CN115097032B

CN115097032B - 一种uhplc特征图谱联合多指标成分含量测定控制清肺达原颗粒质量的方法

Info

Publication number: CN115097032B
Application number: CN202210687641.3A
Authority: CN
Inventors: 成焕波; 翟红伟; 石瑞雪; 胡辉; 孙代华; 李清安
Original assignee: Jingpai Zhengtang Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Jingpai Zhengtang Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-06-17
Filing date: 2022-06-17
Publication date: 2023-07-25
Anticipated expiration: 2042-06-17
Also published as: CN115097032A

Abstract

本发明涉及一种UHPLC特征图谱联合多指标成分含量测定控制清肺达原颗粒质量的方法，包括如下步骤：(1)供试品溶液的制备：制备清肺达原颗粒供试品溶液；(2)对照品溶液的制备：取柴胡皂苷a、黄芩苷、黄芩素、党参炔苷、氢溴酸槟榔碱、厚朴酚、和厚朴酚、芒果苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、大黄素及白藜芦醇，配成对照品溶液；(3)特征图谱的制定：分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入UHPLC色谱仪，以最小峰面积≥0.5‰总峰面积积分，得到特征图谱；(4)选择9个成分标志性成分进行含量测定，进而进行产品质量控制。本发明选择性更高、分析速度更快、灵敏度更高。

Description

一种UHPLC特征图谱联合多指标成分含量测定控制清肺达原颗粒质量的方法

技术领域

本发明属于中药检测及质量控制技术领域，具体地说，涉及一种UHPLC特征图谱联合多指标成分含量测定控制清肺达原颗粒质量的方法。

背景技术

中药复方制剂均为多组分复杂体系，质量控制难度较大。特征图谱是一种综合的可量化的质量控制手段，能较全面地反映复方制剂中所含成分类型与种类。当特征图谱结合标志成分含量测定时，能从定性、定量等两方面对药品质量进行整体描述和评价，对于阐明药效物质基础，促进中药现代化具有重要意义。

然而，因中药复方成分复杂性及各成分之间理化性质差异性，通常很难通过一个色谱条件同时进行中药制剂特征图谱、多指标含量检测，通常需要针对特征图谱、各指标成分含量建立多个检测方法，这样建立的质量标准虽然能对药品质量进行整体描述和评价，实际检测工作量则非常大，检测成本也普遍成倍增加。另一方面，目前中药指纹图谱使用较多仍然以普通HPLC色谱法为主，为了得到更多色谱信息，通过每一个样品检测时间需要1-2小时，检测效率较低。

CN111467451A和CN 113181124A是发明人在先申请的专利，主要公开了本发明所述清肺达原颗粒由柴胡18-25份、黄芩8-15份、法半夏8-15份、全瓜蒌8-15份、党参15-20份、槟榔8-15份、草果15-20份、厚朴15-20份、知母8-15份、赤芍8-15份、甘草8-15份、陈皮8-15份、虎杖8-15份组成，所述清肺达原颗粒在治疗新型冠状病毒肺炎及其他呼吸道病毒作用，以及通过普通HPLC含量测定方法。目前关于清肺达原颗粒特征图谱、多指标含量检测质量控制方法方面尚无研究报道。

发明内容

本发明的目的就是提供一种UHPLC特征图谱联合多指标成分含量测定控制清肺达原颗粒质量的方法，解决现有技术中对清肺达原颗粒质量缺乏精准的质量控制方法问题，提高分析效率。

本发明的技术方案为：

一种UHPLC特征图谱联合多指标成分含量测定控制清肺达原颗粒质量的方法，所述清肺达原颗粒柴胡18-25份、黄芩8-15份、法半夏8-15份、全瓜蒌8-15份、党参15-20份、槟榔8-15份、草果15-20份、厚朴15-20份、知母8-15份、赤芍8-15份、甘草8-15份、陈皮8-15份、虎杖8-15份组成；所述质量控制方法包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取待测清肺达原颗粒制剂，制成供试品溶液；

(2)对照品溶液的制备：取柴胡皂苷a、黄芩苷、黄芩素、党参炔苷、氢溴酸槟榔碱、厚朴酚、和厚朴酚、芒果苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、大黄素及白藜芦醇，配成混合对照品溶液；

(3)特征图谱的制定：分别吸取供试品溶液和对照品溶液，注入UHPLC色谱仪，以最小峰面积≥0.5‰总峰面积积分，依据15批供试品所测得的图谱中的共有峰，得到特征图谱；

(4)选择分离度Ri≥1.5的9个成分标志性成分，即黄芩苷、黄芩素、甘草酸、芒果苷、和厚朴酚、芍药苷、橙皮苷、大黄素、柴胡皂苷a，进行含量测定，通过各成分含量进行产品质量控制。

优选地，所述的步骤(1)中，供试品溶液的制备方法为：取本品粉末0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇10ml，密塞，称定重量，在功率为250W、频率为40kHz条件下超声处理20分钟，自然冷却，再称定重量，用体积浓度为50％的乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

优选地，所述的步骤(3)中，色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈A、流动相B为0.12％甲酸溶液，进行梯度洗脱；检测波长为200-280nm，柱温为25-35℃；流速为0.25-0.45ml/min；理论板数按黄芩苷计算应不低于2800。

进一步的，所述色谱柱为ACQUITYHSS T₃；流动相为乙腈A-0.12％甲酸溶液B，所述梯度洗脱条件为，0-4min,90-88％B；4-11min,88-80％B；11-21min,80-60％B；21-25min,60-20％B；25-29min,20％B；检测波长为230nm；柱温为30℃；流速为0.4ml/min。在该色谱条件下，峰7(芒果苷)、峰10(芍药苷)、峰18(橙皮苷)、峰23(黄芩苷)、峰30(黄芩素)分离效果更佳，可用于含量测定。

更进一步的，所述流速为0-21min,0.4ml/min；21-29min,0.3ml/min。在该色谱条件下，峰37(甘草酸)、峰38(柴胡皂苷a)、峰39(大黄素)、峰40(和厚朴酚)分离效果更佳，可用于含量测定。

本发明所述特征图谱有42个共有峰，其中能完全分离(Ri≥1.5)12个，不能完全分离(0.75≤Ri≤1.5)15个，分离效果不佳(Ri≤0.75)15个。以参照物色谱峰保留时间为基准，计算其他共有色谱峰的相对保留时间，其相对保留时间不超过平均值的±10％，优选为±5％；待测制剂的特征图谱与对照特征图谱的相似度，为0.9-1.0。

本发明所述的步骤(4)中9个标志性成分的含量为：黄芩苷≥130μg/mL、黄芩素≥35μg/mL、甘草酸≥20μg/mL、芒果苷≥5μg/mL、和厚朴酚≥4μg/mL、芍药苷≥20μg/mL、橙皮苷≥10μg/mL、大黄素≥3μg/mL、柴胡皂苷a≥1.5μg/mL。

本发明利用超高效液相色谱(UHPLC)法提供了一种既能通过一个色谱条件实现特征图谱，多指标含量测定，同时又能缩短检测周期的清肺达原颗粒质量的方法。从特征图谱联合多指标成分含量测定进行定性、定量等两方面对本发明所述中药复方颗粒质量进行整体描述和评价。同普通HPLC法相比，本发明提供的方法选择性更高、分析速度更快、灵敏度更高，对提高本发明所述清肺达原颗粒的开发和质量控制具有十分重要的意义。

附图说明

图1为15批清肺达原颗粒特征图谱；

图2为清肺达原颗粒对照特征图谱；

图3为含量测定混合对照品色谱图，其中峰1为芒果苷、峰2为芍药苷、峰3为橙皮苷、峰4为黄芩苷、峰5为黄芩素、峰6为甘草酸、峰7为柴胡皂苷a、峰8为大黄素、峰9为和厚朴酚；

图4为含量测定供试品品色谱图，其中峰1为芒果苷、峰2为芍药苷、峰3为橙皮苷、峰4为黄芩苷、峰5为黄芩素、峰6为甘草酸、峰7为柴胡皂苷a、峰8为大黄素、峰9为和厚朴酚。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明作一步说明，但不作为本发明的限制。

实施例1：清肺达原颗粒特征图谱检测方法

取待测清肺达原颗粒制剂粉末0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇10ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)20分钟，放冷，再称定重量，用50％浓度的稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

取柴胡皂苷a、黄芩苷、黄芩素、党参炔苷、氢溴酸槟榔碱、厚朴酚、和厚朴酚、芒果苷、芍药苷、甘草苷、甘草酸铵、橙皮苷、大黄素及白藜芦醇，配成0.1-1mg/mL混合对照品溶液，用于定性分析。

以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈(A)-0.12％甲酸溶液(B)，按下表中的规定进行梯度洗脱；检测波长为230nm，柱温为30℃；流速为0～21min,0.4ml/min；21～29min,0.3ml/min。理论板数按黄芩苷计算应不低于2800。

分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液各1μl，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，即得。

实施例2：清肺达原颗粒特征图谱方法学考察

精密度：取同一批清肺达原颗粒(QFDYG01批)粉末0.1g，精密称定，按实施例1项下供试品溶液的制备和色谱条件方法实验，连续进样6次。

重复性：取同一批清肺达原颗粒(QFDYG01批)粉末0.1g，精密称定，按实施例1项下供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述相同色谱条件测定。

稳定性：取同一批清肺达原颗粒(QFDYG01批)粉末0.1g，精密称定，按实施例1项下供试品溶液的制备和色谱条件方法实验，分别在制备后放置0、3、9、18、24、30小时进样测定。

以上精密度、重复性、稳定性方法学实验考察均以分离度Ri≥1.5且峰面积较高的12个色谱峰作为代表，即峰7(芒果苷)、峰10(芍药苷)、峰17(未鉴定)、峰18(橙皮苷)、峰23(黄芩苷)、峰24(未鉴定)、峰25(未鉴定)、峰30(黄芩素)、峰37(甘草酸)、峰39(大黄素)、峰40(和厚朴酚)、峰41(厚朴酚)。同时，以峰18(橙皮苷)保留时间和峰面积作为参照峰，以各主要色谱峰的相对保留时间(RRTs))及相对峰面积(RPAs)的RSD值来评价方法学实验可行性。实验结果表明，精密度实验各色谱峰RRTs和RPAs分别在0.04-0.42％,0.09-2.82％之间，重复性实验各色谱峰RRTs和RPAs分别在0.03-0.22％,0.10-2.62％之间，稳定性实验各色谱峰RRTs和RPAs分别在0.08-0.1.15％,0.31-2.95％之间。以上说明方法稳定可行，可用于本发明技术方案特征图谱分析，详细实验结果见下表1-表3。

实施例3：15批清肺达原颗粒特征图谱测定及共有峰标定

取15批清肺达原颗粒，将组方中每味药饮片根据批次不同按随机组合原则组合成15批次，称取等量的每批次各单味药饮片，将其混匀，按CN111467451A中公开的方法制备成品颗粒。分别按实施例1中供试品制备方法和色谱条件在UHPLC色谱仪进样检测，以最小峰面积≥0.5‰总峰面积积分，得到不同批次的清肺达原颗粒的特征图谱。将15批色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》2012年版相似度软件，采用均值法，多点矫正进行峰匹配，共得到42个共有峰，其中14个共有峰通过对照品指认，分别为峰1(槟榔碱)、峰7(芒果苷)、峰10(芍药苷)、峰11(甘草苷)、峰18(橙皮苷)、峰21(党参炔苷)、峰22(白藜芦醇)、峰23(黄芩苷)、峰30(黄芩素)、峰37(甘草酸)、峰39(大黄素)、峰40(和厚朴酚)、峰41(厚朴酚)、最后生成对照特征图谱R，如图1-2所示。15批样品同对照特征图谱相似度匹配结果见下表4。

实施例4：9个标志性成分含量测定方法学考察线性关系

分别按照如下制备一系列6个标准品混合溶液：芒果苷(3,10,20,30,60,150μg/mL),黄芩苷(70,105,150,210,280,700μg/mL),芍药苷(12.42～124.43μg/mL),橙皮苷(8.71～87.73μg/mL),甘草酸铵(6,30,60,90,120,300μg/mL),和厚朴酚(3,15,20,30,60,150μg/mL),大黄素(2,8,16,32,64,128μg/mL),黄芩素(10,30,60,120,240,360μg/mL)，柴胡皂苷a(2,15,30,60,90,160μg/mL)。分别将上述6个标准品混合溶液注入1μl进入UHPLC液相色谱仪，按实施例1项下供试品溶液的制备和色谱条件方法实验。以进样浓度为横坐标X，以进样量峰面积纵坐标Y，绘制标准曲线。结果表明，9个物质均在考察范围内线性关系良好，相关系数均大于0.991。详细实验结果见下表5。

精密度：取同一批清肺达原颗粒(QFDYG01批)粉末约0.1g，精密称定，按实施例1项下供试品溶液的制备和色谱条件方法实验，连续进样6次。

重复性：取同一批清肺达原颗粒(QFDYG01批)粉末约0.1g，精密称定，按实施例1项下供试品溶液的制备方法平行制备6份供试品溶液，按上述相同色谱条件测定。

稳定性：取同一批清肺达原颗粒(QFDYG01批)粉末约0.1g，精密称定，按实施例1项下供试品溶液的制备和色谱条件方法实验，分别在制备后放置0、3、9、18、24、30小时进样测定。

以各化合物峰面积的RSD值来评价精密度、重复性、稳定性方法学实验可行性。实验结果表明，方法稳定可行，可用于本发明技术方案9种标志性成分含量测定，详细实验结果见下表5。

准确度：取已知指标成分含量的样品9份，精密称定，采用高、中、低(1:1.2，1:1，1:0.8)的不等量加样回收率法进行，每一种浓度平行制备3份，按超高效液相色谱条件进行测定，计算各成分的平均回收率及RSD，测定结果见表5。

表5 9种标志性成分方法学研究测定结果

实施例5 15批样品9个标志性成分含量测定

根据建立的方法，按实施例1项下供试品溶液的制备和色谱条件方法实验，测定15批样品9个标志性成分含量，测定结果如下表6。

以上测定结果表明，9个标志性成分含量测定方法稳定可行，方法选择性高、分析速度快、灵敏度高，对提高本发明所述清肺达原颗粒的开发和质量控制具有十分重要的意义。

Claims

1.一种UHPLC特征图谱联合多指标成分含量测定清肺达原颗粒质量的方法，所述清肺达原颗粒由柴胡18-25份、黄芩8-15份、法半夏8-15份、全瓜蒌8-15份、党参15-20份、槟榔8-15份、草果15-20份、厚朴15-20份、知母8-15份、赤芍8-15份、甘草8-15份、陈皮8-15份、虎杖8-15份组成，其特征在于，包括如下步骤：

(1)供试品溶液的制备：取待测清肺达原颗粒，制成供试品溶液，其方法为：取本品粉末0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇10ml，密塞，称定重量，在功率为250W、频率为40kHz的条件下超声处理20分钟，自然冷却，再称定重量，用体积浓度为50%的乙醇溶液补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，

色谱条件为：色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相A为乙腈，流动相B为0.12%甲酸溶液，进行梯度洗脱；检测波长为200-280nm，柱温为25-35℃；理论板数按黄芩苷计算应不低于2800；

所述色谱柱为ACQUITY UHPLC® HSS T3；梯度洗脱条件为，0-4min，90-88% B；4-11min，88-80% B；11-21 min，80-60% B；21-25 min，60-20% B；25-29 min，20% B；检测波长为230nm；柱温为30℃；流速为0-21min, 0.4ml/min；21-29min, 0.3ml/min；

(4)选择分离度Ri≥1.5的9个标志性成分，即黄芩苷、黄芩素、甘草酸、芒果苷、和厚朴酚、芍药苷、橙皮苷、大黄素、柴胡皂苷a，进行含量测定。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述特征图谱有42个共有峰；其中能完全分离的12个，不能完全分离的15个，分离效果不佳 15个。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，42个共有峰以参照物色谱峰保留时间为基准，计算其他共有色谱峰的相对保留时间，其相对保留时间不得超过平均值的±10％；待测制剂的特征图谱与对照特征图谱的相似度为0.9～1.0。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，相对保留时间不得超过平均值的±5％。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中9个标志性成分含量分别为：黄芩苷≥130µg/mL、黄芩素≥35µg/mL、甘草酸≥20µg/mL、芒果苷≥5µg/mL、和厚朴酚≥4µg/mL、芍药苷≥20µg/mL、橙皮苷≥10µg/mL、大黄素≥3µg/mL、柴胡皂苷a≥1.5µg/mL。