CN106248841A - 风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法 - Google Patents

风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法，是以2,3,5,4′‑四羟基二苯乙烯‑2‑O‑β‑D‑葡萄糖苷对照品为对照，以乙腈‑0.1％磷酸溶液＝20～25︰80～75为流动相的高效液相色谱法。本发明提供的风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法，能够实现对制何首乌含量的快速、准确、高重现性、高回收率的测定，与现有技术相比，本发明通过高效液相色谱法对风湿宁药酒中制何首乌成分的含量进行测定，本测定方法专属性强、精密度高、重复性好、回收率高、稳定性高、测量结果准确，达到了有效控制风湿宁药酒质量的目的，确保了产品质量的稳定、安全、有效。

Description

风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法
技术领域
本发明涉及风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法，具体属于中药检测技术领域。
背景技术
风湿宁药酒是由鸡血藤、制何首乌、豨莶草、麸炒苍术、大血藤、菝葜、老鹳草、红花、乌梢蛇、五加皮、桂枝、蚕沙、白鲜皮、石菖蒲、苦参、细辛、寻骨风、高良姜、桑枝、白芷、地黄、苍耳子和川芎制成的。功能是祛风活血，利湿通络。方中鸡血藤为君药，具有活血通络，祛痰生新，流利经脉之效。臣以制何首乌、生地黄、五加皮滋补肝肾，养血添精；豨莶草、大血藤、菝葜、白鲜皮、苦参等祛风除湿，解毒清络。佐以桂枝、细辛、蚕沙、乌梢蛇辛温祛风，合营通络；苍术健脾，祛风胜湿；石菖蒲通九窍，补五脏；白芷、高良姜祛寒止痛；苍耳子甘能益血，苦能燥湿，温能通畅，治上中下一身风湿众病。使以川芎、红花，川芎为血中气药，与红花相伍，活血化瘀，祛风止痛，引导诸药直达病灶，与上述诸药合用，能使充正气旺，血行风自灭。现有的风湿宁药酒的质量标准中未涉及到制何首乌的含量测定项目，因此，研究一种操作简单，专属性强，能够准确测量风湿宁药酒中制何首乌含量的方法，显得尤为必要。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法，能够高效、准确的测定制何首乌含量，专属性强，精密度高。
本发明的风湿宁药酒，是由鸡血藤100g、制何首乌50g、豨莶草100g、麸炒苍术50g、大血藤100g、菝葜50g、老鹳草100g、红花25g、乌梢蛇50g、五加皮25g、桂枝50g、蚕沙25g、白鲜皮50g、石菖蒲25g、苦参50g、细辛25g、寻骨风50g、高良姜25g、桑枝50g、白芷25g、地黄50g、苍耳子50g和川芎25g制得。以上二十三味，粉碎成粗粉，按流浸膏剂与浸膏剂项下的渗漉法(《中国药典》2015年版通则0189)用白酒8.6kg作溶剂，浸渍48小时后,缓缓渗漉，收集漉液，静置，滤过，滤液加蔗糖860g搅拌溶解，滤过，制成8500mL，即得。
为了实现上述目标，本发明采用如下的技术方案：
风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法，是以2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品为对照，以乙腈-0.1％磷酸溶液＝20～25︰80～75为流动相的高效液相色谱法。
具体含量测定方法为：照《中国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法，按照以下步骤测定：
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.1％磷酸溶液＝20～25︰80～75为流动相，检测波长为300～350nm，柱温为25℃～35℃，流速为1.0～1.5mL/min，理论板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成30μg/mL的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密量取本品10mL～15mL，置于20mL棕色容量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
进一步地，具体含量测定方法为：照《中国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法，按照以下步骤测定：
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.1％磷酸溶液＝22︰78为流动相，检测波长为320nm，柱温为30℃，流速为1.2mL/min，理论板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成30μg/mL的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密量取本品10mL，置于20mL棕色容量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
按照前述含量测定方法，本品中制何首乌按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷计，每1mL不得少于0.034mg。
为了确保本发明鉴别方法科学、合理、可行，对本发明的鉴别方法进行了研究和考察。
制何首乌具有补肝肾，益精血，强筋骨之功效，其特有化学成分二苯乙烯苷(2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷)是制剂中的主要活性成分，故选用二苯乙烯苷作为本品的定量控制指标成分，用高效液相色谱法测定，经方法学考察，符合含量测定要求。经试验，该方法具有分离效果好、灵敏、准确等优点。
1、实验仪器与材料：
仪器：Waters e2695高效液相色谱仪；waters2489双波长紫外检测器。
对照品：2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品(来源：中国食品药品检定研究院，批号：120901-201512，标示量：91.0％)。
试剂：样品前处理用到的乙醇为分析纯，流动相中用到的乙腈为色谱纯，水为纯化水，磷酸为分析纯。
2、色谱条件选择
2.1、柱温选择
为寻找最佳柱温，采用不同柱温进行实验，观察结果，结果见表1。
表1柱温实验表
柱温(℃) 20 25 30 35 40
观察结果 分离度差 分离度良好 分离度良好 分离度良好 溶剂粘度大
由表1可知，在25～35℃分离度良好，因而选择25～35℃作为柱温均可。
2.2、流速选择
为寻找最佳流速范围，采用不同流速进行实验，记录色谱峰，结果见表2。
表2色谱峰记录表
由表2可知，设置流速为1.0～1.5mL/min，各峰间的分辨率良好，色谱时间短，峰面积适中，效果最好。
2.3、流动相选择
为寻找最佳流动相，采用不同流动相进行UV检测，记录色谱峰，结果见表3。
表3不同流动相UV检测表
流动相 色谱峰
乙腈：水＝15：85 峰形稍差，分离度高
乙腈：水＝25：75 峰形稍差，分离度较高
乙腈：水＝70：30 峰形差，分离度低
乙腈：0.1％磷酸水溶液＝22：78 产生鬼峰少，峰形较好，分离度高
乙腈：0.1％磷酸水溶液＝25：75 峰形较好，分离度高
乙腈：0.1％磷酸水溶液＝20：80 峰形较好，分离度高
由表3可知，选用乙腈：0.1％磷酸水溶液＝22：78作为流动相，其产生的鬼峰少，得到的峰形好且分离度高，为最佳条件。
2.4、检测波长的选择
在300～350nm对2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液进行光谱紫外扫描，其在320nm处有极大吸收波长，其它本品溶液在此波长下也有较好的显示，因此本发明中检测波长优选为320nm。
2.5、色谱柱选择
通过查阅各种药学资料及中国药典(2015年版)关于“制何首乌”的含量测定方法，对流动相进行筛选，最终确定的色谱条件如下：Venusil C18柱(250mm×4.6mm，5μm)。
3、系统适用性试验：
吸取对照品溶液20μL注入高效液相色谱仪测定，理论板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计大于2000。
4、样品溶液的制备
对照品溶液的制备：取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成30μg/mL的溶液，即得。对照品溶液色谱图如图1所示。
供试品溶液的制备：供试品溶液的制备：精密量取本品10mL～15mL，置于20mL棕色容量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液，即得。供试品溶液色谱图如图2所示。
阴性制剂溶液的制备：取去除制何首乌的处方药材按制备工艺制备得到阴性制剂，再同供试品溶液的方法制备，即得。
5、空白试验
取阴性制剂溶液10μL注入高效液相色谱仪测定，结果表明，在2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰处基本无干扰。
6、仪器精密度试验
吸取浓度为30.39μg/mL的对照品溶液10μL注入高效液相色谱仪测定，连续进样6次，结果见表4。结果表明仪器精密度良好。
表4
7、标准曲线及线性范围
取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，制成30.39μg/ml的对照品溶液，再精密吸取上述对照品溶液2μL、10μL、20μL、30μL、40μL注入液相色谱仪测定。结果见表5。
表5
经回归分析，得回归方程：Y＝4006490X-65319，相关系数R＝1。2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷进样量在0.06078μg～1.2156μg范围内呈良好的线性关系，标准曲线如图3所示。
8、重复性试验
精密量取风湿宁药酒(批号120901)10mL至20mL棕色容量瓶中，加稀乙醇稀释至刻度，摇匀即得，分别处理6份，分别吸取10μL溶液注入液相色谱仪测定，结果见表6。结果表明方法重复性好。
表6
9、中间精密度
精密量取风湿宁药酒(批号120901)10mL至20mL棕色容量瓶中，加稀乙醇(50％乙醇)稀释至刻度，摇匀即得样品，由两名分析人员各分别处理6份样品，使用不同的仪器，分别吸取10μL溶液注入液相色谱仪测定，结果见表7表明中间精密度良好。
表7
10、加样回收率试验
精密量取批号120901风湿宁药酒(含量0.0520mg/mL)5mL至20mL容量瓶中，精密加入50.65μg/mL 2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品溶液5mL，加稀乙醇(60％乙醇)稀至刻度，摇匀，即得，分别处理共6份。分别吸取10μL溶液注入液相色谱仪测定，结果见表8。由表8可知，本发明方法准确度高。
表8
11、供试品溶液稳定性试验
取供试品溶液(批号120901)，于0h、2h、4h、6h、8h、10h、12h精密吸取10μL注入高效液相色谱仪，测定样品12h的稳定性。结果表明，供试品在12h内稳定，见表9。
表9
12、样品含量测定
分别精密吸取10μL注入高效液相色谱仪测定，结果如表10所示。
表10
根据处方量(制何首乌50g，制成成品酒约8500mL)，结合药典规定的制何首乌的二苯乙烯苷最低含量限度0.70％，可计算本品理论含量为：50×0.70％×1000/8500＝0.04118mg/mL。上述测定的10批样品中含量最低为0.0344mg/mL，根据理论含量计算得转移率为：0.0344/0.04118×100％＝82.1％，转移率在可接受范围，故测定方法中暂定含量限度为：每1mL含制何首乌以2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷(C22H22O9)计，不得少于0.034mg。
本发明的有益之处在于：本发明提供的风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法，能够实现对制何首乌含量的快速、准确、高重现性、高回收率的测定，与现有技术相比，本发明通过高效液相色谱法对风湿宁药酒中制何首乌成分的含量进行测定，本测定方法专属性强、精密度高、重复性好、回收率高、稳定性高、测量结果准确，达到了有效控制风湿宁药酒质量的目的，确保了产品质量的稳定、安全、有效。
附图说明
图1是本发明的对照品溶液色谱图；
图2是本发明的供试品溶液色谱图；
图3是本发明的标准曲线图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的介绍。
实施例1
风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法：照《中国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法，按照以下步骤测定：
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.1％磷酸溶液＝20︰80为流动相，检测波长为300nm，柱温为25℃，流速为1.0mL/min，理论板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成30μg/mL的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密量取本品10mL，置于20mL棕色容量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
实施例2
风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法：照《中国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法，按照以下步骤测定：
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.1％磷酸溶液＝25︰75为流动相，检测波长为350nm，柱温为35℃，流速为1.5mL/min，理论板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成30μg/mL的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密量取本品15mL，置于20mL棕色容量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
实施例3
风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法：照《中国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法，按照以下步骤测定：
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.1％磷酸溶液＝22︰78为流动相，检测波长为320nm，柱温为30℃，流速为1.2mL/min，理论板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成30μg/mL的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密量取本品10mL，置于20mL棕色容量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得
实施例4
风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法：照《中国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法，按照以下步骤测定：
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.1％磷酸溶液＝23︰77为流动相，检测波长为310nm，柱温为28℃，流速为1.2mL/min，理论板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成30μg/mL的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密量取本品12mL，置于20mL棕色容量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各15μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。

Claims (4)

1.风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法，其特征在于：所述含量测定方法是以2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品为对照，以乙腈-0.1％磷酸溶液＝20～25︰80～75为流动相的高效液相色谱法。
2.根据权利要求1所述的风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法，其特征在于：照《中国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法，按照以下步骤测定：
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.1％磷酸溶液＝20～25︰80～75为流动相，检测波长为300～350nm，柱温为25℃～35℃，流速为1.0～1.5mL/min，理论板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成30μg/mL的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密量取本品10mL～15mL，置于20mL棕色容量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10～20μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
3.根据权利要求2所述的风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法，其特征在于：照《中国药典》2015年版四部通则0512高效液相色谱法，按照以下步骤测定：
色谱条件与系统适应性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈-0.1％磷酸溶液＝22︰78为流动相，检测波长为320nm，柱温为30℃，流速为1.2mL/min，理论板数按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：取2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加50％乙醇制成30μg/mL的溶液，作为对照品溶液；
供试品溶液的制备：精密量取本品10mL，置于20mL棕色容量瓶中，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液作为供试品溶液；
测定：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μL，注入高效液相色谱仪，测定，即得。
4.根据权利要求2或3所述的风湿宁药酒中制何首乌的含量测定方法，其特征在于：本品中制何首乌按2,3,5,4′-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷计，每1mL不得少于0.034mg。
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