CN114720600A

CN114720600A - 一种护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法

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Publication number: CN114720600A
Application number: CN202210361669.8A
Authority: CN
Inventors: 黄慧云; 潘翠萍; 方淑玲; 王春彬
Original assignee: Guangdong Annol Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Guangdong Annol Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-04-07
Filing date: 2022-04-07
Publication date: 2022-07-08

Abstract

本发明属于中药制剂检测技术领域，具体涉及一种护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法。发明提供的护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法是采用高效液相色谱方法进行检测，流动相为乙腈‑水(15:85)，检测波长为320nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL。本发明提供的护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法操作简单，且具有良好的线性关系，精密度、稳定性和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，满足国家药品标准要求。

Description

一种护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法

技术领域

本发明属于中药制剂检测技术领域，具体涉及一种护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法。

背景技术

近年来，中药安全问题，主要来自两方面：第一，掺杂掺假，即用廉价药材代替高价药材，或未按中药组方要求的比例配制；第二，药代动力学过程不明，即所用药材有效成分不明、组分不明、不良反应未明，是中药难以融入现代医学体系的重要原因。传统的中药品质研究有“四大鉴别法”，即：基原鉴别、性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别，随着分析技术的发展和对中药不断深入的研究，中药指纹图谱应运而生，它是目前能够为国内外广泛接受的一种中药质量评价模式，其中薄层扫描(TLCS)、高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)已成为公认的三种常规分析手段。

然而，中药指纹图谱研究主要是针对单味药材提取而言，在植物制剂的整体性作用和药效相关性方面缺乏理论依据和相应的理论指导，并不适用于中成药的质量评价。

中药何首乌特有成分为二苯乙烯苷类(CAS:82373-94-2)，何首乌中已发现的二苯乙烯苷包括2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(简称二苯乙烯苷)、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2,3-二-O-β-D-葡萄糖苷(即何首乌丙素)、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-(6”-O-α-D-吡喃葡萄糖)-β-D-吡喃葡萄糖苷、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-O-(6”-O-乙酰基)-β-D-葡萄糖苷等。中华人民共和国药典将二苯乙烯苷作为检测何首乌的定量指标，在《中国药典》2020年版一部制何首乌质量标准中规定二苯乙烯苷含量不得低于0.70％。

中药护骨胶囊由制何首乌、淫羊藿、熟地黄、龟甲、巴戟天、杜仲、续断、骨碎补、当归、山药等中药材制成，具有补肾益精之功。制何首乌为方中君药，成分占比较大，2,3,5,4ˊ-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷(以下简称二苯乙烯甘)为制何首乌中有效成分之一。原标准中无二苯乙烯苷含量的测定，为了进一步提高护骨胶囊的中药材质量，满足相关规范的要求。寻找一种快速、便捷、稳定、可靠的护骨胶囊中二苯乙烯苷成分含量测量方法是十分有必要的。

发明内容

为解决现有技术中的缺陷，本发明提供了一种护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法。该护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法是采用高效液相色谱方法进行检测，流动相为乙腈-水，检测波长为320nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL，具有专属性强、精密度高、稳定性好和重复性好的优点，满足国家药品标准要求。

本发明提供了一种护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法，包括以下步骤：

S1对照品溶液的制备：取2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品，加体积比为50％的甲醇制成每1mL含二苯乙烯苷0.2mg的溶液，得对照品溶液；

S2供试品溶液的制备：取护骨胶囊内容物0.4g至于圆底烧瓶中，精密加入体积比为50％的甲醇25mL，密塞，称定重量，水浴加热回流30～40min，放至室温，称定重量，用体积比为50％的甲醇补足减失重量，摇匀，静置，上清液滤过，取续滤液，得供试品溶液；

S3液相色谱仪检测：

精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得。

进一步地，所述步骤S2中护骨胶囊每粒含制何首乌以2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷计，不得少于0.50mg。

进一步地，所述步骤S3中液相色谱仪不受色谱仪型号限制，优选色谱仪为Waters2695/2487高效液相色谱仪。

进一步地，所述高效液相色谱仪中的色谱柱为C₁₈柱。

进一步地，所述色谱柱为长度为250mm，内径为4.6mm，填充剂粒径为5μm。

进一步地，所述步骤S3中色谱条件为：高效液相色谱的流动相相为乙腈-水，检测波长为320nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL。

进一步地，所述乙腈与水的体积比为15:85。

与现有技术相比，本发明提供的护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法操作简单，且具有良好的线性关系、精密度、稳定性和重复性，加样回收率高，检测结果准确、可靠，满足国家药品标准要求。。

附图说明：

图1为对照品溶液的色谱图；

图2为供试品溶液的色谱图；

图3为缺制何首乌的阴性对照溶液的色谱图；

图4为二苯乙烯苷对照品标准曲线图。

具体实施方式

以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D葡萄糖苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110844-201411)、乙腈(色谱纯)、甲醇(分析纯)。

一、摸索试验：

摸索护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法中提取溶剂、提取方法和提取时间，具体方法如下：

1、提取溶剂的确定：

首乌延寿片、降脂减肥颗粒、下消丸药品中的二苯乙烯苷多用稀乙醇、甲醇等作为提取溶剂，发明人比较了以稀乙醇、75％(mL/mL)乙醇、50％(mL/mL)甲醇作为提取溶剂对样品处理的结果如表1所示：

表1不同提取溶剂提取二苯乙烯苷的含量

溶剂	稀乙醇	75％乙醇	50％甲醇
				二苯乙烯苷含量(mg/g)	2.52	2.55	2.48

由表1可见，分别以稀乙醇、75％乙醇、50％甲醇作为提取溶剂时，供试品中二苯乙烯苷的含量相差不大，且75％乙醇作为提取溶剂时保留时间不稳定，样品峰面积也相差较大，不宜作为提取溶剂；样品中加入稀乙醇后样品变粘未能完全分散，也不宜作为溶剂，综合考虑选用50％甲醇作为提取溶剂最适宜。

其中：所述稀乙醇：取乙醇529ml，加水稀释至1000ml，即得。本液在20℃时含C₂H₅OH应为49.5％～50.5％(mL/mL)。

2、提取方法的确定：

发明人通过对超声提取法与回流提取法的比较，发现回流提取法的提取率高于超声提取法，结果如表2所示：

表2两种提取方法提取二苯乙烯苷的含量

提取方法	超声提取法	回流提取法
			二苯乙烯苷含量(mg/g)	2.33	2.16

因此，本发明采用回流提取法作为护骨胶囊中二苯乙烯苷的提取方法。

3、提取时间的确定：

发明人分别对提取时间20min、30min、40min、60min进行了考察，结果如表3所示：

表3不同提取时间提取二苯乙烯苷的含量

提取时间	20min	30min	40min	60min
					二苯乙烯苷含量(mg/g)	1.92	1.89	1.80	1.84

由表3可知，回流20min和30min二苯乙烯苷含量相差不大，回流40min和60min，含量反而下降，可能与二苯乙烯苷分解有关，因此确定回流提取时间为30min。

进一步地，发明人通过对乙腈：水(20:80)、甲醇：水(30:70)、乙腈：水(15:85)作为流动相的比较，发现当以乙腈：水(20:80)为流动相时，存在阴性干扰，而以甲醇：水(30:70)作为流动相时，二苯乙烯苷主峰的保留时间不稳定，只有以乙腈：水(15:85)为流动相时，主成分和其他杂质分离度好，阴性无干扰。故选用乙腈：水(15:85)作为护骨胶囊中二苯乙烯苷含量测定的流动相。

试验结果表明本发明提供的护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法快速，简便，准确，可用于护骨胶囊二苯乙烯苷含量的质量控制。

实施例1、一种护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法

S1对照品溶液的制备：取2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品，加体积比为50％(mL/mL)的甲醇制成每1mL含二苯乙烯苷0.2mg的溶液，得对照品溶液；

S2供试品溶液的制备：取护骨胶囊内容物0.4g置于圆底烧瓶中，所述护骨胶囊每粒含制何首乌以2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷计，不得少于0.50mg，精密加入体积比为50％(mL/mL)的甲醇25mL，密塞，称定重量，水浴加热回流30min，放至室温，称定重量，用体积比为50％(mL/mL)的甲醇补足减失重量，摇匀，静置，上清液滤过，取续滤液，得供试品溶液；

S3液相色谱仪检测：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，即得；

所述色谱条件为：

Waters 2695/2487高效液相色谱仪，色谱柱为C₁₈柱，所述色谱柱为长度为250mm，内径为4.6mm，填充剂粒径为5μm；流动相为乙腈-水，所述乙腈与水的体积比为15:85，检测波长为320nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL。

实施例2、护骨胶囊样品的制备

护骨胶囊配方：

制何首乌348g、淫羊蕾278g、熟地黄348g、龟甲208g、巴戟天278g、杜仲278g、续断278g、骨碎补278g、当归208g和山药278g。

制备工艺：

取山药93g粉碎成细粉，余下的山药与其余九味中药置多功能提取罐中加水煎煮二次，每次1小时，同时收集挥发油；合并煎液，滤过，滤液浓缩至相对密度1.07-1.13(70℃)的清膏，喷雾干燥得干膏粉；挥发油用少量乙醇稀释，喷入山药细粉，低温(65℃以下)干燥，与干膏粉混匀，装胶囊，制成1000粒，即得。

试验例一、专属性试验测定

1、试验对象：

1.1、按照实施例1的方法制备对照品溶液和供试品溶液；

1.2、阴性对照溶液的制备：按供试品处方量制备不含制何首乌的阴性制剂，依供试品溶液的制备方法制得阴性对照液。

2、试验方法：

分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10μL，分别按照实施例1的色谱条件进行测定。

3、试验结果：

试验结果如图1～图3所示，其中：图1为对照品溶液的色谱图，图2为供试品溶液的色谱图，图3为缺制何首乌的阴性对照溶液色谱图。由此可知，阴性样品对2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的测定无干扰。

试验例二、线性关系考察试验测定

1、试验方法：

分别取浓度为0.03888mg/mL的2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液5μL、25μL、50μL、75μL、100μL，按照实施例1的色谱条件注入色谱仪，测定其峰面积Y为纵坐标，对照品进样量X为横坐标。

2、试验结果：

试验结果如图4所示，其中：回归方程为：Y＝106020X-33449(R²＝l)，2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在0.19μg～3.89μg范围内，进样量与峰面积之间呈良好的线性关系。

试验例三、精密度试验测定

1、试验方法：

吸取按照实施例1制得的对照品溶液10μL，按照实施例1的色谱条件进行测定，重复进样6次。

2、试验结果：

试验结果如表4所示。

表4精密度试验结果

由表4可知，本发明测得2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面积的RSD＝0.7％，表明进样精密度良好。

试验例四、稳定性试验测定

1、试验方法：

按照实施例1制得的供试品溶液，按照实施例1的色谱条件，分别于0、3、5、7、11、13、15小时精密吸取10μL供试品溶液注入液相色谱仪进行测定。

2、试验结果：

试验结果如表5所示。

表5稳定性试验结果

由表5可知，本发明测得样品中2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰面积的RSD＝0.3％，说明供试品溶液中2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在15小时内稳定。

试验例五、重复性试验测定

1、试验方法：

精密称取同一批按照实施例2的配方和工艺制得的护骨胶囊(批号：20150102)6份，按实施例1供试品溶液制备方法分别制备，按实施例1的色谱条件进行测定。

2、试验结果：

试验结果如表6所示。

表6重复性试验结果

由表6可知，本发明测得护骨胶囊中2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的平均含量为0.79mg/粒，RSD＝0.6％，表明本发明提供的护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法重复性良好。

试验例六、加样回收试验测定

1、试验方法：

精密称取已知2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷含量的样品(批号：20150102)6份，每份约0.4g，精密称定，分别加入0.9721mg-2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品，按实施例1的供试品溶液同法制备，并按实施例1的色谱条件进行测定。

2、试验结果：

试验结果如表7所示。

表7回收率试验结果

由表7可知，本发明测得得平均回收率为103.97％，RSD为1.4％，表明本发明提供的护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法可行。

试验例七、样品的含量测定

1、试验方法：

取按照实施例2的配方和工艺制得的护骨胶囊三批，按照实施例1的色谱条件分别测定2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的含量。

2、试验结果：

试验结果如表8所示。

表8三批样品的含量

上述实施例仅示例性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，举凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。

Claims

1.一种护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2供试品溶液的制备：取护骨胶囊内容物0.4g置于圆底烧瓶中，精密加入体积比为50％的甲醇25mL，密塞，称定重量，水浴加热回流30～40min，放至室温，称定重量，用体积比为50％的甲醇补足减失重量，摇匀，静置，上清液滤过，取续滤液，得供试品溶液；

S3液相色谱仪检测：

2.如权利要求1所述的护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中护骨胶囊每粒含制何首乌以2,3,5,4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷计，不得少于0.50mg。

3.如权利要求1所述的护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱仪中的色谱柱为C₁₈柱。

4.如权利要求3所述的护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法，其特征在于，所述色谱柱的长度为250mm，内径为4.6mm，填充剂粒径为5μm。

5.如权利要求1所述的护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中色谱条件为：高效液相色谱的流动相为乙腈-水，检测波长为320nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进样量为10μL。

6.如权利要求5所述的护骨胶囊制何首乌二苯乙烯苷成分的检测方法，其特征在于，所述乙腈与水的体积比为15:85。