CN102397522A - 一种新生化颗粒的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新生化颗粒的制备方法,包括下列步骤:取当归、川芎、桃仁、甘草(炙)、干姜(炭)、红花6味药材,粉碎,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,得超临界萃取物,备用;取益母草,粉碎,加入盐酸水溶液1.5L,投入微波萃取装置中进行微波萃取,合并萃取液,滤过,浓缩,通过大孔吸附树脂柱吸附,用乙醇洗脱,收集洗脱液,减压回收乙醇并浓缩、干燥,得益母草提取物,备用;将上述超临界萃取物、益母草提取物与质量百分比为1:1的红糖-淀粉混合物混合,制成颗粒。采用本发明制备的新生化颗粒便于服用。本发明还涉及新生化颗粒在制备治疗乳腺增生药物的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种药物的制备方法,尤其是一种中药的制备方法。
背景技术
新生化颗粒是由益母草、当归、桃仁、川芎和红花等7味药组成,收载于《部颁标准》中药成方制剂第5册,能活血、祛瘀、止痛。用于产后恶露不行,少腹疼痛,也可试用于上节育后引起的阴道流血,月经过多。
现有技术中,尚未有新生化颗粒在治疗乳腺增生方面的报道。
现代研究表明,新生化颗粒具有温和的收缩子宫作用;具有明显的止血作用;具有良好的抗炎作用,可明显减轻子宫内炎症;具有良好的镇痛作用。
现有技术中,新生化颗粒的制备采用水煎煮的方法,工艺粗糙、落后,杂质多,导致患者日用量过大,不方便服用,严重影响了本品在临床上应用。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种新生化颗粒的制备方法,使其安全有效,方便服用。
本发明所要解决的另一个问题是提供新生化颗粒在制备治疗乳腺增生药物方面的应用。
为了解决上述技术问题,本发明提出了下述技术方案。
取当归240g、川芎90g、桃仁24g、甘草(炙)15g、干姜(炭)15g、红花15g ,粉碎,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为1%,萃取压力15-25MPa,温度30-50℃, CO2流量1-3ml/g生药·min,萃取时间120-150min,得超临界萃取物,备用;取益母草300g,粉碎,加入pH值为3-4的盐酸水溶液1.5L,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率300-600W,萃取2次,每次3-8分钟,合并萃取液,滤过,浓缩,通过大孔吸附树脂柱吸附,用浓度为60-80%乙醇洗脱,收集3-8倍量柱体积的洗脱液,减压回收乙醇并浓缩、干燥,得益母草提取物,备用;将上述超临界萃取物、益母草提取物与质量百分比为1:1的红糖-淀粉混合物混合混合,制成颗粒156g。
所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa,温度40℃, CO2流量2ml/g生药·min,萃取时间130min。
所述微波萃取功率500W,每次萃取6分钟。
所述大孔吸附树脂选自D101型、D102型、AB-8型大孔吸附树脂中的一种。
所述大孔吸附树脂柱洗脱用乙醇的浓度为70%,收集量为5倍量柱体积。
现有技术中,新生化颗粒每次需服用12g(相当于18g药材),而采用本发明制备而成的新生化颗粒每次仅需服用4g(相当于18g药材),在具有相似药理活性的情况下大大减少了服用量。此结论可以通过下述试验证明。
试验一 不同方法制备的新生化颗粒中阿魏酸含量的比较。
1、仪器及试药
新生化颗粒(超临界法,以下简称X-LJ,下同):按实施例3方法制备。
新生化颗粒(传统法X-CT,下同),按《部颁标准》中药成方制剂第5册方法制备,即当归240g、川芎90g、桃仁24g、甘草(炙)15g、干姜(炭)15g、益母草300g 、红花15g,以上七味,粉碎成粗粉提取挥发油。蒸镏后的水溶液另器收集。药渣再加水煎煮二次,第一次 2小时,第二次 1.5小时,合并煎液,滤过,滤液与上述溶液合并,浓缩成稠膏,加入红糖适量,混匀,制成颗粒;于60℃烘干,粉碎,用乙醇制成颗粒,喷入挥发油,即得。
Agilent 1200高效液相色谱仪;METTLER AE240电子分析天平。
阿魏酸对照品(中国药品生物制品检定所)。
2、方法
色谱条件 Kromasi C18色谱柱(4.6mm×200mm,5μm);甲醇-0.5%磷酸溶液(50∶50)流动相;流速1.0mL·min-1,检测波长320nm,柱温25℃。精密量取对照品溶液、供试品溶液各10μL。
溶液的制备 取阿魏酸对照品适量,置棕色量瓶中,加甲醇制成每1mL含5μg的对照品溶液;分别取供品约2g,研细,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,称定质量,超声处理60min,放冷,再称定质量,用甲醇补足减失的质量,摇匀,滤过,取上清液即得供试品溶液。
3、结果
试验结果见表1,结果表明采用本发明制备的新生化颗粒中阿魏酸的含量(0.378mg/g )是采用传统法(0.113 mg/g)的3.3倍。
表1 不同方法制备的新生化颗粒中阿魏酸含量
样品 | 含量(mg/g) |
X-LJ | 0.378 |
X-CT | 0.113 |
试验二 不同方法制备的新生化颗粒药效学比较。
1、 试验材料。
1.1 动物
昆明种小鼠,雌性;SD大鼠,雌性;由上海斯莱克实验动物有限公司提供。
1.2 药品
新生化颗粒(超临界法,以下简称X-LJ):按实施例3方法制备。
新生化颗粒(传统法,简称X-CT),按《部颁标准》中药成方制剂第5册方法制备。
己烯雌酚注射液,广州明兴制药厂生产;己烯雌酚片,广东彼迪药业有限公司生产;酚磺乙胺注射液,太原卫星制药厂生产;阿司匹林片,湖南南光药业有限公司生产;缩宫素,上海第一生化药业有限公司生产。枸橼酸他莫昔芬,苏州第壹制药有限公司;苯甲酸雌二醇(E2),浙江仙琚制药股份有限公司;雌二醇放射免疫分析药盒,北京北方技术研究所。
1.3 仪器
十六导生理参数分析记录仪,天津。GC-1500γ放射免疫计数器,科大。
1.4 数据及统计
数据以mean±s表示,用SPSS11.0软件进行分析。用单因素方差分析进行统计学显著性分析。
2、方法及结果。
2.1 对未孕大鼠子宫平清肌收缩的影响。
雌性未孕SD大鼠,体重150-200g,实验前皮下注射已烯雌酚注射液0.2mg·100g-1·d-1,连续2d。颈椎脱臼处死大鼠,剖腹,找出子宫轻剥离,在子宫二角相连处下端剪断取出子宫,置于盛有台氏液的培养皿中。仔细剪除附着在子宫上的结缔组织和脂肪组织,剪取其中一段约1cm,在其两端各用两细线结扎,一端固定在盛有20ml台氏液的浴槽底部,另一端与换能器相连,并通过十六导生理参数分析记录仪记录子宫收缩活动。恒温(37±0.5℃),通以混合气体,静止张力1g。平衡lh后开始试验。按累积浓度法每次向浴槽内加人0.1mL受试药。实验分营养液对照组;阳性药对照组,包括缩宫素(3.0mU·mL-1)组,X-CT组(0.311×10-3g·mL-1,相当于人临床剂量的1/500);供试组,X-LJ低、中、高剂量组(0.052×10-3g·mL-1、0.104×10-3g·mL-1、1.04×10-3g·mL-1,分别相当于人临床剂量的1/1000、1/500、1/50)。记录给药前和给药后15min子宫收缩振幅(波型最高点与最低点之间距离)、频率(每10min收缩次数)及活力(振幅×频率),求出各指标变化百分率{[(给药后值一给药前值)/给药前值] ×100%}。
结果(见表2)表明,各给药组均可显著增加未孕大鼠离体子宫平滑肌收缩振幅、频率和活力的变化百分率,与营养液对照组比较p<0.01。X-LJ中剂量组与X-CT组相比未见显著性差异(p>0.05),表明在相应的剂量下(均相当于人临床剂量的1/500),两者生物活性相似。
表2 不同制备方法的新生化颗粒对未孕大鼠子宫平清肌收缩的影响(n=8)
组别 | 剂量 | 振幅变化百分率(%) | 频率变化百分率(%) | 活力变化百分率(%) |
营养液对照组 | - | 14.8±13.7 | 1.3±1.1 | 3.3±3.0 |
缩宫素 | 3.0mU·mL-1 | 55.3±43.2** | 70.6±63.2** | 100.4±89.7** |
X-CT | 0.311×10-3 | 32.7±22.3** | 22.3±17.4** | 44.4±40.3** |
X-LJ低剂量 | 0.052×10-3 | 30.7±24.6** | 19.7±13.3** | 39.7±36.5** |
X-LJ中剂量 | 0.104×10-3 | 34.6±27.7** | 23.6±16.8** | 43.8±38.8** |
X-LJ高剂量 | 1.04×10-3 | 35.5±28.0** | 27.5±18.2** | 43.2±41.0** |
注:与营养液对照组相比,** p<0.01。
2.2 对小鼠断尾出血时间的影响。
取雌性昆明小鼠,体重18-22g,随机分成5组,每组12只。溶剂对照组,X-CT组(3.8g·Kg-1,相当于人临床剂量,即日服36g生药), X-LJ低、中、高剂量(0.6g·Kg-1、1.3g·Kg-1、2.6g·Kg-1,其中中剂量组相当于人临床剂量,即日服36g生药)。口服给药,溶剂对照组给予相应溶剂,每天1次,连续7天。于末次给药后30min,以利剪将小鼠尾尖0.5cm横断,血液自行流出后开始计时,每隔10s用滤纸吸去血滴1次,直至血流自然停止,记录出血时间。
结果(见表3)表明,各给药组均可显著缩短小鼠的断尾出血时间,与溶剂对照组相比p<0.01。X-LJ中剂量组与X-CT组相比未见显著性差异(p>0.05),表明在相应的剂量下(均相当于人临床剂量),两者生物活性相似。
表3 不同制备方法的新生化颗粒对小鼠断尾出血时间的影响(n=12)
组别 | 剂量g·Kg-1 | 出血时间(min) |
溶剂对照组 | —— | 69.34±28.63 |
X-CT | 3.8 | 31.28±24.60** |
X-LJ低剂量 | 0.6 | 35.66±21.76** |
X-LJ中剂量 | 1.3 | 29.83±23.42** |
X-LJ高剂量 | 2.6 | 27.61±19.98** |
注:与溶剂对照组相比,** p<0.01。
2.3对大鼠子宫炎症的影响。
取雌性SD大鼠,体重180-220g,随机分成5组,每组8只。溶剂对照组,X-CT组(1.9g·Kg-1,相当于人临床剂量,即日服36g生药), X-LJ低、中、高剂量(0.3g·Kg-1、0.6g·Kg-1、1.2g·Kg-1,其中中剂量组相当于人临床剂量,即日服36g生药)。用乙醚麻醉动物,剪去下腹部毛,消毒后于腹正中线处作2cm长切口,分离子宫,沿子宫左侧角上1cm处作一切口,将一塑料管(管径2cm,长0.5cm,重2mg,酒精消毒)置于子宫内,与子宫切口缝合固定。术后2h开始给药,每天l次,连续7d,口服给药,溶剂对照组给予相应溶剂。末次给药后,处死动物,取出两侧子宫,除去脂肪,分析天平称重,每鼠子宫左侧与右侧的差值即为炎症肿胀程度。
结果(见表3)表明,各给药组均可显著减轻塑料管所致大鼠子宫炎症的肿胀程度,与溶剂对照组相比p<0.05、0.01。X-LJ中剂量组与X-CT组相比未见显著性差异,表明在相应的剂量下(均相当于人临床剂量),两者生物活性相似。
表4 不同制备方法的新生化颗粒对大鼠子宫炎症的影响(n=8)
组别 | 剂量g·Kg-1 | 肿胀度(mg) |
溶剂对照组 | —— | 73.2±10.3 |
X-CT | 1.9 | 42.0±8.2** |
X-LJ低剂量 | 0.3 | 54.7±8.8* |
X-LJ中剂量 | 1.2 | 43.4±7.9** |
X-LJ高剂量 | 2.4 | 38.8±7.7** |
注:与溶剂对照组相比,*p<0.05,** p<0.01。
2.4 对醋酸诱导小鼠扭体反应的影响 。
取雌性昆明小鼠,体重18-22g,分组、给药方法同2.2,于末次给药后30min,每鼠腹腔注射0.6%冰醋酸0. 2mL,观察30min内出现的扭体次数,及计算扭体反应抑制率,抑制率大于50%认为有镇痛作用。
结果(见表5)表明,各给药组均可显著减少醋酸诱导小鼠的扭体次数,与溶剂对照组相比p<0.05、0.01。其中,X-CT组、X-LJ中、高剂量组的抑制率均大于50%,镇痛作用明显。X-LJ中剂量组与X-CT组相比未见显著性差异(p>0.05),表明在相应的剂量下(均相当于人临床剂量),两者生物活性相似。
表5 不同制备方法的新生化颗粒对醋酸诱导小鼠扭体反应的影响(n=12)
组别 | 剂量g·Kg-1 | 扭体次数(次/15min) | 抑制率(%) |
溶剂对照组 | —— | 43.7±18.6 | —— |
X-CT | 3.8 | 19.3±12.3** | 55.8 |
X-LJ低剂量 | 0.6 | 27.6±14.4* | 36.8 |
X-LJ中剂量 | 1.3 | 18.6±13.1** | 57.4 |
X-LJ高剂量 | 2.6 | 16.2±11.7** | 62.9 |
注:与溶剂对照组相比,* p<0.05,** p<0.01。
2.5 对雌二醇(E2)诱导的大鼠乳腺小叶增生的影响。
取SD大鼠,雌性,体重180-200g,随机分为7组,每组12只:正常对照组、模型组、阳性对照组(枸橼酸他莫昔芬,4.0mg/kg),X-CT组(1.9g·Kg-1,相当于人临床剂量,即日服36g生药), X-LJ低、中、高剂量(0.3g·Kg-1、0.6g·Kg-1、1.2g·Kg-1,其中中剂量组相当于人临床剂量,即日服36g生药)。除正常对照组外,其余组均隔日肌肉注射苯甲酸雌二醇(E2)0.5mg·Kg-1,连续30天,肌注两周后开始灌胃给予受试药物,正常对照组给予对应体积的生理盐水,肌注E2结束后再给药两周,末次给药次日,取血,3000rpm 10分钟离心,取血清,放免法测定血清中雌二醇含量。用游标卡尺测量大鼠第二对乳房直径变化,每只大鼠选取最大乳腺组织2个,10%福尔马林固定,常规石蜡包埋,切片,HE染色,由病理专业人员阅片,光镜下观察有无组织病理学改变及病变轻重程度。
病理诊断标准:
乳腺组织根据病理增生状况分为I~IV四级,又分别评分为1分、2分、3分、4分,各级标准如下:
I级:(正常乳腺组织),乳腺小叶不增生(-),腺泡数量极少,腺泡和导管不扩张,处于静止期状态。
II级:轻度增生(+),乳腺小叶无明显增生,个别腺泡和导管有轻度增生,无扩张。
III级:中度增生(++),乳腺小叶大部分增生,部分腺泡和导管明显扩张。
IV:明显增生(+++),乳腺小叶明显增生,腺泡和导管处于极度扩张状态,腺上皮细胞呈扁平状,腺泡内及导管内有大量的分泌物。
累计每组动物乳腺评分,并计算出平均数±标准差,分值越高提示增生程度越重。
结果(见表6)表明,与正常对照组相比,模型组大鼠的乳头直径明显变大,雌二醇含量明显升高,乳腺组织增生评分明显升高,且均具有非常显著性意义(p<0.01),表明造模成功。与模型组相比,阳性对照组、X-LJ高剂量组大鼠的乳头直径明显变小,乳腺组织增生评分明显降低,且具有非常显著性意义(p<0.01);X-LJ中剂量组大鼠的乳头直径变小,乳腺组织增生评分降低,且具有显著性意义(p<0.05)。与模型组相比,阳性对照组、中剂量组、高剂量组大鼠的雌二醇含量明显降低,且均具有非常显著性意义(p<0.01);低剂量组大鼠的雌二醇含量降低,且具有显著性意义(p<0.05)。X-LJ中剂量组与X-CT组相比,乳头直径、乳腺组织增生指标均有显著性差异(p<0.05),表明在相应的剂量下(均相当于人临床剂量),采用本发明制备的新生化颗粒在抑制大鼠乳腺增生方面具有优于传统新生化颗粒的药理活性。
表6 不同制备方法的新生化颗粒对E2诱导大鼠乳腺小叶增生模型乳头直径、血清E2的影响(n=12)
注:与正常对照组相比,## p<0.01;与模型组相比,* p<0.05、** p<0.01。与X-LJ中剂量相比, △ p<0.05。
上述研究表明,采用本发明制备的新生化颗粒,有效成分含量是传统法制备的新生化颗粒的三倍。在服用量减少2/3的情况下,两者在收缩子宫、止血、抗炎、止痛方面的药理活性相当。而前者在抗乳腺增生方面的活性明显优于后者。前者可以在制备治疗乳腺增生药物中应用。
为了更好的说明本发明的技术方案,下文将对其具体实施方式做进一步的表述,但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
具体实施方式
实施例1
取当归240g、川芎90g、桃仁24g、甘草(炙)15g、干姜(炭)15g、红花15g ,粉碎,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为1%,萃取压力15MPa,温度30℃, CO2流量1ml/g生药·min,萃取时间120min,得超临界萃取物,备用;取益母草300g,粉碎,加入pH值为3-4的盐酸水溶液1.5L,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率300W,萃取2次,每次3分钟,合并萃取液,滤过,浓缩,通过D102型大孔吸附树脂柱吸附,用浓度为60%乙醇洗脱,收集3倍量柱体积的洗脱液,减压回收乙醇并浓缩、干燥,得益母草提取物,备用;将上述超临界萃取物、益母草提取物与淀粉混合,制成颗粒156g。
采用上文所述方法检测,成品中的阿魏酸含量为0.318mg/g。
采用上文所述方法,研究成品的止血作用,结果见表7。
表7 新生化颗粒对小鼠断尾出血时间的影响(n=12)
组别 | 剂量g·Kg-1 | 出血时间(min) |
溶剂对照组 | —— | 69.34±28.63 |
实施例1 | 1.3 | 31.72±24.44** |
注:与溶剂对照组相比,** p<0.01。
实施例2
取当归240g、川芎90g、桃仁24g、甘草(炙)15g、干姜(炭)15g、红花15g ,粉碎,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为1%,萃取压力15MPa,温度50℃, CO2流量3ml/g生药·min,萃取时间150min,得超临界萃取物,备用;取益母草300g,粉碎,加入pH值为3-4的盐酸水溶液1.5L,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率600W,萃取2次,每次8分钟,合并萃取液,滤过,浓缩,通过AB-8型大孔吸附树脂柱吸附,用浓度为80%乙醇洗脱,收集8倍量柱体积的洗脱液,减压回收乙醇并浓缩、干燥,得益母草提取物,备用;将上述超临界萃取物、益母草提取物与质量百分比为1:1的红糖-淀粉混合物混合,制成颗粒156g。
采用上文所述方法检测,成品中的阿魏酸含量为0.324mg/g。
采用上文所述方法,研究成品的止血作用,结果见表8。
表8 新生化颗粒对小鼠断尾出血时间的影响(n=12)
组别 | 剂量g·Kg-1 | 出血时间(min) |
溶剂对照组 | —— | 69.34±28.63 |
实施例1 | 1.3 | 32.63±23.79** |
注:与溶剂对照组相比,** p<0.01。
实施例3
取当归240g、川芎90g、桃仁24g、甘草(炙)15g、干姜(炭)15g、红花15g ,粉碎,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为1%,萃取压力20MPa,温度40℃, CO2流量2ml/g生药·min,萃取时间130min,得超临界萃取物,备用;取益母草300g,粉碎,加入pH值为3-4的盐酸水溶液1.5L,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率500W,萃取2次,每次6分钟,合并萃取液,滤过,浓缩,通过D101大孔吸附树脂柱吸附,用浓度为70%乙醇洗脱,收集5倍量柱体积的洗脱液,减压回收乙醇并浓缩、干燥,得益母草提取物,备用;将上述超临界萃取物、益母草提取物与质量百分比为1:1的红糖-淀粉混合物混合,制成颗粒156g。
Claims (6)
1.一种新生化颗粒的制备方法,由当归240g、川芎90g、桃仁24g、甘草(炙)15g、干姜(炭)15g、益母草300g、红花15g共7味药材作为原料药制成,其特征在于所述的方法包括下列步骤:取当归、川芎、桃仁、甘草(炙)、干姜(炭)、红花6味药材,粉碎,加入到CO2超临界萃取器中,乙醇作为夹带剂,夹带剂占总萃取溶剂的体积百分比为1%,萃取压力15-25MPa,温度30-50℃, CO2流量1-3ml/g生药·min,萃取时间120-150min,得超临界萃取物,备用;取益母草,粉碎,加入pH值为3-4的盐酸水溶液1.5L,投入微波萃取装置中进行微波萃取,萃取功率300-600W,萃取2次,每次3-8分钟,合并萃取液,滤过,浓缩,通过大孔吸附树脂柱吸附,用浓度为60-80%乙醇洗脱,收集3-8倍量柱体积的洗脱液,减压回收乙醇并浓缩、干燥,得益母草提取物,备用;将上述超临界萃取物、益母草提取物与质量百分比为1:1的红糖-淀粉混合物混合,制成颗粒156g。
2.根据权利要求1所述一种新生化颗粒的制备方法,其特征在于所述CO2超临界萃取的萃取压力20MPa,温度40℃, CO2流量2ml/g生药·min,萃取时间130min。
3.根据权利要求1所述一种新生化颗粒的制备方法,其特征在于所述微波萃取功率500W,每次萃取6分钟。
4.根据权利要求1所述一种新生化颗粒的制备方法,其特征在于所述大孔吸附树脂选自D101型、D102型、AB-8型大孔吸附树脂中的一种。
5.根据权利要求1所述一种新生化颗粒的制备方法,其特征在于所述大孔吸附树脂柱洗脱用乙醇的浓度为70%,收集量为5倍量柱体积。
6.根据权利要求1所述方法制备的新生化颗粒,其作为制备治疗乳腺增生药物的应用。
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