CN107782798A - 一种应用双波长uplc检测芪参益气滴丸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种中药制剂的检测方法，特别涉及一种应用双波长UPLC对芪参益气滴丸进行检测的方法，所述方法步骤如下：步骤1：对照品溶液制备步骤2：供试品溶液制备步骤3：测定法分别取对照品溶液和供试品溶液各1‑6μL，分别注入液相色谱仪检测，记录190nm到400nm波长下色谱图，将每个波长下谱图积分的AIA文件导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，按均值法生成各波长下指纹图谱，步骤4：Sm、Pm及a值的计算按照公式1、2、3计算供试品双波长指纹信息的Sm、Pm及a值，得到单波长数据；再按照公式4‑6整合两个波长的数据，得到供试品整合后数据，和标准指纹图谱数据比较即可得知供试品的检测结果。

Description

一种应用双波长UPLC检测芪参益气滴丸的方法

技术领域：

本发明涉及一种中药制剂的检测方法，特别涉及一种应用双波长UPLC对芪参益气滴丸进行检测的方法

背景技术：

中药色谱指纹图谱是一种综合的、可量化的色谱鉴定手段。借以鉴别真伪，评价原料药材、半成品和成品质量均一性和稳定性。其基本属性是“整体性”和“模糊性”。其中，“整体性”是指把所测得的指纹谱图当成一个整体来进行各方面评价，并不是孤立地根据指纹图谱中单个峰的有无或高低来判断中药材或成药的质量；“模糊性”指单个个体的样本之间本来就存在有大大小小的差异，有些是很难精确测量的。可在很大程度上对中药的研制、加工工艺、运输贮存等过程中的化学成分的改变情况进行反映，再结合一定的药效以及临床上的观察，能够更加客观真实的反映中药材和中成药的质量，提高中药质量控制标准。

芪参益气滴丸由黄芪、丹参、三七和降香油组成的中药复方制剂。于2003年经中国国家食品药品监督管理局批准用于治疗冠心病、心绞痛，具有剂量小、服用方便、溶出速度快、可直接经粘膜吸收入血、生物利用度高、疗效高及无胃肠刺激、无明显毒副作用的特点。

现有技术中，对芪参益气滴丸的检测方法包括使用HPLC-UV及GC/MS方法，建立了芪参益气滴丸多维指纹图谱的相似度评价方法，该方法包括：

⑴样品制备：供试品2.5g使用10mL 70％甲醇水超声溶解，制备得到。色谱柱：Agilent SB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：A乙睛-B0.08％甲酸-水，洗脱程序：0-15min(5％-23％A)、15min-25min(23％-24％A)、25min-40min(24％-40％A)、40min-44min(40％-58％A)、44min-55min(58％-58％A)，洗脱55min。流速：0.5ml/min，柱温：25℃，检测波长254nm，进样量：10μL。

⑵.供试品2.5g，10％甲醇水超声40min,溶解，至室温，离心，取上清液5.0ml，使用填有0.5gYMC-C18填料的固相萃取小柱，使用10mL 10％氨水-10％甲醇水洗脱，弃去洗脱液，加5mL甲醇洗脱，收集洗脱液，蒸干，1mL 70％甲醇水复溶，离心，即得。色谱柱：AgilentSB-C18(250mm×4.6mm，5μm)，流动相：A乙睛-B0.02％甲酸-水，洗脱程序：0-20min(20％-33％A)、20min-25min(33％-35％A)、25min-35min(35％-43％A)、35min-55min(43％-80％A)、55min-65min(80％-90％A)，洗脱65min。流速：1.0ml/min，柱温：35℃，检测波长203nm，进样量：20μL。评价方法：将原始峰面积进行归一化，采用串行方式进行信息融合，利用夹角余弦测度计算相似度值，然后进行数据分析。

实验采用了两个不同的样品前处理方法，两个不同的色谱条件，较为复杂且洗脱时间长。且评价方法采用了夹角余弦测度法，此相似度计算方法对各个特征变量值的大小不敏感，只能完成定性评价，不能提供定量信息，同时计算方法受大峰影响严重，不能全面灵敏地反映中药的化学物质差异情况。

现有技术中也包括液相色谱-质谱联用方法，同时测定了芪参益气滴丸中的黄芪甲苷、丹参素、原儿茶醛、人参皂苷Rg1和Rb1，只是建立了这5个活性成分的含量测定方法，用于质量控制；龙辉等分别运用HPLC和UPLC分析方法，仅仅测定了芪参益气滴丸中丹参素的含量，分别建立并比较了这一活性成分的HPLC和UPLC含量测定方法，用于质量控制。但由于芪参益气滴丸化学成分种类较多且理化性质差异较大，仅对制剂中少数成分进行定量的方法评价制剂的质量，过于片面；单一波长指纹图谱对中药同时进行整体定性和定量分析的结果也具有很大片面性和随机性，很难完整表征其化学特征。

中药多维指纹图谱可以从不同分析角度完整的体现中药的化学成分，从而实现对中药的质量控制。因此建立芪参益气滴丸的多维指纹图谱，可较为直观、全面地反映制剂的整体质量。

本发明从多维紫外波长检测的角度出发即采用多波长检测方式，尽可能地使样品中重要药效物质在其最大吸收波长处得到较好的吸收，从多侧面获得主要药效物质的专属性信号，采用系统指纹定量法，以宏定性相似度Sm和宏定量相似度Pm等参量为评价指标，再利用均方开方法整合多波长指纹信息，既可兼顾突出大值也可综合小值，使得双波长下相同指纹峰及不同指纹峰处于同一体系被权衡，反应质量的整体性，较为全面的体现其质量信息，评价结果可信度增加。本发明评价方法如下：

1.本发明运用了超信息特征数字化评价系统，可多侧面、多角度、全方位挖掘指纹图谱信息，并结合计算机技术和化学计量学手段对大量信息进行提取、加工、精炼，用100个量化指标揭示指纹图谱的多维多息特征。

2.运用系统指纹定量法对中药系统指纹整体进行定性定量评价(通过Sm、Pm、α值表示)。3.利用了均方开方整合法，权衡各个指纹信息，具备兼顾突出大值和综合小值作用的特点，反应整体质量。

本发明针对中药制剂芪参益气滴丸，建立了UPLC双波长指纹图谱的评价方法，研究以系统指纹定量法的宏定性相似度Sm、宏定量相似度Pm为评价指标，采用均方开方法整合双波长下各样品的信息，并结合系统聚类分析，实现对制剂的整体质量评价。

发明内容：

本发明公开了一种芪参益气滴丸的检测方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1：对照品溶液制备

精密称取毛蕊异黄酮苷对照品1-10mg，置5-50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至100-1000μg/mL对照品储备液。进样前用甲醇分别稀释至10-100μg/mL；

步骤2：供试品溶液制备

取芪参益气滴丸1-10g，精密称定，加0-95％甲醇水溶液适量超声提取10-40min，定容到10mL量瓶中摇匀，作为供试液。进样前过0.1-0.45μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试液；

步骤3：测定法

分别取对照品溶液和供试品溶液各2-8μL，分别注入液相色谱仪检测，记录190nm到400nm波长下色谱图，将每个波长下谱图积分的AIA文件导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，按均值法生成各波长下指纹图谱。

步骤4：Sm、Pm及a值的计算

按照公式1、2、3计算供试品双波长指纹信息的Sm、Pm及a值，得到单波长数据；再按照公式4-6整合两个波长的数据，得到供试品整合后数据，和标准指纹图谱数据比较即可得知供试品的检测结果；

其中所述公式如下：

公式1

公式2

公式3

公式4

公式5

公式6

其中所述的液相色谱仪色谱条件如下：

色谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)，HSS-T3(100mm×2.1mm，1.8μm)、HSS-C18(100mm×2.1mm，1.8μm)、Phenomenex-C18(100mm×2.1mm，2.6μm)或BEH-shiled-RP18(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相{A为0.1-0.2％甲酸水，B为乙腈}或{A为0.1％-0.2％甲酸水，B为0.1％-0.2％甲酸乙腈}；梯度洗脱：(0～5.0min，99～87％A；5.0～7.0min，87％～83％A；7.0～10.0min，83％～80.5％A；10.0～15.0min，80.5％～77％A；15.0～18.0min，77％～76.5％A；18.0～24.0min，76.5％～45％A；24.0～28.0min，45％～30％A；28.0～30.0min，30％～5％A)；流速0.35-0.45mL/min；紫外检测波长：190nm至400nm全扫；柱温(30.0-35.0)℃；进样量3-5μL；洗脱20-40min。

优选的，本发明的检测方法，步骤如下：

步骤1：对照品溶液制备

精密称取毛蕊异黄酮苷对照品2-8mg，置10-30ml，量瓶中，用甲醇溶解并稀释至300-500μg/mL对照品储备液。进样前用甲醇分别稀释至30-50μg/mL；

步骤2：供试品溶液制备

取芪参益气滴丸3-5g，精密称定，加25-75％，甲醇水溶液适量超声提取30min，定容到10mL量瓶中摇匀，作为供试液。进样前过0.22μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试液；

步骤3：测定法

分别取对照品溶液和供试品溶液各5μL，分别注入液相色谱仪检测，记录203-254nm波长下色谱图，将每个波长下谱图积分的AIA文件导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，按均值法生成各波长下对照指纹图谱。

所述的液相色谱仪色谱条件如下：

色谱柱HSS-T3(100mm×2.1mm，1.8μm)或BEH-shiled-RP18(100mm×2.1mm，1.7μm；流动相{A为0.2％甲酸水，B为乙腈}或{A为0.1％甲酸水，B为0.1％甲酸乙腈}；梯度洗脱：(0～5.0min，99～87％A；5.0～7.0min，87％～83％A；7.0～10.0min，83％～80.5％A；10.0～15.0min，80.5％～77％A；15.0～18.0min，77％～76.5％A；18.0～24.0min，76.5％～45％A；24.0～28.0min，45％～30％A；28.0～30.0min，30％～5％A)；流速0.4mL/min；紫外检测波长：203-254nm；柱温30.0℃；进样量5μL；洗脱30min；

步骤4：评价芪参益气滴丸质量

按照公式1、2、3计算供试品双波长指纹信息的Sm、Pm及a值，得到单波长数据；再按照公式4-6整合两个波长的数据，得到供试品整合后数据，和标准指纹图谱数据比较即可得知供试品的检测结果；

最优选的，本发明的检测方法，步骤如下

步骤1：对照品溶液制备

精密称取毛蕊异黄酮苷对照品5mg，置10ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至300-500μg/mL对照品储备液，进样前用甲醇分别稀释至30-50μg/mL；

步骤2：供试品溶液制备

取芪参益气滴丸2.5g，精密称定，加50％甲醇水溶液适量超声提取30min，定容到10mL量瓶中摇匀，作为供试液；进样前过0.22μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试液；

步骤3：测定法

分别取对照品溶液和供试品溶液各5μL，分别注入液相色谱仪检测，记录203-254nm波长下色谱图，将每个波长下谱图积分的AIA文件导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，按均值法生成各波长下对照指纹图谱，

所述的液相色谱仪色谱条件如下：

色谱柱ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)；流动相{A为0.2％甲酸水，B为乙腈}或{A为0.1％甲酸水，B为0.1％甲酸乙腈}；梯度洗脱：(0～5.0min，99～87％A；5.0～7.0min，87％～83％A；7.0～10.0min，83％～80.5％A；10.0～15.0min，80.5％～77％A；15.0～18.0min，77％～76.5％A；18.0～24.0min，76.5％～45％A；24.0～28.0min，45％～30％A；28.0～30.0min，30％～5％A)；流速0.4mL/min；紫外检测波长：优选203-254nm；柱温30.0℃；进样量5μ)；洗脱30min。

步骤4：评价芪参益气滴丸质量

按照公式1、2、3计算供试品双波长指纹信息的Sm、Pm及a值，得到单波长数据；再按照公式4-6整合两个波长的数据，得到供试品整合后数据，和标准指纹图谱数据比较即可得知供试品的检测结果；

上述方法中:

Sm：宏定性相似度 双定性相似度(SF与SF')的均值

SF：定性相似度 定性描述化学成分数量和分布比例,大峰掩蔽小峰

SF'：比率定性相似度 定性等权描述化学成分数量和比例,大、小峰等权

Pm：宏定量相似度 双定量相似度(C与P)的均值

C：投影含量相似度 定量描述总化学成分宏观含量,大峰掩蔽小峰

P：定量相似度 定量描述总化学成分宏观含量,大、小峰等权

α：指纹均化性变动系数 样品均化系数相对偏差

γ：指纹信号均化系数

x,y表示横纵坐标轴；i是数学表达式的符号；m只是一个符号，是S、P和α的下标；

n：在本发明中n＝2

以下为本发明名词术语释义：

多维指纹图谱——采用多种分析仪器联用的模式来建立指纹图谱。

系统指纹定量法——(Systematic quantified fingerprint method，SQFM)是用Sm、Pm和α相结合来鉴定中药质量的方法，是在对指纹系统宏观定性分析合格基础上，直接对系统指纹进行整体定量分析，是对系统的宏观量化评价，具有实用性和可操作性系统聚类分析——将样品或变量按照它们在性质上的亲疏程度进行分类的多元统计分析方法，即：开始每个对象自成一类，然后每次将最相似的两类合并，合并后重新计算新类与其他类的距离或相近性测度。

中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0——研究中药数字化指纹图谱最佳的技术工具，将实验的数据信号首先进行积分处理后直接调入该软件中,能按峰号自动匹配或按域值自动匹配(1s内完成),输入检测波长和表观进样量可即刻获得中药数字化色谱指纹图谱的114个参数的计算结果。这些参数能提供十分详细的中药质量变异信息,为理想地控制中药质量提供了重要的信息判定依据。

AIA——Analytical Instrument Association的缩写，一种文件格式。

本发明优选的实验方法、色谱条件和溶剂提取方法，是经过筛选得到的，筛选过程如下：1.仪器与试药

ACQUITY UPLC(美国Waters公司，包括二元高压梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、PDA检测器、Empower 3色谱工作站；Mettler Toledo Xs105分析天平(瑞士，Mettler Toledo公司)；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水系统(美国，Millipore公司)；甲醇(色谱纯，美国Merk公司)；乙腈(色谱纯，美国Merk公司)；甲酸(色谱纯，瑞士Fluke公司)；水为去离子水。原儿茶醛(纯度97.9％，批号：200619)、毛蕊异黄酮苷(纯度97.9％，批号：200619)、芒柄花素(纯度97.9％，批号：200619)对照品均购自中国食品药品检定研究院，丹酚酸D对照品(纯度98.7％，批号：BP002S，天津一方科技有限公司)，反式-橙花叔醇对照品(纯度≥85％，批号Lot#BCBP532TV，德国Sigma公司)和人参皂苷Rb1对照品(纯度：92.6％，批号：200921，中国药品生物制品检定所)；49批芪参益气滴丸制剂(天津天士力制药股份有限公司，规格：0.5g/袋)，批号：121207，121209，121210，130103，130107，130111，130203，130206，130409，130412，130609，130705，130707，130810，130911，131206，140105，140206，140207，140306，140307，140401，140403，140507，140509，140609，140612，140706，140715，140909，141002，141206，150102，150106，150110，150111，150208，150212，150315，150317，150401，150501，150505，150603，150605，150703，150805，151124，151221。

2.方法

2.1对照品溶液制备

精密称取原儿茶醛对照品5mg，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀得500μg/mL对照品储备液，同法分别配制500μg/mL毛蕊异黄酮苷、丹酚酸D、芒柄花素、反式-橙花叔醇及人参皂苷Rb1对照品储备液。进样前用甲醇分别稀释至50μg/mL。

2.2供试液制备

取芪参益气滴丸2.5g，精密称定，加50％甲醇水溶液适量超声提取30min，以50％甲醇水溶液定容到10mL量瓶中摇匀，作为供试液。进样前过0.22μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试液。

2.3色谱条件

ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)；流动相A为0.1％甲酸水，B为0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱(0～5.0min，99～87％A；5.0～7.0min，87％～83％A；7.0～10.0min，83％～80.5％A；10.0～15.0min，80.5％～77％A；15.0～18.0min，77％～76.5％A；18.0～24.0min，76.5％～45％A；24.0～28.0min，45％～30％A；28.0～30.0min，30％～5％A)；流速0.4mL/min；紫外检测波长：190nm至400nm全扫；柱温(30.0±0.15)℃；进样量5μL；洗脱30min。

3.结果与讨论

3.1色谱条件优化

采用色谱指纹图谱指数F(chromatographic fingerprints index，F)作为优化指标，F反映指纹信号大小和信号均化程度及分离效率的高低，以F越大越好。本试验考察了不同提取溶剂、不同提取时间、不同色谱柱以及不同流动相下的样品色谱图，计算并比较各条件下F值，见图1。根据F值并结合谱图分离情况确定色谱条件见“2.3项”，这一结果与图谱直观比较结果一致。

图1的表格数据如下

3.2检测波长的选择

芪参益气滴丸主要含黄酮类、黄酮苷类、酚酸类及皂苷类等化学成分，其中黄酮类、黄酮苷类及酚酸类化合物在200-300nm处紫外吸收较强，皂苷类化合物在203nm处存在紫外吸收，因此为了尽可能表达该制剂化学指纹的整体信息，试验利用PDA记录了190-400nm指纹信号，选择了两个检测波长203和254nm分别建立指纹图谱，避免了单一波长下某些组分信号的丢失，最大限度丰富指纹信息。

3.3系统适用性试验

分别精密吸取各对照品溶液5μL和供试液5μL进样并记录谱图，见图2。对比保留时间确定了原儿茶醛、毛蕊异黄酮苷、丹酚酸D、芒柄花素、反式-橙花叔醇及人参皂苷Rb1的峰位。因毛蕊异黄酮苷响应值较大且与相邻峰分离较好，故选作参照峰，其理论板数不低于200000。考察正常检测条件下2h空针图中未见溶剂峰，2h供试液色谱图组分30min内出峰完全，确定洗脱时间30min。

3.4精密度试验

精密吸取S1样品供试液5μL，连续进样6次，记录色谱图。以毛蕊异黄酮苷的保留时间和峰面积为参照，计算各波长下各共有峰相对保留时间RSD均<1.0％，相对峰面积RSD均<3.0％，表明检测系统进样精密度合格。

3.5稳定性试验

取S1样品，新制备供试液，分别于0、2、4、8、12、24h进样分析，记录色谱图，以毛蕊异黄酮苷的保留时间和峰面积为参照，计算各波长下各共有峰相对保留时间RSD均<1.0％，相对峰面积RSD均<3.0％，表明样品在24h内稳定。

3.6重复性试验

取S1样品平行制备6份供试液并进样检测，记录色谱图。以毛蕊异黄酮苷的保留时间和峰面积为参照，计算各波长下各共有峰相对保留时间RSD均<1.0％，相对峰面积RSD均<3.0％，表明方法重复性良好。

3.7双波长芪参益气滴丸指纹图谱建立

将49批芪参益气滴丸供试液分别进样检测，记录203nm和254nm波长下色谱图，在双波长下均以毛蕊异黄酮苷为参照峰，按峰出现率100％计，确定各检测波长下的共有指纹峰：30个共有峰(254nm)和36个共有峰(203nm)。将每个波长下49个谱图积分的AIA文件导入孙国祥等开发的“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，按均值法生成各波长下对照指纹图谱(RFP)见图3。

3.8系统指纹定量法评价芪参益气滴丸质量

系统指纹定量法(Systematic quantified fingerprint method，SQFM)是在对指纹图谱宏观定性分析合格基础上，直接对系统指纹进行整体定量分析，是对中药指纹系统的宏观量化评价。试验采用SQFM对芪参益气滴丸进行质量评价，把芪参益气滴丸-UPLC指纹整体看作一个系统，宏定性相似度Sm见式(1)，可整体监测芪参益气滴丸的化学指纹数量和含量分布比例情况；宏定量相似度Pm见式(2)，可整体监测芪参益气滴丸化学指纹整体含量情况；样品均化变异系数a见式(3)，用于限定芪参益气滴丸-UPLC指纹比例变异范围，质量等级划分标准见表1。试验以“3.7项”下的RFP为标准，计算各波长指纹信息的Sm、Pm及a，得到单波长评价数据，结果见表2(254nm、203nm)。采用均方开方整合法，按照公式(4-6)整合双波长下49批芪参益气滴丸s的单波长评价数据，得到整合后数据，结果见表2(均方开方整合数据)。运用SPSS 19.0软件，以Sm、Pm为指标，分别对单波长评价数据及整合后数据进行系统聚类分析(Hierarchical cluster analysis，HCA)，采用组间平均链锁法(Between-groups linkage),利用欧式距离平方(Squared Euclidean distance)为测度，分类结果见图4。

表1系统指纹定量法划分质量限度

3.8.1结果

(1)254nm波长评价结果：SQFM数据显示80％的样品质量在5级以上；聚类分析将49批样品分为5类。S18(Pm为165.9％)质量为劣，为第5类；第4类(S6、S13、S14、S27、S29、S31、S35、S38、S41)在SQFM评价中Pm均偏低(57.4％-73.6％)，S13、S31为5级，其他为6级，质量一般；大多数样品Sm大于0.8，为第3类，质量在4级以上，表明聚类分析与SQFM评价结果具有一致性。

(2)203nm波长评价结果：SQFM数据显示70％的样品质量在5级以上；聚类分析将49批样品分为5类。S28的Sm(0.703)、Pm(47.2％)均偏低，质量为劣，为第5类；第4类Sm均大于0.8，Pm在80％-110％之间，质量在4级以上；而第2类(S5为6级、S18为6级、S42为5级)由于其Pm均偏高被视为同一类，质量一般。聚类分析与SQFM评价结果对第2类样品的评价有差异，其他样品具有一致性。

(3)均方开方整合结果：SQFM数据显示83％的样品质量在5级以上；聚类分析将49批样品分为5类。S28的Sm(0.688)、Pm(73.7％)均偏低，质量一般，为第5类；第3类包含大多数样品，其Sm均大于0.8，质量在4级以上；而第2类(S5为5级、S18为7级)由于其Pm均偏高被视为同一类。聚类分析与SQFM评价结果对第2、5类样品的评价有差异，其他样品具有一致性。

(4)两波长评价结果相比，由于皂苷类及反式橙花叔醇等成分在203nm波长下存在响应，按均值法得到对照指纹图谱，各个成分的权重不同致使两个波长的评价结果存在差异，因此单一波长的评价方法并不能全面的评估其质量信息，需要从多维全信息的角度对其质量进行控制。整合后评价结果与单波长评价相比，样品合格率增加，各批次样品质量等级在双波长的基础上趋于均值。以Sm、Pm为指标进行聚类分析，多数样品评价结果与SQFM一致，但由于个别批次Pm差别略大，致使S18、S28分类有异，表明批次间含量存在差异，需要权衡各个成分信息进行质量控制。按照均方开方整合法重新整合各波长信息，既可兼顾突出大值也可综合小值，使得双波长下相同指纹峰及不同指纹峰处于同一体系被权衡，反映质量的整体性，较为全面的体现其质量信息，评价结果可信度增加。

本发明以色谱指纹图谱指数F作为优化指标，对提取溶剂、提取时间、色谱柱及流动相等色谱条件进行优化，选择毛蕊异黄酮苷为参照峰，确定双波长下的共有指纹峰：30个共有指纹峰(254nm)及36个共有指纹峰(203nm)，建立了芪参益气滴丸-UPLC双波长指纹图谱，用“中药色谱指纹图谱超信息特征化评价系统4.0”软件对指纹图谱进行处理，以Sm，Pm及a为评价指标，用系统指纹定量法对49批芪参益气滴丸的指纹峰进行评价，结合均方开方整合法，权衡各个指纹信息，并采用系统聚类分析，客观清晰地判定其质量等级及分类，有效地鉴定其整体质量。分析表明，254nm和203nm波长下各批次样品的信号数量和强度的响应存在差异，对于成分复杂的中药复方制剂，单一的评价方法不能全面的评估其质量，需要从多维全信息的角度对其质量进行评价。本试验所建立的双波长UPLC指纹图谱的评价方法，可更加直观、全面的反映指纹信息，尤其适用于成分复杂的中药制剂，可为芪参益气滴丸质量控制提供全新的参考。

本发明的有益效果

1、本发明根据成分的性质，选择双波长进行分析，样品处理操作简单，且使用UPLC法30min内完成分析，时间较短，精密度、重复性较好。

2、采用孙国祥等开发的“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，可获得重要的数字化信息，用于指纹信息分析。

将实验的数据信号首先进行积分处理后直接调入该软件中,能按峰号自动匹配或按域值自动匹配(1s内完成),输入检测波长和表观进样量可即刻获得中药数字化色谱指纹图谱的114个参数的计算结果。其中，包括色谱指纹图谱15个定性相似度和17个定量相似度判据参数。本发明运用了定性相似度SF、比率定性相似度S’F、定量相似度P及投影含量相似度C四个参数，此外，SF与S’F的均值为宏定性相似度Sm(用其整体监测化学指纹数量和分布比例)，C与P的均值为宏定量相似度Pm(其能够整体监测化学指纹整体含量)，本发明以Sm、Pm及α(样品均化变异系数)为指标进行质量评价。

3、本发明采用了系统指纹定量法，以宏定性相似度Sm和宏定量相似度Pm等参量为评价指标，再利用均方开方法整合多波长指纹信息，既可兼顾突出大值也可综合小值，使得双波长下相同指纹峰及不同指纹峰处于同一体系被权衡，反应质量的整体性，较为全面的体现其质量信息，同时结合了系统聚类分析，使得评价结果可信度高。

附图说明：

图1不同条件下芪参益气滴丸UPLC指纹图谱的F值

图2芪参益气滴丸与原儿茶醛、毛蕊异黄酮苷、丹酚酸D、芒柄花素、反式-橙花叔醇及人参皂苷Rb1对照品溶液的UPLC图谱

图3双波长下49批芪参益气滴丸UPLC指纹图谱和对照指纹谱

图4 49批芪参益气滴丸的系统聚类分析图

具体实施方式：

以下通过实施例进一步说明本发明。

实施例1

步骤1：对照品溶液制备

精密称取毛蕊异黄酮苷对照品5mg，置10mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀得500μg/mL对照品储备液。进样前用甲醇分别稀释至50μg/mL。

步骤2：供试品溶液制备

取芪参益气滴丸2.5g，精密称定，加50％甲醇水溶液适量超声提取30min，以50％甲醇水溶液定容到10mL量瓶中摇匀，作为供试液。进样前过0.22μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试液。

步骤3：测定法

分别取对照品溶液和供试品溶液各5μL，分别注入液相色谱仪检测，记录203nm和254nm波长下色谱图，将每个波长下谱图积分的AIA文件导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，按均值法生成各波长下对照指纹图谱。

所述的液相色谱仪色谱条件如下：

ACQUITY UPLC HSS T3(100mm×2.1mm，1.8μm)；流动相A为0.1％甲酸水，B为0.1％甲酸乙腈；梯度洗脱(0～5.0min，99～87％A；5.0～7.0min，87％～83％A；7.0～10.0min，83％～80.5％A；10.0～15.0min，80.5％～77％A；15.0～18.0min，77％～76.5％A；18.0～24.0min，76.5％～45％A；24.0～28.0min，45％～30％A；28.0～30.0min，30％～5％A)；流速0.4mL/min；紫外检测波长：190nm至400nm全扫；柱温(30.0±0.15)℃；进样量5μL；洗脱30min。

步骤4：评价芪参益气滴丸质量

采用系统指纹定量法对芪参益气滴丸进行质量评价。即：对得到的Sm、Pm及α数据进行分析。

将49批芪参益气滴丸供试液分别进样检测，记录203nm和254nm波长下色谱图，在双波长下均以毛蕊异黄酮苷为参照峰，按峰出现率100％计，确定各检测波长下的共有指纹峰：30个共有峰(254nm)和36个共有峰(203nm)。将每个波长下49个谱图积分的AIA文件导入孙国祥等开发的“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，按均值法生成各波长下对照指纹图谱(RFP)。

实施例2

一种芪参益气滴丸的检测方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1：对照品溶液制备

精密称取毛蕊异黄酮苷对照品1mg，置5ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至100μg/mL对照品储备液。进样前用甲醇分别稀释至10μg/mL；

步骤2：供试品溶液制备

取芪参益气滴丸1g，精密称定，加甲醇适量超声提取10min，定容到10mL量瓶中摇匀，作为供试液，进样前过0.1μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试液；

步骤3：测定法

分别取对照品溶液和供试品溶液各8μL，分别注入液相色谱仪检测，记录190nm到400nm波长下色谱图，以毛蕊异黄酮苷为参照峰，按峰出现率100％计，确定共有峰。将每个波长下谱图积分的AIA文件导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，按均值法生成各波长下指纹图谱。

步骤4：Sm、Pm及a值的计算

按照公式1、2、3计算供试品双波长指纹信息的Sm、Pm及a值，得到单波长数据；再按照公式4-6整合两个波长的数据，得到供试品整合后数据，和标准指纹图谱数据比较即可得知供试品的检测结果。以对照指纹图谱为标准，按照公式1、2、3计算供试品双波长指纹信息的Sm、Pm及a值，得到单波长数据；再按照公式4-6整合两个波长的数据，得到供试品整合后数据，以Sm、Pm及a为指标参照质量划分限度即可得知供试品的检测结果。

实施例3

一种芪参益气滴丸的检测方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1：对照品溶液制备

精密称取毛蕊异黄酮苷对照品10mg，置50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至1000μg/mL对照品储备液。进样前用甲醇分别稀释至100μg/mL；

步骤2：供试品溶液制备

取芪参益气滴丸5g，精密称定，加95％甲醇水溶液适量超声提取40min，定容到10mL量瓶中摇匀，作为供试液，进样前过0.45μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试液；

步骤3：测定法

分别取对照品溶液和供试品溶液各2μL，分别注入液相色谱仪检测，记录190nm到400nm波长下色谱图，将每个波长下谱图积分的AIA文件导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，按均值法生成各波长下指纹图谱，

步骤4：Sm、Pm及a值的计算

按照公式1、2、3计算供试品双波长指纹信息的Sm、Pm及a值，得到单波长数据；再按照公式4-6整合两个波长的数据，得到供试品整合后数据，和标准指纹图谱数据比较即可得知供试品的检测结果；

实施例4

步骤同实施例1，但其中所述对照品溶液用甲醇水溶液溶解并稀释至300μg/mL,进样前再进一步稀释至30μg/mL。其中甲醇水溶液的浓度为25％。

实施例5

步骤同实施例1，但其中所述对照品溶液用甲醇水溶液溶解并稀释至500μg/mL,进样前再进一步稀释至50μg/mL。其中甲醇水溶液的浓度为75％。

实施例6

步骤同实施例1，其中的微孔滤膜为0.22μm。

实施例7

步骤同实施例1，其中超声提取30min。

实施例8

步骤同实施例1，其中色谱柱选择HSS-T3(100mm×2.1mm，1.8μm)或BEH-shiled-RP18(100mm×2.1mm，1.7μm)。

实施例9

步骤同实施例1，其中流动相A为0.2％甲酸水，B为乙腈，或A为0.1％甲酸水，B为0.1％甲酸乙腈。

实施例10

步骤同实施例1，其中紫外检测波长的范围为203-254nm。

Claims (10)

1.一种芪参益气滴丸的检测方法，所述方法包括如下步骤：

步骤1：对照品溶液制备

精密称取毛蕊异黄酮苷对照品1-10mg，置5-50ml量瓶中，用甲醇溶解并稀释至100-1000μg/mL对照品储备液，进样前用甲醇分别稀释至10-100μg/mL；

步骤2：供试品溶液制备

取芪参益气滴丸1-10g，精密称定，加0-95％甲醇水溶液适量超声提取10-40min，定容到10mL量瓶中摇匀，作为供试液，进样前过0.1-0.45μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液作为供试液；

步骤3：测定法

分别取对照品溶液和供试品溶液各2-8μL，分别注入液相色谱仪检测，记录190nm到400nm波长下色谱图，将每个波长下谱图积分的AIA文件导入“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，按均值法生成各波长下指纹图谱；

步骤4：Sm、Pm及a值的计算

按照公式1、2、3计算供试品双波长指纹信息的Sm、Pm及a值，得到单波长数据；再按照公式4-6整合两个波长的数据，得到供试品整合后数据，和标准指纹图谱数据比较即可得知供试品的检测结果；

其中，所述的液相色谱仪色谱条件如下：

色谱柱选择HSS-T3(100mm×2.1mm，1.8μm)、HSS-C18(100mm×2.1mm，1.8μm)、Phenomenex-C18(100mm×2.1mm，2.6μm)或BEH-shiled-RP18(100mm×2.1mm，1.7μm)；流动相A为0.1-0.2％甲酸水，B为乙腈或A为0.1％-0.2％甲酸水，B为0.1％-0.2％甲酸乙腈；流速0.35-0.45mL/min；紫外检测波长：190nm至400nm全扫；柱温30.0-35.0℃；洗脱20-40min；

其中，梯度洗脱方法为：

0～5min，99→87％A；

5.0～7.0min，87％→83％A；

7.0～10.0min，83％→80.5％A；

10.0～15.0min，80.5％→77％A；

15.0～18.0min，77％→76.5％A；

18.0～24.0min，76.5％→45％A；

24.0～28.0min，45％→30％A；

28.0～30.0min，30％→5％A；

其中公式如下：

公式1

公式2

公式3

公式4

公式5

公式6

2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述对照品溶液用甲醇溶解并稀释至300-500μg/mL,进样前再进一步稀释至30-50μg/mL。

3.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述甲醇水溶液的浓度为25-75％。

4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述微孔滤膜为0.22μm。

5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述超声提取30min。

6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述色谱柱选择HSS-T3(100mm×2.1mm，1.8μm)或BEH-shiled-RP18(100mm×2.1mm，1.7μm)。

7.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述流动相A为0.2％甲酸水，B为乙腈，或A为0.1％甲酸水，B为0.1％甲酸乙腈。

8.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述紫外检测波长的范围为203-254nm。

9.一种双波长芪参益气滴丸指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤如下：

将多批芪参益气滴丸供试液分别进样检测，记录203nm和254nm波长下色谱图，在双波长下均以毛蕊异黄酮苷为参照峰，按峰出现率100％计，确定各检测波长下的共有指纹峰：将每个波长下谱图积分的AIA文件导入孙国祥等开发的“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，按均值法生成各波长下对照指纹图谱(RFP)。

10.一种双波长芪参益气滴丸指纹图谱的建立方法，其特征在于，步骤如下：

将49批芪参益气滴丸供试液分别进样检测，记录203nm和254nm波长下色谱图，在双波长下均以毛蕊异黄酮苷为参照峰，按峰出现率100％计，确定各检测波长下的共有指纹峰：30个共有峰(254nm)和36个共有峰(203nm)，将每个波长下49个谱图积分的AIA文件导入孙国祥等开发的“中药色谱指纹图谱超信息特征数字化评价系统4.0”软件，按均值法生成各波长下对照指纹图谱(RFP)。