CN103113435A - 一种制备山奈酚-3-o-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法 - Google Patents

一种制备山奈酚-3-o-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法 Download PDF

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王海涛
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Abstract

本发明提供了一种制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，该方法采用二维液相色谱－质谱联用技术，以甲醇－水或乙腈－水为流动相，以反相C18色谱柱为一维制备色谱柱，对银杏叶提取物进行组分切割，收集目标组分为山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品。再以反相C18色谱柱为二维制备色谱柱，在质谱选择离子峰指导下，对山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品进行组分切割，收集，旋转蒸发浓缩，得到高纯度的山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷，纯度可以达到70%以上。本发明制备过程重复性高，可操作性好，同时银杏叶资源丰富，容易获取，适合大规模生产的要求，可用于舒血宁注射液原料制备。

Description

一种制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体地说，涉及一种制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法。 
背景技术
山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷属于黄酮类化合物，黄酮类化合物具有很好的药学效果，能降低毛细血管通透性和脆性,促进细胞增生和防止血细胞凝聚,清除自由基，在心脑血管疾病的治疗上起到了举足轻重的作用。同时，研究表明山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷还具有抗肿瘤作用。 
山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷存在于珍珠菜、碟豆花、长春花、乔皮、海芒果、长叶胡颓子、银杏叶等植物中。目前对于山奈酚-3--2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷提取分离，主要是植物经过醇提，然后经大孔树脂或葡聚糖凝胶等多次柱层析步骤进行分离纯化，操作步骤繁琐，过程复杂，同时需要消耗大量的有机溶剂，耗时费力。用二维液相色谱－质谱技术制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法还未见报道。 
二维液相色谱技术是通过用两根性质相同或不同的色谱柱对复杂样品进行分离。作为一种分析复杂样品的理想工具，它已被广泛应用于医药卫生、食品科学、环境和农业科学等各个领域。与单维制备色谱相比，二维液相色谱不但具有更高的峰容量，而且两维具有不同的选择性。经过第一维简化的组分可以在第二维上根据不同的选择性而实现互补分离，结构相似的化合物可能在第二维可到有效分离，从而提高制备的效率和化合物纯度。 
银杏叶为银杏科植物银杏（Ginkgo biloba）的干燥叶，其提取物具有活血化 瘀通络的功效。现在药理研究表明，银杏叶中富含大量黄酮和银杏内酯。我国是银杏资源的古国和大国，全国有20多个省市区大面积种植银杏树，银杏资源占全世界的70%，银杏叶的总产量每年在2×107kg以上，资源极大丰富。 
发明内容
针对上述缺陷，本发明提供一种以银杏叶提取物为原料，采用二维液相色谱－质谱技术制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法。 
为解决上述问题，本发明所采用的技术方案是： 
一种制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，其特征在于：步骤如下： 
1）、从中药提取物中制备高纯度山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷； 
2）、将中药提取物溶于甲醇－水溶液，制得中药提取物溶液； 
3）、采用分离纯化技术从中药提取物中制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷。 
2、根据权利要求1所述制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述中药提取物为银杏叶提取物，银杏叶提取物溶于25%－75%的甲醇－水溶液，制得银杏叶提取物溶液，银杏叶提取物浓度为10－1000mg/mL。 
3、根据权利要求1所述制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述分离纯化技术为二维液相色谱－质谱联用进行银杏叶提取物制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷； 
液相色谱进行一维制备的色谱柱为反相C18，反相C8，Click OEG。采用液相色谱进行二维制备的色谱柱为反相C18，反相C8，Click OEG； 
一维液相色谱制备采用的流动相为有机相与水相混合，洗脱条件按照有机 相5－65%等度或0－50分钟有机相由5%提高到70%梯度进行；有机相为甲醇或乙腈，水相为水； 
对保留时间5－25分钟主成分为山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的组分进行收集，旋转蒸发至干，作为一维制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品；将一维制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品用25%－75%的甲醇－水溶液溶解，至浓度为20－200mg/mL； 
对一维收集浓缩后的样品，进行二维液相色谱制备。采用的流动相为有机相与水相混合，洗脱条件按照有机相5－15%等度或经0－30分钟有机相由5%提高到30%梯度进行，二维制备根据质谱选择离子指导组分收集；有机相为甲醇或乙腈，水相为水； 
制备时流动相流速为60－120mL/min，制备时柱温为室温或25－40℃，制备时进样量为200－3000μL/针，检测器为DAD紫外检测器和质谱检测器；制备时流动相最佳流速为80－100mL/min，制备时柱温为室温，制备时进样量为2000－2500μL/针，紫外检测器为360nm； 
二维液相色谱制备收集到的山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷馏分进行旋转蒸发浓缩至干，得到山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷化合物。 
4、根据权利要求3所述制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述一维制备最佳流动相为乙腈与水，采用梯度方式，乙腈比例由10%经15－20分钟增加到15%－25%。 
5、根据权利要求3所述制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述二维制备最佳流动相为乙腈与水，采用等度条件，乙腈浓度为8－15%，，二维制备质谱选择离子为m/z＝317和287，收集m/z=287的馏分。 
6、根据权利要求3所述制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法， 其特征在于：所述最佳二维色谱柱组合为一维为反相C18，二维为反相C18。 
7、根据权利要求3所述制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述制备时流动相最佳流速为80－100mL/min，制备时柱温为室温，制备时进样量为2000－2500μL/针，紫外检测器为360nm。 
由于采用了上述技术方案，与现有技术相比，本发明与现有技术相比具有以下特点： 
1）、山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷纯度高。由于本发明所用的技术方法，直接针对植物中所含的山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷进行制备，无需经过加热、酸碱的变化，山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷以在药材中本身存在的状态被制备出来，没有水解产物掺杂，因此得到的山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷纯度高，达到70%以上。 
2）、方法简单易行，操作简便。本发明所涉及的制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，仪器自动化程度高，操作方便、简单，常温常压下就可进行，适合大规模生产的需要。 
3）、药材来源广，易获得，价格便宜。银杏是我国特有的珍贵树种，占全世界资源的70%，银杏叶的总产量每年在2×107kg以上，资源极大丰富。 
三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂作为应用时间久、疗效明确、使用安全的中药注射剂，有着广泛的应用，而本发明制得的山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷是三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂中一种重要的原料。而本发明提供的制备方法，过程重复性高，可操作性好，同时银杏叶资源丰富，容易获取，适合大规模生产的要求，可用于舒血宁注射液、银杏叶酊剂原料山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的制备。 
具体实施方式
实施例： 
本发明是以银杏叶提取物为原料，采用二维液相色谱－质谱技术制备高纯度芦丁的方法，芦丁的纯度可以达到80%以上。 
本发明为从银杏叶提取物中制备高纯度芦丁的方法，步骤如下： 
1、银杏叶提取物溶于25%－75%的甲醇－水溶液，制得银杏叶提取物溶液，银杏叶提取物浓度为10－1000mg/mL，最佳银杏叶提取物溶于40－60%的甲醇－水溶液，银杏叶提取物浓度最佳为250－550mg/mL。 
2、采用液相色谱进行一维制备的色谱柱为反相C18，反相C8，Click OEG。采用液相色谱进行二维制备的色谱柱为反相C18，反相C8，Click OEG。最佳二维色谱柱组合为一维为反相C18，二维为反相C18。 
3、一维液相色谱制备采用的流动相为甲醇或乙腈与水混合，洗脱条件按照有机相5－65%等度或0－50分钟有机相由5%提高到70%梯度进行。一维制备最佳流动相为乙腈或含0.1%甲酸的乙腈，与水或含0.1%甲酸的水，采用梯度方式，有机相比例由10%经15－20分钟增加到15－25%。 
4、对保留时间5－25分钟主成分为山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的组分进行收集，旋转蒸发至干，作为一维制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品。将一维制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品用甲醇－水溶解，至浓度为20－200mg/mL。一维制备最佳收集时间为10－20分钟，为主要含山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的组分，浓缩至浓度为50－100mg/mL。 
5、对一维收集浓缩后的样品，进行二维液相色谱制备。采用的流动相为甲醇或乙腈与水混合，洗脱条件按照有机相5－15%等度或经0－30分钟有机相由5%提高到30%梯度进行。二维制备最佳流动相为乙腈或含0.1%甲酸的乙腈，与 水或含0.1%甲酸的水，采用等度条件，乙腈或含0.1%甲酸的乙腈浓度为8－15%；二维制备质谱选择离子为m/z＝317和287，收集m/z=287的馏分。 
6、制备时流动相流速为60－120mL/min，制备时柱温为室温或25－40℃，制备时进样量为200－3000μL/针，检测器为DAD紫外检测器和质谱检测器，质谱选择离子指导组分收集；最佳流速为80－100mL/min，柱温为室温，进样量为2000－2500μL/针，紫外检测器为360nm。 
7、将二维液相色谱制备收集到的山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷馏分旋转蒸发浓缩至干，得到高纯度的山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷化合物。 
以下是根据本发明的具体实施方式，结合实际，本发明提供了四种实施例。 
实施例1： 
称取银杏叶提取物500g，溶于1L50%的甲醇－水溶液，制得银杏叶提取物溶液，浓度为500mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用XUnion C18，流动相采用乙腈为有机相，水为水相，梯度洗脱方式：有机相浓度由10%经20分钟提高到25%。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为室温，进样量为500μL/针，流动相流速为90mL/min，收集9－12分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品。用40%的甲醇－水溶液溶解山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品，浓度为50mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为XUnion C18流动相选择乙腈为有机相，水为水相，采用10%有机相等度洗脱。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，，质谱选择离子m/z为317和287，制备温度为室温，进样量为1000μL/针，流动相流速为100mL/min，收集m/z为287的馏分，旋转蒸发至干，得到山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠 李糖基葡萄糖苷化合物，经液相色谱分析，纯度为95%，一维制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品中山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的含量为30%。 
实施例2： 
称取银杏叶提取物2000g，溶于2L25%的甲醇－水溶液，制得银杏叶提取物溶液，浓度为1000mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用XUnion C8，流动相采用甲醇为有机相，水为水相，有机相浓度为65%等度，采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为40℃，进样量为200μL/针，流动相流速为60mL/min，收集5－7分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品。用50%的甲醇－水溶液溶解山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品，浓度为20mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为Xterra C18流动相选择甲醇为有机相，水为水相，采用梯度洗脱方式：有机相浓度由5%经30分钟提高到30%。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，质谱选择离子m/z为317和287，制备温度为室温，进样量为3000μL/针，流动相流速为100mL/min，收集m/z为287的馏分，旋转蒸发至干，得到山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷化合物，经液相色谱分析，纯度为85%，一维制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品中山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的含量为18%。 
实施例3： 
称取银杏叶提取物100g，溶于10L75%的甲醇－水溶液，制得银杏叶提取物溶液，浓度为10mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用Click OEG，流动相采用含0.1%甲酸的甲醇为有机相，含0.1% 甲酸的水为水相，采用5%有机相等度方式洗脱。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为30℃，进样量为3000μL/针，流动相流速为120mL/min，收集22－25分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品。用60%的甲醇－水溶液溶解山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品，浓度为80mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为Click OEG，流动相选择含0.1%甲酸的甲醇为有机相，含0.1%甲酸的水为水相，采用15%有机相等度洗脱。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，质谱选择离子m/z为317和287，制备温度为25℃，进样量为200μL/针，流动相流速为90mL/min，收集m/z为287的馏分。旋转蒸发至干，得到山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷化合物，经液相色谱分析，纯度为70%，一维制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品中山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的含量为12%。 
实施例4： 
称取银杏叶提取物100g，溶于500mL55%的甲醇－水溶液，制得银杏叶提取物溶液，浓度为200mg/mL，过0.45μm微孔滤膜，进行一维液相色谱制备。一维液相色谱采用Click OEG，流动相采用含0.1%甲酸的甲醇为有机相，含0.1%甲酸的水为水相，采用梯度：有机相浓度由5%经50分钟提高到70%，采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，制备温度为25℃，进样量为2000μL/针，流动相流速为80mL/min，收集15－18分钟的馏分，进行旋转蒸发浓缩至干，为一维制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品。用50%的甲醇－水溶液溶解山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品，浓度为200mg/mL，经微孔滤膜过滤，进行二维液相色谱制备，色谱柱为Symmetry C8，流动相选择含0.1%甲酸的甲醇为有机相，含0.1%甲酸的水为水相，采用5%有机 相浓度洗脱。采用DAD紫外检测器360nm选择吸收波长，质谱选择离子m/z为317和287，制备温度为40℃，进样量为200μL/针，流动相流速为60mL/min，收集m/z为287的馏分，旋转蒸发至干，得到山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷化合物，经液相色谱分析，纯度为85%，一维制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品中山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的含量为20%。 
所属技术领域的技术人员应该悉知，本发明的技术方法不仅仅限于从银杏叶提取物中制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷，还可以应用于其它药材山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的提取。 
三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂作为应用时间久、疗效明确、使用安全的中药注射剂，有着广泛的应用，而本发明制得的山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷是三九牌舒血宁注射液、银杏叶酊剂中一种重要的原料。而本发明提供的制备方法，过程重复性高，可操作性好，同时银杏叶资源丰富，容易获取，适合大规模生产的要求，可用于舒血宁注射液、银杏叶酊剂原料山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的制备。 
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细工艺流程，单本发明并不局限于上述详细工艺流程，即不意味着本发明必须依赖上述详细工艺流程才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加，具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。 

Claims (7)

1.一种制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，其特征在于：步骤如下：
1）、从中药提取物中制备高纯度山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷；
2）、将中药提取物溶于甲醇－水溶液，制得中药提取物溶液；
3）、采用分离纯化技术从中药提取物中制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷。
2.根据权利要求1所述制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述中药提取物为银杏叶提取物，银杏叶提取物溶于25%－75%的甲醇－水溶液，制得银杏叶提取物溶液，银杏叶提取物浓度为10－1000mg/mL。
3.根据权利要求1所述制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述分离纯化技术为二维液相色谱－质谱联用进行银杏叶提取物制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷；
液相色谱进行一维制备的色谱柱为反相C18，反相C8，Click OEG。采用液相色谱进行二维制备的色谱柱为反相C18，反相C8，Click OEG；
一维液相色谱制备采用的流动相为有机相与水相混合，洗脱条件按照有机相5－65%等度或0－50分钟有机相由5%提高到70%梯度进行；有机相为甲醇或乙腈，水相为水；
对保留时间5－25分钟主成分为山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的组分进行收集，旋转蒸发至干，作为一维制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品；将一维制备山奈酚-3--2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷粗品用25%－75%的甲醇－水溶液溶解，至浓度为20－200mg/mL；
对一维收集浓缩后的样品，进行二维液相色谱制备。采用的流动相为有机相与水相混合，洗脱条件按照有机相5－15%等度或经0－30分钟有机相由5%提高到30%梯度进行，二维制备根据质谱选择离子指导组分收集；有机相为甲醇或乙腈，水相为水；
制备时流动相流速为60－120mL/min，制备时柱温为室温或25－40℃，制备时进样量为200－3000μL/针，检测器为DAD紫外检测器和质谱检测器；制备时流动相最佳流速为80－100mL/min，制备时柱温为室温，制备时进样量为2000－2500μL/针，紫外检测器为360nm；
二维液相色谱制备收集到的山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷馏分进行旋转蒸发浓缩至干，得到山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷化合物。
4.根据权利要求3所述制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述一维制备最佳流动相为乙腈与水，采用梯度方式，乙腈比例由10%经15－20分钟增加到15%－25%。
5.根据权利要求3所述制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述二维制备最佳流动相为乙腈与水，采用等度条件，乙腈浓度为8－15%，，二维制备质谱选择离子为m/z＝317和287，收集m/z=287的馏分。
6.根据权利要求3所述制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述最佳二维色谱柱组合为一维为反相C18，二维为反相C18。
7.根据权利要求3所述制备山奈酚-3-O-2”,6”-二鼠李糖基葡萄糖苷的方法，其特征在于：所述制备时流动相最佳流速为80－100mL/min，制备时柱温为室温，制备时进样量为2000－2500μL/针，紫外检测器为360nm。
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