CN116139239B - 调经化瘀中药组合物及测定方法和用途 - Google Patents

调经化瘀中药组合物及测定方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及调经化瘀中药组合物及测定方法和用途。一方面，提供了测定呈片剂形式的通常称为乌金片的中药组合物中的芍药苷的方法，片剂由如下中药材制成：蒲黄、百草霜、小茴香油、益母草、熟地黄、三棱、艾叶(炭)、延胡索、香附、白芍、木香、补骨脂、吴茱萸、川芎、莪术、当归；该方法使用高效液相色谱法测定，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以乙腈‑甲醇‑水(12:3:85)为流动相，检测波长为230nm。还提供了一种调经化瘀中药组合物及其制备方法和用途。该片剂在临床上可用于调经化瘀，用于气郁结滞、胸胁刺痛、产后瘀血、小腹疼痛、五心烦热、面黄肌瘦具有优异的治疗效果。

Description

调经化瘀中药组合物及测定方法和用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，涉及一种具有调经化瘀的中药组合物，它们的制备方法，以及它们的用途，该中药组合物在临床上可用于气郁结滞、胸胁刺痛、产后瘀血、小腹疼痛、五心烦热、面黄肌瘦。
背景技术
具有调经化瘀的中药组合物乌金片已收载于《中药成方制剂第十七册》第21页，标准编号WS3-B-3142-98。乌金片的处方为：蒲黄30g、百草霜21g、小茴香油0.15ml、益母草480g、熟地黄30g、三棱30g、艾叶(炭)30g、延胡索90g、香附180g、白芍90g、木香30g、补骨脂30g、吴茱萸30g、川芎90g、莪术30g、当归30g。在上述标准中，记载的乌金片的制法为：以上十六味，蒲黄、百草霜分别粉碎成细粉，过筛；茴香油用乙醇适量溶解，备用；益母草、熟地黄、三棱用水煎煮两次，第一次3小时，第二次2小时；艾叶水煮沸后80℃温浸2小时；合并以上水提取液、温浸液，滤过，滤液浓缩成膏(相对密度1.20～1.30，50～60℃)；延胡索、香附、白芍、木香、补骨脂、吴茱萸、川芎、莪术用60％乙醇回流提取三次，第一次6小时，第二次4小时，第三次2小时；当归提取三次，第一次用乙醇回流提取8小时，再用60％乙醇回流提取两次，第一次4小时，第二次2小时，合并以上乙醇提取液，滤过，回收乙醇浓缩成膏；将水、醇浓缩膏合并，加入蒲黄等细粉及辅料适量混匀，制成颗粒，干燥，放冷，兑入茴香油醇溶液，混匀，压制成1110片，得到每片重0.6g的片剂。WS3-B-3142-98只进行了芍药苷的鉴别，未进行其它项目的鉴别，更未对典型化学成分进行含量测定
乌金片现有质量标准的配方和制法与上述标准WS3-B-3142-98基本相同，在质量控制方面除了提供芍药苷的鉴别外，还对益母草、延胡索、川芎、当归进行了鉴别，此外，还使用反相HPLC法测定了片剂中的芍药苷。然而，该现有质量标准测定片剂中芍药苷的反相HPLC法存在例如测定结果不准确的缺陷。因此，本领域技术人员迫切期待有一种新的方法来准确地测定乌金片中的芍药苷。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种乌金片，其具有调经化瘀之功效，临床上可用于气郁结滞、胸胁刺痛、产后瘀血、小腹疼痛、五心烦热、面黄肌瘦，该乌金片能够使用优良的检测方法对其进行质量监测。本发明的另一目的在于提供一种对乌金片进行质量检测的方法。通过本发明方法，本发明实现了至少一个上述的目的。本发明基于此类发现而得以完成。
为此，本发明第一方面涉及一种可称为乌金片的呈片剂形式的中药组合物，其由如下重量比例的中药材和适量辅料制成：蒲黄24～30g、百草霜17～21g、小茴香油0.1～0.5ml、益母草390～475g、熟地黄24～30g、三棱24～30g、艾叶(炭)24～30g、延胡索73～89g、香附146～178g、白芍73～89g、木香24～30g、补骨脂24～30g、吴茱萸24～30g、川芎73～89g、莪术24～30g、当归24～30g。
根据本发明第一方面的中药组合物，其由如下重量比例的中药材和适量辅料制成：蒲黄27.03g、百草霜18.92g、小茴香油0.135ml、益母草432.43g、熟地黄27.03g、三棱27.03g、艾叶(炭)27.03g、延胡索81.08g、香附162.16g、白芍81.08g、木香27.03g、补骨脂27.03、吴茱萸27.03g、川芎81.08g、莪术27.03g、当归27.03g。
根据本发明第一方面的中药组合物，其每1000片是由如下重量比例的中药材和适量辅料制成：蒲黄24～30g、百草霜17～21g、小茴香油0.1～0.5ml、益母草390～475g、熟地黄24～30g、三棱24～30g、艾叶(炭)24～30g、延胡索73～89g、香附146～178g、白芍73～89g、木香24～30g、补骨脂24～30g、吴茱萸24～30g、川芎73～89g、莪术24～30g、当归24～30g。
根据本发明第一方面的中药组合物，其每1000片是由如下重量比例的中药材和适量辅料制成：蒲黄27.03g、百草霜18.92g、小茴香油0.135ml、益母草432.43g、熟地黄27.03g、三棱27.03g、艾叶(炭)27.03g、延胡索81.08g、香附162.16g、白芍81.08g、木香27.03g、补骨脂27.03、吴茱萸27.03g、川芎81.08g、莪术27.03g、当归27.03g。
根据本发明第一方面的中药组合物，其每片的片重为550～650mg。
根据本发明第一方面的中药组合物，其每片的片重为580～620mg。
根据本发明第一方面的中药组合物，其每片的片重为600mg。
根据本发明第一方面的中药组合物，其中所述辅料包括润滑剂和填充剂。例如，所述润滑剂选自：硬脂酸、硬脂酸镁、硬脂酸钙或其组合。例如，所述填充剂选自：淀粉、糊精、蔗糖、乳糖或其组合。
根据本发明第一方面的中药组合物，其中包含0.5～1.5％的硬脂酸镁，例如其中包含1％的硬脂酸镁。
根据本发明第一方面的中药组合物，其中包含淀粉和糊精，例如二者重量比为1：2，例如其用量是使得片剂重量达到规定的片重。
根据本发明第一方面的中药组合物，其是按照包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)蒲黄、百草霜分别粉碎成细粉，过筛，混合，得药粉，备用；
(2)小茴香油用乙醇适量(例如小茴香油的10～20倍体积例如约15倍体积)溶解，备用；
(3)益母草、熟地黄、三棱用水煎煮两次(例如，第一次加12倍量水，浸泡0.5小时，煎煮3小时，第二次加8倍量水，煎煮2小时)，过滤，得水提取液；艾叶加水于80℃温浸(例如，加12倍量水，浸泡0.5小时，煮沸后80℃温浸2小时)，过滤，得温浸液；合并以上水提取液、温浸液，滤过，滤液浓缩成膏；
(4)延胡索、香附、白芍、木香、补骨脂、吴茱萸、川芎、莪术用60％乙醇回流提取三次(例如，第一次6小时，第二次4小时，第三次2小时，加醇量分别为8倍、6倍、6倍)，合并三次提取液并过滤，得醇提取液；当归用乙醇回流提取三次(例如，第一次用8倍量乙醇回流提取8小时，再用60％乙醇回流提取两次，第一次4小时，第二次2小时，加醇量分别为6倍、6倍)，合并三次提取液并过滤，得醇提取液；合并以上乙醇提取液，滤过，回收乙醇浓缩成膏；
(5)将水、醇浓缩膏合并，加入蒲黄和百草霜细粉、淀粉、糊精、硬脂酸镁混匀，制成颗粒，干燥，放冷，兑入小茴香油醇溶液，混匀，压制成片剂；
(6)使用包括如下步骤的方法测定所得片剂中的芍药苷含量：
照中国药典2020年版四部通则0512之高效液相色谱法进行测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(例如柱规格为4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈-甲醇-水(12:3:85)为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.02mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：(a)取供试品20片，精密称定总重量，研细，混匀，取约相当于2片乌金片的量，精密称定，置50ml量瓶中，加50％乙醇约45ml，超声处理(例如，功率250W，频率45KHz)40分钟，(b)放冷至室温，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置70℃水浴上蒸干，(c)残渣用50％甲醇10ml溶解，加在中性氧化铝柱(例如100～200目，4～5g)上，用50％甲醇(例如，该50％甲醇中还添加0.85mg/ml三乙胺)80ml洗脱，收集洗脱液，置70℃水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
进一步的，本发明第二方面提供了制备本发明第一方面任一项所述呈片剂形式的中药组合物的方法，包括如下步骤：
(1)蒲黄、百草霜分别粉碎成细粉，过筛，混合，得药粉，备用；
(2)小茴香油用乙醇适量(例如小茴香油的10～20倍体积例如约15倍体积)溶解，备用；
(3)益母草、熟地黄、三棱用水煎煮两次(例如，第一次加12倍量水，浸泡0.5小时，煎煮3小时，第二次加8倍量水，煎煮2小时)，过滤，得水提取液；艾叶加水于80℃温浸(例如，加12倍量水，浸泡0.5小时，煮沸后80℃温浸2小时)，过滤，得温浸液；合并以上水提取液、温浸液，滤过，滤液浓缩成膏；
(4)延胡索、香附、白芍、木香、补骨脂、吴茱萸、川芎、莪术用60％乙醇回流提取三次(例如，第一次6小时，第二次4小时，第三次2小时，加醇量分别为8倍、6倍、6倍)，合并三次提取液并过滤，得醇提取液；当归用乙醇回流提取三次(例如，第一次用8倍量乙醇回流提取8小时，再用60％乙醇回流提取两次，第一次4小时，第二次2小时，加醇量分别为6倍、6倍)，合并三次提取液并过滤，得醇提取液；合并以上乙醇提取液，滤过，回收乙醇浓缩成膏；
(5)将水、醇浓缩膏合并，加入蒲黄和百草霜细粉、淀粉、糊精、硬脂酸镁混匀，制成颗粒，干燥，放冷，兑入小茴香油醇溶液，混匀，压制成片剂；
(6)使用包括如下步骤的方法测定所得片剂中的芍药苷含量：
照中国药典2020年版四部通则0512之高效液相色谱法进行测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(例如柱规格为4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈-甲醇-水(12:3:85)为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.02mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：(a)取供试品20片，精密称定总重量，研细，混匀，取约相当于2片乌金片的量，精密称定，置50ml量瓶中，加50％乙醇约45ml，超声处理(例如，功率250W，频率45KHz)40分钟，(b)放冷至室温，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置70℃水浴上蒸干，(c)残渣用50％甲醇10ml溶解，加在中性氧化铝柱(例如100～200目，4～5g)上，用50％甲醇(例如，该50％甲醇中还添加0.85mg/ml三乙胺)80ml洗脱，收集洗脱液，置70℃水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
进一步的，本发明第三方面提供了测定本发明第一方面任一项所述呈片剂形式的中药组合物中的芍药苷的方法，包括如下步骤：
照中国药典2020年版四部通则0512之高效液相色谱法进行测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(例如柱规格为4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈-甲醇-水(12:3:85)为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.02mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：(a)取供试品20片，精密称定总重量，研细，混匀，取约相当于2片乌金片的量，精密称定，置50ml量瓶中，加50％乙醇约45ml，超声处理(例如，功率250W，频率45KHz)40分钟，(b)放冷至室温，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置70℃水浴上蒸干，(c)残渣用50％甲醇10ml溶解，加在中性氧化铝柱(例如100～200目，4～5g)上，用50％甲醇(例如，该50％甲醇中还添加0.85mg/ml三乙胺)80ml洗脱，收集洗脱液，置70℃水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
进一步的，本发明第四方面提供了本发明第一方面任一项所述呈片剂形式的中药组合物在制备用于调经化瘀的药物中的用途；例如在制备用于气郁结滞、胸胁刺痛、产后瘀血、小腹疼痛、五心烦热、面黄肌瘦的药物中的用途。
本发明制备的乌金片以及对它们进行质量检测的方法呈现如上下文所述优良效果。
附图说明
图1：专属性考察的典型图谱
具体实施方式
本发明提供以下具体实例以进一步对本发明的各个方面进行说明。
在下文具体实例压制片剂时，针对设计的片重，选择适宜大小的圆形冲模以6.5～8kg的力压制成片，将压制成的片剂放置4～5小时后即用铝塑泡罩密封包装。
实施例1：制备呈片剂形式的中药组合物(即乌金片)
以制备1000片投料的配方和量：
蒲黄27.03g、百草霜18.92g、小茴香油0.135ml、
益母草432.43g、熟地黄27.03g、三棱27.03g、艾叶(炭)27.03g、
延胡索81.08g、香附162.16g、白芍81.08g、木香27.03g、补骨脂27.03、吴茱萸27.03g、川芎81.08g、莪术27.03g、当归27.03g，
淀粉、糊精、硬脂酸镁按以下制法所示量添加。
制法：
蒲黄、百草霜分别粉碎成细粉，过筛，混合，得药粉，备用；
小茴香油用乙醇适量(2ml)溶解，备用；
益母草、熟地黄、三棱用水煎煮两次，第一次加12倍量水，浸泡0.5小时，煎煮3小时，第二次加8倍量水，煎煮2小时，过滤，得水提取液；
艾叶加12倍量水，浸泡0.5小时，煮沸后80℃温浸2小时，过滤，得温浸液；
合并以上水提取液、温浸液，滤过，滤液浓缩成膏(相对密度为1.27，50-60℃)；
延胡索、香附、白芍、木香、补骨脂、吴茱萸、川芎、莪术用60％乙醇回流提取三次，第一次6小时，第二次4小时，第三次2小时，加醇量分别为8倍、6倍、6倍，合并三次提取液并过滤，得醇提取液；
当归提取三次，第一次用8倍量乙醇回流提取8小时，再用60％乙醇回流提取两次，第一次4小时，第二次2小时，加醇量分别为6倍、6倍，合并三次提取液并过滤，得醇提取液；
合并以上乙醇提取液，滤过，回收乙醇浓缩成膏；
将水、醇浓缩膏合并，加入蒲黄等细粉、淀粉、糊精、硬脂酸镁混匀，制成颗粒，干燥，放冷，兑入小茴香油醇溶液，混匀，压制成1000片，得到每片重600mg的片剂；以上硬脂酸镁添加量是片剂重量的1％(添加约6mg/片)，淀粉和糊精二者重量比为1：2且添加适量至每片总重量600mg(添加淀粉和糊精二者总量约407mg/片)；
使用下文各种试验例的方法测定上述乌金片中的芍药苷含量。
实施例2：提供市售的乌金片
本实施例2提供三批市售乌金片，由云南永孜堂制药有限公司生产(国药准字Z20083015)，每片重0.6g，三批片剂的批号分别为210412、210413、210415；
使用下文各种试验例的方法测定上述乌金片中的芍药苷含量。
试验例1：片剂质量检测
参照现行质量标准，对本文实施例1～2的一些乌金片进行质量检测。
1、性状：一般规定乌金片应为棕褐色片、气香、味苦。经观察，实施例1～2的全部乌金片均为棕褐色片、气香、味苦，均符合规定。
2、鉴别：取一个批次的乌金片20片，研细，加水50ml，置水浴上加热，离心，滤过，滤液用乙酸乙酯提取三次，每次30ml，合并提取液，回收乙酸乙酯浓缩至2ml，作为供试品溶液；另取芍药苷对照品，加乙醇制成每1ml含1mg的溶液作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水(7：3：1)下层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以硫酸乙醇液(1：1)(V/V)，在105℃烘至斑点显色清晰；一般规定，供试品色谱中，在与对照色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。经检测，实施例1～2的全部乌金片，供试品色谱中，在与对照色谱相应的位置上，均显示相同颜色的斑点。
3、鉴别：取一个批次的10片，研细，加乙醇50ml，超声处理30分钟，滤过，滤液水浴上浓缩至10ml，加于活性炭-氧化铝柱(活性炭0.5g，中性氧化铝100-200目，5g，内径10mm)上，用乙醇50ml洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取盐酸水苏碱对照品，加乙醇制成每1ml含5mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正丁醇-盐酸-水(4：1：0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以稀碘化铋钾试液。一般规定，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。经检测，实施例1～2的全部乌金片，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显示相同颜色的斑点。
4、鉴别：取一个批次的10片，研细，加氨水湿润，放置1小时，加三氯甲烷50ml，超声处理30分钟，分取氯仿层，滤过，滤液蒸干，残渣加乙醇2ml使溶解，作为供试品溶液。另取延胡索乙素对照品，加乙醇制成每1m含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环已烷-丙酮(7：3)为展开剂，展开，取出，晾干，碘蒸气显色，至斑点显色清晰，取出，放置待斑点退色后，置紫外光灯(365nm)下检视。一般规定，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。经检测，实施例1～2的全部乌金片，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显示相同颜色的荧光斑点。
5、鉴别：取一个批次的5片，研细，加乙醚30ml，超声处理5分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯2ml使溶解，作为供试品溶液。另取川芎、当归对照药材各1g，同法分别制成对照药材溶液。照薄层色谱法(中国药典2020年版四部通则0502)试验，吸取上述三种溶液各5μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以正已烷-乙酸乙酯(9：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365nm)下检视。一般规定，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。经检测，实施例1～2的全部乌金片，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，均显示相同颜色的荧光斑点。
6、重量差异检查：取供试品20片，精密称定总重量，求得平均片重后，再分别精密称定每片的重量，每片重量与标示片重比较，本领域一般规定重量差异限度应为±5％。经检测，实施例1～2的全部乌金片的重量差异限度均在±1.8％至±2.9％范围内，例如实施例1片剂的重量差异限度为±2.12％。
7、片剂脆碎度：按中国药典2020年版四部之“0923片剂脆碎度检查法”，测定实施例1～2的全部乌金片的脆碎度，结果，实施例1片剂减失重量0.46％，实施例2三批片剂减失重量分别为0.53％、0.38％、0.46％，且均未检出断裂、龟裂及粉碎的片，符合药典一般规定。
8、崩解时限检查：照崩解时限检查法(2020年版中国药典四部通则0921之片剂的崩解时限检查法)检查，一般规定，每批片剂6片均应在1小时内全部崩解时，认为符合规定。经检测，实施例1～2全部乌金片的崩解时限均在24～38min范围内，例如实施例1片剂的崩解时限为34min。
9、含量测定：本领域一般地规定，乌金片含量以其中药材白芍贡献的芍药苷来表征，通常要求每1片含白芍以芍药苷(C23H28O11)计，不得少于0.30mg。经测定，实施例1～2的全部乌金片含白芍以芍药苷(C23H28O11)计，使用本文各种HPLC法测定，均在0.7～1.3mg/片的范围内，参见各个具体测定试验例。
试验例2：正丁醇提取测定片剂中的芍药苷含量
照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(本例使用Thermo ScientificTM HypersilTM ODS C18 HPLC色谱柱，4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈-0.1％磷酸溶液(17:83)为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.02mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：
(a)取供试品20片，精密称定总重量，研细，混匀，取约相当于2片乌金片的量，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％乙醇50ml，称定重量，超声处理(功率250W，频率45KHz)40分钟，
(b)放冷至室温，再称定重量，用50％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置70℃水浴上蒸干，
(c)残渣加水20ml分次使溶解，转移至分液漏斗中，用水饱和的正丁醇溶液振摇提取四次(30ml、30ml、20ml、20ml)，合并正丁醇提取液，用氨试液洗涤二次，每次20ml，弃去氨试液，再用正丁醇饱和的水洗涤二次，每次20ml，分取正丁醇提取液，水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解，转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，进样前滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
试验例3：柱分离测定片剂中的芍药苷含量
本试验例经过详细的研究后，确定如下操作步骤的含量测定方法：
照高效液相色谱法(中国药典2020年版四部通则0512)测定；
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(本例使用Thermo ScientificTM HypersilTM ODS C18 HPLC色谱柱，4.6mm×250mm，5μm)，以乙腈-甲醇-水(12:3:85)为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.02mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：
(a)取供试品20片，精密称定总重量，研细，混匀，取约相当于2片乌金片的量，精密称定，置50ml量瓶中，加50％乙醇约45ml，超声处理(功率250W，频率45KHz)40分钟，
(b)放冷至室温，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置70℃水浴上蒸干，
(c)残渣用50％甲醇10ml溶解，加在中性氧化铝柱(100～200目，4～5g；本例使用货号为AN60C018的Anavo AL-N SPE柱)上，用50％甲醇(该50％甲醇中还添加0.85mg/ml三乙胺)80ml洗脱，收集洗脱液，置70℃水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
试验例4：芍药苷含量的方法学研究
本试验例针对试验例3所描述的方法，进行芍药苷含量的方法学研究。测试样品如未特别说明是指实施例1片剂。
1、专属性考察
空白溶剂：取甲醇，滤过，即得；
对照品溶液制备和供试品溶液制备如上文所述；
阴性样品溶液制备：参照实施例1方法制备仅仅未添加白芍片剂即阴性样品片剂2片，按供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液；
测定：精密吸取空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液与阴性样品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图。四种溶液进样的典型结果色谱图见下图1，其中芍药苷20.768min、理论塔板数17494、拖尾因子1.04、相近峰的分离度2.49。结果表明：供试品溶液图谱中，芍药苷峰即主峰与相邻杂质峰分离度为2.49>1.5，主峰理论板数为17494>2000，表明该方法的系统适用性符合要求；空白溶剂与阴性样品溶液的色谱图中，在与芍药苷对照品色谱峰的相同保留时间处无色谱峰，不干扰样品的含量检测，表明该方法专属性优良。
2、耐用性考察
对照品溶液和供试品溶液如上文所述方法各平行制备2份；
含量测定耐用性考察标准条件及拟耐受性条件如下：流速1.0ml/min±0.2ml/min，柱温30℃±5℃，检测波长230nm±2nm，C18柱为3个不同品牌色谱柱，流动相乙腈-甲醇-水(12:3:85)比例变化为甲醇比例±0.2ml及乙腈比例±0.6ml。
进样测定方式：对照品溶液第1份连续进样5针，计算5针的峰面积RSD％，RSD％不超过2％为符合规定。第2份对照品溶液进双针，2份对照品溶液平均校正因子的比值应在0.98～1.02之间；供试品溶液进双针。
使用实施例1片剂进行试验，耐用性检测结果分别如下：
在0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min三种不同的流速下，芍药苷峰理论板数均在16300～17800范围内、芍药苷峰拖尾因子均在1.03～1.06范围内、芍药苷峰分离度均在2.35～3.13范围内、芍药苷含量在1.01～1.04mg/片范围内且3种条件下含量测定结果的RSD＝0.61％。
在25℃、30℃、35℃三种不同的柱温下，芍药苷峰理论板数均在16100～17300范围内、芍药苷峰拖尾因子均在1.03～1.05范围内、芍药苷峰分离度均在2.47～3.06范围内、芍药苷含量在1.02～1.06mg/片范围内且3种条件下含量测定结果的RSD＝0.82％。
在228nm、230nm、232nm三种不同的检测波长下，芍药苷峰理论板数均在16700～17500范围内、芍药苷峰拖尾因子均在1.02～1.04范围内、芍药苷峰分离度均在2.85～3.77范围内、芍药苷含量在1.02～1.04mg/片范围内且3种条件下含量测定结果的RSD＝0.73％。
在YMC-Pack ODS-AQ(4.6mm×250mm，5μm)、研创Generall C18 AQ(4.6mm×250mm，5μm)、Thermo ScientificTM HypersilTM ODS C18(4.6mm×250mm，5μm)三种不同的品牌色谱柱下，芍药苷峰理论板数均在16500～17300范围内、芍药苷峰拖尾因子均在1.02～1.11范围内、芍药苷峰分离度均在2.38～3.26范围内、芍药苷含量在1.02～1.07mg/片范围内且3种条件下含量测定结果的RSD＝1.23％。
在乙腈：甲醇：水＝12:3:85、12:2.8:85.2、12:3.2:84.8、11.4:3:85.6或12.6:3:84.4五种不同的流动相比例条件下，芍药苷峰理论板数均在15700～17100范围内、芍药苷峰拖尾因子均在1.02～1.07范围内、芍药苷峰分离度均在2.27～3.44范围内、芍药苷含量在1.01～1.07mg/片范围内且5种条件下含量测定结果的RSD＝0.96％。
上述结果表明，在流动相中乙腈和甲醇变化、流速变化、检测波长变化、柱温变化、不同品牌色谱柱改变的条件下，芍药苷峰与相近杂质峰分离度均大于1.5，主峰理论板数均大于2000，主峰拖尾因子均小于2.0，各条件下含量数据的相对标准偏差均小于2.0％，符合含量测定耐用性试验要求，表明该方法耐用性良好。
3、线性关系考察
取芍药苷对照品约10mg置50ml量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，作为线性储备液，分别吸取储备液5、5、5、3、3、5ml置200、100、50、20、10、10ml量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含芍药苷5、10、20、30、60、100μg/ml的一系列浓度的溶液，分别取上述待测溶液10μl，注入液相色谱仪；
以进样量(ng)记为x，以峰面积记为y，得到线性方程为：y＝1487.53x-4785.26，相关系数r为0.99999(r>0.998)，Y轴截距在100％响应值的2％以内，响应因子的RSD％为1.01％(<2.0％)，表明芍药苷进样量在50～1000ng范围内线性关系良好。
4、溶液稳定性考察
芍药苷对照品溶液稳定性考察：取对照品溶液于室温(25℃)避光条件下放置，分别于0、2、4、6、8、15、23、35小时，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算芍药苷峰面积相对标准偏差(RSD％)，结果8个测定时间点的保留时间均值为20.421min、RSD＝0.27％，主峰面积均值为296935.23、RSD＝0.34％。
供试品溶液中芍药苷稳定性考察：取供试品溶液于室温(25℃)避光条件下放置，分别于0、2、4、6、8、15、23、35小时，精密量取10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算芍药苷峰面积相对标准偏差(RSD％)，结果8个测定时间点的保留时间均匀值为20.433min、RSD＝0.41％，主峰面积均值为245276.64、RSD＝0.82％。结果表明：对照品及供试品溶液在35小时内，主峰面积RSD值均小于2.0％，保留时间RSD均值小于1％，35小时内主峰变化率均不超过2.0％，表明在该含量测定浓度下，对照品及供试品溶液在35小时内均稳定。
5、精密度考察
(1)进样精密度
精密吸取溶液稳定性项下供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，记录色谱图。连续进样6次，计算芍药苷峰保留时间及峰面积的相对标准偏差(RSD)，结果芍药苷峰保留时间的RSD为0.26(<1％)，主峰面积的RSD为0.41％(<2％)，表明该方法的进样精密度优良。
(2)重复性
按照试验例3方法平行制备对照品溶液2份、供试品溶液6份；精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。6份供试品溶液的平均含量为1.032mg/片、RSD为0.42％。
(3)操作精密度
针对同一批供试品，6名分析员分别配制供试品溶液各6份，以“(2)重复性”中的2份对照品溶液作为对照，测试此配制的全部供试品溶液；结果：6人各自测得的含量均值均在1.02～1.08mg/片范围内，6人各自结果的RSD值均在0.33～0.51％范围内；6人测得含量均值为1.04mg/片，含量总RSD＝0.67％。本操作精密度表明本发明供试品溶液的配制方法具有优良的稳定性，不同工作人员的处理结果一致性非常优良，具有优良的操作精密度。
6、准确度考察
对照品溶液制备：参见上文，平行制备2份；
对照品储备液：取芍药苷对照品12mg于200ml量瓶中，用50％乙醇溶解；
供试品溶液制备：取已测定含量的同一批号样品(实施例1片)1片，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入对照品储备液15ml，再加50％乙醇值至约45ml，超声处理40分钟，放冷至室温，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，滤液于70℃水浴下蒸干，残渣用50％甲醇10ml溶解，参照本试验例供试品溶液制备的方法将其加载到中性氧化铝柱上进行后续处理，包括使用包含0.85mg/ml三乙胺的50％甲醇溶液淋洗柱子，制得供试品溶液，同法配制6份；
测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算测得量，进而计算回收率，6份样品的回收率在99.67～100.84％范围内(显著优于本领域此类HPLC含量测定中95～105％的一般要求)，平均回收率为100.33％，6个回收率结果的RSD为0.37％(显著优于本领域此类HPLC含量测定中<2％的一般要求)。
7、样品含量测定
按试验例3拟定的方法测定实施例1乌金片以及实施例2的210412、210413、210415三批乌金片中的芍药苷含量，结果分别为：1.032mg/片、1.064mg/片、1.017mg/片、1.054mg/片。
试验例5：芍药苷含量的方法学研究
HPLC方法和条件：参照试验例3方法和条件但是洗脱中性氧化铝柱所用50％甲醇中未添加三乙胺；
方法学研究：参照试验例4进行。以下结果主要涉及供试品的测定，对照品溶液的配制和测定参照试验例3和试验例4。
结果：
1、专属性考察：结果与试验例4基本相同，芍药苷20.594min、理论塔板数16832、拖尾因子1.07、相近峰的分离度2.569，系统适用性符合要求，空白溶剂与阴性样品溶液的色谱图中，在与芍药苷对照品色谱峰的相同保留时间处无色谱峰，不干扰样品的含量检测，表明该方法专属性优良。
2、耐用性考察：结果与试验例4基本相同，三种不同流速下含量测定结果的RSD＝0.58％，三种不同柱温下含量测定结果的RSD＝0.86％，三种不同波长下含量测定结果的RSD＝0.70％，三种不同色谱柱下含量测定结果的RSD＝1.28％，五种不同流动相比例下含量测定结果的RSD＝0.91％，上述各条件下芍药苷峰理论板数均在15400～17500范围内、芍药苷峰拖尾因子均在1.02～1.09范围内、芍药苷峰分离度均在2.13～3.27范围内、芍药苷含量在1.02～1.10mg/片范围内；表明该方法耐用性良好。
3、线性关系考察，线性方程为：y＝1487.53x-4785.26，相关系数r为0.99999(r>0.998)，Y轴截距在100％响应值的2％以内，响应因子的RSD％为1.01％(<2.0％)，表明芍药苷进样量在50～1000ng范围内线性关系良好。
以上专属性、耐用性和线性主要与色谱系统有关，与供试品溶液的配制无关。
4、供试品溶液中芍药苷稳定性考察：室温放置，0～35小时8个测定时间点的保留时间均匀值为20.386min、RSD＝0.53％，主峰面积均值为243874.32、RSD＝0.87％，表明供试品溶液在35小时内稳定。另外，与试验例4之稳定性考察相比，虽然供试品溶液的配制方法作了微小改变，但是稳定性仍然优良。
5、精密度考察
(1)进样精密度：溶液稳定性项下供试品溶液连续进样6次，芍药苷峰保留时间的RSD为0.28(<1％)，主峰面积的RSD为0.46％(<2％)，表明该方法的进样精密度优良。
(2)重复性：平行制备供试品溶液6份测定，平均含量为1.024mg/片、RSD为1.83％。
(3)操作精密度：同一批供试品6名分析员分别配制供试品溶液各6份测定，结果：6人各自测得的含量均值均在0.97～1.13mg/片范围内，6人各自结果的RSD值均在1.71～2.01％范围内；6人测得含量均值为1.02mg/片，含量总RSD＝3.13％。尽管6名分析员他们各自使用不添加三乙胺的方法配制供试品并测定时的含量RSD接近于<2％的合格程度，但是在统计6人结果时RSD达到>3％的显然不可接受的程度。表明不添加三乙胺的供试品配制方法在由不同工作人员处理时结果一致性和操作精密度不可接受。
6、准确度考察
由同一分析员进行操作。
对照品溶液制备：平行制备2份；
对照品储备液：取芍药苷对照品12mg于200ml量瓶中，用50％乙醇溶解；
供试品溶液制备：取已测定含量的同一批号样品(实施例1片)1片，精密称定，置50ml量瓶中，精密加入对照品储备液15ml，再加50％乙醇值至约45ml，超声处理40分钟，放冷至室温，加50％乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，滤液于70℃水浴下蒸干，残渣用50％甲醇10ml溶解，参照本试验例供试品溶液制备的方法将其加载到中性氧化铝柱上进行后续处理，但是淋洗柱子所用50％甲醇溶液中未添加三乙胺，制得供试品溶液，同法配制6份；
测定：精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算测得量，进而计算回收率，6份样品的回收率在96.43～102.16％范围内，平均回收率为98.32％，6个回收率结果的RSD为2.24％，准确度明显地比添加三乙胺的方法差。
试验例6：芍药苷含量的方法学研究
使用试验例2的HPLC方法和条件，参照试验例4进行方法学研究。
已经发现，在与HPLC条件有关的参数方面性能可以满足测定要求，例如专属性优良、耐用性考察中五种色谱条件的含量测定结果的RSD值均<1.5％、供试品稳定性的8个测定时间点主峰面积的RSD＝0.93％、进样精密度中主峰面积的RSD为0.58％
但是与样品配制有关的方法学参数却不尽人意，例如，重复性试验中平行制备供试品溶液6份的平均含量RSD为1.65％、操作精密度中同一批供试品6名分析员分别配制供试品溶液各6份测定的6人各自测得含量结果的RSD值均在1.78～2.43％范围内且6人测得含量的总RSD＝3.36％、由同一分析员进行的准确度考察中6份样品的回收率在95.37～101.32％范围内且6个回收率结果的RSD为2.57％
以上试验例2和试验例6的结果表明，该HPLC法的HPLC条件满足一般的测定要求，但是与样品配制有关的操作却不尽如人意，尤其是多名分析员进行测试时效果更差，这可能与供试品溶液繁琐的制备方法有关。从供试品配制的方法简便性角度讲，试验例3的方法显著优于试验例2的方法，从本文上下文详述可知，试验例3方法简便、耗时短、人为影响因素少。但是，出人意料的发现，在试验例3所示操作方法中，用于洗脱柱子的溶剂中添加少量三乙胺对于获得优良精密度和准确度是必要的。
试验例7：片剂稳定性考察
以芍药苷表征片剂的稳定性是一种最直观的方法。
使实施例1～2各批片剂(实施例1乌金片以及实施例2的210412、210413、210415三批乌金片)在模拟市售包装的铝塑复合泡罩包装中，于40℃遮光放置6个月(模拟室温长期放置2年以上的情景)，分别于0月和6月取样，按照本文试验例3的方法测定各批片剂的芍药苷含量。0月结果如上文所记载的，4批片剂的6月结果分别为：1.024mg/片、1.033mg/片、1.027mg/片、1.047mg/片。显示片剂在经历稳定性处理之后典型活性物质的含量基本未发生变化，表明本发明所述乌金片具有优良稳定性。
本发明制备的乌金片具有调经化瘀之功效，临床上可用于气郁结滞、胸肋刺痛、产后淤血、小腹疼痛、五心烦热、面黄肌瘦；一般地，本发明乌金片可以口服用药，通常可以采用一次4片、一日2次的剂量。本发明某些实施例制得的300～400mg/片的片剂在服用时患者的顺应性明显优于市售600mg/片的产品。
虽然上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (7)

1.测定呈片剂形式的中药组合物中的芍药苷的方法，该中药组合物每1000片是由如下重量比例的中药材和适量辅料制成：蒲黄24~30g、百草霜17~21g、小茴香油0.1~0.5ml、益母草390~475g、熟地黄24~30g、三棱24~30g、炭制艾叶24~30g、延胡索73~89g、香附146~178g、白芍73~89g、木香24~30g、补骨脂24~30g、吴茱萸24~30g、川芎73~89g、莪术24~30g、当归24~30g；该中药组合物中包含0.5~1.5%的硬脂酸镁；该中药组合物还包含淀粉和糊精，二者重量比为1：2，且其用量是使得片剂每片达到550~650mg的片重；该方法包括如下步骤：
色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，柱规格为4.6mm×250mm，5μm，以乙腈-甲醇-水三者体积比为12:3:85的混合液为流动相，检测波长为230nm，理论板数按芍药苷峰计算应不低于2000；
对照品溶液的制备：精密称取芍药苷对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.02mg的溶液，即得；
供试品溶液的制备：
(a)取供试品20片，精密称定总重量，研细，混匀，取相当于2片的量，精密称定，置50ml量瓶中，加50%乙醇45ml，以功率250W、频率45KHz超声处理40分钟，
(b)放冷至室温，加50%乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液25ml，置70℃水浴上蒸干，
(c)残渣用50%甲醇10ml溶解，加在100~200目的4~5g中性氧化铝柱上，用添加0.85mg/ml三乙胺的50%甲醇80ml洗脱，收集洗脱液，置70℃水浴上蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至50ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。
2.根据权利要求1的方法，所述中药组合物每1000片是由如下重量比例的中药材和适量辅料制成：蒲黄27.03g、百草霜18.92g、小茴香油0.135ml、益母草432.43g、熟地黄27.03g、三棱27.03g、炭制艾叶27.03g、延胡索81.08g、香附162.16g、白芍81.08g、木香27.03g、补骨脂27.03、吴茱萸27.03g、川芎81.08g、莪术27.03g、当归27.03g。
3.根据权利要求1的方法，所述中药组合物每片的片重为580~620mg。
4.根据权利要求1的方法，所述中药组合物每片的片重为600mg。
5.根据权利要求1的方法，所述中药组合物中包含1%的硬脂酸镁。
6.根据权利要求1的方法，其中所述中药组合物是按照包括如下步骤的方法制备得到的：
(1)蒲黄、百草霜分别粉碎成细粉，过筛，混合，得药粉，备用；
(2)小茴香油用乙醇溶解，备用；乙醇用量是小茴香油的10~20倍体积；
(3)益母草、熟地黄、三棱用水煎煮两次，第一次加12倍量水，浸泡0.5小时，煎煮3小时，第二次加8倍量水，煎煮2小时，过滤，得水提取液；艾叶加12倍量水，浸泡0.5小时，煮沸后80℃温浸2小时，过滤，得温浸液；合并以上水提取液、温浸液，滤过，滤液浓缩成膏；
(4)延胡索、香附、白芍、木香、补骨脂、吴茱萸、川芎、莪术用60%乙醇回流提取三次，第一次6小时，第二次4小时，第三次2小时，加醇量分别为8倍、6倍、6倍，合并三次提取液并过滤，得醇提取液；当归用乙醇回流提取三次，第一次用8倍量乙醇回流提取8小时，再用60%乙醇回流提取两次，第一次4小时，第二次2小时，加醇量分别为6倍、6倍，合并三次提取液并过滤，得醇提取液；合并以上乙醇提取液，滤过，回收乙醇浓缩成膏；
(5)将水、醇浓缩膏合并，加入蒲黄和百草霜细粉、淀粉、糊精、硬脂酸镁混匀，制成颗粒，干燥，放冷，兑入小茴香油醇溶液，混匀，压制成片剂。
7.根据权利要求6的方法，其中步骤(2)中，乙醇用量是小茴香油的15倍体积。
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