CN107422053A - 一种液质联用检测化妆品中三氯乙酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种液质联用检测化妆品中三氯乙酸的方法，该方法包括：将待测化妆品样品经过固相萃取技术进行前处理，用高效液相色谱联合质谱仪检测定性，再利用外标法实现化妆品中三氯乙酸的定量分析。本发明通过结合固相萃取技术进行化妆品样品前处理，利用液相色谱‑串联质谱技术建立了化妆品中的三氯乙酸的测定方法，具有前处理简便易行、分析时间短、检测限低、回收率高、稳定性好的特点，可以快速、简便、准确的测定复杂基质中三氯乙酸的含量。

Description

一种液质联用检测化妆品中三氯乙酸的方法

技术领域

本法明属于化学分析检测领域，特别涉及一种液质联用检测化妆品中三氯乙酸的方法。

背景技术

对卤乙酸给人类造成的健康风险的研究起源于饮用水消毒。饮用水中消毒副产物主要是三卤甲烷和卤乙酸。这二类消毒副产物不但浓度远远超过其余消毒副产物, 而且其致癌风险也不断得到毒理学和生物学的证实，目前越来越多的学者将卤乙酸认定为消毒副产物总致癌风险的首要指标参数。

而在卤乙酸中，又以二氯乙酸和三氯乙酸（TCAA）的单位浓度致癌风险较大，他们被视为氯化消毒副产物卤乙酸类物质的代表，其单位致癌风险分别为2.6 ´ 10^-6和5.5 ´10^-6。按照国际癌症研究机构（IARC）致癌物分类标准，二氯乙酸为2A 类，对人很可能致癌；三氯乙酸为2B 类，对人可能致癌。我国现行的《化妆品安全技术规范》（2015版）中也明确将三氯乙酸列为化妆品禁用组分。

目前对于三氯乙酸（TCAA）现有的测定技术可以分为气相色谱法和液相色谱法，由于TCAA具有强极性、高沸点和难挥发等特点，因此采用气相色谱为分离手段时，需要对其进行衍生化处理，常用的衍生化试剂有重氮甲烷或酸化甲醇，然后使用GC-ECD、GC-MS或GC-MS/MS进行检测，US EPA 方法552.3中的方法即采用酸化甲醇将卤乙酸类物质甲酯化后再用GC-ECD进行检测。由于GC-ECD的定性能力相对较差，为防止待测物的归属错误，US EPA推荐使用“双柱定性”；但这些方法不足之处是样品需要衍生，前处理较为繁琐，难以满足大规模高通量的分析要求。TCAA的液相色谱分离方法主要有毛细管电泳法、离子色谱法和液相色谱法等，其中毛细管电泳的灵敏度往往不高，而液相色谱法中有采用C8、C18和HILIC色谱柱进行分析的报道，但样品需用乙腈稀释，分离效果较差。也有研究选用UPLC-MS /MS 测定HAAs，虽然标准样品的分离效果较好，检测限较低，但检测信号较弱，同时需要对样品进行酸化使pH 值低于3才可获得较满意的分离效果。TCAA也可采用离子色谱分析方法，但该方法易受到试样中无机离子的干扰，分析时间过长。

发明内容

为了解决现有技术中三氯乙酸在仪器分析测定中前处理流程复杂、分析检测灵敏度低、选择性差、分析周期长的问题，本发明首次通过固相萃取技术建立样品前处理，再结合液相色谱-串联质谱技术建立了化妆品中的三氯乙酸的测定方法，具有高的灵敏度以及准确性，适用于实际出入境检测。

本发明采用技术方案如下：

一种液质联用检测化妆品中三氯乙酸含量的方法，包括以下步骤，将待测化妆品经过固相萃取得到检测液；检测液经高效液相色谱处理得到提纯液；提纯液经过质谱仪检测后，利用外标法完成化妆品中三氯乙酸的含量检测。

本发明利用液相色谱处理后再联用质谱仪，可以简单方便的实现化妆品中三氯乙酸的定量分析，解决了现有技术分析结果不准确、分析过程繁琐的问题。

本发明中，外标法为先检测三氯乙酸标准品的保留时间和分子质量，并制备三氯乙酸标准品浓度与质谱峰面积的关系曲线；然后将提纯液经过质谱仪检测后，比对三氯乙酸标准品的保留时间和分子质量；最后将比对匹配的质谱峰面积带入三氯乙酸标准品浓度与质谱峰面积的关系曲线，得到化妆品中三氯乙酸的含量。优选的，三氯乙酸标准品的分子质量为母离子、子离子分子质量，通过进一步碎裂的母离子/子离子对在定性时大大降低了假阳性的可能，同时选择性和灵敏度也得到了大幅的提高，而且还能满足大规模高通量的分析要求。

本发明还公开了一种液质联用定性检测化妆品中三氯乙酸的方法，包括以下步骤，将待测化妆品经过固相萃取得到检测液；检测液经高效液相色谱处理得到提纯液；提纯液经过质谱仪检测后，将得到的保留时间和分子质量与三氯乙酸标准品检测得到的保留时间和分子质量比对，完成化妆品中三氯乙酸的定性检测。

本发明中，所述固相萃取的处理条件为，将待测化妆品溶液涡旋后超声处理，然后离心处理，将上清过滤后得到提取物溶液；然后将提取物溶液经C18小柱处理后再过滤得到检测液。优选的，待测化妆品溶液为浓度0.08～0.12g/mL的待测化妆品水溶液，本发明克服了现有技术需要有机溶剂处理待测样品的缺陷，而且前处理后，测试结果准确，取得了意想不到的技术效果。

比如，称取待测化妆品0.5 g，置于10 mL塑料离心管中，加水5 mL，涡旋60 s后超声提取15 min，然后以10000 rpm转速离心10 min，取上清液通过0.45 μm微孔滤膜，得到提取物溶液；将经过滤膜的提取物溶液在C18小柱进行上样，然后将接受液经0.22 mm滤膜过滤后上机分析。

优选的，所述在C18小柱进行上样前还包括C18小柱活化步骤，具体为，依次用10mL甲醇和15 mL水对C18小柱进行活化，然后静置30 min，以备上样使用。

优选的，所述高效液相色谱的色谱条件为：

仪器：高效液相色谱；色谱柱： C18色谱柱100 mm×2.1 mm，1.9μm；流动相：A为0.1甲酸水溶液，B为甲醇；流速：0.20 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL；梯度洗脱：0 ~ 1.5 min，5 % B，1.5 ~ 5.5 min，5 ~ 40 % B，5.5 ~ 7.5 min，40 % B，7.5 ~ 10 min，5 % B。

优选的，所述质谱处理的质谱条件为：

仪器：三重四级杆串联质谱；离子源：电喷雾离子源（ESI）；电离模式：负模式；扫描模式：选择离子监测（MRM）；鞘气压力：35 arb；辅助气压力：10 arb；毛细管电压：3.0 kv；毛细管温度：270 ℃；蒸发温度：350℃。

本发明具有如下有益效果：

1、本发明首次建立了一种利用固相萃取-高效液相色谱-质谱联用的技术分析化妆品中三氯乙酸的方法，该方法具有前处理简便易行、萃取效率高、检测限低、回收率高、稳定性好、分析时间短等特点，可以快速、简便、准确的测定复杂基质中三氯乙酸的含量；

2、本发明利用高效液相色谱-质谱联用的技术，并利用保留时间和分子质量两个参数同时对于物质进行定性，提升了复杂基质中多组分分离检测时的选择性和准确度；

3、本发明利用串联质谱采用多级反应检测（MRM）模式，通过进一步碎裂的母离子/子离子对在定性时大大降低了假阳性的可能，同时选择性和灵敏度也得到了大幅的提高，而且还能满足大规模高通量的分析要求；

4、本发明实现了化妆品这种复杂基质中三氯乙酸的测定，创造性的将固相萃取的提取液经C18小柱净化，可以将提取液中有机质被吸附，三氯乙酸通过固定相进入收集液，降低了色谱干扰，又减少了对色谱柱的污染；

5、本发明公开的方法对化妆品中三氯乙酸的检出限为5mg/kg，在多种基质中的加标回收率均超过 90 %，检测结果准确，样品前处理简便有效，分析时间短，灵敏度高，能够满足实际化妆品中三氯乙酸检测的要求；

6、本发明建立了一种利用高效液相色谱-质谱联用的技术分析化妆品中三氯乙酸的方法填补了该领域的空白，为化妆品产品质量控制和产品安全监测提供必要的技术支持，对保障民众使用化妆品的安全性具有积极的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的三氯乙酸的标准曲线图；

图2是本发明实施例提供的三氯乙酸标准品液相色谱质谱图；

图3是本发明实施例提供的化妆品（霜膏）加标样品液相色谱质谱图。

图4是本发明实施例提供的化妆品（乳液）加标样品液相色谱质谱图。

图5是本发明实施例提供的化妆品（水剂）加标样品液相色谱质谱图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例公开了一种液质联用检测化妆品中三氯乙酸的方法，所述方法包括定性与定量：将待测化妆品样品经过固相萃取技术进行前处理，再用高效液相色谱实处理后用质谱仪检测定性，再利用外标法实现化妆品中三氯乙酸的定量/定性分析。被检测化妆品基质没有品种、样式的限制，其可以是霜膏、乳液或水剂等。

其中，主要仪器和试剂：

戴安Ultimate 3000高效液相色谱；

色谱柱：Thermo Sycronic C18色谱柱100 mm×2.1 mm，1.9μm；

赛默飞Thermo TSQ Quantum Access Max三重四级杆串联质谱；

离子源：电喷雾离子源（ESI）；

C18固相萃取柱，0.45μm水相滤头，0.22μm水相滤头；

三氯乙酸标准品，纯度 ≥ 98％；甲酸，纯度≥99%，sigma公司；甲醇，色谱级，美国Tedia公司。

化妆品样品组成复杂，除了目标分析物三氯乙酸外还有多种杂质组分，会对后期的分析检测形成干扰，影响检测结果的准确性；这也是现有技术可以有效检测其他成分，但是对三氯乙酸一直没有较好办法的原因。

实施例

待检测化妆品的检测步骤

（1）样品前处理及测试样品制备

用电子天平准确称取待测样品0.5 g（质量精确至0.0001g），置于10 mL塑料离心管中，加水5 mL，涡旋60 s后超声提取15 min，然后以10000 rpm转速离心10 min，取上清液通过0.45 μm微孔滤膜，得到提取物溶液；

C18小柱活化，依次用10 mL甲醇和15 mL水对C18小柱进行活化，然后静置30 min，以备上样；

使用将经过滤膜的提取物溶液在C18小柱进行上样，然后将接受液经0.22 mm滤膜过滤后上机分析。

（2）高效液相色谱仪对上述制备得到的样品溶液进行分离分析

高效液相色谱的色谱条件为：

仪器：戴安Ultimate 3000高效液相色谱；

色谱柱：Thermo Sycronic C18色谱柱100 mm×2.1 mm，1.9μm；

流动相：A为0.1甲酸水溶液，B为甲醇；

流速：0.20 mL/min；

柱温：30 ℃；

进样量：10 μL；

梯度洗脱：0 ~ 1.5 min，5 % B，1.5 ~ 5.5 min，5 ~ 40 % B，5.5 ~ 7.5 min，40 % B，7.5 ~ 10 min，5 % B。

（3）串联质谱仪对液相色谱馏出液进行检测分析

串联质谱仪的质谱条件为：

仪器：赛默飞Thermo TSQ Quantum Access Max三重四级杆串联质谱；

离子源：电喷雾离子源（ESI）；

电离模式：负模式；

扫描模式：选择离子监测（MRM）；

鞘气压力：35 arb；

辅助气压力：10 arb；

毛细管电压：3.0 kv；

毛细管温度：270 ℃；

蒸发温度：350℃。

三氯乙酸标准品的标准曲线的制备具体包括：

（1）配置标准品储备液：分别称取50 mg三氯乙酸（纯度 ≥ 98％）的标准品，用色谱级甲醇定容于50 mL棕色容量瓶中，配置成浓度约100 0mg/L的标准储备液；

（2）配置标准工作溶液：分别量取（1）中所配制的标准储备液用色谱级甲醇配制成浓度分别为50、100、500、1000、2000 mg/L共5个浓度的标准工作溶液；

（3）制作标准曲线：依次对每一浓度的标准工作溶液依照前述方法进样检测，以三氯乙酸物质峰面积为纵坐标Y，三氯乙酸质量浓度为横坐标X，绘制得到标准曲线；其中每个系列进样3次，取平均峰面积值。

三氯乙酸标准品的标准曲线和色谱图分别如图1、图2所示，具体MRM参数见表1。

表1 三氯乙酸的MRM参数信息

图1为以色谱峰的峰面积为纵坐标，与其对应的三氯乙酸浓度为横坐标作图，绘制得到的标准工作曲线，其对应的回归方程为y=1199 x + 28763。从图1可见，在50 ~ 2000 mg/L浓度范围内，三氯乙酸的浓度值与响应峰面积值之间的相关系数为0.9998，呈良好的线性关系；三氯乙酸的检出限低至5mg/kg。

图2为三氯乙酸标准品的色谱图，从图中可以看出三氯乙酸标准品的保留时间是5.54 min。可见，使用本发明的色谱和质谱条件对于三氯乙酸进行分离分析和定性检测，得到的色谱图峰形良好，出峰时间快，分析周期短。

表1为三氯乙酸的MRM参数信息，定量离子对为116.8 > 35.5，定性离子对为160.6> 116.9。利用串联质谱采用多级反应检测（MRM）模式，将目标分析物三氯乙酸的质量分数从单一的分子量信息通过进一步碎裂的母离子/子离子对在定性时大大降低了假阳性的可能，同时选择性和灵敏度也得到了大幅的提高，而且还能满足大规模高通量的分析要求。

本发明实施例公开的方法对于三氯乙酸的定性分析，是通过对比化妆品样品中未知物质的保留时间和分子质量与三氯乙酸标准品的保留时间和分子质量得到。利用保留时间和分子质量两个参数同时对于物质进行定性，提升了复杂基质中多组分分离检测时的选择性和准确度；将待测化妆品样品检测后定性得到对应三氯乙酸的分子质量和保留时间的峰面积代入相应的三氯乙酸标准品的标准曲线中，查出化妆品样品中三氯乙酸的含量。

待检测化妆品的定性/定量分析

将化妆品样品按前述进行前处理后按色谱和质谱条件进样分析，将待测化妆品样品检测所得的峰面积代入相应的标准曲线，计算得到该种化妆品中三氯乙酸的含量，每个样品重复测量3次，取平均峰面积值；结果见表2。

表2 回收率和精密度结果（n=6）

谱图如图3-图5所示，为三氯乙酸添加在化妆品样品以及空白对照样的出峰情况。

图3为霜膏加标样品（5mg/kg）以及空白对照样的质谱图，图A为加标样品，图B为空白对照样，可以看出本发明的方法可以准确检测出霜膏中含有三氯乙酸；

图4为乳液加标样品（20mg/kg）以及空白对照样的质谱图，图A为加标样品，图B为空白对照样，可以看出本发明的方法可以准确检测出霜膏中含有三氯乙酸；

图5为水剂加标样品（50mg/kg）以及空白对照样的质谱图，图A为加标样品，图B为空白对照样，可以看出本发明的方法可以准确检测出霜膏中含有三氯乙酸。

综上，本发明具有如下有益效果：

本发明实施例建立了一种利用固相萃取-高效液相色谱-质谱联用的技术分析化妆品中三氯乙酸的方法，该方法具有前处理简便易行、萃取效率高、检测限低、回收率高、稳定性好、分析时间短等特点，可以快速、简便、准确的测定复杂基质中三氯乙酸的含量；利用高效液相色谱-质谱联用的技术可以利用保留时间和分子质量两个参数同时对于物质进行定性，提升了复杂基质中多组分分离检测时的选择性和准确度；利用串联质谱采用多级反应检测（MRM）模式，通过进一步碎裂的母离子/子离子对在定性时大大降低了假阳性的可能，同时选择性和灵敏度也得到了大幅的提高，而且还能满足大规模高通量的分析要求；实现了化妆品这种复杂基质中三氯乙酸的测定，降低了色谱干扰，又减少了对色谱柱的污染；对化妆品中三氯乙酸的检出限为5mg/kg，在多种基质中的加标回收率均超过 90 %，检测结果准确，样品前处理简便有效，分析时间短，灵敏度高，能够满足实际化妆品中三氯乙酸检测的要求。

因此本发明建立了一种利用高效液相色谱-质谱联用的技术分析化妆品中三氯乙酸的方法填补了该领域的空白，为化妆品产品质量控制和产品安全监测提供必要的技术支持，对保障民众使用化妆品的安全性具有积极的意义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种液质联用检测化妆品中三氯乙酸含量的方法，其特征在于，包括以下步骤，将待测化妆品经过固相萃取得到检测液；检测液经高效液相色谱处理得到提纯液；提纯液经过质谱仪检测后，利用外标法完成化妆品中三氯乙酸的含量检测。

2.根据权利要求1所述液质联用检测化妆品中三氯乙酸含量的方法，其特征在于，外标法为先检测三氯乙酸标准品的保留时间和分子质量，并制备三氯乙酸标准品浓度与质谱峰面积的关系曲线；然后将提纯液经过质谱仪检测后，比对三氯乙酸标准品的保留时间和分子质量；最后将比对匹配的质谱峰面积带入三氯乙酸标准品浓度与质谱峰面积的关系曲线，得到化妆品中三氯乙酸的含量。

3.根据权利要求2所述液质联用检测化妆品中三氯乙酸含量的方法，其特征在于，三氯乙酸标准品的分子质量为母离子、子离子分子质量。

4.一种液质联用定性检测化妆品中三氯乙酸的方法，其特征在于，包括以下步骤，将待测化妆品经过固相萃取得到检测液；检测液经高效液相色谱处理得到提纯液；提纯液经过质谱仪检测后，将得到的保留时间和分子质量与三氯乙酸标准品检测得到的保留时间和分子质量比对，完成化妆品中三氯乙酸的定性检测。

5.根据权利要求4所述液质联用定性检测化妆品中三氯乙酸的方法，其特征在于，三氯乙酸标准品的分子质量为母离子、子离子分子质量。

6.根据权利要求1或者权利要求4所述的方法，其特征在于，所述固相萃取的处理条件为，将待测化妆品溶液涡旋后超声处理，然后离心处理，将上清过滤后得到提取物溶液；然后将提取物溶液经C18小柱处理后再过滤得到检测液。

7. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，待测化妆品溶液为浓度0.08～0.12g/mL的待测化妆品水溶液；所述在C18小柱进行上样前还包括C18小柱活化步骤，具体为，依次用10 mL甲醇和15 mL水对C18小柱进行活化，然后静置30 min。

8. 根据权利要求1或者权利要求4所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱的色谱条件为： C18色谱柱；流动相：A为0.1甲酸水溶液，B为甲醇；梯度洗脱：0 ~ 1.5 min，5 % B，1.5 ~ 5.5 min，5 ~ 40 % B，5.5 ~ 7.5 min，40 % B，7.5 ~ 10 min，5 % B。

9.根据权利要求1或者权利要求4所述的方法，其特征在于，所述质谱处理的扫描模式为选择离子监测。

10.根据权利要求1或者权利要求4所述的方法，其特征在于，所述化妆品包括霜膏、乳液或者水剂。