CN107325138B

CN107325138B - 一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种主要花色苷的方法

Info

Publication number: CN107325138B
Application number: CN201610979230.6A
Authority: CN
Inventors: 付玉杰; 焦骄; 黄玉岩; 顾成波; 李璐; 崔琦; 刘巨钊
Original assignee: Northeast Forestry University
Current assignee: Daxing'anling Anxilai Chaoyue Biotechnology Co ltd
Priority date: 2016-11-08
Filing date: 2016-11-08
Publication date: 2020-04-28
Anticipated expiration: 2036-11-08
Also published as: CN107325138A

Abstract

本发明涉及一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种主要花色苷的方法。目的是提供一种简便、经济、绿色环保、收率高的从黑加仑果渣中提取分离纯化四种高纯度花色苷的方法。该方法以工业生产加工后的黑加仑废渣为原料采用匀浆破碎偶合酶水解技术、负压空化强化提取技术、大孔吸附树脂树脂富集技术、中压快闪反向色谱分离技术以及低温晶析和重结晶技术等得到纯度可达95％的飞燕草素3‑O‑葡萄糖苷、飞燕草素3‑O‑芸香糖苷、矢车菊素3‑O‑葡萄糖苷和矢车菊素3‑O‑芸香糖苷四种花色苷单体成分。该方法的原料丰富易得、工艺耗时短、溶剂消耗少、所得花色苷纯度高、生产成本低，适合用于规模化工业化生产。

Description

一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种主要花色苷的方法

技术领域

本发明涉及一种从黑加仑果渣中提取分离纯化高纯度四种花色苷的方法，属于植物次生代谢产物分离纯化领域。

背景技术

黑加仑，学名黑穗醋栗(Ribes nigrruu L.)，俗称黑豆果，别名黑夏果，为虎耳草科(saxifragaceae)、茶蕉子属(Ribes)的一种落叶小灌木，主产于我国东北地区和新疆北部，其果实为暗紫褐色小浆果，可以食用，也可以加工成果汁、果酱等食品。黑加仑含有丰富的糖、有机酸、多种维生素、花色苷、活性矿物质及特殊芳香成分，具有很高的营养价值和药用价值。其中总花色苷含量为3.5mg/g鲜果重(张志东2002)。目前己经知道的黑加仑的治疗功能包括痛风、肾结石、膀肤炎、出疹热、蛋白尿、贫血病、水肿、风湿病、痢疾、胃肠炎、口腔和咽喉疾病、支气管咳嗽等(赵新淮1998)。

花色苷(Anthocyanin)是一类广泛存在于植物中的水溶性色素,属于类黄酮化合物，花色苷是花青素与糖以糖苷键结合而成的一类化合物，广泛存在于植物的花、果实、茎、叶和根器官的细胞液中，使其呈现由红、紫红到兰等不同颜色。花色苷它不但是一种很好的天然食用色素,而且具有美容、养颜、降脂、减肥和抗衰老等重要的生理功能(金海英2006)。花色苷的主要作用在于清除自由基，对花色苷成分药理研究发现其有促进视红素再合成、改善循环、抗溃疡、抗炎症等多种药理活性,可以明显改善用眼疲劳(李春阳2006)。黑加仑浆果资源在工厂生产黑加仑果制品后，剩余的果渣现在基本上一部分作为粗加工产品如果酱，果糖等的原料，附加值低，另一部分作废弃物处理，造成了资源的浪费。黑加仑果皮富含天然花色苷，是食品工业不可缺少的基本原料。黑加仑果皮中主要含有四种花色苷，分别是飞燕草素3-O-葡萄糖苷、飞燕草素3-O-芸香糖苷、矢车菊素3-O-葡萄糖苷和矢车菊素3-O-芸香糖苷。到目前为止分离纯化花色苷单体的方法一般都是用半制备高效液相色谱或高速逆流色谱法等，这些方法普遍存在设备昂贵、方法烦琐等缺点，且无法进行大规模的分离纯化，在实际生产中难以得到应用，使得花色苷产品大量缺乏，价格非常昂贵。

本发明以工业生产过程中产生的废弃果渣为原料，提出了一种通过多种现代分离技术手段相结合的方法，实现经济有效、简单快速、损失少且绿色环保的提取、分离和纯化黑加仑花色苷的方法，可实现黑加仑花色苷的产业化生产，为食品工业以及其应用提供一种良好的天然黑加仑花色苷，产品纯度高,，大大提高了产品的附加值，对浆果加工产业具有重要的推动作用。

发明内容

本发明的目的在于提供一种以黑加仑果渣为原料，通过匀浆破碎偶合酶水解技术、负压空化提取技术、大孔吸附树脂技术、中压快闪反相硅胶柱层析分离技术及低温析晶和重结晶技术，达到快速、简单获得黑加仑花色苷单体。该方法分离纯化工艺简单易行，操作安全，产品得率高以及纯度高，同时适用于工业应用。

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

(1).匀浆破碎偶合酶水解黑加仑果渣：将黑加仑果渣按质量体积比加入5～9倍原料质量的水进行匀浆破碎三次，每次4～9min，用柠檬酸或盐酸调节浆液pH为3～6，按果渣质量比20～60mg/g加入纤维素酶、果胶酶或上述两种酶的混合酶，然后将浆液放入恒温摇床中，在温度20～50℃酶解1～5h，抽滤，收集滤液滤渣。

(2).负压空化强化提取黑加仑滤渣：将上一步骤中的滤渣按质量体积比10～30倍的滤渣质量的乙醇进行负压空化提取，乙醇浓度为70-90％，负压空化提取压力为-0.04～-0.09MPa，室温下提取2～4次，提取时间为30～50min，将得到的滤液与步骤(1)中的滤液合并，减压浓缩回收出去溶剂，得到黑加仑浸膏。

(3).大孔吸附树脂富集黑加仑花色苷：选用的大孔吸附树脂型号包括D4020、AB-8、NKA-9、D3520、D101和DM-130树脂中的一种。将上述黑加仑浸膏按质量体积比分散于10～30倍浸膏质量的蒸馏水中后，离心取上层清液上样进入大孔吸附树脂柱，上样体积为2～10倍柱体积。吸附饱和后用蒸馏水洗脱杂质至流出液液体无色，然后用20～50％乙醇洗脱，收集洗脱溶液，减压回收除去溶剂，得到黑加仑花色苷大孔树脂富集物；

(4).中压快闪反相色谱分离花色苷单体：将黑加仑花色苷树脂富集物加入初始流动相溶解后进行0.45μm滤膜过滤上样。中压层析柱填料为ODS-C₁₈反相硅胶，上样体积为柱体积的1/10～1/5，选用流动相A－水:甲酸(90:10)，流动相B－乙腈：甲醇(85:15)，A:B＝93:7等梯度洗脱，洗脱流速为20～35ml/min。随后用HPLC在检测波长520nm下检测流出物成分，合并相同部分，得到花色苷4种单体成分。

(5).低温晶析和重结晶黑加仑花色苷：低温晶析和重结晶所用溶剂为50～70％乙醇，用溶剂饱和溶解中压柱层析得到的花色苷单体组分，然后进行低温晶析(晶析温度为-4～20℃)和重结晶。

本发明具有下列优点：

1.本发明所用的原料为工业生产中弃用的黑加仑果渣，可以高效的废物利用。工艺简单易行、步骤少、耗时短、得率高、条件温和，适合大规模生产。

2.采用先进的匀浆破碎偶合酶水解技术，具有粉碎、提取和生物转化与一体的特点，同时具有绿色环保的特点。该技术使植物细胞壁快速充分破碎，与酶充分反应增加了游离态目标成分的含量，加速了细胞内的有效成分扩散到溶剂中，同时负压空化强效传质提取技术的应用可以大大提高了目标物的提取效率。

3.大孔吸附树脂富集花色苷步骤中，可以简单有效的将非目标化合物去除，得到花色苷含量较高的富集物。

4.中压快闪反相色谱分离技术及低温晶析和重结晶技术用于黑加仑四种花色苷的分离，所得产品得率高、纯度高，工艺快速、可缩短实验周期，降低黑加仑花色苷的生产成本。

附图说明

图1为黑加仑花色苷的结构

(1)飞燕草素3-O-葡萄糖苷结构

(2)飞燕草素3-O-芸香糖苷结构

(3)矢车菊素3-O-葡萄糖苷结构

(4)矢车菊素3-O-芸香糖苷结构

图2为黑加仑花色苷的HPLC色谱图

(A)标准品HPLC色谱图

(B)黑加仑提取样品HPLC色谱图

(C)纯化后的飞燕草素3-O-葡萄糖苷HPLC色谱图

(D)纯化后的飞燕草素3-O-芸香糖苷HPLC色谱图

(E)纯化后的矢车菊素3-O-葡萄糖苷HPLC色谱图

(F)纯化后的矢车菊素3-O-芸香糖苷HPLC色谱图

图3为黑加仑花色苷的质谱图

(A)纯化后的飞燕草素3-O-葡萄糖苷的二级质谱谱图

(B)纯化后的飞燕草素3-O-芸香糖苷的二级质谱谱图

(C)纯化后的矢车菊素3-O-葡萄糖苷的二级质谱谱图

(D)纯化后的矢车菊素3-O-芸香糖苷的二级质谱谱图

具体实施方案

实施例1

将1kg黑加仑果渣加入6L水进行匀浆破碎三次，每次5min，用柠檬酸调节浆液pH为4，加入纤维素酶30g，然后将浆液放入恒温摇床中，在温度30℃酶解2h，抽滤，收集滤液滤渣。向滤渣中加入12L乙醇进行负压空化提取，乙醇浓度为80％，负压空化提取压力为-0.05MPa，室温下提取3次，提取时间为30min，将得到的滤液与步骤(1)中的滤液合并，减压浓缩回收出去溶剂，得到黑加仑浸膏168.6g。选用大孔吸附树脂型号AB-8树脂。将上述黑加仑浸膏分散于3L纯水中后，离心取上层清液上样进入大孔吸附树脂柱，上样体积为10倍柱体积。吸附饱和后用蒸馏水洗脱杂质至流出液液体无色，然后用30％乙醇洗脱，收集洗脱溶液，减压回收除去溶剂，得到黑加仑花色苷大孔树脂富集物6.7g；将黑加仑花色苷大孔树脂富集物加入初始流动相溶解后进行0.45μm滤膜过滤上样。中压层析柱填料为ODS-C₁₈反相硅胶，上样体积为柱体积的1/8，选用流动相A-水:甲酸(90:10)，流动相B-乙腈:甲醇(85:15)，A:B＝93:7等梯度洗脱，洗脱流速为20ml/min。用HPLC在检测波长520nm检测流出物成分，合并相同部分，然后分别减压浓缩至干。用50％乙醇作为溶剂饱和溶解中压柱层析得到的花色苷组分，然后进行低温晶析，重结晶后得到纯度可达95.6％飞燕草素3-O-葡萄糖苷221mg、纯度可达96.2％飞燕草素3-O-芸香糖苷357mg、纯度可达95％矢车菊素3-O-葡萄糖苷118mg和纯度可达95.8％矢车菊素3-O-芸香糖苷326mg。

实施例2

将1kg黑加仑果渣加入8L水进行匀浆破碎三次，每次5min，用盐酸调节浆液pH为5，加入纤维素酶果胶酶混合酶50g，然后将浆液放入恒温摇床中，在温度45℃酶解4h，抽滤，收集滤液滤渣。向滤渣中加入15L乙醇进行负压空化提取，乙醇浓度为80％，负压空化提取压力为-0.07MPa，室温下提取4次，提取时间为40min,将得到的滤液与步骤(1)中的滤液合并，减压浓缩回收出去溶剂，得到黑加仑浸膏189.3g。选用大孔吸附树脂型号D101树脂。将上述黑加仑浸膏分散于2L纯水中后，离心取上层清液上样进入大孔吸附树脂柱，上样体积为5倍柱体积。吸附饱和后用蒸馏水洗脱杂质至流出液液体无色，然后用40％乙醇洗脱，收集洗脱溶液，减压回收除去溶剂，得到黑加仑花色苷大孔树脂富集物7.8g；将黑加仑花色苷大孔树脂富集物加入初始流动相溶解后进行0.45μm滤膜过滤上样。中压层析柱填料为ODS-C₁₈反相硅胶，上样体积为柱体积的1/10，选用流动相A-水:甲酸(90:10)，流动相B-乙腈:甲醇(85:15)，A:B＝93:7等梯度洗脱，洗脱流速为30ml/min。随后用HPLC在检测波长520nm检测流出物成分，合并相同部分，然后分别减压浓缩至干。用55％乙醇作为溶剂饱和溶解中压柱层析得到的花色苷组分，然后进行低温晶析，重结晶后得到纯度可达95.1％飞燕草素3-O-葡萄糖苷255mg、纯度可达95.8％飞燕草素3-O-芸香糖苷445mg、纯度可达95.3％矢车菊素3-O-葡萄糖苷136mg和纯度可达96％矢车菊素3-O-芸香糖苷387mg。

Claims

1.一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种花色苷的方法，其特征在于按如下工艺步骤进行：

(1).匀浆破碎偶合酶水解黑加仑果渣：将黑加仑果渣加入质量体积比5～9倍的水进行匀浆破碎，将得到黑加仑果渣浆按质量比20～60mg/g加入纤维素酶、果胶酶或上述两种酶的混合酶，放入恒温摇床中进行酶解，抽滤，收集滤液滤渣；

(2).负压空化强化提取黑加仑滤渣：将得到的黑加仑滤渣用乙醇溶液进行负压空化强化提取，乙醇浓度为70-90％，负压空化提取压力为-0.04～-0.09MPa，室温下提取2-4次，提取时间为30～50min，提取结束后进行抽滤，将得到的滤液与步骤(1)中的滤液合并，减压浓缩回收除去溶剂，得到黑加仑浸膏；

(3).大孔吸附树脂富集黑加仑花色苷：将得到的浸膏加入适量的水溶解进行离心，将得到的上清液加入D4020、AB-8、NKA-9、D3520、D101和DM-130大孔吸附树脂柱中的一种，进行吸附富集，然后用蒸馏水进行非目标化合物的洗脱，弃去蒸馏水洗脱液，再用20～50％乙醇洗脱，收集洗脱液；减压回收除去溶剂，得到黑加仑花色苷树脂富集物；

(4).中压快闪反相色谱分离花色苷单体：步骤(3)得到的富集物用一定比例水，甲醇，甲酸溶液刚好溶解后上ODS-C₁₈反相硅胶中压柱，选用流动相A-水:甲酸(90:10)，流动相B-乙腈：甲醇(85:15)，A:B＝93:7进行等梯度洗脱，洗脱流速为20～35mL/min，收集相应的洗脱液得到相应的花色苷单体；

(5).低温晶析和重结晶黑加仑花色苷：将得到的花色苷成分经过低温晶析和重结晶得到纯度可达95％的花色苷单体成分，分别为飞燕草素3-O-葡萄糖苷、飞燕草素3-O-芸香糖苷、矢车菊素3-O-葡萄糖苷、矢车菊素3-O-芸香糖苷。

2.根据权利要求1所述的一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种花色苷的方法，其特征在于加入按质量体积比5～9倍原材料的水进行匀浆破碎，连续匀浆破碎三次，每次4～9分钟，将匀浆破碎后得到的浆液用柠檬酸或盐酸将PH值调节到3～6，将得到黑加仑果渣浆按质量比20～60mg/g加入纤维素酶、果胶酶或上述两种酶的混合酶，然后将浆液放入恒温摇床中，在温度20～50℃酶解1～5h，抽滤，收集滤液滤渣。

3.根据权利要求1所述的一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种花色苷的方法，其特征在于将上一步骤中的滤渣按质量体积比10～30倍的滤渣质量的乙醇进行负压空化提取，乙醇浓度为70-90％，负压空化提取压力为-0.04～-0.09MPa，室温下提取2～4次，提取时间为30～50min,将得到的滤液与步骤(1)中的滤液合并，减压浓缩回收除去溶剂，得到黑加仑浸膏。

4.根据权利要求1所述的一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种花色苷的方法，其特征在于选用大孔吸附树脂型号为D4020、AB-8、NKA-9、D3520、D101和DM-130树脂中的一种，上述黑加仑浸膏按质量体积比分散于10～30倍浸膏质量的纯水中后，离心取上层清液上样加入大孔吸附树脂柱，上样体积为1～10倍柱体积，吸附饱和后用蒸馏水洗脱杂质至流出液无色，然后用20～50％乙醇洗脱，收集洗脱溶液，减压回收除去溶剂，得到黑加仑花色苷树脂富集物。

5.根据权利要求1所述的一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种花色苷的方法，其特征在于将黑加仑花色苷树脂富集物加入初始流动相溶解后进行0.45μm过滤上样，中压层析柱填料为ODS-C₁₈反相硅胶，上样体积为柱体积的1/10～1/5，选用流动相A-水：甲酸(90：10)，流动相B-乙腈：甲醇(85：15)，A：B＝93：7等梯度洗脱，洗脱流速为20～35mL/min，用HPLC在检测波长520nm检测流出物成分，合并相同部分。

6.按照权利要求1所述的一种从黑加仑果渣中提取分离纯化四种花色苷的方法，其特征在于其低温晶析和重结晶所用溶剂为50～70％乙醇，用溶剂饱和溶解中压柱层析得到的花色苷单体组分，然后进行低温晶析和重结晶，晶析温度为-4～20℃。