CN101993424A - 落叶松树脂醇及其衍生物、制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了落叶松树脂醇及其衍生物、制备方法和在抗病毒中的应用。所述落叶松树脂醇及其衍生物，其是具有苯环和四氢呋喃环的木脂素类化合物以及其与单糖或多糖的酯化物，其分子结构的通式如下：

Description

落叶松树脂醇及其衍生物、制备方法和用途

技术领域

本发明涉及落叶松树脂醇及其衍生物，特别涉及落叶松树脂醇及其与单糖、多糖的衍生物。本发明还涉及所述落叶松树脂醇及其衍生物的制备方法和用途。

背景技术

板兰根为十字花科植物落蓝Isati、indlgotic。Fort的干燥根，具有清热解毒，凉血利咽作用。临床上广泛应用于治疗流感，带状疤疹、腮腺炎等病毒性疾病。有关板兰根抗病毒有效部位的研究已有许多报道，抗病毒有效物质种类较多，我们的研究工作进一步证实板兰根抗病毒有效部位主要与含有氨基酸或小肽的化合物有关。柯萨奇病毒B3(CVB3)是正链RNA病毒，属于小RNA病毒科，肠道病毒属。柯萨奇病毒是病毒性心肌炎的主要病原体，约50％病毒性心肌炎系CVB3所致，直接影响该病的预后。目前，常用的抗病毒药物病毒唑属核苷类似物，毒性较大，且具有致畸作用。因此，寻找更加安全有效的抗CVB3药物势在必行。南板蓝根是我国传统中药的重要组成，南板蓝根是产于我国热带地区的中药材。作者以广东省产的南板蓝根为主，以HeLa细胞为体外筛选模型，对其有效部位抗CVB3活性进行研究，为筛选新的抗病毒药物提供理论依据。

板蓝根临床上广泛用于治疗病毒和细菌感染性疾病。一些体内和体外的实验研究均证实了板蓝根的抗流感病毒活性。以鸡胚法考察15个种质的板蓝根对甲型流感病毒的抑制作用，血凝滴度显示板蓝根的水提醇沉淀对病毒的直接作用、治疗作用、预防作用的有效率分别为100％、60％、70给引本研究也显示了板蓝根抗流感病毒作用，在板蓝根的直接作用、预防作用和治疗作用下，流感病毒感染力分别下降200倍、1000倍和100倍(TCID。分别降低2.5log、3.0log、2.0log)，明显降低流感病毒体外增殖能力。采用血凝抑制试验方法，考察板蓝根凝集素效价与抑制流感病毒作用的关系，认为板蓝根凝集素的抗病毒功效与其血凝活性呈正相关，板蓝根凝集素具有血凝活性。在对板蓝根凝集素粗提液抗流感病毒的研究中发现，板蓝根凝集素对流感病毒具有显著的直接杀灭作用和预防作用及良好的治疗作用，而且抑制流感病毒的效果与板蓝根凝集素血凝活性的高低有关。

经研究表明，从板蓝根中分离得到的木脂素总苷lignan-sides是抑制流感病毒的有效成分，其中代表成分为落叶松树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷clemastanin B，其分子结构如下：

然而上述落叶松树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷clemastanin B在实际的药学实验中，表现出吸收性较差、药效较低等问题。

发明内容

鉴于作为板蓝根有效成分地落叶松树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷需要进行改良，故本发明中对于所述落叶松树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷进行的结构改良，以提高其药效等。

本发明的目的之一在于提供落叶松树脂醇及其衍生物，其作为结构改良的落叶松树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷，具有抗病毒的作用。

本发明的目的之二在于提供所述落叶松树脂醇及其衍生物的制备方法和用途，同时避免单纯的采用有机合成所带来的毒副作用较大的缺陷，并且避免单纯的采用原料提纯带来的药效较差的缺陷。

本发明所公开的落叶松树脂醇(lariciresinol)及其衍生物，是具有苯环和四氢呋喃环的木脂素类化合物以及其与单糖或多糖的酯化物，其分子结构的通式如下：

其中，R1为羟基、羟基与单糖的酯化物、羟基与多糖的酯化物。

在一个优选实施例中，所述R1为羟基，所述落叶松树脂醇衍生物的分子结构如下：

在一个优选实施例中，所述单糖为唾液酸C11H19NO9，即所述R1为羟基与唾液酸C11H19NO9的酯化物，所述落叶松树脂醇衍生物的分子结构如下：

在一个优选实施例中，所述单糖为唾液酸α-2，3-半乳糖C18H31NO14，即所述R1为羟基与唾液酸α-2，3-半乳糖C18H31NO14的酯化物，所述落叶松树脂醇衍生物的分子结构如下：

所述落叶松树脂醇及其衍生物是按照以下方法进行制备的，其包括用于制备落叶松树脂醇的步骤1～6以及用于制备其衍生物的步骤7。

所述步骤1为提取步骤，具体包括：

步骤1.1：按料液体积比1∶3～1∶9，将20目～50目的板蓝根药材粗粉与95％乙醇混合，将所得混合液在加热至80℃～90℃回流2小时，过滤得到乙醇提取液和残留物，向所得残留物中加入与之前所加95％乙醇体积相等的95％乙醇，将所得混合液在80℃～90℃下加热回流2小时，过滤再次得到乙醇提取液和残留物；

步骤1.2：合并所得乙醇提取液，并将其加热至55℃～65℃减压回收溶剂至残留物为浸膏状，得到总提取物浸膏。

所述步骤2为溶剂处理步骤，具体包括：

步骤2.1：按照体积比1∶8～1∶10，将所得浸膏与水混合，并将所得混合液加热至60℃～80℃搅拌15～25分钟，采用等体积氯仿萃取所得混合液1～4次，得到氯仿萃取过的水层，随后采用等体积乙酸乙酯萃取所得水层1～4次，合并乙酸乙酯萃取液并采用无水硫酸钠脱水，得到溶液；

步骤2.2：将所得溶液在30℃～40℃下减压回收溶剂至干，并按照料液体积比1∶4～1∶6将所得残留物溶于30℃～40℃的95％乙醇中，将所得溶液加热至40℃～50℃减压浓缩至所得溶液中乙醇含量不高于50％，得到残留物的乙醇溶液。

所述步骤3为大孔树脂处理步骤，具体包括：

步骤3.1：将所得的残留物的乙醇溶液加入大孔树脂柱中，采用10％乙醇溶液和30％乙醇溶液冲洗到无色，随后采用95％乙醇冲洗，收集流出液；

步骤3.2：将所得流出液加热回流至40℃～50℃减压回收溶剂至干，得到固体残留物。

所述步骤4为重结晶步骤，具体包括：

步骤4.1：将所得固体残留物溶于温度为30℃～40℃的甲醇和丙酮的混合溶液；

所述固体残留物与甲醇和丙酮的混合溶液的料液体积比为1∶4～1∶6；

所述甲醇和丙酮的混合溶液中，甲醇和丙酮的体积比为1∶1～1∶2；

步骤4.2：将所得溶液加热至30℃～40℃减压浓缩至原先体积的1/5，将所得浓缩物在-23℃～-13℃条件下静置12～24小时，析出黄色针状晶体，滤出晶体；

步骤4.3：将所得晶体在室温条件下采用甲醇、水反复重结晶2～4次，得到中间产物落叶松树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷；

所述甲醇、水反复重结晶过程是在3℃～7℃条件下自然析晶。

所述步骤5为水解步骤，具体包括：

步骤5.1：将0.8～1.2g所得中间产物溶于45～55mL 1％HCL溶液，并将所得溶液加热回流至60℃～80℃搅拌反应6～10小时，趁热抽滤；

步骤5.2：将所得滤液在室温下静置冷却0.5～1小时，采用45～55mL乙醚萃取1～3次，合并所得乙醚层并将其加热至40℃～50℃减压浓缩至干，得到落叶松树脂醇的粗产品。

所述步骤6为重结晶步骤，具体包括：

步骤6.1：将所得粗产品与15～25mL乙酸乙酯混合，并将所得混合液加热至35℃～40℃溶解，随后将所得溶液在-23℃～-13℃条件下静置析晶，得到析出物。

步骤6.2：采用步骤6.1的过程处理所得析出物2～3次，析出白色针状晶体，得到落叶松树脂醇。

所述步骤7为衍生化步骤，具体包括：

步骤7.1：将0.15～0.25g单糖或多糖溶于20～30ml二氯甲烷，随后在室温下依次加入0.8～1.2g所得落叶松树脂醇和40～60mg二环己基碳二亚胺(DCC)；

步骤7.2：将所得溶液在室温条件下搅拌8～12小时，随后加入等体积的水稀释，并采用等体积的二氯甲烷萃取3次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；

步骤7.3：将所得溶液加热回流至35℃～45℃减压蒸馏，除去溶剂，得到落叶松树脂醇与单糖或多糖的酯化物。

在一个优选实施例中，步骤7中所采用的单糖为唾液酸C11H19NO9。

在一个优选实施例中，步骤7中所采用的多糖为唾液酸α2，3-半乳糖C18H31NO14。

经上述制备过程所得的落叶松树脂醇及其衍生物，由于具有落叶松树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷的主体结构，具有抗病毒的作用，可别具有抗流感病毒的作用。

本发明同时公开了所述落叶松树脂醇及其衍生物在抗病毒中的应用，特别是在抗流感病毒中的应用。

本发明所公开的前述任一结构的落叶松树脂醇及其衍生物可以采用药剂学上的常规药物载体制成任何一种剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、软胶剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、脂质体注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。

附图说明

图1为落叶松树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷水解生成落叶松树脂醇的反应方程式。

图2为落叶松树脂醇与唾液酸的反应方程式。

图3为落叶松树脂醇与唾液酸α2，3-半乳糖的反应方程式。

具体实施方式

根据本发明的权利要求和发明内容所公开的内容，本发明的技术方案具体如以下实施例所述。

本发明所公开的制备方法是采用多级萃取和树脂树立的方法，提取板蓝根中的落叶松树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷，随后在酸性条件下，将经过重结晶处理后的落叶松树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷进行水解，从而制备得到本发明所公开的落叶松树脂醇。随后在二氯甲烷和二环己基碳二亚胺(DCC)存在的条件下，将经过重结晶提纯的落叶松树脂醇与单糖或多糖进行衍生化反应，从而制备得到本发明所公开的落叶松树脂醇及其衍生物。上述该制备过程主要包括落叶松树脂醇的制备以及用于其与单糖或多糖的衍生化。以下实施例所述制备过程，所采用的各种化学试剂如无特别标注，则为分析纯。

实施例1：落叶松树脂醇的制备

采用板蓝根药材粗粉作为原料，通过提取、溶剂处理、大孔树脂处理、重结晶、水解(如图1所示)、重结晶等步骤，制备得到落叶松树脂醇，其具体过程如下。

步骤1为提取步骤，其进一步包括：

步骤1.1：按料液体积比1∶3～1∶9，将20目～50目的板蓝根药材粗粉与95％乙醇混合，将所得混合液在加热至80℃～90℃回流2小时，过滤得到乙醇提取液和残留物，向所得残留物中加入与之前所加95％乙醇体积相等的95％乙醇，将所得混合液在80℃～90℃下加热回流2小时，过滤再次得到乙醇提取液和残留物；

步骤1.2：合并所得乙醇提取液，并将其加热至55℃～65℃减压回收溶剂至残留物为浸膏状，得到总提取物浸膏；

所述总提取物浸膏是密度ρ＝1.30的浸膏状提取物。

步骤2为溶剂处理步骤，其进一步包括：

步骤2.1：按照体积比1∶8～1∶10，将所得浸膏与水混合，并将所得混合液加热至60℃～80℃搅拌15～25分钟，采用等体积氯仿萃取所得混合液1～4次，得到氯仿萃取过的水层，随后采用等体积乙酸乙酯萃取所得水层1～4次，合并乙酸乙酯萃取液并采用无水硫酸钠脱水，得到溶液；

步骤2.2：将所得溶液在30℃～40℃下减压回收溶剂至干，并按照料液体积比1∶4～1∶6将所得残留物溶于30℃～40℃的95％乙醇中，将所得溶液加热至40℃～50℃减压浓缩至所得溶液中乙醇含量不高于50％，得到残留物的乙醇溶液。

步骤3为大孔树脂处理步骤，其进一步包括：

步骤3.1：将所得的残留物的乙醇溶液加入大孔树脂柱中，其柱径比1∶10～1∶15，采用10％乙醇溶液和30％乙醇溶液冲洗到无色，随后采用4倍柱体积的95％乙醇冲洗，收集流出液；

步骤3.2：将所得流出液加热回流至40℃～50℃减压回收溶剂至干，得到固体残留物。

步骤4为重结晶步骤，其进一步包括：

步骤4.1：将所得固体残留物溶于温度为30℃～40℃的甲醇和丙酮的混合溶液；

所述固体残留物与甲醇和丙酮的混合溶液的料液体积比为1∶4～1∶6；

所述甲醇和丙酮的混合溶液中，甲醇和丙酮的体积比为1∶1～1∶2；

步骤4.2：将所得溶液加热至30℃～40℃减压浓缩至原先体积的1/5，将所得浓缩物在-23℃～-13℃条件下静置12～24小时，析出黄色针状晶体，滤出晶体；

步骤4.3：将所得晶体在室温条件下采用甲醇、水反复重结晶2～4次，得到中间产物落叶松树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷；

所述甲醇、水反复重结晶过程是在3℃～7℃条件下自然析晶。

步骤5为水解步骤，其进一步包括：

步骤5.1：将0.8～1.2g所得中间产物溶于45～55mL 1％HCL溶液，并将所得溶液加热回流至60℃～80℃搅拌反应6～10小时，趁热抽滤；

步骤5.2：将所得滤液在室温下静置冷却0.5～1小时，采用45～55mL乙醚萃取1～3次，合并所得乙醚层并将其加热至40℃～50℃减压浓缩至干，得到落叶松树脂醇的粗产品。

步骤6为重结晶步骤，其进一步包括：

步骤6.1：将所得粗产品与15～25mL乙酸乙酯混合，并将所得混合液加热至35℃～40℃溶解，随后将所得溶液在-23℃～-13℃条件下静置析晶，得到析出物。

步骤6.2：采用步骤6.1的过程处理所得析出物2～3次，析出白色针状晶体，得到落叶松树脂醇。

经过上述步骤，制备得到落叶松树脂醇。

实施例2：衍生化

按照图2所示的反应方程式，在二氯甲烷和二环己基碳二亚胺(DCC)存在的条件下，将实施例1所制备得到的落叶松树脂醇与唾液酸C11H19NO9进行衍生化，从而得到落叶松树脂醇与唾液酸的酯化物，所述衍生化步骤7进一步包括：

步骤7.1：将0.15～0.25g唾液酸C11H19NO9溶于20～30ml二氯甲烷，随后在室温下依次加入0.8～1.2g所得落叶松树脂醇和40～60mg二环己基碳二亚胺(DCC)；

步骤7.2：将所得溶液在室温条件下搅拌8～12小时，随后加入等体积的水稀释，并采用等体积的二氯甲烷萃取3次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；

步骤7.3：将所得溶液加热回流至35℃～45℃减压蒸馏，除去溶剂，得到落叶松树脂醇与唾液酸的酯化物。

实施例3：衍生化

按照图2所示的反应方程式，在二氯甲烷和二环己基碳二亚胺(DCC)存在的条件下，将实施例1所制备得到的落叶松树脂醇与唾液酸α2，3-半乳糖C18H31NO14进行衍生化，从而得到落叶松树脂醇与唾液酸的酯化物，所述衍生化步骤7进一步包括：

步骤7.1：将0.15～0.25g唾液酸α2，3-半乳糖C18H31NO14溶于20～30ml二氯甲烷，随后在室温下依次加入0.8～1.2g所得落叶松树脂醇和40～60mg二环己基碳二亚胺(DCC)；

步骤7.2：将所得溶液在室温条件下搅拌8～12小时，随后加入等体积的水稀释，并采用等体积的二氯甲烷萃取3次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；

步骤7.3：将所得溶液加热回流至35℃～45℃减压蒸馏，除去溶剂，得到落叶松树脂醇与唾液酸α2，3-半乳糖的酯化物。

实施例4：

采用以下技术参数改进实施例1。

步骤1.1中，按照料液体积比为1∶4混合板蓝根药材粗粉与95％乙醇，每次加热回流的温度都为81℃。

步骤1.2中，加热减压回收的温度为56℃。

步骤2.1中，按照体积比1∶8.5混合所得浸膏与水，加热至62℃条件下搅拌24分钟，采用氯仿萃取所得混合液3次，采用乙酸乙酯萃取所得水层2次。

步骤2.2中，将所得溶液在31℃下减压回收溶剂至干，按照料液体积比1∶4.5将所得残留物溶于31℃的95％乙醇中，所得溶液加热至41℃减压浓缩，并且所得溶液中乙醇含量45％。

步骤3.2中，将所得流出液加热至41℃减压回收溶剂至干。

步骤4.1中，所述甲醇和丙酮的混合溶液中，甲醇和丙酮的体积比为1∶1.1，按照料液体积比为1∶4.5将所得固体残留物溶于所述混合溶液，且所述混合溶液的温度为31℃。

步骤4.2中，所得溶液加热至31℃进行减压浓缩，所得浓缩物在-22℃条件下静置14小时。

步骤4.3中，所得晶体采用甲醇、水反复重结晶3次并在4℃条件下自然析晶。

步骤5.1中，采用46mL 1％HCL溶液溶解0.9g所得中间产物，所得溶液加热回流至62℃搅拌反应9小时。

步骤5.2中，所得滤液静置冷却0.6小时，采用46mL乙醚萃取2次，所得乙醚层加热至41℃减压浓缩至干。

步骤6.1中，所得粗产品与16mL乙酸乙酯混合，所得混合液加热至36℃溶解，并在-22℃条件下静置析晶。

实施例5：

采用以下技术参数改进实施例1。

步骤1.1中，按照料液体积比为1∶5混合板蓝根药材粗粉与95％乙醇，每次加热回流的温度都为83℃。

步骤1.2中，加热减压回收的温度为58℃。

步骤2.1中，按照体积比1∶9混合所得浸膏与水，加热至66℃条件下搅拌22分钟，采用氯仿萃取所得混合液3次，采用乙酸乙酯萃取所得水层2次。

步骤2.2中，将所得溶液在33℃下减压回收溶剂至干，按照料液体积比1∶5将所得残留物溶于35℃的95％乙醇中，所得溶液加热至45℃减压浓缩，并且所得溶液中乙醇含量40％。

步骤3.2中，将所得流出液加热至43℃减压回收溶剂至干。

步骤4.1中，所述甲醇和丙酮的混合溶液中，甲醇和丙酮的体积比为1∶1.3，按照料液体积比为1∶5将所得固体残留物溶于所述混合溶液，且所述混合溶液的温度为33℃。

步骤4.2中，所得溶液加热至33℃进行减压浓缩，所得浓缩物在-20℃条件下静置16小时。

步骤4.3中，所得晶体采用甲醇、水反复重结晶3次并在5℃条件下自然析晶。

步骤5.1中，采用48mL 1％HCL溶液溶解0.95g所得中间产物，所得溶液加热回流至66℃搅拌反应8.5小时。

步骤5.2中，所得滤液静置冷却0.7小时，采用48mL乙醚萃取2次，所得乙醚层加热至43℃减压浓缩至干。

步骤6.1中，所得粗产品与18mL乙酸乙酯混合，所得混合液加热至37℃溶解，并在-20℃条件下静置析晶。

实施例6：

采用以下技术参数改进实施例1。

步骤1.1中，按照料液体积比为1∶6混合板蓝根药材粗粉与95％乙醇，每次加热回流的温度都为85℃。

步骤1.2中，加热减压回收的温度为60℃。

步骤2.1中，按照体积比1∶9混合所得浸膏与水，加热至70℃条件下搅拌20分钟，采用氯仿萃取所得混合液3次，采用乙酸乙酯萃取所得水层3次。

步骤2.2中，将所得溶液在35℃下减压回收溶剂至干，按照料液体积比1∶5将所得残留物溶于35℃的95％乙醇中，所得溶液加热至45℃减压浓缩，并且所得溶液中乙醇含量35％。

步骤3.2中，将所得流出液加热至45℃减压回收溶剂至干。

步骤4.1中，所述甲醇和丙酮的混合溶液中，甲醇和丙酮的体积比为1∶1.5，按照料液体积比为1∶5将所得固体残留物溶于所述混合溶液，且所述混合溶液的温度为35℃。

步骤4.2中，所得溶液加热至35℃进行减压浓缩，所得浓缩物在-18℃条件下静置18小时。

步骤4.3中，所得晶体采用甲醇、水反复重结晶3次并在5℃条件下自然析晶。

步骤5.1中，采用50mL 1％HCL溶液溶解1.0g所得中间产物，所得溶液加热回流至70℃搅拌反应8小时。

步骤5.2中，所得滤液静置冷却0.75小时，采用50mL乙醚萃取2次，所得乙醚层加热至45℃减压浓缩至干。

步骤6.1中，所得粗产品与20mL乙酸乙酯混合，所得混合液加热至37.5℃溶解，并在-18℃条件下静置析晶。

实施例7：

采用以下技术参数改进实施例1。

步骤1.1中，按照料液体积比为1∶7混合板蓝根药材粗粉与95％乙醇，每次加热回流的温度都为87℃。

步骤1.2中，加热减压回收的温度为62℃。

步骤2.1中，按照体积比1∶9混合所得浸膏与水，加热至67℃条件下搅拌18分钟，采用氯仿萃取所得混合液2次，采用乙酸乙酯萃取所得水层3次。

步骤2.2中，将所得溶液在37℃下减压回收溶剂至干，按照料液体积比1∶5将所得残留物溶于37℃的95％乙醇中，所得溶液加热至47℃减压浓缩，并且所得溶液中乙醇含量30％。

步骤3.2中，将所得流出液加热至47℃减压回收溶剂至干。

步骤4.1中，所述甲醇和丙酮的混合溶液中，甲醇和丙酮的体积比为1∶1.7，按照料液体积比为1∶5将所得固体残留物溶于所述混合溶液，且所述混合溶液的温度为37℃。

步骤4.2中，所得溶液加热至37℃进行减压浓缩，所得浓缩物在-16℃条件下静置20小时。

步骤4.3中，所得晶体采用甲醇、水反复重结晶3次并在5℃条件下自然析晶。

步骤5.1中，采用52mL 1％HCL溶液溶解1.05g所得中间产物，所得溶液加热回流至74℃搅拌反应7.5小时。

步骤5.2中，所得滤液静置冷却0.8小时，采用52mL乙醚萃取2次，所得乙醚层加热至47℃减压浓缩至干。

步骤6.1中，所得粗产品与22mL乙酸乙酯混合，所得混合液加热至38℃溶解，并在-16℃条件下静置析晶。

实施例8：

采用以下技术参数改进实施例1。

步骤1.1中，按照料液体积比为1∶8混合板蓝根药材粗粉与95％乙醇，每次加热回流的温度都为89℃。

步骤1.2中，加热减压回收的温度为64℃。

步骤2.1中，按照体积比1∶9.5混合所得浸膏与水，加热至78℃条件下搅拌16分钟，采用氯仿萃取所得混合液2次，采用乙酸乙酯萃取所得水层3次。

步骤2.2中，将所得溶液在39℃下减压回收溶剂至干，按照料液体积比1∶5.5将所得残留物溶于39℃的95％乙醇中，所得溶液加热至49℃减压浓缩，并且所得溶液中乙醇含量25％。

步骤3.2中，将所得流出液加热至49℃减压回收溶剂至干。

步骤4.1中，所述甲醇和丙酮的混合溶液中，甲醇和丙酮的体积比为1∶1.9，按照料液体积比为1∶5.5将所得固体残留物溶于所述混合溶液，且所述混合溶液的温度为39℃。

步骤4.2中，所得溶液加热至39℃进行减压浓缩，所得浓缩物在-14℃条件下静置22小时。

步骤4.3中，所得晶体采用甲醇、水反复重结晶3次并在6℃条件下自然析晶。

步骤5.1中，采用54mL 1％HCL溶液溶解1.1g所得中间产物，所得溶液加热回流至78℃搅拌反应7小时。

步骤5.2中，所得滤液静置冷却0.9小时，采用54mL乙醚萃取2次，所得乙醚层加热至49℃减压浓缩至干。

步骤6.1中，所得粗产品与24mL乙酸乙酯混合，所得混合液加热至39℃溶解，并在-14℃条件下静置析晶。

实施例9：

采用以下技术参数改进实施例2。

步骤7.1中，将0.16g唾液酸C11H19NO9溶于21ml二氯甲烷，依次加入0.85g所得落叶松树脂醇和42mg二环己基碳二亚胺(DCC)。

步骤7.2中，搅拌反应8.5小时。

步骤7.3中，所得溶液加热回流至36℃减压蒸馏。

实施例10：

采用以下技术参数改进实施例2。

步骤7.1中，将0.18g唾液酸C11H19NO9溶于23ml二氯甲烷，依次加入0.95g所得落叶松树脂醇和46mg二环己基碳二亚胺(DCC)。

步骤7.2中，搅拌反应9.5小时。

步骤7.3中，所得溶液加热回流至38℃减压蒸馏。

实施例11：

采用以下技术参数改进实施例2。

步骤7.1中，将0.20g唾液酸C11H19NO9溶于25ml二氯甲烷，依次加入1.00g所得落叶松树脂醇和50mg二环己基碳二亚胺(DCC)。

步骤7.2中，搅拌反应10小时。

步骤7.3中，所得溶液加热回流至40℃减压蒸馏。

实施例12：

采用以下技术参数改进实施例2。

步骤7.1中，将0.22g唾液酸C11H19NO9溶于27ml二氯甲烷，依次加入1.05g所得落叶松树脂醇和54mg二环己基碳二亚胺(DCC)。

步骤7.2中，搅拌反应10.5小时。

步骤7.3中，所得溶液加热回流至42℃减压蒸馏。

实施例13：

采用以下技术参数改进实施例2。

步骤7.1中，将0.24g唾液酸C11H19NO9溶于29ml二氯甲烷，依次加入1.15g所得落叶松树脂醇和58mg二环己基碳二亚胺(DCC)。

步骤7.2中，搅拌反应11.5小时。

步骤7.3中，所得溶液加热回流至44℃减压蒸馏。

实施例14：

采用以下技术参数改进实施例3。

步骤7.1中，将0.16g唾液酸α2，3-半乳糖C18H31NO14溶于21ml二氯甲烷，依次加入0.85g所得落叶松树脂醇和42mg二环己基碳二亚胺(DCC)。

步骤7.2中，搅拌反应8.5小时。

步骤7.3中，所得溶液加热回流至36℃减压蒸馏。

实施例15：

采用以下技术参数改进实施例3。

步骤7.1中，将0.18g唾液酸α2，3-半乳糖C18H31NO14溶于23ml二氯甲烷，依次加入0.95g所得落叶松树脂醇和46mg二环己基碳二亚胺(DCC)。

步骤7.2中，搅拌反应9.5小时。

步骤7.3中，所得溶液加热回流至38℃减压蒸馏。

实施例16：

采用以下技术参数改进实施例3。

步骤7.1中，将0.20g唾液酸α2，3-半乳糖C18H31NO14溶于25ml二氯甲烷，依次加入1.00g所得落叶松树脂醇和50mg二环己基碳二亚胺(DCC)。

步骤7.2中，搅拌反应10小时。

步骤7.3中，所得溶液加热回流至40℃减压蒸馏。

实施例17：

采用以下技术参数改进实施例3。

步骤7.1中，将0.22g唾液酸α2，3-半乳糖C18H31NO14溶于27ml二氯甲烷，依次加入1.05g所得落叶松树脂醇和54mg二环己基碳二亚胺(DCC)。

步骤7.2中，搅拌反应10.5小时。

步骤7.3中，所得溶液加热回流至42℃减压蒸馏。

实施例18：

采用以下技术参数改进实施例3。

步骤7.1中，将0.24g唾液酸α2，3-半乳糖C18H31NO14溶于29ml二氯甲烷，依次加入1.15g所得落叶松树脂醇和58mg二环己基碳二亚胺(DCC)。

步骤7.2中，搅拌反应11.5小时。

步骤7.3中，所得溶液加热回流至44℃减压蒸馏。

实施例19：

根据实施例4～8，特别是根据实施例6，制备得到落叶松树脂醇，其结构如下：

将所得落叶松树脂醇按照实施例9～13进行衍生化，特别是根据实施例11，制备得到落叶松树脂醇与唾液酸的酯化物，其结构如下：

将所得落叶松树脂醇按照实施例14～18进行衍生化，特别是根据实施例16，制备得到落叶松树脂醇与唾液酸α2，3-半乳糖的酯化物，其结构如下：

实施例20：落叶松树脂醇及其衍生物制剂的制备

按照上述实施例制备得到具有实施例19的分子式结构的各种落叶松树脂醇及其衍生物。

将所得落叶松树脂醇及其衍生物，采用药剂学上的常规药物载体，并采用药剂学上的常规制备方法，制备成药剂学上的常规剂型，包括但不限于片剂、胶囊剂、软胶剂、喷雾剂、凝胶剂、凝胶吸入剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、脂质体注射剂、靶向给药注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂，优选口服给药的制剂、喷雾剂等。

实施例21：落叶松树脂醇及其衍生物的体内抗流感病毒药效学试验

1、病毒及动物：

流感病毒小鼠适应株H1N1(A/PR8/34，中国预防科学院病毒研究所流感中心)。用SPF鸡胚尿囊接种，收集尿囊液，血凝滴度为I：2560(每毫升约2＊103倍LD50)，离心后分装，-70℃保存。小鼠IFN-γELISA试剂盒(u-CytechBio Science公司)。BALB/C雌性小鼠(SPF级，上海中医药大学)，20～22g。

2、实验方法：

2.1落叶松树脂醇及其衍生物的供试样品配制：

按照上述实施例制备得到具有实施例19的分子式结构的各种落叶松树脂醇及其衍生物，含量99.0％

2.2分组及动物模型的制备：

将120只小鼠随机均分为正常组、病毒组、落叶松树脂醇及其衍生物治疗I、II组。治疗I组病毒感染前5d开始，每只小鼠ip 1ml 1g/L/d落叶松树脂醇及其衍生物溶液，连续10d；治疗II组每鼠ip 1ml 1g/L/d落叶松树脂醇及其衍生物溶液，连续5d；正常组和病毒组均ip等量生理盐水，连续10d。各组小鼠(除正常组外)在实验第5天、于乙醚浅麻醉下，以50倍LD的攻击量滴鼻感染流感病毒，每鼠0.03ml。每天观察小鼠的生存状况，记录各组小鼠的死亡数和存活天数，病毒感染15d后，处死小鼠。同时取肺组织测定肺指数，取血测定IgG水平，取脾测定IFN-γ。

2.3血清中抗流感病毒抗体IgG的测定

用病毒液包被96孔板，在包被孔中分别加入100斗I不同稀释度的小鼠血清，设复孔、阴性对照，第二抗体用I：200HRP标记的羊抗小鼠IgG抗体，OPD-H202底物显色，1mol/L H2SO4终止反应。空白调零后，于490nm处测定各孔的吸光度。

2.4小鼠脾细胞中IFN-γ的测定

病毒感染后第15天处死小鼠，无菌条件下取睥组织，0.1g组织中加入1ml生理盐水，研磨成匀浆。此原液稀释10倍，连续5个梯度。按ELISA试剂盒说明书检测样品中IFN-γ的含量。

2.5统计学处理组间比较用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3、结果

3.1对鼠流感病毒性肺炎的治疗作用

用小鼠感染流感病毒后引发了小鼠肺炎，肺重增加，肺指数也相应增加。肺指数可作为评价指标之一。对鼠流感病毒性肺炎的治疗作用见表1。

表1落叶松树脂醇及其衍生物对流感病毒性肺炎的治疗效果(±s，n＝8)

3.2小鼠血清中IgG水平的比较

采用落叶松树脂醇及其衍生物治疗I、II组小鼠产生的血清抗流感病毒的抗体滴度(A490)分别为0.5634-0.08、0.545±0.08，明显高于病毒组(0.311±0.05)及正常组(0.134±0.02)，均有显著性差异(P＜0.01)。说明落叶松树脂醇及其衍生物能促进小鼠产生高滴度的IgG。但落叶松树脂醇及其衍生物治疗I、II组间比较无显著性差异(P＞0.05)。

3.3小鼠脾脏中IFN-γ水平的测定

正常组、病毒组、落叶松树脂醇及其衍生物治疗I、II组的IFN-γ水平分别为98±6.0、145±12、218±17、210±17ng/L。治疗I、II组与病毒组、正常组比较，IFN-γ水平明显升高(P＜0.05)。

实施例22：落叶松树脂醇及其衍生物制剂的应用

根据实施例21，按照上述实施例制备得到具有实施例19的分子式结构的落叶松树脂醇及其衍生物，用于抗病毒，特别是在抗病毒中的应用，特别是在抗流感病毒中的应用。

上述内容为本发明的具体实施例的例举，对于其中未详尽描述的试剂、设备、操作方法等，应当理解为采取本领域已有的普通及常规试剂、设备、操作方法等来予以实施。

同时本发明上述实施例仅为说明本发明技术方案之用，仅为本发明技术方案的列举，并不用于限制本发明的技术方案及其保护范围。采用等同技术手段、等同试剂等对本发明权利要求书及说明书所公开的技术方案的改进应当认为是没有超出本发明权利要求书及说明书所公开的范围。

Claims (10)

1.一种落叶松树脂醇(lariciresinol)及其衍生物，其特征在于，是具有苯环和四氢呋喃环的木脂素类化合物以及其与单糖或多糖的酯化物，其分子结构的通式如下：

其中，R1为羟基、羟基与单糖的酯化物、羟基与多糖的酯化物。

2.如权利要求1所述的落叶松树脂醇衍生物，其特征在于，所述R1为羟基与唾液酸C11H19NO9的酯化物，所述落叶松树脂醇衍生物的分子结构如下：

3.如权利要求1所述的落叶松树脂醇衍生物，其特征在于，所述R1为羟基与唾液酸α-2，3-半乳糖C18H31NO14的酯化物，所述落叶松树脂醇衍生物的分子结构如下：

4.一种如权利要求1所述的落叶松树脂醇及其衍生物的制备方法，其特征在于，包含以下步骤：

步骤1：提取

将板蓝根药材粗粉采用95％乙醇加热回流提取1～3次，得到乙醇提取液和残留物，合并所得各乙醇提取液，将其加热减压回收溶剂至残留物为浸膏状，得到总提取物浸膏；

步骤2：溶剂处理

将所得浸膏与水混合，并加热搅拌，采用等体积氯仿萃取所得混合液1～4次得到水层，随后采用等体积乙酸乙酯萃取所得水层1～4次，合并乙酸乙酯萃取液，将所得溶液减压回收溶剂至干，随后将所得残留物溶于95％乙醇，并将所得溶液加热减压浓缩至其中乙醇含量不高于50％，得到残留物的乙醇溶液；

步骤3：大孔树脂处理

将所得的残留物的乙醇溶液加入大孔树脂柱中，采用10％乙醇溶液和30％乙醇溶液冲洗到无色，随后采用95％乙醇冲洗，收集流出液，并将其加热回流减压回收溶剂至干，得到固体残留物；

步骤4：重结晶

将所得固体残留物溶于甲醇和丙酮的混合溶液，随后将所得溶液加热减压浓缩，将所得浓缩物静置析晶，得到黄色针状晶体，将所得晶体采用甲醇、水反复重结晶2～4次，得到中间产物落叶松树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷；

步骤5：水解

将所得中间产物溶于1％HCL溶液，并加热回流搅拌反应，随后趁热抽滤，并将所得滤液静置冷却，随后采用乙醚萃取1～3次，合并乙醚层并将其加热至减压浓缩至干，得到落叶松树脂醇的粗产品；

步骤6：重结晶

将所得粗产品溶于乙酸乙酯，随后将所得溶液静置析晶，重复上述溶解析晶过程处理2～3次，析出白色针状晶体，得到落叶松树脂醇。

5.如权利要求4所述的落叶松树脂醇及其衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤1、步骤2分别进一步包括以下步骤：

步骤1.1：按料液体积比1∶3～1∶9，将20目～50目的板蓝根药材粗粉与95％乙醇混合，将所得混合液在加热至80℃～90℃回流2小时，过滤得到乙醇提取液和残留物，向所得残留物中加入与之前所加95％乙醇体积相等的95％乙醇，将所得混合液在80℃～90℃下加热回流2小时，过滤再次得到乙醇提取液和残留物；

步骤1.2：合并所得乙醇提取液，并将其加热至55℃～65℃减压回收溶剂至残留物为浸膏状，得到总提取物浸膏；

步骤2.1：按照体积比1∶8～1∶10，将所得浸膏与水混合，并将所得混合液加热至60℃～80℃搅拌15～25分钟，采用等体积氯仿萃取所得混合液1～4次，得到氯仿萃取过的水层，随后采用等体积乙酸乙酯萃取所得水层1～4次，合并乙酸乙酯萃取液并采用无水硫酸钠脱水，得到溶液；

步骤2.2：将所得溶液在30℃～40℃下减压回收溶剂至干，并按照料液体积比1∶4～1∶6将所得残留物溶于30℃～40℃的95％乙醇中，将所得溶液加热至40℃～50℃减压浓缩至所得溶液中乙醇含量不高于50％，得到残留物的乙醇溶液。

6.如权利要求4所述的落叶松树脂醇及其衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤3、步骤4分别进一步包括以下步骤：

步骤3.1：将所得的残留物的乙醇溶液加入大孔树脂柱中，采用10％乙醇溶液和30％乙醇溶液冲洗到无色，随后采用95％乙醇冲洗，收集流出液；

步骤3.2：将所得流出液加热回流至40℃～50℃减压回收溶剂至干，得到固体残留物；

步骤4.1：将所得固体残留物溶于温度为30℃～40℃的甲醇和丙酮的混合溶液；

所述固体残留物与甲醇和丙酮的混合溶液的料液体积比为1∶4～1∶6；

所述甲醇和丙酮的混合溶液中，甲醇和丙酮的体积比为1∶1～1∶2；

步骤4.2：将所得溶液加热至30℃～40℃减压浓缩至原先体积的1/5，将所得浓缩物在-23℃～-13℃条件下静置12～24小时，析出黄色针状晶体，滤出晶体；

步骤4.3：将所得晶体在室温条件下采用甲醇、水反复重结晶2～4次，得到中间产物落叶松树脂醇-二-吡喃葡萄糖苷；

所述甲醇、水反复重结晶过程是在3℃～7℃条件下自然析晶。

7.如权利要求4所述的落叶松树脂醇及其衍生物的制备方法，其特征在于，所述步骤5、步骤6分别进一步包括以下步骤：

步骤5.1：将0.8～1.2g所得中间产物溶于45～55mL 1％HCL溶液，并将所得溶液加热回流至60℃～80℃搅拌反应6～10小时，趁热抽滤；

步骤5.2：将所得滤液在室温下静置冷却0.5～1小时，采用45～55mL乙醚萃取1～3次，合并所得乙醚层并将其加热至40℃～50℃减压浓缩至干，得到落叶松树脂醇的粗产品；

步骤6.1：将所得粗产品与15～25mL乙酸乙酯混合，并将所得混合液加热至35℃～40℃溶解，随后将所得溶液在-23℃～-13℃条件下静置析晶，得到析出物

步骤6.2：采用步骤6.1的过程处理所得析出物2～3次，析出白色针状晶体，得到落叶松树脂醇。

8.如权利要求4所述的落叶松树脂醇及其衍生物的制备方法，其特征在于，进一步包含步骤7衍生化，所述步骤7包括以下步骤：

步骤7.1：将0.15～0.25g唾液酸C11H19NO9溶于20～30ml二氯甲烷，随后在室温下依次加入0.8～1.2g所得落叶松树脂醇和40～60mg二环己基碳二亚胺(DCC)；

步骤7.2：将所得溶液在室温条件下搅拌8～12小时，随后加入等体积的水稀释，并采用等体积的二氯甲烷萃取3次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；

步骤7.3：将所得溶液加热回流至35℃～45℃减压蒸馏，除去溶剂，得到落叶松树脂醇与唾液酸的酯化物。

9.如权利要求4所述的落叶松树脂醇及其衍生物的制备方法，其特征在于，进一步包含步骤7衍生化，所述步骤7包括以下步骤：

步骤7.1：将0.15～0.25g唾液酸α2，3-半乳糖C18H31NO14溶于20-30ml二氯甲烷，随后在室温下依次加入0.8～1.2g所得落叶松树脂醇和40～60mg二环己基碳二亚胺(DCC)；

步骤7.2：将所得溶液在室温条件下搅拌8～12小时，随后加入等体积的水稀释，并采用等体积的二氯甲烷萃取3次，合并有机相并采用饱和食盐水洗涤、无水硫酸钠干燥；

步骤7.3：将所得溶液加热回流至35℃～45℃减压蒸馏，除去溶剂，得到落叶松树脂醇与唾液酸α2，3-半乳糖的酯化物。

10.如权利要求1所述的落叶松树脂醇及其衍生物在抗病毒中的应用，特别是在抗流感病毒中的应用。

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