CN115097029A - 一种蟾酥药材的薄层指纹信息斑点鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种蟾酥药材的薄层指纹信息斑点鉴别方法。其特征在于：用简便、快捷的前处理方法得到供试品与对照药材溶液，采用同一供试品溶液，以3种不同极性的展开剂，在3块薄层板上，多种检视条件下，检视了蟾酥药材的约60种信息斑点，归属29种化学成分。各成分斑点鲜亮、清晰、直观、颜色各异，易于判断识别对比。几块薄层板，数十毫升有机溶剂，29种成分斑点信息，远多于高效液相指纹图谱的信息质控指标。但其简便性、快捷性、低成本、高效率，却是指纹图谱不具备的。彰显了其创新性、实用性以及显著的有益效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种蟾酥药材的薄层指纹信息斑点鉴别方法，属于薄层鉴别领域。即，采用同一供试品溶液，以3种不同极性的展开剂，在3块薄层板上，多种检视条件下，检视了蟾酥药材的60种信息斑点，归属29种化学成分。
背景技术
所谓的中药材薄层指纹信息斑点鉴别方法，顾名思义就是将高效液相指纹图谱的含义引入薄层鉴别领域，以数块薄层板，替换了价格高昂、性能齐全的高效液相色谱仪；以薄层鉴别的梯度展开剂，替换了高效液相的梯度流动相；以各成分颜色各异、鲜亮直观的斑点特征，替换了指纹图谱呈现的同一模样的成分波峰；不但成本降低，效率提高，且易于普及推广应用。在不同的检视条件下，呈现出的五颜六色，信息繁多，直观、靓丽的成分斑点，易于观察对比，做出质量评价。即将中药材中的脂溶性、中极性以及水溶性成分，依据相似相容的溶解定律，按非极性、中极性、极性的顺序，在各自极性不同的展开溶剂中，通过反复地吸附与解吸附，将药材中具有检测信息的大部分有效成分，按着极性大小，在极少数的薄层板上，不同的检视条件下，简便、快捷地获得尽可能多的斑点信息图谱，由此组成一套从脂溶性到水溶性成分薄层信息斑点指纹图，以便对药材进行多指标质量评价。
中药蟾酥为蟾酥科动物中华大蟾酥Bufo bufo gargarizans cantor或黑眶蟾酥Bufo melanostictus Schn的干燥分泌物。为中国药典和中国兽药典历版收载的品种，具有解毒、止痛、开窍醒神之功效。用于痈疽疔疮，咽喉肿痛，中暑神昏，痧胀腹痛吐泻。是传统中医及现代医学中的一种动物源中药材，价格昂贵，日用量仅为0.015～0.03g。蟾酥是一种动物毒素，其化学成分复杂。根据现代医学分析，蟾酥的主要成分为多肽，包括神经肽和激素，有毒，具有麻醉、对抗微生物等活性。根据化合物的溶解性，可将蟾酥的有效成分划分为脂溶性、水溶性与其他成分。脂溶性成分主要为蟾毒配基类化合物，占蟾酥有效物质的20％左右，包括脂蟾毒配基类、华蟾毒配基类以及蟾毒灵类等，其中以蟾毒灵和华蟾蜍毒配基为代表的蟾毒配基类化合物被认为是蟾酥抗肿瘤作用的主要活性物质。水溶性成分主要是蟾毒色胺类化合物，属于生物碱类化合物。其中五羟色胺、N-甲基五羟色胺、N，N-二甲基五羟色胺、N，N，N-三甲基五羟色胺以及蟾蜍噻咛五种吲哚生物碱为主要有效成分。其他成分包括吗啡、肾上腺素、甾醇、二烯内酯、胆甾醇等。其中蟾蜍二烯内酯为强心苷类化合物，是目前公认的蟾酥中的主要强心活性成分。中国兽药典2020年版二部收载蟾酥的薄层鉴别是以蟾酥对照药材和脂蟾毒配基及华蟾酥次素对照品为对照，喷雾10％硫酸乙醇溶液，日光下检视供试品色谱，在与对照品和对照药材色谱相应的位置上，呈现的相同颜色的斑点。具体检测方法如下：取蟾酥粉末0.2g，加乙醇10ml，加热回流30分钟，滤过，滤液置10ml量瓶中，加乙醇稀释至刻度，作为供试品溶液。另取蟾酥对照药材，同法制成对照药材溶液。再取脂蟾毒配基及华蟾酥次素对照品，加乙醇分别制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法试验，吸取上述4种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环己烷一三氯甲烷一丙酮(4∶3∶3)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％硫酸乙醇溶液，热风吹至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点；在与对照品色谱相应的位置上，显相同的一个绿色及一个红色斑点。
在中国药典2020年版一部收载的方法与中国兽药典大同小异，不同的部分只是以对照药材为对照，观察日光和紫外光灯(365nm)下的颜色和荧光斑点。查阅文献，基本都是采用的药典收载的方法。还未查阅到蟾酥药材的薄层信息斑点指纹鉴别方法和鉴别图谱。
为给蟾酥药材及其不同工艺制备的多种制剂，提供简便、快捷、低成本、高效率的薄层斑点信息指纹鉴别方法，对蟾酥药材进行了专题薄层鉴别研究。获得了一套简便、快捷的蟾酥药材薄层指纹信息斑点鉴别方法和鉴别图谱。
发明内容
用简便、快捷的前处理方法得到供试品与对照药材溶液，采用同一供试品溶液，以3种不同极性的展开剂，在3块薄层板上，多种检视条件下，检视了蟾酥药材的约60种信息斑点，归属29种化学成分。各成分斑点鲜亮、清晰、直观、颜色各异，易于判断识别对比。几块薄层板，数十毫升展开剂，29种成分信息，远多于高效液相指纹图谱的信息质控指标。但其简便性、快捷性、直观性、低成本、高效率，却是指纹图谱不具备的。彰显了其创新性、实用性以及显著的有益效果。完成该指纹信息斑点鉴别，只需药材和对照药材各0.2g、提取溶剂12ml、展开剂45ml、时间2小时。简便、快捷、高效，是目前已报道方法都不具备的。为蟾酥药材的多指标快速质量监督，提供了方法与薄层指纹信息斑点色谱图。为不同制备工艺制备的含蟾酥复方制剂，提供了薄层鉴别参考信息。
本发明解决其技术问题所采用的方案为：
(1)蟾酥药材的脂溶性成分薄层鉴别：取蟾酥药材0.2g，研细，加甲醇6ml，回流提取20分钟，倾出提取液，静置，上清液作为供试品溶液；另取蟾酥对照药材0.2g，同法制备对照药材溶液；吸取供试品溶液和对照药材溶液各8～10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为3.5∶2.2∶3∶0.1的环己烷-三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，展开，取出，热风吹干，置紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点；再置暗室内透过灯光检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；
(2)蟾酥药材的中极性成分薄层鉴别：吸取(1)项下的供试品溶液和对照药材溶液各7～8μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为2∶2∶4∶0.2的环己烷-三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点；置暗室内透过灯光检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；
(3)蟾酥药材的水溶性成分薄层鉴别：吸取(1)项下的供试品溶液和对照药材溶液各8～10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为2∶4∶3∶0.2的三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，热风吹干，置紫外光灯254nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色荧光主斑点；再置暗室内透过灯光检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
本发明的原理如下：
依据中药各有效成分的化学结构与性质，遵循相似相容的提取原则，采用适宜的提取溶剂，简便、快捷地制备供试品与对照药材溶液。再采用不同极性的展开剂，进行展开，各种化学成分就会随着不同的展开剂，依据吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的能力不同，而在各自的薄层板上得以良好分离。再借助各种极性近似的有效成分，在同一块薄层板上，不同的检视条件下，虽然重叠，但在不同的层次上，互不干扰，呈现出各自不同的斑点颜色，获得多信息的薄层色谱图。按展开剂的极性大小，将各薄层板上分离良好的多信息梯度薄层色谱图，从非极性到极性连接起来，就形成一套薄层指纹信息斑点鉴别图谱。
本发明的创新点及有益效果如下：
1.蟾酥药材以体积比为3.5∶2.2∶3∶0.1的环己烷-三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，将脂溶性成分展开后，薄层板置紫外光灯254nm下检视到6个深浅不一的褐色斑点，其中3个斑点含量高、比较清新(图1)；喷雾10％硫酸乙醇溶液显色后，置紫外光灯365nm下检视到11个不同颜色荧光斑点，斑点清晰、分离良好，各斑点均匀地分布在整个薄层板上(图2)；再将该板置暗室内透过灯光检视，获得11个不同颜色的斑点，斑点清晰、五颜六色，非常漂亮(图3)。在一个薄层区域检出十余种分离良好、斑点清晰的化学成分，充分展现了创新性与新颖性，是屈指可数的范例。其关键技术得益于4种展开溶剂的最佳配比和薄层展开技术的娴熟性，展开剂的微酸性确保了脂蟾毒配基中的酯键结构均能以稳定的分子体存在，克服了多形体的拖尾弊端；娴熟性保证了点样量和所点斑点大小、均匀、适中，杜绝了因点样技术造成的斑点拖尾。3种检视条件，共检出信息斑点28种，归属14种不同的化学成分。
2.蟾酥药材以体积比为2∶2∶4∶0.2的环己烷-三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，展开的中极性成分，喷雾10％硫酸乙醇溶液显色后，置紫外光灯365nm下检视到9个荧光斑点，其中，8个清晰，1个隐约可见，斑点鲜亮各异，分布在薄层板的上半部(图4)；再将该板置暗室内透过灯光检视，获得7个不同颜色的呈色斑点，斑点清晰、四颜五色，也算得上漂亮(图5)。2种检视条件，共检视到信息斑点16个，归属9种化学成分。
3.蟾酥药材以体积比为2∶4∶3∶0.2的三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸为展开剂，将水溶性成分展开后，置紫外光灯254nm下检视到4个棕褐色斑点(图6)；喷雾10％硫酸乙醇溶液显色后，置紫外光灯365nm下检视到5个荧光斑点，其中，1个亮蓝绿色，2个暗红色，1个暗粉色，1个暗蓝色(图7)；置暗室内透过灯光检视到7个颜色深浅不一的棕褐色斑点(图8)；共检出信息斑点16个，归属12种化学成分。
4.采用同一供试品溶液和对照药材溶液，以3种不同极性的展开剂，在3块薄层板上，多种检视条件下，检视了蟾酥药材的60种信息斑点。除去每块薄层板上承上启下的斑点和重复斑点，归属于约29种化学成分。3块薄层板，数十毫升有机溶剂，可获得29种成分信息斑点，远多于指纹图谱呈现的9个信息波峰(图9)的信息质控指标。但其简便性、快捷性、信息斑点的直观性、低成本、高效率，却是指纹图谱不具备的。彰显了其创新性、实用性以及显著的有益效果。为不同来源、不同产地的蟾酥药材进行质量评价和质量对比，提供了方法和图谱；为不同工艺与组方的复方制剂，进行蟾酥药材投料监督，提供了可供选择的薄层指纹信息斑点色谱图。
5.本发明与已报道方法相比，不再局限于显色后观察灵敏度很低的呈色斑点(图10、11、12)，通过紫外光灯365nm和透过灯光检视，大幅度提升了斑点的灵敏度，使斑点清晰鲜亮，斑点数增多，其检测指标提升，更利于质量监督。
6.蟾酥是中华大蟾酥或黑眶蟾酥的干燥分泌物，因其所含的蟾毒配基类等成分既是治病的有效成分，也是毒性成分，价格昂贵，用量少而严格，能简便、快捷、低成本、高效率、多指标进行质量评价至关重要，该发明方法正是迎合了上述需求，适合于广范围普及推广应用，具有很高的实用价值。
本发明不但具有创造性，而且还具有前瞻性，它将目前常规的药材单区域数成分薄层鉴别提升到了梯度展开条件下的数十种成分组成的薄层指纹信息斑点鉴别，将薄层鉴别提升到了一个新高度，推动了薄层鉴别技术领域的发展。
附图说明
图1为蟾酥药材的脂溶性成分在紫外光灯254nm下检视的薄层TLC图。
图2为蟾酥药材的脂溶性成分用10％硫酸乙醇溶液显色后，紫外光灯365nm下检视的薄层TLC图。
图3为蟾酥药材的脂溶性成分用10％硫酸乙醇溶液显色后，在暗室内透过灯光检视的薄层TLC图。
图4为蟾酥药材的中极性成分用10％硫酸乙醇溶液显色后，在紫外光灯365nm下检视的薄层TLC图。
图5为蟾酥药材的中极性成分用10％硫酸乙醇溶液显色后，在暗室内透过灯光检视的薄层TLC图。
图6为蟾酥药材的水溶性成分紫外光灯254nm下检视的薄层TLC图。
图7为蟾酥药材的水溶性成分用10％硫酸乙醇溶液显色后，在紫外光灯365nm下检视的薄层TLC图。
图8为蟾酥药材的水溶性成分用10％硫酸乙醇溶液显色后，在暗室内透过灯光检视的薄层TLC图。
图9为中国药典2020年版一部蟾酥药材项下收载的蟾酥指纹色谱图。
图10为蟾酥药材的脂溶性成分用10％硫酸乙醇溶液显色后，日光下检视的薄层TLC图。
图11为蟾酥药材的中极性成分用10％硫酸乙醇溶液显色后，日光下检视的薄层TLC图。
图12为蟾酥药材的水溶性成分用10％硫酸乙醇溶液显色后，日光下检视的薄层TLC图。
图1、2、3、10为同一块薄层板，不同检视条件下的薄层色谱图，其中，1蟾酥对照药材；2、3、4、5为蟾酥药材。
图4、5、11为同一块薄层板，不同检视条件下的薄层色谱图，其中，1蟾酥对照药材；2、3、4、5为蟾酥药材。
图6、7、8、12为同一块薄层板，不同检视条件下的薄层色谱图，其中，1蟾酥对照药材；2、3、4、5为蟾酥药材。
图9中，波峰1.日蟾毒它灵；波峰2.蟾毒它灵；波峰3.蟾毒灵；波峰4(S).华蟾酥毒基；波峰5.脂蟾毒配基
本发明具体实施方式如下：
(1)蟾酥药材的脂溶性成分薄层鉴别：取蟾酥药材0.2g，研细，加甲醇6ml，回流提取20分钟，倾出提取液，静置，上清液作为供试品溶液；另取蟾酥对照药材0.2g，同法制备对照药材溶液；吸取供试品溶液和对照药材溶液各8～10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为3.5∶2.2∶3∶0.1的环己烷-三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，展开，取出，热风吹干，置紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点；置暗室内透过灯光检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；
(2)蟾酥药材的中极性成分薄层鉴别：吸取(1)项下的供试品溶液和对照药材溶液各7～8μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为2∶2∶4∶0.2的环己烷-三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点；置暗室内透过灯光检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；
(3)蟾酥药材的水溶性成分薄层鉴别：吸取(1)项下的供试品溶液和对照药材溶液各8～10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为2∶4∶3∶0.2的三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，热风吹干，置紫外光灯254nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色荧光主斑点；再置暗室内透过灯光检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
Claims (2)
1.一种蟾酥药材的薄层指纹信息斑点鉴别方法，其特征在于：
(1)蟾酥药材的脂溶性成分薄层鉴别：取蟾酥药材0.2g，研细，加甲醇6ml，回流提取20分钟，倾出提取液，静置，上清液作为供试品溶液；另取蟾酥对照药材0.2g，同法制备对照药材溶液；吸取供试品溶液和对照药材溶液各8～10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为3.5∶2.2∶3∶0.1的环己烷-三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，展开，取出，热风吹干，置紫外光灯254nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点；置暗室内透过灯光检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；
(2)蟾酥药材的中极性成分薄层鉴别：吸取(1)项下的供试品溶液和对照药材溶液各7～8μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为2∶2∶4∶0.2的环己烷-三氯甲烷-丙酮-甲酸为展开剂，展开，取出，热风吹干，喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视；供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色荧光斑点；置暗室内透过灯光检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；
(3)蟾酥药材的水溶性成分薄层鉴别：吸取(1)项下的供试品溶液和对照药材溶液各8～10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以体积比为2∶4∶3∶0.2的三氯甲烷-丙酮-甲醇-甲酸为展开剂，展开，取出，热风吹干，置紫外光灯254nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点；喷以10％硫酸乙醇溶液，105℃加热至斑点显色清晰，置紫外光灯365nm下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色荧光主斑点；再置暗室内透过灯光检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色斑点。
2.根据权利要求1所述的一种蟾酥药材的薄层指纹信息斑点鉴别方法，其特征在于以3种不同的展开剂，在3块薄层板上共检出60种特征信息斑点，归属29种化学成分。
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