
牡丹皮120重量份、 栀子120重量份、 柴胡120重量份 、
茯苓 180重量份、 瓜蒌皮120重量份、 当归 120重量份 、
广郁金 180重量份、 陈皮 120重量份、 浙贝母120重量份 、
生牡蛎 600重量份、 黄柏120重量份、 香附120重量份、
黄芩 120重量份 、 三棱120重量份、 白术120重量份、
白芍120重量份 、 苯甲酸钠 3重量份、 甜菊总苷 0.5重量份、
柠檬香精 2体积份。
本发明中药组合物原料，按照常规工艺，制成临床可接受的口服溶液。
本发明中药组合物的具体制备工艺如下：
取中药组合物原料当归、广郁金、陈皮、香附、柴胡置于提取器内，提尽挥发油，药液滤过，滤液及挥发油备用。取牡丹皮、栀子、茯苓、瓜蒌皮、浙贝母、生牡蛎、黄柏、黄芩、三棱、白术、白芍加水浸泡充分湿润后与以上药渣合并，加水过药面2～4cm，煎煮2-4次，每次保持微沸1-2小时，时加搅拌，以煮透为度，过筛滤过，合并滤液，放置12小时以上，取上清液浓缩4小时左右至适量，滤液与上述所备用的滤液及挥发油合并。再浓缩至相对密度不低于1.10的口服溶液。趁热加入苯甲酸钠、甜菊总苷至上述药液中，待冷加入柠檬香精，搅匀，使成全量。
本发明中药组合物的优选制备工艺如下：
取中药组合物原料当归、广郁金、陈皮、香附、柴胡置于提取器内，提尽挥发油，药液滤过，滤液及挥发油备用。取牡丹皮、栀子、茯苓、瓜蒌皮、浙贝母、生牡蛎、黄柏、黄芩、三棱、白术、白芍加水浸泡充分湿润后与以上药渣合并，加水过药面2～4cm，煎煮2次，每次保持微沸1.5小时，时加搅拌，以煮透为度，过筛滤过，合并滤液，放置12小时以上，取上清液浓缩4小时左右至适量，滤液与上述所备用的滤液及挥发油合并。再浓缩至相对密度不低于1.10的口服溶液。趁热加入苯甲酸钠、甜菊总苷至上述药液中，待冷加入柠檬香精，搅匀，使成全量。
本发明的质量检测方法包括如下鉴别方法和/或含量测定方法：
鉴别方法包括如下鉴别中的一种和/或几种：
A：取中药组合物口服溶液10ml，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，取上清夜作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 ml含20μg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨水为展开剂，苯:醋酸乙酯:异丙醇:甲醇:浓氨水=6：3：1.5：1.5：0.5，置氨蒸汽饱和的展开缸内，展开取出凉干。置紫外灯下检视，波长λ=365nm。供试品色谱中；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
B：取中药组合物口服溶液20ml，置分液漏斗中，用醋酸乙酯-无水乙醇振摇提取2次，醋酸乙酯:无水乙醇=4：1，每次25ml，合并醋酸乙酯液，用水洗涤2次，每次20 ml，醋酸乙酯液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取橙皮苷对照品适量加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上以氯仿-丙酮-甲醇为展开剂，氯仿:丙酮:甲醇=10：2：2，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液后置紫外灯下检视，波长λ=365nm。供试品色谱中；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
C: 精密量取中药组合物口服溶液2mL，置25mL量瓶中，加甲醇适量，水浴中充分振摇，放冷至室温，加甲醇定容，摇匀，过滤，取续滤液为供试品溶液；取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。对照品溶液、供试品溶液均点样1μl在聚酰氨薄膜上，36%乙酸展开，在展开槽中加入展开剂，预平衡30min，上行展开，置紫外灯下检视，波长λ=275nm显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
质量检测方法中的含量测定方法如下：
照薄层色谱法：供试品溶液的制备：精密量取中药组合物口服溶液2ml，置回流瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，置水浴上回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，作为对照品溶液。测定法：精密吸取供试品溶液1μl，对照品溶液1μl与3μl，分别交叉点于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，照薄层色谱法进行扫描，波长：λs=323nm，λR=500nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度分值，计算，即得。
本发明的口服溶液含有有效治疗剂量的有效成分。具有舒肝理气、清热活血、软坚化痰的作用，能有效治疗肝郁痰阻型儿童早期性性早熟。
具体实施方式
下述实验和实例用于进一步说明但不限于本发明。
实验例1：提取工艺的研究实验
1.挥发油提取正交实验设计
1.1称取当归120g、郁金180g、陈皮120g、香附120g、柴胡120g等药材，将当归、郁金、陈皮、香附、柴胡等药材粉碎为粗粉，再充分混匀后提取挥发油，，选用L9(3 4)正交实验对其进行优化研究，选取提取时间(A)、浸泡时间(B)、加水量(C)为考察因素。考察指标为挥发油提出量，并对结果进行直观分析和方差分析。
表1 挥发油提取正交试验因素水平表
表2 挥发油提取工艺L9(34)正交表
表 3 挥发油提取量方差分析表
| 方差来源 | ss | 自由度μ | MS | F | P |
| A | 0.2353 | 2 | 0.1177 | 392.33 | <0.01 ** |
| B | 0.0014 | 2 | 0.0007 | 2.8 | >0.05 |
| C | 0.0013 | 2 | 0.00065 | 2.6 | >0.05 |
| D | 0.0005 | 2 | 0.00025 |
注：F1-0.05(2.2)=19.0 F1-0.01 (2.2)=99.0 **表示有极显著差异
1.2 挥发油结果分析
由表3方差分析可知，因素A 即提取时间对挥发油的提取量有极显著影响(P < 0.01 )，差异有统计学意义；因素B，C无显著影响(P > 0.05 )， 差异无统计学意义。由表2极差可知，三个因素挥发油的提取量的影响顺序为A>B>C，各因素不同水平对挥发油的提取量的影响顺序为， A3>A2>Al，B1>B3>B2， C3>C1>C2，综合以上分析，考虑生产实际，确定最佳工艺条件为A3B1C3 。即提取时间为4小时，浸泡时间为0.5小时，加水量为6倍。
1.3 工艺条件验证
为适应生产实际，取10倍处方量的药材共3份，按所优选的工艺条件进行验证实验，结果见表4。
表4 验证实验结果
结果表明，所确定的工艺条件重现性好、可操作性强，可进行扩大生产。说明上述所优选的工艺条件是合理可行的。
2.水提取正交实验设计
2.1 以黄芩苷含量为考察指标。采用正交试验加水量(A)、浸泡时间(B)、提取次数(C)、提取时间(D)4个因素进行考查(设计3个水平)，在平行操作条件下，按L9(34)正交表进行试验，优选水提取最佳工艺条件。具体方法如下。
表5 水提取正交试验因素水平表
2.2 正交实验方法 按处方比例称取各药材，牡丹皮120g、栀子120g、茯苓 180g 、 瓜蒌皮120g 、浙贝母120g 、生牡蛎 600g、黄柏120g 、黄芩 120g 、三棱120g 、白术120g 、白芍120g，采用当归、郁金、陈皮、香附、柴胡药材先行提取挥发油，收集挥发油备用，然后其药渣与剩余药材采用水煎法进行提取。对照提取工艺路线设计，按正交试验方案设计进行加水提取，合并煎液，滤过，备用。考察指标为黄芩苷含量，并对结果进行直观分析和方差分析。
2.3 正交试验结果及方差分析（见表6、表7）
表6 水提取工艺L9(34)正交表
表7 水提取方差分析表
| 方差来源 | ss | 自由度μ | MS | F | P |
| A | 1.0118 | 2 | 0.5059 | 13.2782 | >0.05 |
| C | 3.5203 | 2 | 1.7602 | 46.1995 | <0.05* |
| D | 2.4329 | 2 | 1.2165 | 46.1995 | <0.05* |
| B(误差) | 0.0761 | 2 | 0.00381 |
*F1-0.05(2.2)=19.00 F1-0.10(2.2)=9.00 *表示有显著差异
2.4 结果分析
由方差分析表可知，因素C，D 即提取次数和提取时间对黄芩苷的提出量有显著影响(P < 0.05 )，因素A,B无显著影响(P > 0.05 )，由极差可知，四个因素对黄芩苷的提出量的影响顺序为C>D>A>B，各因素不同水平对黄芩苷的提出量的影响顺序为C2>C3>Cl，D3>D2>D1，A2>A3>Al， B1>B3>B2。综合以上分析，考虑生产实际，确定最佳工艺条件为C2D3A2B1。即提取次数为2次，提取时间为每次1.5小时，加水量为6倍，浸泡时间为30分钟。
2.5 工艺条件验证
为适应医院制剂生产实际，取10倍处方量的药材共3份。按所优选的工艺条件进行验证实验。
表8 验证实验结果
结果表明，所确定的工艺条件重现性好、可操作性强，可进行扩大生产。说明上述所优选的工艺条件是合理可行的。
实验例2：中药组合物中黄芩苷的含量测定实验研究
1. 溶液配制
对照品溶液：取黄芩苷对照品，加甲醇制成0.3mg／ml的溶液，作为对照品溶液。
供试品溶液：精密量取中药组合物2ml，置25ml量瓶中，加甲醇适量，水浴中充分振摇，冷至室温，加甲醇定容，摇匀，过滤，取续滤液为供试品溶液。
2. 色谱条件
分别取对照品溶液、供试品溶液各1 μl ，点于同一聚酰胺薄膜上，以乙酸为展开剂。展开后取出晾干。用薄层扫描法测定，波长：λs=323nm，λR=500nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度分值，计算即得。空白样品不干扰测定。
3. 线性试验
分别取浓度为0.15mg／ml的黄芩苷对照品溶液1、2、3、4、5 μl点于同一聚酰胺薄膜上，展开后取出晾干，扫描。以峰面积A为纵坐标，点样量Q为横坐标，进行线性回归，得回归方程为：A= 1627.90Q+ 40.17，r=0.9987。表明黄芩苷在0.15~0.75 μg时线性关系良好。
4. 回收率试验
取缺黄芩的模拟样品2ml，共5份，各置25ml量瓶中，精密加入黄芩苷对照品适量，按“1.”项下方法制成回收率试验用溶液，依法测定。结果得方法平均回收率为99.2％，RSD为1.5％。
5. 精密度试验
取黄芩苷对照品溶液，在同一聚酰胺薄膜上，点样5个，计算得黄芩苷峰面积的RSD为2.1％。对同一批号样品，共5份，分别制备成供试品溶液，依法测定，结果得黄芩苷的平均含量为5.35mg／ml， RSD为2.0％。
6. 样品测定
分别取对照品溶液和供试品溶液点样，测得4批样品中黄芩苷含量分别为5.53、5.11、5.45、5.38mg／ml。
7. 讨论
经对多批样品中黄芩苷含量的测定结果，建议本品中含黄芩苷不小于1．5mg／ml较好。
下述实施例均能实现上述实验例的效果。
实施例1： 中药组合物的制备
牡丹皮100重量份 栀子100重量份 柴胡 100重量份
茯苓210重量份 瓜蒌皮100重量份 当归 100重量份
广郁金210重量份 陈皮 100重量份 浙贝母100重量份
生牡蛎700重量份 黄柏100重量份 香附100重量份
黄芩 100重量份 三棱100重量份 白术100重量份
白芍100重量份 苯甲酸钠 3重量份 甜菊总苷 0.5重量份
柠檬香精 2体积份。
取中药组合物原料当归、广郁金、陈皮、香附、柴胡置于提取器内，提尽挥发油，药液滤过，滤液及挥发油备用。取牡丹皮、栀子、茯苓、瓜蒌皮、浙贝母、生牡蛎、黄柏、黄芩、三棱、白术、白芍加水浸泡充分湿润后与以上药渣合并，加水过药面2～4cm，煎煮2-4次，每次保持微沸1-2小时，时加搅拌，以煮透为度，过筛滤过，合并滤液，放置12小时以上，取上清液浓缩4小时左右至适量，滤液与上述所备用的滤液及挥发油合并。再浓缩至相对密度不低于1.10的口服溶液。趁热加入苯甲酸钠、甜菊总苷至上述药液中，待冷加入柠檬香精，搅匀，使成全量。
实施例2： 中药组合物的制备
牡丹皮140重量份 栀子140重量份 柴胡140重量份
茯苓 150重量份 瓜蒌皮140重量份 当归 140重量份
广郁金 150重量份 陈皮 140重量份 浙贝母140重量份
生牡蛎 500重量份 黄柏140重量份 香附140重量份
黄芩 140重量份 三棱140重量份 白术140重量份
白芍140重量份 苯甲酸钠 3重量份 甜菊总苷 0.5重量份
柠檬香精 2体积份
取中药组合物原料当归、广郁金、陈皮、香附、柴胡置于提取器内，提尽挥发油，药液滤过，滤液及挥发油备用。取牡丹皮、栀子、茯苓、瓜蒌皮、浙贝母、生牡蛎、黄柏、黄芩、三棱、白术、白芍加水浸泡充分湿润后与以上药渣合并，加水过药面2～4cm，煎煮2-4次，每次保持微沸1-2小时，时加搅拌，以煮透为度，过筛滤过，合并滤液，放置12小时以上，取上清液浓缩4小时左右至适量，滤液与上述所备用的滤液及挥发油合并。再浓缩至相对密度不低于1.10的口服溶液。趁热加入苯甲酸钠、甜菊总苷至上述药液中，待冷加入柠檬香精，搅匀，使成全量。
实施例3： 中药组合物的制备
牡丹皮120重量份 栀子120重量份 柴胡120重量份
茯苓 180重量份 瓜蒌皮120重量份 当归 120重量份
广郁金 180重量份 陈皮 120重量份 浙贝母120重量份
生牡蛎 600重量份 黄柏120重量份 香附120重量份
黄芩 120重量份 三棱120重量份 白术120重量份
白芍120重量份 苯甲酸钠 3重量份 甜菊总苷 0.5重量份
柠檬香精 2体积份。
取中药组合物原料当归、广郁金、陈皮、香附、柴胡置于提取器内，提尽挥发油，药液滤过，滤液及挥发油备用。取牡丹皮、栀子、茯苓、瓜蒌皮、浙贝母、生牡蛎、黄柏、黄芩、三棱、白术、白芍加水浸泡充分湿润后与以上药渣合并，加水过药面2～4cm，煎煮2-4次，每次保持微沸1-2小时，时加搅拌，以煮透为度，过筛滤过，合并滤液，放置12小时以上，取上清液浓缩4小时左右至适量，滤液与上述所备用的滤液及挥发油合并。再浓缩至相对密度不低于1.10的口服溶液。趁热加入苯甲酸钠、甜菊总苷至上述药液中，待冷加入柠檬香精，搅匀，使成全量。
实施例4： 质量检测中的鉴别方法
A：取实施例1中药组合物口服溶液10ml，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，取上清夜作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 ml含20μg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨水为展开剂，苯:醋酸乙酯:异丙醇:甲醇:浓氨水=6：3：1.5：1.5：0.5，置氨蒸汽饱和的展开缸内，展开取出凉干。置紫外灯下检视，波长λ=365nm。供试品色谱中；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
B：取实施例1中药组合物口服溶液20ml，置分液漏斗中，用醋酸乙酯-无水乙醇振摇提取2次，醋酸乙酯:无水乙醇=4：1，每次25ml，合并醋酸乙酯液，用水洗涤2次，每次20 ml，醋酸乙酯液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取橙皮苷对照品适量加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上以氯仿-丙酮-甲醇为展开剂，氯仿:丙酮:甲醇=10：2：2，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液后置紫外灯下检视，波长λ=365nm。供试品色谱中；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
C: 精密量取实施例1中药组合物口服溶液2mL，置25mL量瓶中，加甲醇适量，水浴中充分振摇，放冷至室温，加甲醇定容，摇匀，过滤，取续滤液为供试品溶液；取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。对照品溶液、供试品溶液均点样1μl在聚酰氨薄膜上，36%乙酸展开，在展开槽中加入展开剂，预平衡30min，上行展开，置紫外灯下检视，波长λ=275nm，显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
实施例5： 质量检测中的含量测定方法
照薄层色谱法：供试品溶液的制备：精密量取实例2中药组合物口服溶液2ml，置回流瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，置水浴上回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液,作为对照品溶液。测定法：精密吸取供试品溶液1μl，对照品溶液1μl与3μl，分别交叉点于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，照薄层色谱法进行扫描，波长：λs=323nm，λR=500nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度分值，计算，即得。
实施例6： 质量检测方法
A：取实施例3中药组合物口服溶液10ml，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，取上清夜作为供试品溶液。另取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 ml含20μg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨水为展开剂，苯:醋酸乙酯:异丙醇:甲醇:浓氨水=6：3：1.5：1.5：0.5，置氨蒸汽饱和的展开缸内，展开取出凉干。置紫外灯下检视，波长λ=365nm。供试品色谱中；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
B：取实施例3中药组合物口服溶液20ml，置分液漏斗中，用醋酸乙酯-无水乙醇振摇提取2次，醋酸乙酯:无水乙醇=4：1，每次25ml，合并醋酸乙酯液，用水洗涤2次，每次20 ml，醋酸乙酯液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取橙皮苷对照品适量加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上以氯仿-丙酮-甲醇为展开剂，氯仿;丙酮:甲醇=10：2：2，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液后置紫外灯下检视，波长λ=365nm。供试品色谱中；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
C: 精密量取实施例3中药组合物口服溶液2mL，置25mL量瓶中，加甲醇适量，水浴中充分振摇，放冷至室温，加甲醇定容，摇匀，过滤，取续滤液为供试品溶液；取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液。对照品溶液、供试品溶液均点样1μl在聚酰氨薄膜上，36%乙酸展开，在展开槽中加入展开剂，预平衡30min，上行展开，置紫外灯下检视，波长λ=275nm，显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
薄层色谱法测定：供试品溶液的制备：精密量取实例3中药组合物口服溶液2ml，置回流瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，置水浴上回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液。对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，作为对照品溶液。测定法：精密吸取供试品溶液1μl，对照品溶液1μl与3μl，分别交叉点于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，照薄层色谱法进行扫描，波长：λs=323nm，λR=500nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度分值，计算，即得。
实施例7：中药组合物口服溶液的急性毒性实验
实验目的:观察受试物一日给予动物后所产生的急性毒性反应和死亡情况。
实验动物:昆明种小鼠，体重19-21克，雌雄各半。于实验开始前禁食12小时。
剂量：以本品受试物原液，一次给予最大体积0.8mlg/20g一日2次，两次给药间隔6小时。
给药途径：口服灌胃。
方法：取健康小鼠20只，雌雄各半，给予一日二次口服灌胃上述量的受试液，给药后即刻观察动物反应情况并继续观察七天。
结果： 表9 实验动物阳性反应结果
毒性反应（症状）：
本品经口服后，即刻未见小鼠出现异常反应，连续观察七天，小鼠均存活。
结论：小鼠一日二次口服本品的最大给药量为80ml/kg（折合生药为201.6g/kg）。
实施例8：中药组合物治疗儿童性早熟的初步临床研究
一.对象与方法
1．对象为50例中医定型为肝郁痰阻型性早熟女童，年龄为7.7±0.84岁。
2．B超检查：在治疗前分别测量子宫、卵巢的体积。治疗前后各检查一次。
3．乳房发育：按Ｔanner分期法判断，每二月判断一次，共3次并作记录。
4．骨龄测定：治疗前摄左手腕骨掌骨正位片，按照Greulich-Pyle图谱法确定骨龄。
5．服药方法：50例女童全部服用本口服溶液，服法：25ml/次、2次/日，治疗均达6月以上。
二.结果
50例受试女童中39人服药后得到改善，无效11例中5人因症状改善中途停药而出现早熟病情反复，总体有效率为78%。治疗后测量子宫、卵巢的体积明显变小，基本恢复到实际年龄水平；乳房发育有33例恢复为ＴannerⅠ、Ⅱ期水平；骨龄复查测定表明31例恢复实际年龄水平。
通过对治疗肝郁痰阻型性早熟女童的临床观察，表明其疗效确切，具有舒肝理气、清热活血、软坚化痰的作用，可有效抑制性腺过早、过快发育和骨骺快速闭合，延缓骨龄的增长速度，维持儿童的正常生长速度，改善患儿的最终身高。患儿使用后无明显毒副作用发生且价格便宜，患儿和家长普遍反响良好，具有很好的社会效应和经济效应，市场开发前景广阔。
Claims (8)
1.一种治疗肝郁痰阻型儿童性早熟的中药组合物，其特征在于制成该中药组合物的原料组成为：
牡丹皮80-140重量份、 栀子80-140重量份、 柴胡80-140重量份、
茯苓 120-210重量份、 瓜蒌皮80-140重量份、 当归 80-140重量份 、
广郁金 120-210重量份、陈皮 80-140重量份、 浙贝母80-140重量份、
生牡蛎 300-700重量份、黄柏80-140重量份、 香附80-140重量份、
黄芩 80-140重量份、 三棱80-140重量份、 白术80-140重量份、
白芍80-140重量份、 苯甲酸钠 3重量份、 甜菊总苷 0.5重量份、
柠檬香精 2体积份。
2.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于制成该中药组合物的原料组成为：
牡丹皮100重量份、 栀子100重量份、 柴胡 100重量份、
茯苓210重量份、 瓜蒌皮100重量份、 当归 100重量份 、
广郁金210重量份、 陈皮 100重量份、 浙贝母100重量份、
生牡蛎700重量份、 黄柏100重量份、 香附100重量份、
黄芩 100重量份、 三棱100重量份、 白术100重量份、
白芍100重量份、 苯甲酸钠 3重量份 、 甜菊总苷 0.5重量份、
柠檬香精 2体积份。
3.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于制成该中药组合物的原料组成为：
牡丹皮140重量份、 栀子140重量份、 柴胡140重量份、
茯苓 150重量份、 瓜蒌皮140重量份 、 当归 140重量份 、
广郁金 150重量份、 陈皮 140重量份、 浙贝母140重量份 、
生牡蛎 500重量份、 黄柏140重量份 、 香附140重量份、
黄芩 140重量份、 三棱140重量份、 白术140重量份、
白芍140重量份、 苯甲酸钠 3重量份、 甜菊总苷 0.5重量份 、柠檬香精 2体积份。
4.如权利要求1所述的中药组合物，其特征在于制成该中药组合物的原料组成为：
牡丹皮120重量份、 栀子120重量份、 柴胡120重量份、
茯苓 180重量份、 瓜蒌皮120重量份、 当归 120重量份、
广郁金 180重量份、 陈皮 120重量份、 浙贝母120重量份 、
生牡蛎 600重量份 、 黄柏120重量份、 香附120重量份、
黄芩 120重量份、 三棱120重量份、 白术120重量份、
白芍120重量份、 苯甲酸钠 3重量份、 甜菊总苷 0.5重量份、
柠檬香精 2体积份。
5.如权利要求1或2或3或4所述的中药组合物的制备方法，其特征在于该方法为：
步骤1：取中药组合物原料当归、广郁金、陈皮、香附、柴胡置于提取器内，提尽挥发油，药液滤过，滤液及挥发油备用；
步骤2：取牡丹皮、栀子、茯苓、瓜蒌皮、浙贝母、生牡蛎、黄柏、黄芩、三棱、白术、白芍加水浸泡充分湿润后与以上药渣合并，加水过药面2～4cm，煎煮2-4次，每次保持微沸1-2小时，时加搅拌，以煮透为度，过筛滤过，合并滤液，放置12小时以上，取上清液浓缩4小时左右，滤液与步骤1所备用的滤液及挥发油合并；再浓缩至相对密度不低于1.10的口服溶液；
步骤3：趁热加入苯甲酸钠、甜菊总苷至上述药液中，待冷加入柠檬香精，搅匀，使成全量。
6.如权利要求5所述的中药组合物的制备方法，其特征在于该方法为：
步骤1：取中药组合物原料当归、广郁金、陈皮、香附、柴胡置于提取器内，提尽挥发油，药液滤过，滤液及挥发油备用；
步骤2：取牡丹皮、栀子、茯苓、瓜蒌皮、浙贝母、生牡蛎、黄柏、黄芩、三棱、白术、白芍加水浸泡充分湿润后与以上药渣合并，加水过药面2～4cm，煎煮2次，每次保持微沸1.5小时，时加搅拌，以煮透为度，过筛滤过，合并滤液，放置12小时以上，取上清液浓缩4小时左右，滤液与上述所备用的滤液及挥发油合并；再浓缩至相对密度不低于1.10的口服溶液；
步骤3：趁热加入苯甲酸钠、甜菊总苷至上述药液中，待冷加入柠檬香精，搅匀，使成全量。
7.如权利要求1或2或3或4所述的中药组合物的检测方法，其特征在于该方法包括如下鉴别：
A：取中药组合物口服溶液10ml，置水浴上蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，取上清液作为供试品溶液；另取盐酸小檗碱对照品，加甲醇制成每1 ml含20μg的溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-醋酸乙酯-异丙醇-甲醇-浓氨水为展开剂，苯:醋酸乙酯:异丙醇:甲醇:浓氨水=6：3：1.5：1.5：0.5，置氨蒸汽饱和的展开缸内，展开取出凉干；置波长λ= 365nm的紫外灯下检视；供试品色谱中；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
B：取中药组合物口服溶液20ml，置分液漏斗中，用醋酸乙酯-无水乙醇振摇提取2次，醋酸乙酯:无水乙醇=4：1，每次25ml，合并醋酸乙酯液，用水洗涤2次，每次20 ml，醋酸乙酯液置水浴上蒸干，残渣加甲醇2ml使溶解，作为供试品溶液；另取橙皮苷对照品适量加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液；吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一聚酰胺薄膜上以氯仿-丙酮-甲醇为展开剂，氯仿:丙酮:甲醇=10：2：2，展开，取出，晾干，喷以三氯化铝试液后置波长λ=365nm的紫外灯下检视；供试品色谱中；在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；
C: 精密量取中药组合物口服溶液2mL，置25mL量瓶中，加甲醇适量，水浴中充分振摇，放冷至室温，加甲醇定容，摇匀，过滤，取续滤液为供试品溶液；取黄芩苷对照品适量，加甲醇制成每1mL含1mg的溶液，作为对照品溶液；对照品溶液、供试品溶液均点样1μl在聚酰氨薄膜上，36%乙酸展开，在展开槽中加入展开剂，预平衡30min，上行展开，置波长λ=275nm的紫外灯下检视，显色，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。
8.如权利要求1或2或3或4所述的中药组合物的检测方法，其特征在于该方法包括如下含量测定：
照薄层色谱法
供试品溶液的制备：精密量取中药组合物口服溶液2ml，置回流瓶中，精密加入甲醇25ml，称定重量，置水浴上回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
对照品溶液的制备：精密称取黄芩苷对照品，加甲醇制成每1ml含0.15mg的溶液，作为对照品溶液；
测定法：精密吸取供试品溶液1μl，对照品溶液1μl与3μl，分别交叉点于同一聚酰胺薄膜上，以醋酸为展开剂，展开，取出，晾干，照薄层色谱法进行扫描，波长：λs=323nm，λR=500nm，测量供试品吸收度积分值与对照品吸收度分值，计算，即得。
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