CN107367557A - 一种蜚蠊中原儿茶酸含量的uplc测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蜚蠊中原儿茶酸含量的UPLC测定方法，该方法包括如下步骤：蜚蠊粗粉，加水浸泡，提取三次，合并三次提取液并过滤，滤液浓缩再加入75％～95％的乙醇，弃去上层油脂，下层药液过滤，滤液回收乙醇，减压浓缩，加入甘油，再用纯化水定容，得蜚蠊醇提取物脱脂原液，用超高效液相色谱法进行检测，测定原儿茶酸的含量。本发明建立了蜚蠊醇提物中原儿茶酸的UPLC测定方法，所述的方法重复性好，稳定性高，分析速度快，为蜚蠊药材的质量控制提供了新的参考依据。

Description

一种蜚蠊中原儿茶酸含量的UPLC测定方法
技术领域
本发明涉及中药材成分含量测定方法领域，具体涉及一种蜚蠊中原儿茶酸含量的UPLC测定方法。
背景技术
蜚蠊，亦称为美洲大蠊(Periplaneta americana)，属于昆虫纲蜚蠊目大蠊属，是重要的药用昆虫，临床上对创面的修复及愈合具有明显的促进作用，同时还具有消炎抗菌、保肝抗肿瘤、增强机体免疫力等功能。研究表明，美洲大蠊药材中除了含有大量的脂肪酸、多糖、氨基酸、多元醇以外，还含有水杨酸、原儿茶酸及核苷酸类成分。原儿茶酸是一种天然的酚酸类物质，能够抗菌抗炎镇痛，在抗氧化应激，抑制细胞凋亡、抗血小板凝集、降低心肌耗氧量、神经保护、抗肿瘤、祛痰、平喘等方面亦有突出的药理作用，临床上常用于治疗慢性气管炎。原儿茶酸也是活血化瘀类中草药中的主要活性成分。
与传统的高效液相色谱(HPLC)相比，超高效液相色谱(UPLC)具有分离度更高，分析速度更快，检测器灵敏度更高的特点。UPLC色谱柱采用粒径小于2μm的填料，显著增加了柱子的效能。与传统的C18色谱柱相比，T3柱能保证与100％水相流动相相兼容，对不同极性的化合物均有良好的保留，在分析过程中适用范围更广。
目前为止，尚没有关于测定美洲大蠊醇提物中原儿茶酸含量的HPLC及UPLC方法。本发明拟通过外标法，在超高效液相色谱(UPLC)上运用T3色谱柱建立分析美洲大蠊醇提物中原儿茶酸的方法，同时测定原儿茶酸的含量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蜚蠊中原儿茶酸的UPLC测定方法，通过确定UPLC的测定条件，对蜚蠊醇提物中原儿茶酸含量进行测定，为蜚蠊成分检测提供更加灵敏、快捷、准确的检测方法。
本发明提供了一种蜚蠊中原儿茶酸含量的UPLC测定方法，其特征在于，所述的测定方法为UPLC检测方法，该方法由以下步骤实现：
a.蜚蠊样品的制备方法：
将干燥的蜚蠊粗粉，每1kg粗粉加4kg水，浸泡1小时后，温度约在70℃，提取三次：第一次8小时，第二次加水3kg，提取6小时，第三次加水3kg，提取4小时，合并三次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为70℃时1.10～1.20，加入75％～95％的乙醇，70℃保温搅拌30分钟，静置12小时，弃去上层油脂，下层药液过滤，滤液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为70℃时1.20～1.25，加入甘油0.5L，充分搅拌均匀，滤过，纯化水定容至10L，即得蜚蠊醇提取物脱脂原液，蜚蠊醇提物脱脂原液经13000r/min高速离心1min，取上清液过膜后，备用；
b.UPLC测定蜚蠊样品中原儿茶酸的条件：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm)；
流动相：流动相A为缓冲盐溶液，流动相B为有机溶剂，进样量：1μL，流速：0.5mL/min，温度：样品检测温度20℃～30℃，柱温30℃～45℃，检测波长：190～450nm，洗脱时间：9～11min，洗脱程序为：99％～20％(A)：1％～80％(B)。
进一步，所述的流动相A为缓冲盐溶液，该缓冲盐溶液含0.1％甲酸和25mmol甲酸铵，流动相B为100％乙腈；
进一步，所述的检测波长为：254nm；温度：样品检测温度25℃，柱温40℃，洗脱时间：11min；
进一步，所述的洗脱程序为：0～1min，99％(A)：1％(B)；1～2min，99％～90％(A)：1％～10％(B)；2～6min，90％～60％(A)：10％～40％(B)；6～7min，60％～20％(A)：40％～80％(B)；7～8min，20％(A)：80％(B)；8～8.01min，20％～99％(A)：80％～1％(B)；8.01～11min，99％(A)：1％(B)；
优选的，所述的蜚蠊为美洲大蠊。
说明书附图
图1美洲大蠊样品和原儿茶酸标准品对比图；
图2原儿茶酸的标准曲线；
具体实施方式
为更加清楚地对本发明进行说明，通过以下具体实施例对本发明所述的方法进行更为详细地说明。以下所述的实施例仅表达了本发明的几种实施方式，本能理解为对本发明专利范围的限制，本发明专利所保护的范围以权利要求所述范围为准。
实施例1
a.蜚蠊样品的制备方法：
将干燥的蜚蠊粗粉，每1kg粗粉加4kg水，浸泡1小时后，温度约在70℃，提取三次：第一次8小时，第二次加水3kg，提取6小时，第三次加水3kg，提取4小时，合并三次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为70℃时1.10～1.20，加入75％～95％的乙醇，70℃保温搅拌30分钟，静置12小时，弃去上层油脂，下层药液过滤，滤液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为70℃时1.20～1.25，加入甘油0.5L，充分搅拌均匀，滤过，纯化水定容至10L，即得蜚蠊醇提取物脱脂原液，蜚蠊醇提物脱脂原液经13000r/min高速离心1min，取上清液过膜后，备用；
b.色谱条件
色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1×100mm；1.8μm)，样品温度25℃，进样量1μL，柱温40℃，流速为0.5mL/min，检测波长设置三个，分别是254nm，流动相选择缓冲盐(0.1％甲酸，25mmol甲酸铵)(A)和乙腈(100％)(B)，洗脱时间为11min，洗脱梯度见表1。
表1洗脱梯度程序表
c.结果
经过测定样品含量见表2，根据对照品的标准曲线，将原液中原儿茶酸的峰面积带入线性方程，求得1mL美洲大蠊脱脂原液中，含有51.38μg原儿茶酸，即美洲大蠊脱脂原液中原儿茶酸的浓度为51.38μg/mL。
表2样品含量测定结果
实验例1
为了验证本发明的方法的可行性和准确性，作了如下的方法学验证试验：
1.材料
1.1仪器材料
Waters ACQUITY超高效液相色谱仪，ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1×100mm；1.8μm)，美国Waters公司。
1.2对照品及样品
原儿茶酸：(批号223812，J&K chemical公司)，质量分数≥98％。
美洲大蠊：由四川好医生攀西药业有限责任公司提供。
2.方法学实验
2.1线性关系考察
称取0.016g原儿茶酸对照品，溶于100mL甲醇配成浓度为160μg/ml的对照品溶液，再加甲醇等比例依次稀释到80μg/mL、40μg/mL、20μg/mL、10μg/mL，按照实施例1中色谱条件由低到高的顺序对5个浓度的原儿茶酸依次进样，测定相对峰面积(见表3)，然后以浓度为横坐标，以相对峰面积为纵坐标绘制对照品的标准曲线(见图2)，得到线性方程为y＝7188.6x+5371.7，r＝0.9999，原儿茶酸对照品在10～160μg浓度范围内与峰面积呈现良好的线性关系。
表3标准曲线数据表
2.2精密度实验
按照实施例1中色谱条件连续进样160μg/ml原儿茶酸标准品溶液6次，以测定的峰面积值(见表4)，计算RSD值为0.59％，表明仪器的精密度良好。
表4精密度实验结果
2.3稳定性实验
按照实施例1中色谱条件，分别在0h、2h、4h、8h、12h进样，所对应的峰面积计算(见表5)RSD值为0.80％，表明样品的稳定性良好。
表5稳定性实验结果
2.4重复性实验
按照实施例1中色谱条件，分别检测样品QC1、QC2、QC3、QC4、QC5和QC6中原儿茶酸所对应的峰面积(见表6)，计算RSD值为0.73％，表明该实验方法的重复性良好。
表6重复性实验结果
2.5加样回收实验
取10mL已知含量的美洲大蠊脱脂原液取三份，按照1：2，1：1，2：1(已知量：添加量)三种比例向其中分别添加1.00mg、0.50mg、0.30mg原儿茶酸对照品，每种添加浓度进行三次平行实验，实验数据取平均值；根据公式“加样回收率＝(测得量-固有含量)/加入量×100％”计算加样回收率(见表7)，结果表明，原儿茶酸的平均回收率为87.45％～93.00％；RSD值分别为0.52％、0.10％、0.70％，RSD均小于1％，表明样品的回收率良好。
表7回收率实验结果
本发明的有益效果
目前为止，尚没有关于测定美洲大蠊醇提物中原儿茶酸含量的HPLC及UPLC方法。本发明采用UPLC方法对蜚蠊醇提取物脱脂原液中所含的原儿茶酸含量进行分析，最终建立了蜚蠊醇提物中原儿茶酸的分析方法，同时测定原儿茶酸的含量，本发明所述的方法重复性好，稳定性高，分析速度快，为美洲大蠊药材的质量控制提供了新的参考依据。

Claims (5)

1.一种蜚蠊中原儿茶酸含量的UPLC测定方法，其特征在于，所述的测定方法为UPLC检测方法，该方法由以下步骤实现：
a.蜚蠊样品的制备方法：
将干燥的蜚蠊粗粉，每1kg粗粉加4kg水，浸泡1小时后，温度约在70℃，提取三次：第一次8小时，第二次加水3kg，提取6小时，第三次加水3kg，提取4小时，合并三次提取液，过滤，滤液浓缩至相对密度为70℃时1.10～1.20，加入75％～95％的乙醇，70℃保温搅拌30分钟，静置12小时，弃去上层油脂，下层药液过滤，滤液回收乙醇，减压浓缩至相对密度为70℃时1.20～1.25，加入甘油0.5L，充分搅拌均匀，滤过，纯化水定容至10L，即得蜚蠊醇提取物脱脂原液，蜚蠊醇提物脱脂原液经13000r/min高速离心1min，取上清液过膜后，备用；
b.UPLC测定蜚蠊样品中原儿茶酸的条件：
色谱柱：Waters ACQUITY UPLC HSS T3柱(2.1×100mm，1.8μm)；
流动相：流动相A为缓冲盐溶液，流动相B为有机溶剂，进样量：1μL，流速：0.5mL/min，温度：样品检测温度20℃～30℃，柱温30℃～45℃，检测波长：190～450nm，洗脱时间：9～11min，洗脱程序为：99％～20％(A)：1％～80％(B)。
2.权利要求1所述的一种蜚蠊中原儿茶酸含量的UPLC测定方法，其特征在于，所述的流动相A为缓冲盐溶液，该缓冲盐溶液含0.1％甲酸和25mmol甲酸铵，流动相B为100％乙腈。
3.权利要求1所述的一种蜚蠊中原儿茶酸含量的UPLC测定方法，其特征在于，所述的检测波长为：254nm；温度：样品检测温度25℃，柱温40℃；洗脱时间为：11min。
4.权利要求1所述的一种蜚蠊中原儿茶酸含量的UPLC测定方法，其特征在于，所述的洗脱程序为：0～1min，99％(A)：1％(B)；1～2min，99％～90％(A)：1％～10％(B)；2～6min，90％～60％(A)：10％～40％(B)；6～7min，60％～20％(A)：40％～80％(B)；7～8min，20％(A)：80％(B)；8～8.01min，20％～99％(A)：80％～1％(B)；8.01～11min，99％(A)：1％(B)。
5.权利要求1～3中任意一项所述的一种蜚蠊中原儿茶酸含量的UPLC测定方法，其特征在于，所述的蜚蠊为美洲大蠊。
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