CN107179374A

CN107179374A - 精血补片指纹图谱的检测方法

Info

Publication number: CN107179374A
Application number: CN201710517640.3A
Authority: CN
Inventors: 金俊杰; 蔡宝昌; 赵敏; 秦昆明; 杨冰
Original assignee: JIANGSU HAISHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: JIANGSU HAISHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2017-06-29
Filing date: 2017-06-29
Publication date: 2017-09-19
Anticipated expiration: 2037-06-29
Also published as: CN107179374B

Abstract

本发明公开了精血补片指纹图谱的检测方法，精血补片指纹图谱建立包括以下步骤：步骤1，精血补片供试品溶液的制备；步骤2，分别精密吸取供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图；步骤3，将步骤2中获得的精血补片指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统，选择不同批次精血补片的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成精血补片的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。本发明所提供的精血补片指纹图谱，能全面，客观地表征精血补片的质量，有利于全面监控药物的质量。本发明提供的指纹图谱的检测方法具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

Description

精血补片指纹图谱的检测方法

技术领域

本发明涉及一种中成药的检测方法，具体涉及精血补片指纹图谱的检测方法。

背景技术

指纹图谱是指某些复杂物质，比如中药，某种生物体或某种组织或细胞的DNA，蛋白质经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示其化学特征的色谱图或光谱图。中药指纹图谱是一种综合的，可量化的鉴定手段，它是建立在中药化学成分系统研究的基础上，主要用于评价中药材以及中药制剂质量的真实性、优良性和稳定性。中药及其制剂均为多组分复杂体系，因此评价其质量应采用与之相适应的，能提供丰富鉴别信息的检测方法，建立中药指纹图谱将能较为全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。

精血补片是由生晒参、红参、制何首乌、紫河车、五味子、陈皮等6味药材制成的复方制剂(由江苏海昇药业有限公司生产，国药准字Z32021173)具有补肝肾，益血气，养心神的疗效，用于神经衰弱，精神萎靡、头晕目弦、心悸失眠等症。该制剂现执行标准已经对二苯乙烯苷进行了定量分析，但由于精血补片药味繁多，成分复杂，个别成分的定性定量分析仍难以全面反应药品的全面信息，为更有效地控制精血补片的质量，本发明针对精血补片药效成分建立了制剂的指纹图谱，对全面客观评价精血补片的质量具有重要的意义。

发明内容

发明目的：本发明的目的是解决现有技术的不足，提供一种精血补片的指纹图谱检测方法，该检测方法可以客观、全面、准确的评价精血补片的质量，对控制精血补片的质量和保证临床疗效具有重要意义。

技术方案：为了实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种精血补片指纹图谱的检测方法，其包括以下步骤：

步骤1、精血补片供试品溶液的制备：提供不同批次的精血补片供试品，分别取一定重量的供试品置于容器中，向容器中加入石油醚并进行超声处理，冷却，摇匀，过滤，取滤渣蒸干，然后加入甲醇超声处理，冷却，摇匀，过滤，取滤液蒸干，再用甲醇定容于容量瓶即得供试品溶液；

步骤2、参照峰溶液的制备：取一定量的橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、和大黄素，加入甲醇溶解；

步骤3、分别精密吸取供试品溶液和参照峰溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图；

步骤4，将步骤3中获得的精血补片指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次精血补片的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成精血补片的对照指纹图谱；计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。

作为优选方案，以上所述的精血补片指纹图谱的检测方法，步骤1精血补片供试品溶液制备方法为：取精血补片供试品0.1～0.5g置具塞锥形瓶中，加入石油醚20mL，在250W，40kHz超声下处理30分钟；然后加甲醇20mL，超声30分钟，最后的溶液定容于2mL的容量瓶中。

作为优选方案，以上所述的精血补片指纹图谱的检测方法，步骤3中，分别精密吸取供试品溶液和参照峰溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录115分钟的液相色谱图。

作为优选方案，以上所述的精血补片指纹图谱的检测方法，步骤3中，液相色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相B，以体积百分比浓度为0.1％甲酸水溶液为流动相A进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为254nm；柱温为30℃；梯度洗脱的流程为：0～10分钟，5→10％流动相B，95→90％流动相A；10～50分钟，10→25％流动相B，90→75％流动相A；50～65分钟，25→45％流动相B，75→55％流动相A；65～ 80分钟，45％流动相B，55％流动相A；80～115分钟，45→80％流动相B，55→20％流动相A。

作为优选方案，以上所述的精血补片指纹图谱的检测方法，色谱柱规格为： 4.6mm×250mm，5μm的YMC-PackODS-A色谱柱。

作为优选方案，以上所述的精血补片指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹图谱中的特征峰为与橙皮苷对应的8号峰，与二苯乙烯苷对应的6号峰，与五味子醇甲对应的10号峰，与大黄素对应的13号峰，其相对保留时间分别为47.296分钟、38.890分钟、75.158分钟、90.264分钟。指纹图谱中的特征峰还包括：相对保留时间为7.294分钟的1号峰、相对时间9.388分钟为的2号峰、相对时间为12.419的3号峰、相对时间为12.852的4号峰、相对时间为19.779的5号峰、相对时间为43.361分钟的7号峰、相对时间为57.393分钟的 9号峰、相对时间为76.256分钟的11号峰、相对时间为82.525分钟的12号峰、相对时间为91.031分钟的14号峰、相对时间为112.437分钟的15号峰。

有益效果：

1、本发明根据精血补片中所含的活性成分，包括皂苷类、蒽醌类、萜类和黄酮类化合物的结构性质特点，通过大量实验筛选出最佳的流动相组成，梯度洗脱程序、流速，检测波长、色谱柱，柱温等分析条件，经多次实验验证表明，本发明提供的精血补片指纹图谱检测方法可以全面、客观、准确的检测和评价精血补片的质量，为保证临床疗效具有重要意义。

2、用本发明所提供的方法所建立的精血补片指纹图谱，能有效地表征精血补片片的质量，能客观体现各个构成指纹特征峰的前后顺序和相互关系，注重整体面貌特征，既可避免因测定个别化学成分而判定精血补片质量的片面性，又可减少为质量达标而人为处理的可能性。

3、本发明提供的精血补片指纹图谱的检测方法，具有方法简便、稳定、精密度高、重现性好等优点。

附图说明

图1为本发明所述的精血补片的对照指纹图谱。

图2为本发明所述的精血补片的10批次供试品指纹图谱。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例用到的仪器与试剂

仪器：LC-20AD高效液相色谱仪，包括岛津工作站、在线脱气机、自动进样器、紫外-可见光检测器、柱温箱(日本岛津公司)；

METTLER TOLEDO AL204型电子分析天平

METTLER TOLEDOXP6型电子分析天平；

KQ-250DB型数控超声波清洗器。

对照品：橙皮苷对照品(南京森贝伽生物科技有限公司，批号：161231，纯度≥98％)，二苯乙烯苷对照品(南京森贝伽生物科技有限公司，批号：160315，纯度≥98％)，五味子醇甲对照品(南京森贝伽生物科技有限公司，批号：161016，纯度≥99％)，大黄素对照品 (南京森贝伽生物科技有限公司，批号：130526，纯度≥98％)。

试剂：乙腈，色谱纯，美国天地公司，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2、药品来源

本发明用精血补片的批号分别为：150902、150601、150901、160401、160301、150903、 151101、130301、120303、120301，均产于江苏海昇药业有限公司。

实施例1一种精血补片指纹图谱的检测方法，包括以下步骤：

步骤1、精血补片供试品溶液的制备：分别取江苏海昇药业有限公司生产的分别为： 150902、150601、150901、160401、160301、150903、151101、130301、120303、120301的精血补片各0.25g置具塞锥形瓶中，加入石油醚20mL，在250W，40kHz超声下处理30分钟，冷却，摇匀，过滤，取滤渣蒸干，然后加入甲醇20mL，超声30分钟，最后的溶液定容于2mL 的容量瓶中，得到10批次的供试品溶液。

步骤2、参照峰溶液的制备：取一定量的橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲、和大黄素加甲醇溶解得到0.788mg/mL、0.293mg/mL、0.062mg/mL和0.019mg/mL的橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲和大黄素对照品混合溶液；

步骤3、分别精密吸取各供试品溶液和参照峰溶液注入液相色谱仪，记录115分钟的色谱图如图1；具体的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相B，以体积百分比浓度为0.1％甲酸为流动相A进行梯度洗脱；流速为1.0ml/min；检测波长为254nm；柱温为30℃；

梯度洗脱的流程为：0～10分钟，5→10％流动相B，95→90％流动相A；10～50分钟，10→25％流动相B，90→75％流动相A；50～65分钟，25→45％流动相B，75→55％流动相 A；65～80分钟，45％流动相B，55％流动相A；80～115分钟，45→80％流动相B，55→20％流动相A。

色谱柱规格为：YMC-PackODS-A色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)。

步骤4、将步骤3中获得的精血补片指纹图谱仪器导出，并导入中药色谱指纹图谱相似度评价系统；选择不同批次精血补片的色谱图中均存在的色谱峰作为共有峰；用平均值计算法生成精血补片的对照指纹图谱，如图2所示。计算各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。结果见表1。

表110批精血补片供试品溶液相似度评价结果

指纹图谱技术参数的确定，上述试验结果表明，以对照指纹图谱为参照计算相似度，10批精血补片指纹图谱相似度均在0.95以上，因此暂定精血补片指纹图谱标准为：供试品图谱应与对照指纹图谱一致，按中药色谱指纹图谱相似度评价系统，供试品指纹图谱与对照指纹图谱经相似度计算，相似度不得低于0.90。

色谱条件的优化：

1.1检测波长的选择

采用紫外-可见光检测器对精血补片供试品溶液进行全波长扫描检测，结果发现，在 284nm和254nm为检测波长时，此时谱图基线平稳、数目较多，分离度良好，峰形较尖，能够达到比较理想的分离效果；参照峰溶液进行检测时，在254nm为检测波长时，各参照峰形良好，故选择254nm作为本次实验精血补片HPLC指纹图谱研究过程中的吸收波长。

1.2色谱条件的优化

洗脱系统的选择

除洗脱系统条件外其它与供试品进行色谱检测的基本步骤相同。洗脱系统的选择，可以根据不同流动相下HPLC图谱上的色谱峰数目和峰形效果及分离效果，来确定流动相。根据大量实验摸索，结果发现：甲醇-水流动相下洗脱出的峰分离度不好，而且峰形不佳；乙腈- 水为流动相，洗脱出的峰数目较多，峰分离度较高，大多数峰形较好，个别峰形不行，可在水相中加入少量甲酸改变峰形，故最终洗脱系统选择为乙腈-0.1％甲酸水溶液。

1.3供试品溶液的制备

1.3.1提取方法的选择

样品处理采用了水浴加热回流和超声两种方式，采用甲醇超声，方法简单，HPLC图谱上显示的化学成分较多，且分离效果较好。

1.3.2提取溶剂的选择

对于甲醇浓度，采用体积浓度80％甲醇溶液和100％甲醇溶液进行超声比较，区别并不大，故采用100％甲醇溶液进行超声可以作为精血补片样品的提取方法，100％甲醇溶液超声供试品溶液，色谱图上的杂峰较多，可采用石油醚进行脱脂，去除一些小极性的化学成分。

1.4方法学验证

1.4.1精密度试验

取同一批精血补片供试品溶液(批号160301)，连续进样6次，每次进样量10μL，按实施例1中色谱条件检测，测定其HPLC色谱图，以橙皮苷为参考峰，对色谱图中15个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD<0.4％，共有峰峰面积RSD<1.8％，说明仪器精密度较好，其中橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲和大黄素保留时间和峰面积精密度试验结果见表2和表3。

表2精密度试验结果(n＝6)

表3精密度试验结果(n＝6)

1.4.2稳定性试验

取同一批精血补片供试品溶液(批号160301)，分别于0、4、8、16、24h，重复进样，每次进样量10μL，按实施例1中的色谱条件检测，测定其HPLC色谱图，以橙皮苷为参考峰，对色谱图中的15个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间RSD<0.8％，共有峰峰面积RSD<1.7％，说明供试品溶液在24h内稳定性较好，其中橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲和大黄素保留时间和峰面积稳定性试验结果见表4和表5。

表4稳定性试验结果(n＝5)

表5稳定性试验结果(n＝5)

1.4.3重复性试验

取同一批精血补片(批号160301)，按实施例1中供试品溶液的制备方法分别制备6份供试品溶液，进样量10μL，按实施例1中色谱条件检测，测定其HPLC色谱图，以橙皮苷为参考峰，对色谱图中的15个共有指纹峰进行考察，结果表明，共有指纹峰的保留时间 RSD<0.7％，共有峰峰面积RSD<2.5％，说明该方法重复性良好，其中橙皮苷、二苯乙烯苷、五味子醇甲和大黄素保留时间和峰面积重复性试验结果见表6和表7。

表6重复性试验结果(n＝6)

表7重复性试验结果(n＝6)

以上实验结果表明，本发明提供的精血补片指纹图谱检测方法，稳定性好，精密度高，重复性好，能全面客观评价血补片的质量，为保证临床疗效具有重要的意义。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

Claims

1.一种精血补片指纹图谱的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的精血补片指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤1精血补片供试品溶液制备方法为：取精血补片供试品0.1～0.5g置具塞锥形瓶中，加入石油醚20mL，在250W，40kHz超声下处理30分钟；然后加甲醇20mL，超声30分钟，最后的溶液定容于2mL的容量瓶中。

3.根据权利要求1所述的精血补片指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤3中，分别精密吸取供试品溶液和参照峰溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录115分钟的液相色谱图。

4.根据权利要求1所述的精血补片指纹图谱的检测方法，其特征在于，步骤3中，液相色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相B，以体积百分比浓度为0.1％甲酸水溶液为流动相A进行梯度洗脱；流速为1.0mL/min；检测波长为254nm；柱温为30℃；梯度洗脱的流程为：0～10分钟，5→10％流动相B，95→90％流动相A；10～50分钟，10→25％流动相B，90→75％流动相A；50～65分钟，25→45％流动相B，75→55％流动相A；65～80分钟，45％流动相B，55％流动相A；80～115分钟，45→80％流动相B，55→20％流动相A。

5.根据权利要求4所述的精血补片指纹图谱的检测方法，其特征在于，色谱柱规格为：4.6mm×250mm，5μm的YMC-Pack ODS-A色谱柱。

6.根据权利要求1所述的精血补片指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹图谱中的特征峰为与橙皮苷对应的8号峰，与二苯乙烯苷对应的6号峰，与五味子醇甲对应的10号峰，与大黄素对应的13号峰，其相对保留时间分别为47.296分钟、38.890分钟、75.158分钟、90.264分钟。

7.根据权利要求6所述的精血补片指纹图谱的检测方法，其特征在于，指纹图谱中的特征峰还包括：相对保留时间为7.294分钟的1号峰、相对时间9.388分钟为的2号峰、相对时间为12.419的3号峰、相对时间为12.852的4号峰、相对时间为19.779的5号峰、相对时间为43.361分钟的7号峰、相对时间为57.393分钟的9号峰、相对时间为76.256分钟的11号峰、相对时间为82.525分钟的12号峰、相对时间为91.031分钟的14号峰、相对时间为112.437分钟的15号峰。