CN103102252B - 一种从大青叶中分离纯化(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的方法 - Google Patents

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本发明涉及一种从大青叶中分离纯化(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的方法。该方法包括五步骤：A.匀浆破碎酶解：大青叶进行匀浆破碎，加入纤维素酶、果胶酶或两者组成的复合酶进行酶解；B.负压空化强化提取：甲醇、乙醇或醇水混合溶液进行负压空化强化提取；C.树脂富集：上样进入大孔吸附树脂柱，用30%～35%乙醇、50%～60%乙醇分步洗脱吸附有目标物的大孔吸附树脂；D.色谱分离：用90%甲醇溶解样品后，进入Toyopearl HW-40S凝胶树脂柱，梯度洗脱，分段收集流份；E.结晶：(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂素粗品用甲醇结晶得到纯度均大于95%的(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素产品。本发明方法步骤少，耗时短，溶剂消耗少，更加经济环保，且得率高，适合于规模化生产，具有较高的经济价值。

Description

一种从大青叶中分离纯化(+)-异落叶松树脂醇和(-)-落叶松脂素的方法
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种从大青叶中快速大量分离纯化高纯度(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的方法。
背景技术
大青叶是我国的传统中药，为十字花科植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的叶子。性味苦寒，归心、胃经。具有清热解毒、凉血消斑的功效，临床上则用作治疗各种病毒性流行感冒、流行性腮腺炎和病毒性肝炎等感染性疾病(仲卫国等，2011)。药理研究表明，其具有抗病毒、增强免疫力、抗内毒素、抗肿瘤、保肝利胆、抗菌、解热、抗炎等生物学活性(郑雪花，2007)。
(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素是大青叶的重要的有效成分。中国专利(公开号1704066)“异落叶松树脂醇的药物用途”，该专利公开的结果表明(＋)-异落叶松树脂醇能显著降低内毒素诱发的多脏器功能衰竭所致的小鼠死亡率。体内活性研究表明(－)-落叶松脂素具有显著的抗炎和抗感受伤害作用(KüpeliE.et al，2003)。另有研究表明落叶松脂素还具有抗真菌和调控树突状细胞功能的作用(Hwang B.et al，2011；戴先坤，2010)。尽管从植物中获得的(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的活性突出，但目前关于其分离纯化的报道较少(柳继锋等，2006；李彬等，2005；刘海利等，2002)，并且在这些报道中采用传统的提纯技术手段，需要进行有机溶剂萃取和正相硅胶柱层析，过程漫长、目标化合物易损失，而且毒性较大的有机试剂氯仿、二氯甲烷等使用量大，不利于环保与健康。
发明内容
本发明旨在克服上述缺陷，提供一种从大青叶中快速大量分离纯化高纯度(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的方法。
为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种从大青叶中分离纯化(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：
A.匀浆破碎酶解：新鲜或干燥大青叶按质量体积比加入4～10倍原料质量的水进行匀浆破碎3～10min，用柠檬酸、冰醋酸或盐酸调节浆液pH为4.0～5.5，加入纤维素酶、果胶酶或两者组成的复合酶使酶浓度为350～750U/mL，然后在35～55°C条件下酶解1～5h，过滤，收集滤液、滤渣。
B.负压空化强化提取：上述滤渣按质量体积比加入8～25倍滤渣质量的甲醇、乙醇或醇水混合溶液进行负压空化强化提取，提取温度为室温至50°C，提取压力为-0.05～-0.09MPa，提取2～4次，每次20min～60min，合并提取液与步骤A所得滤液，减压回收除去溶剂，得到大青叶浸膏。
C.树脂富集：上述大青叶浸膏按质量体积比分散于10～30倍浸膏质量的20%乙醇中后，上样进入大孔吸附树脂柱，上样体积为3～15倍柱体积，然后先用30%～35%乙醇充分洗脱，弃去洗脱液，再用50%～60%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收除去溶剂，得到树脂富集物。所述的大孔吸附树脂包括AB-8、X-5、H1020、D101、HPD826、HPD600、ADS-5和NKA-9型大孔吸附树脂。
D.色谱分离：上述树脂富集物加入90%甲醇至刚好溶解后进行连续中压色谱柱层析。其中，层析柱填料为Toyopearl HW-40S凝胶树脂；上样体积为柱体积的1/12～1/6；梯度洗脱依次选用的洗脱剂为90%甲醇、纯甲醇和丙酮，分段收集流份，得到(＋)-异落叶松树脂醇流份和(－)-落叶松脂素流份，然后分别减压浓缩至干，得到(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂素粗品。
E.结晶：(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂素粗品用甲醇反复重结晶得到纯度均大于95%的(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素。
本发明具有如下优点：
(1)步骤少，耗时短，得率高，操作简便，适合大规模生产。
(2)采用匀浆破碎酶解技术，粉碎过程不产生粉尘，安全绿色，并具有破坏细胞壁、使植物细胞和酶充分接触以及瞬时刺激诱发内源性酶活性的作用。
(3)树脂富集步骤中，分步洗脱使大部分大极性的糖苷和有机酸以及弱极性的生物碱被除去，大大提高了富集物中(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的含量。
(4)采用连续中压凝胶树脂柱色谱分离，无死吸附，极大提高得率，并且试剂毒性小，替代了硅胶柱层析常用的氯仿、二氯甲烷等高毒性试剂，更加快速、安全、环保。
附图说明
图1为(＋)-异落叶松树脂醇的结构
图2为(－)-落叶松脂素的结构
具体实施方式
实施例1
一种从大青叶中快速大量分离纯化高纯度(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的方法，按如下工艺步骤进行：
A.匀浆破碎酶解：1kg干燥大青叶加入5L水进行匀浆破碎5min，用盐酸调节浆液pH为4.0，加入纤维素酶使酶浓度为500U/mL，然后在40°C条件下酶解3h，过滤，收集滤液、滤渣。
B.负压空化强化提取：上述滤渣加入17L乙醇进行负压空化强化提取，提取温度为45°C，提取压力为-0.06MPa，提取2次，每次50min，合并提取液与步骤A所得滤液，减压回收除去溶剂，得到大青叶浸膏170g。
C.树脂富集：上述大青叶浸膏分散于4.5L20%乙醇中后，上样进入NKA-9大孔吸附树脂柱，上样体积为12倍柱体积，然后先用35%乙醇充分洗脱，弃去洗脱液，再用55%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收除去溶剂，得到树脂富集物9.3g。
D.色谱分离：上述树脂富集物加入90%甲醇至刚好溶解后进行连续中压色谱柱层析。层析柱填料为Toyopearl HW-40S凝胶树脂；上样体积为柱体积的1/7；梯度洗脱依次选用的洗脱剂为90%甲醇、纯甲醇和丙酮，分段收集流份，得到(＋)-异落叶松树脂醇流份和(－)-落叶松脂素流份，然后分别减压浓缩至干，得到(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂素粗品。
E.结晶：(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂素粗品用甲醇反复重结晶得到纯度为96%的(＋)-异落叶松树脂醇295mg和纯度为96.6%的(－)-落叶松脂素276mg。
实施例2
一种从大青叶中快速大量分离纯化高纯度(＋)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素的方法，按如下工艺步骤进行：
A.匀浆破碎酶解：1kg干燥大青叶加入7L水进行匀浆破碎8min，用冰醋酸调节浆液pH为5.0，加入纤维素酶和果胶酶的复合酶使纤维素酶浓度为350U/mL、果胶酶浓度为200U/mL，然后在45°C条件下酶解2h，过滤，收集滤液、滤渣。
B.负压空化强化提取：上述滤渣加入10L80%乙醇进行负压空化强化提取，提取温度为35°C，提取压力为-0.075MPa，提取3次，每次30min，合并提取液与步骤A所得滤液，减压回收除去溶剂，得到大青叶浸膏195g。
C.树脂富集：上述大青叶浸膏分散于3.5L20%乙醇中后，上样进入H1020大孔吸附树脂柱，上样体积为6倍柱体积，然后先用30%乙醇充分洗脱，弃去洗脱液，再用50%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收除去溶剂，得到树脂富集物11.2g。
D.色谱分离：上述树脂富集物加入90%甲醇至刚好溶解后进行连续中压色谱柱层析。层析柱填料为Toyopearl HW-40S凝胶树脂；上样体积为柱体积的1/10；梯度洗脱依次选用的洗脱剂为90%甲醇、纯甲醇和丙酮，分段收集流份，得到(＋)-异落叶松树脂醇流份和(－)-落叶松脂素流份，然后分别减压浓缩至干，得到(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂素粗品。
E.结晶：(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂素粗品用甲醇反复重结晶得到纯度为97.5%的(＋)-异落叶松树脂醇393mg和纯度为96.9%的(－)-落叶松脂素356mg。

Claims (1)

1.一种从大青叶中分离纯化(+)-异落叶松树脂醇和(-)-落叶松脂素的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：
A.匀浆破碎酶解：新鲜或干燥大青叶按质量体积比加入4～10倍原料质量的水进行匀浆破碎3～10min，用柠檬酸、冰醋酸或盐酸调节浆液pH为4.0～5.5，加入纤维素酶、果胶酶或两者组成的复合酶使酶浓度为350～750U/mL，然后在35～55℃条件下酶解1～5h，过滤，收集滤液、滤渣；
B.负压空化强化提取：上述滤渣按质量体积比加入8～25倍滤渣质量的甲醇、乙醇或醇水混合溶液进行负压空化强化提取，提取温度为室温至50℃，提取压力为-0.05～-0.09MPa，提取2～4次，每次20min～60min，合并提取液与步骤A所得滤液，减压回收除去溶剂，得到大青叶浸膏；
C.树脂富集：上述大青叶浸膏按质量体积比分散于10～30倍浸膏质量的20%乙醇中后，上样进入NKA-9或H1020大孔吸附树脂柱，上样体积为3～15倍柱体积，然后先用30%～35%乙醇充分洗脱，弃去洗脱液，再用50%～60%乙醇洗脱，收集洗脱液，减压回收除去溶剂，得到树脂富集物；
D.色谱分离：上述树脂富集物加入90%甲醇至刚好溶解后进行连续中压色谱柱层析，其中，层析柱填料为Toyopearl HW-40S凝胶树脂；上样体积为柱体积的1/12～1/6；梯度洗脱依次选用的洗脱剂为90%甲醇、纯甲醇和丙酮，分段收集流份，得到(+)-异落叶松树脂醇流份和(-)-落叶松脂素流份，然后分别减压浓缩至干，得到(+)-异落叶松树脂醇粗品和(-)-落叶松脂素粗品；
E.结晶：(＋)-异落叶松树脂醇粗品和(－)-落叶松脂素粗品用甲醇反复重结晶得到纯度均大于95%的(+)-异落叶松树脂醇和(－)-落叶松脂素。
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