CN103599146B

CN103599146B - 一种利尿组合物的制备方法与用途

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Publication number: CN103599146B
Application number: CN201310553170.8A
Authority: CN
Inventors: 许福泉; 冯媛媛; 郭雷; 阎斌伦
Original assignee: Huaihai Institute of Techology
Current assignee: Huaihai Institute of Techology
Priority date: 2013-11-11
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2016-04-27
Anticipated expiration: 2033-11-11
Also published as: CN103599146A

Abstract

本发明是一种利尿组合物的制备方法，其步骤如下：取柽柳的干燥枝叶，净选、粉碎，用水或醇类溶剂进行提取；提取液经浓缩干燥后得提取物，水复溶后经大孔树脂层析，以0%、5%、15%、65%、95%乙醇水溶液洗脱剂，得到65%洗脱物，即得利尿组合物；对利尿组合物进行系统分离，可得到24种化合物。本发明可以充分利用滩涂地区丰富的传统柽柳资源，且该组合物及其制剂主要具有利尿功效，可用于治疗水肿性疾病。

Description

一种利尿组合物的制备方法与用途

技术领域

本发明涉及一种组合物的制备方法，特别是一种利尿组合物的制备方法与用途。

背景技术

柽柳（TamarixchinensisLour.）为柽柳科植物，其干燥细嫩枝叶为我国常用中药，收载历版《中华人民共和国药典》，味甘、辛，性平，具有散风、解表、透疹等功效，可用于麻疹不透、风湿痹痛等症。但迄今为止，尚未见有关柽柳利尿作用组合物成分及应用的报道。

水肿是一种临床常见证候，其发生原因较多，中医药根据其发病机理不同，归纳为以下五种治疗方法：1.）通过活血化瘀而利水，主要用于治疗慢性肾炎、肝硬化等引起的水肿；2.）通过温阳而利水，主要用于治疗膀胱气化不足，肾阳虚衰等引起的水肿；3.）通过理气而利水，主要通过肺气肃降、通条水道，下达膀胱，排出体外；4.）健脾燥湿而利水，主要用于脾阳虚弱湿困脾土，气不化水，运化无权，水邪四溢；5.）逐水消肿，主要用于水肿严重，口渴、面赤、气粗或喘、肤胀坚实，二溲不同，燥实之阳水证。其中又以前三种基于利尿的方法应用最为广泛。另外，1957年以来长期的临床验证显示：利用小剂量利尿剂可以有效降压，且不易产生耐药性，可单独作为首选药治疗高血压。根据中医药认识，借鉴中药独特的诊疗和恢复优势，从传统中药中挖掘具有安全、高效利尿新型药物具有重大的临床价值和社会意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种新、操作简单、有效成份可控的利尿组合物的制备方法。

本发明所要解决的别一个技术问题是提供了上述方法所制得的利尿组合物的用途。

本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种利尿组合物的制备方法，其特点是，其步骤如下：

（1）取柽柳的干燥枝叶，净选、粉碎，用水或醇类溶剂进行提取；提取液经浓缩干燥后得提取物，水复溶后经大孔树脂层析，以0%、5%、15%、65%、95%乙醇水溶液洗脱剂，得到65%洗脱物，即得利尿组合物；

（2）对利尿组合物进行系统分离，首先利用MCI柱色谱以0%、10%、30%、60%、95%甲醇水溶液洗脱，弃去水洗脱部分，得到10%、30%、60%、95%乙醇洗脱物；10%洗脱物经SephadexLH-20凝胶柱层析，薄层检测示踪合并相同组分，结合高效液相制备，得到化合物8、14、15、16和17；30%洗脱物经SephadexLH-20凝胶柱层析，薄层检测示踪合并相同组分，结合高效液相制备，得到化合物1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12和13；60%洗脱物经SephadexLH-20凝胶柱层析，薄层检测示踪合并相同组分，结合高效液相制备，得到化合物18、20、21、22和24；95%洗脱物经SephadexLH-20凝胶柱层析，薄层检测示踪合并相同组分，结合高效液相制备，得到化合物19和23；

所述的24个化合物如下：

化合物1：柽柳素（tamarixetin）；

化合物2：4’-甲氧基山奈酚（4’-methoxykaempferol）；

化合物3：山奈酚（kaempferol）；

化合物4：3’,4’-二甲氧基山奈酚（3’,4’-dimethoxykaempferol）；

化合物5：7,4’-二甲氧基山奈酚（7,4’-dimethoxykaempferol）；

化合物6：7-甲氧基山奈酚（7-methoxykaempferol）；

化合物7：3-甲氧基山奈酚（3-methoxykaempferol）；

化合物8：3-O-吡喃葡萄糖基山奈酚（3-O-glucopyranosylkaempferol）；

化合物9：槲皮素（quercetin）；

化合物10：5-羟基-7,4’-二甲氧基黄酮（5-hydroxy-7,4’-dimethoxyflavone）；

化合物11：异鼠李素（rhamnetin）；

化合物12：香橙素（aromadendrin)；

化合物13：鼠李柠檬素（rhamnocitrin）；

化合物14：3-O-吡喃葡萄糖基槲皮素（3-O-glucopyranosylquercetin）；

化合物15：没食子酸（gallicacid）；

化合物16：没食子酸甲酯（gallicacidmethylester)；

化合物17：3-甲氧基没食子酸甲酯（3-methoxygallicacidmethylester）；

化合物18：柽柳酮（tamarixone）；

化合物19：柽柳醇（tamarixol）；

化合物20：白桦脂酸（betulinicacid）；

化合物21：羽扇豆醇（lupeol）；

化合物22：杨梅萜二醇（myricadiol）；

化合物23：异油桐醇酸（isoaleuritolicacid）；

化合物24：3-对羟基肉桂酰基异油桐醇酸（isoaleuritolicacid3-p-hydroxycinnamate）。

以下是化合物1-24的结构式：

本发明方法所制备得到的利尿组合物可以用于制备治疗水肿性疾病药物；还可以用于制备辅助治疗临床利尿相关疾病的保健品。

发明人经研究发现，本发明中柽柳提取物具有明显的利尿作用，且中剂量组与阳性对照作用相对，与空白对照存在显著性差异。进一步研究表明：柽柳提取物经大孔树脂处理后得到具有显著利尿作用的活性部位，该活性部位化学成分研究表明其主要含有黄酮、有机酸、萜类成分，且主要成分具有利尿活性。该活性部位及部分活性成分利尿作用较好，首先能明显提高排尿量，与空白对照存在显著性差异，作用与阳性对照相当；另外，电解质研究显示：相对于对照组，其不会导致离子紊乱，体现出很好的应用前景。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：本发明可以充分利用滩涂地区丰富的传统柽柳资源，深入进行研究开发，明确了该药用植物有效部位的组合物及其制剂的临床应用，即该组合物由24个化学成分组成，本发明组合物及其制剂主要具有利尿功效，可用于治疗水肿性疾病。

具体实施方式

根据本发明所公开的技术内容，本领域技术人员将很清楚本发明的其他实施方案，下述实施方案仅作示例。在不违反本发明主旨及范围的情况下，可对本发明进行各种改变和改进。这些改变和改进均应在本发明的保护范围之内。

实施例1，一种利尿组合物的制备方法，其步骤如下：

所述的24个化合物如下：

化合物1：柽柳素；

化合物2：4’-甲氧基山奈酚；

化合物3：山奈酚；

化合物4：3’,4’-二甲氧基山奈酚；

化合物5：7,4’-二甲氧基山奈酚；

化合物6：7-甲氧基山奈酚；

化合物7：3-甲氧基山奈酚；

化合物8：3-O-吡喃葡萄糖基山奈酚；

化合物9：槲皮素；

化合物10：5-羟基-7,4’-二甲氧基黄酮；

化合物11：异鼠李素；

化合物12：香橙素；

化合物13：鼠李柠檬素；

化合物14：3-O-吡喃葡萄糖基槲皮素；

化合物15：没食子酸；

化合物16：没食子酸甲酯；

化合物17：3-甲氧基没食子酸甲酯；

化合物18：柽柳酮；

化合物19：柽柳醇；

化合物20：白桦脂酸；

化合物21：羽扇豆醇；

化合物22：杨梅萜二醇；

化合物23：异油桐醇酸；

化合物24：3-对羟基肉桂酰基异油桐醇酸。

实施例2，柽柳提取物急性毒（MTD测定）实验。

1kg柽柳粉碎，乙醇回流提取（3×2h），过滤后减压浓缩得浸膏112g，浸膏悬浮于0.5%羟甲基纤维素钠溶液，超声溶解，得280、560、840mg/mL悬浮液待用（注：840mg/mL悬浮液粘稠度较高）。

昆明种小鼠（SPF，23±1g，♀♂各半）80只，禁食12h后，随机分为4组（20只/组，♀♂各半），按40mL/kg给药容量分别灌胃给予蒸馏水、低、中、高试药，间隔2h，连续给药3次。

给药1h后观察，高剂量小鼠出现反应迟钝现象，其他组无明显异常，2h后，高剂量组基本恢复正常。连续观察发现，首次给药3h后高中剂量小鼠有稀便；末次给药12h后，各组小鼠外观、行为、呼吸、四肢活动均未见异常。

柽柳醇提物小鼠灌胃高剂量为33.600g/kg，即相当于300g生药/kg，按小鼠与成人剂量换算系数7-8，相当于体重60kg成人1500-1715g，超过药典(3-6g)用量285-571倍。

以上实验结果提示柽柳提取物在小鼠给药剂量300g生药/kg时，未见明显毒性反应。

实施例3，柽柳组合物利尿活性实验。

3kg柽柳粉碎，乙醇回流提取（3×2h），减压浓缩得浸膏，浸膏经水复溶后用柱大孔树脂处理，得到利尿活性部位（243g），该活性部位进一步利用MCI柱层析，得到30%乙醇洗脱部分，进一步经聚酰胺柱处理，得到含有8个黄酮成分的活性组合物（2277mg）。

活性部位利尿实验

Wister大鼠（SPF，160±10g，♀♂各半）60只，随机分为5组（♀♂各半），实验前均以40mL/kg给药容量分别灌胃生理盐水，然后按空白对照、阳性对照、低剂量、中剂量、高剂量分别给药10mL/kg蒸馏水、2.0mg/kg呋塞米、50mg/kg活性部位、100mg/kg活性部位、200mg/kg活性部位。大鼠置于代谢笼，分别收集0-1,1-3,3-5,5-7,7-9,9-11,11-15和15-24h各时间段内尿液，记录尿液体积并测定pH和主要电解质。

表1口服活性部位后排尿量(n=12)

表2口服活性部位后Na⁺,K⁺和Cl^-离子浓度(n=12)

活性组合物利尿实验

Wister大鼠（SPF，160±10g，♀♂各半）60只，随机分为5组（♀♂各半），实验前均以40mL/kg给药容量分别灌胃生理盐水，然后按空白对照、阳性对照、低剂量、中剂量、高剂量分别给药10mL/kg蒸馏水、2.0mg/kg呋塞米、2.3mg/kg活性组合物、4.6mg/kg活性组合物、9.2mg/kg活性组合物。大鼠置于代谢笼，分别收集0-1,1-3,3-5,5-7,7-9,9-11,11-15和15-24h各时间段内尿液，记录尿液体积并测定pH和主要电解质。

表3口服活性部位后排尿量(n=12)

表4口服活性组合物后Na⁺,K⁺和Cl^-离子浓度(n=12)

组合物成分分析

化合物1-7、9和内标鼠李素均购自中检所，1-7和9准确称量后用色谱甲醇定容于5mL容量瓶，浓度分别为800、1400、1200、900、1000、1200、800、1100μg/mL，然后用色谱甲醇依次稀释，得到梯度溶液，最低浓度分别为1.6、1.4、1.2、1.8、1.0、1.2、1.6、1.1μg/mL。鼠李素定容得浓度250μg/mL的内标。

以峰面积比（样品与内标的比）为Y轴，样品浓度为X轴，分别得到各成分标准曲线如下：

化合物1：Y=0.00283X-0.0448，0.9993

化合物2：Y=0.00264X-0.0219，0.9991

化合物3：Y=0.00302X-0.0734，0.9986

化合物4：Y=0.00279X-0.0633，0.9990

化合物5：Y=0.00257X-0.0347，0.9989

化合物6：Y=0.00292X-0.0525，0.9993

化合物7：Y=0.00249X+0.0121，0.9989

化合物9：Y=0.00289X-0.0322，0.9991

得到化合物1-7和9的含量分别为31.36%、25.45%、11.20%、8.30%、11.86%、6.14%、2.50%、3.07%，共计99.87%；其余化合物总和占0.13%。

含量分析实验方法如下：

WatersacquityUPLC，色谱柱:BEHC18,2.1×100mm,1.7μm

流速：0.3mL/min

流动相：甲醇(A)-水(B)

梯度：0-5minA/B:10-90

5-10minA/B:10-90到30-70

10-15minA/B:30-70到65-35

15-20minA/B:65-35。

Claims

1.一种利尿组合物的制备方法，其特征在于，其步骤如下：

3kg柽柳粉碎，乙醇回流提取3次，每次2h，减压浓缩得浸膏，浸膏经水复溶后用柱大孔树脂处理，得到利尿活性部位243g，该活性部位进一步利用MCI柱层析，得到30％乙醇洗脱部分，进一步经聚酰胺柱处理，得到主要含有化合物1-7、化合物9这8个黄酮成分的活性组合物2277mg；

所述的化合物1-7和化合物9的含量分别为31.36％、25.45％、11.20％、8.30％、11.86％、6.14％、2.50％、3.07％，共计99.87％；

所述的8个黄酮成分分别如下：