CN108892657A - 一种环烯醚萜酯类化合物、其制备方法及其应用 - Google Patents

一种环烯醚萜酯类化合物、其制备方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种环烯醚萜酯类化合物、其制备方法以及在癌症治疗中的应用，该环烯醚萜酯类化合物的结构如式(1)所示。该环烯醚萜酯类化合物的制备方法包括：A、使用提取溶剂对药材提取，得到提取液；B、将提取液浓缩，加水混悬，分别用极性由小到大的有机溶剂进行萃取，得到萃取液，萃取液浓缩，得到环烯醚萜酯粗提物；C、环烯醚萜酯粗提物上正相柱用洗脱剂进行洗脱；收集洗脱液，干燥，得到富含新颖环烯醚萜酯化合物的提取物；D、提取物进行反相中压柱层析及制备型高效液相柱层析分离，得到所述的一个新颖环稀醚萜酯化合物。该制备方法操作简单，生产成本低，得到的产品可用于癌症治疗药物的制备，具有良好开发前景。

Description

一种环烯醚萜酯类化合物、其制备方法及其应用
技术领域
本发明属于天然药物化学领域，具体是一种环烯醚萜酯类化合物、其制备方法及其应用。
背景技术
败酱科(Valerianaceae)败酱属(Patrinia Juss.)植物约有20种，主产于亚洲东部至中部和北美洲西北部，我国有10个种，3个亚种2个变种，全国各地均产，资源极其丰富。该属多种植物民间常做药用，作为传统中药使用的有黄花败酱、白花败酱、墓头回等，其应用历史悠久，应用范围广泛。
墓回头又名脚汗草、箭头风，为败酱科败酱属糙叶败酱(Patrinia scabraBunge.)及异叶败酱(Patrinia heterophylla Bunge.)的干燥根茎，有特殊腐臭，在我国分布较广，具有多年用药历史。墓头回，性凉，味苦，微酸涩。具有燥湿止带、收敛止血、清热解毒之功效。主治赤白带下，泄泻痢疾，疮疡肿毒。
墓头回含有几十个非苷环烯醚萜类成分。环烯醚萜为臭蚁二醛的缩醛衍生物，非苷环烯醚萜主要以C1、C10、C11等-OH与异戊酰基(isovaleryl)、乙酰基(Acetyl)等成酯的形式存在，称为环烯醚萜酯。迄今为止，虽然从败酱科败酱属植物中分离得到一系列环烯醚萜酯类化合物，但并没有提供一种工艺科学合理，有效成分性能稳定、生物活性高的败酱科败酱属植物环烯醚萜酯类化合物的制备方法。
败酱科败酱属植物环烯醚萜酯类化合物应用方面，文献报道多集中在镇静、催眠等方面，其在癌症治疗方面的应用研究鲜有报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种新颖环烯醚萜酯类化合物、其制备方法以及应用，该环烯醚萜酯类化合物具有较好的抗癌活性，同时该制备方法工艺操作简单，能够得到纯度较高的环烯醚萜酯类化合物。
一种环烯醚萜酯类化合物，结构如式(1)：
该化合物的结构目前未见有文献报道，同时MTT试验表明该化合物对人源胰腺癌细胞具有显著的抑制作用，具有抗肿瘤活性。
本发明还提供了一种所述的环烯醚萜酯类化合物的制备方法，包括下述步骤：
(A)提取：采用提取溶剂对药材进行提取，得到提取液；所述的药材为败酱科败酱属中药墓头回的根茎和/或根；
(B)萃取：对步骤(A)得到的提取液进行浓缩，得到的浓缩物加水混悬，然后采用萃取溶剂进行萃取得到萃取液，萃取液经过浓缩，得到环烯醚萜酯粗提物；
(C)柱层析：步骤(B)得到的环烯醚萜酯粗提物上正相柱用洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得到富含所述环稀醚萜酯化合物的提取物；
(D)中压柱层析及制备型高效液相柱层析：步骤(C)得到的提取物进行中压柱层析分离，得到如式(1)所示化合物的粗产品，然后对所述粗产品进行制备型高效液相柱层析，得到如式(1)所示的化合物。
所述的中压柱层析及制备型高效液相柱层析中，色谱柱填料均为十八烷基键合相硅胶；所述中压柱层析流动相至少包括55～90％的甲醇水溶液；制备型高效液相流动相至少包括35～75％的乙腈水溶液。
步骤A中，药材的提取方法较多，包括渗漉法。渗漉法提取效率高，提取溶剂用量少，常温提取能耗低，简便可行。文献报道，环烯醚萜酯对酸、热、光不稳定，易降解。渗漉法在常温下操作，不会造成热敏性有效成分的破坏。
步骤B中，萃取溶剂可以有多种选择，但至少要包括乙酸乙酯。乙酸乙酯极性大于现有技术中的石油醚、二氯甲烷，能够将墓头回提取物中环烯醚萜酯类成分萃取完全；乙酸乙酯极性小于现有技术中的正丁醇，不但能将环烯醚萜酯类成分完全萃取出来，还能够剔除一些易溶于正丁醇的极性略大的非环烯醚萜酯类杂质，从而使得墓头回有效部位中环烯醚萜酯类活性成分的含量更高，纯度更高。
步骤C中，洗脱剂有比较严格的要求，并对体积比有限定，所述洗脱剂洗脱能力强，能够保证得到性能稳定、所述化合物含量高的提取物。
所述的洗脱剂包括由体积比为30～0:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂。
步骤D中，所述的中压柱层析及制备型高效液相柱层析均为反相色谱，色谱柱填料均为十八烷基键合相硅胶。
所述中压柱层析流动相至少包括55～90％的甲醇水溶液；制备型高效液相流动相至少包括35～75％的乙腈水溶液。
为了取得更好的发明效果，以下作为本发明的优选：
步骤(A)中，所述药材为墓头回的根和/或根茎，该药材价廉易得。
所述提取溶剂为水、醇中的一种或两种，该提取溶剂使用安全、价廉、且具有较好的提取效率。进一步优选，所述提取溶剂为含乙醇质量分数为95％的乙醇水溶液。该提取溶剂的性质非常适合于提取墓头回饮片，能够更加高效、完全地获取墓头回药用部位中的环烯醚萜酯类活性成分，且能避免大量极性较大的非环烯醚萜酯类杂质被提取出来。
所述提取方法为溶剂提取法。进一步优选，所述提取方法为渗漉法。药材打粉，过40目筛，药粉润湿后装柱，加95％乙醇冷浸72h，渗漉，提取溶剂总体积相当于药材重量的18倍。该法提取效率高，提取溶剂用量少，常温下提取能耗低，且能避免热敏性活性成分的降解，渗漉设备简单，也能大量节约生产成本。
步骤(B)中，所述的萃取溶剂为石油醚、乙醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水中的两种以上。萃取时按极性由小到大依次使用单一溶剂进行萃取。进一步优选，所述的萃取溶剂为：乙酸乙酯和正丁醇，萃取时按极性大小依次使用单一溶剂等体积进行萃取。根据相似相溶原理，分别通过上述萃取溶剂萃取，以使步骤A得到的药材提取液浓缩加水混悬后的溶液按照极性由小到大分离，通过薄层色谱(TLC)检识，墓头回萃取液中的环烯醚萜酯主要集中在乙酸乙酯萃取液中，其它萃取溶剂主要用于去除药材提取物中非环烯醚萜酯类杂质，以得到高纯度的环烯醚萜酯有效部位。因此，进一步优选，将乙酸乙酯萃取液浓缩，乙酸乙酯提取物上正相柱进一步纯化，其余的可以忽略，从而减少生产成本。
步骤(C)中，所述正相柱填料为100～200目的柱层析用硅胶或氧化铝。
所述的洗脱剂包括由体积比为30：1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为20：1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为15： 1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为10：1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为8：1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为6：1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为3：1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为1：1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂、由体积比为0：1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱。采用石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱，该洗脱体系洗脱能力强，通过TLC检识，本发明所述新颖环烯醚萜酯几乎全部位于体积比为6:1的石油醚和乙酸乙酯组成的洗脱剂洗脱后的洗脱液中，使得墓头回有效部位中新颖环烯醚萜酯活性成分含量更高，分布更加集中。
步骤(D)中，所述的中压色谱及制备型高效液相色谱填料均为十八烷基键合相硅胶，该填料对环稀醚萜酯类化合物具有较强的选择性，分离效果好。中压柱层析，具有上样量大，分离效率高等优势。
上述提取物用少量四氢呋喃溶解，加适量初始流动相稀释后，湿法上样，分别用65％、70％、75％、80％的甲醇水溶液洗脱，该流动相洗脱能力强，所述化合物几乎全部集中在75％甲醇水洗脱的部分流分中。
75％甲醇水洗脱所得部分流分蒸干，样品进行反相制备型高效液相柱层析，用35～75％的乙腈水洗脱，进一步优选，用55％的乙腈水等度洗脱，收集所述化合物对应色谱峰的流分，蒸干，即得到所述化合物。所述化合物与另一环稀醚萜酯类成分极性非常相近，普通硅胶柱层析及反相中压柱层析，均难以将这两种物质分开，制备型高效液相色谱具有上样量大，柱效高，分离效率高等优点，使两种极性接近的环稀醚萜酯类化合物达到了良好的分离。
本发明还提供了一种所述的环烯醚萜酯类化合物在制备治疗癌症药物中的应用。更具体地说，所述新颖环烯醚萜酯化合物对人源胰腺癌细胞，具有一定的抑制作用。以MTT法，对得到的墓头回中新颖环烯醚萜酯化合物，进行了抑制人源胰腺癌细胞株增殖活性研究，结果显示，本发明制备的新颖环烯醚萜酯化合物对人胰腺癌细胞具有显著的抑制作用，半数抑制浓度IC50约为：4.18～7.66μg/mL。上述细胞株可采用市售产品，如：可采用美国模式培养物集存库ATCC(Americantype culture collection)的各种细胞株。
本发明墓头回中新颖环烯醚萜酯化合物可与市售或者常用的载体结合，用于制备预防或者/和治疗，或者/和协同治疗癌症的药物。所述的药物可以为脂肪乳剂、注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂等形式。
与现有的技术相比，本墓头回中新颖环烯醚萜酯化合物制备方法及其癌症治疗应用的优点在于：化合物结构新颖，生物活性强。利用系统溶剂法及正相、反相色谱，中压、高压色谱，分离、纯化得到了一个结构新颖的环稀醚萜酯化合物。使用的溶剂廉价易得，且毒性较低。本发明墓头回中一个新颖环烯醚萜酯的制备方法科学合理，操作简单，生产成本低，具有良好的应用前景。
附图说明
图1(A)是化合物(1)的核磁共振氢谱；
图1(B)是化合物(1)的核磁共振碳谱；
图1(C)是化合物(1)的1H 1HCOSY谱；
图1(D)是化合物(1)的HSQC谱；
图1(E)是化合物(1)的HMBC谱；
图1(F)是化合物(1)的NOESY谱；
图2是不同浓度的新颖环烯醚萜酯化合物PHE6A对肿瘤细胞的体外增殖抑制作用。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的内容作进一步详细的说明，但不应将实施例理解为对本发明的限制。在不脱离本发明上述思想的情况下，根据本领域普通技术知识和常规手段作出的各种替换手段或变更，均包含在本发明之内。
实施例1
一种环烯醚萜酯的制备方法包括下述步骤：
A、提取：墓头回药材打粉，过40目筛备用。取墓头回药材粗粉5kg，加适量提取溶剂润湿后装柱，再加适量95％乙醇冷浸72h后渗漉提取，收集渗漉液。提取总溶剂体积相当于药材质量的18倍量(总计用去95％的乙醇90 L)。
B、萃取：将步骤A得到的渗漉液减压浓缩至无醇味，接近干，加水混悬至1.5L，分别用1.5L的乙酸乙酯、1.5L的正丁醇萃取，各萃取溶剂均萃取三次，合并各次的萃取液，分别得到墓头回乙酸乙酯萃取液，正丁醇萃取液，通过TLC检识，墓头回环烯醚萜酯主要集中在乙酸乙酯萃取液中，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到墓头回乙酸乙酯提取物192.22g。
C、柱层析：取上述墓头回乙酸乙酯提取物约150g，上100～200目的正相硅胶柱进行分离，然后分别使用多个不同的洗脱剂洗脱，各个洗脱剂均由石油醚和乙酸乙酯组成，且体积均为9L(3.5个柱体积)，各个洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为30：1，20：1，15：1，10：1，8：1，6：1，3： 1，1：1，0：1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分经TLC 检识，富含所述新颖环稀醚萜酯的流分，主要集中在石油醚和乙酸乙酯6：1 的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，得到富含两个新颖环烯醚萜酯的提取物6.30g。
D、中压柱层析及制备型高效液相柱层析：取上述提取物约3g，进行中压柱层析分离，中压柱填料为十八烷基键合相硅胶，粒径为50微米，样品用少量四氢呋喃溶解后湿法上样，用65％、70％、75％、80％的甲醇水溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱约2L(4个柱体积)。
E、制备型高效液相柱层析：收集75％甲醇水洗脱液对应的部分流分，减压回收溶剂，得到提取物约301mg，该提取物用流动相溶解后，进行反相制备型高效液相柱层析，用55％的乙腈水溶液等度洗脱，收集所述新颖环烯醚萜酯色谱峰对应流分，减压回收溶剂得到所述环烯醚萜酯化合物(C20H28O7)约 69.7mg。
实施例2
A、提取：取墓头回药材5kg，加10倍量95％乙醇，85℃回流提取，每次提取时间为2h，共提取2次，合并两次提取液。总计用去95％的乙醇100L。
B、萃取：将步骤A得到的提取液减压浓缩至无醇味，接近干，加水混悬至1.5L，用1.5L的乙酸乙酯萃取，萃取三次，合并各次的萃取液，得到墓头回乙酸乙酯萃取液，通过TLC检识，墓头回环烯醚萜酯类成分主要集中在乙酸乙酯萃取液中，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到墓头回乙酸乙酯提取物169.61g。
C、柱层析：取上述墓头回乙酸乙酯提取物约150g，上100～200目的硅胶正相柱进行分离，然后分别使用多个不同的溶剂梯度洗脱，各个洗脱剂均由石油醚和乙酸乙酯组成，且体积均为9L(3.5个柱体积)，各个洗脱剂中石油醚和乙酸乙酯的体积比分别为30：1，20：1，15：1，10：1，8：1，6：1， 3：1，1：1，0：1，并按极性由小到大的顺序依次进行梯度洗脱。所得流分经薄层色谱检识，所述新颖环烯醚萜酯主要集中于石油醚和乙酸乙酯6：1的洗脱剂的洗脱液中，收集上述洗脱液，用旋转蒸发仪在40℃减压回收溶剂，即得到富含一个新颖环烯醚萜酯的提取物5.37g。
D、中压柱层析：取上述提取物约3g，进行中压柱层析分离，中压柱填料为十八烷基键合相硅胶，粒径为50微米，样品用65％甲醇水溶解后，湿法上样，用65％、70％、75％、80％的甲醇水溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱约2L (4个柱体积)。
E、制备型高效液相柱层析：收集75％甲醇水洗脱液对应的部分流分，减压回收溶剂，得到提取物约268mg，该提取物用流动相溶解后，进行反相制备型高效液相柱层析，用55％的乙腈水溶液等度洗脱，收集所述新颖环烯醚萜酯色谱峰对应流分，减压回收溶剂得到所述环烯醚萜酯化合物(C20H28O7)约 55.4mg。
化合物(1)通过核磁共振氢谱和核磁共振碳谱及2D NMR谱表征，具有如式(1)所示化学结构。表征数据见表1。
表1：化合物(1)的1H NMR(600MHz)13C NMR谱(150MHz)(δ，ppm，TMS， CDCl3)
实施例2提取溶剂较实施例1多了2倍量，但化合物的得率较实施例1 略低，可见渗漉法对环稀醚萜酯的提取效率较回流提取法高。回流提取法在 85℃操作，若工业化大生产，其能源消耗也将增加生产成本；另外，85℃的高温也可能会引起热敏性环烯醚萜酯的降解。实施例2步骤D，采用65％的甲醇溶解样品后，湿法上样，环稀醚萜酯类化合物在65％甲醇水溶液中，溶解度较差，致使上样难度增大，故富含两个新颖环稀醚萜酯的提取物，在进行中压柱层析分离时，先用少量四氢呋喃溶解，再用适量流动相稀释后上样较优。
实施例3新颖环烯醚萜酯化合物体外抗肿瘤实验：
3.1仪器与试剂：
胎牛血清，0.25％胰酶-EDTA，PBS：美国Life Technologies公司；
RMPI-1640培养基：吉诺生物医药技术有限公司；
SRB粉末:美国Sigma Aldrich公司；
CO2培养箱：美国Thermo scientific公司；
Spectramax M3酶标仪：美国Molecular Devices公司；
细胞培养板：美国corning公司；
3.2实验步骤：
1)消化肿瘤细胞，调整细胞浓度为6×104/mL，96孔板中每孔加100μL(每孔含5,000个细胞)，37℃、5％CO2培养24h后进行下一步试验；
2)用不同浓度的实施例1制备的化合物处理肿瘤细胞，每孔设两个复孔。
3)药物与肿瘤细胞孵育48h后,每孔加入10μL MTT，37℃继续孵育4h后，终止培养，用移液枪轻轻吸掉培养液，加入DMSO(150μL/孔)，振摇均匀后，用酶标仪在570nm处测定每个孔的光密度OD值，计算2个复孔的平均值和标准差。
3.3实验结果：通过在人源胰腺癌共5个细胞株上得到的结果，所制备的新颖环烯醚萜酯化合物PHE6A对以上细胞株均表现出了较好的抗肿瘤活性，如表2 所示。并且如图2所示，所制备的新颖环烯醚萜酯化合物PHE6A表现出了较好的浓度相关性。
表2：新颖环烯醚萜酯化合物PHE6A对人源胰腺癌细胞株的半数抑制浓度 IC50值(mean±SD,n＝3)
本发明制备得到的墓头回中一个新颖环烯醚萜酯化合物可与市售或者常用的载体结合，用于制备预防、治疗、协同治疗癌症的药物。所述药物可以为脂肪乳剂、注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂等形式。
本发明制备所得墓头回中一个新颖环烯醚萜酯化合物，当在治疗上进行施用(给药)时，可提供不同的效果。通常，可将本发明制备的一种环烯醚萜酯化合物配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中。配制好的药物可以通过常规途径给药，包括(但并不限于)：静脉、肌肉、腹膜内、皮下、皮内或局部给药。所用载体介质包括(但并不限于)：生理盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合。本发明一种环烯醚萜酯化合物可以被制成脂肪乳的形式，例如用注射用大豆油、卵磷脂、甘油和其它辅剂的水溶液，通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊剂之类的药物，也可通过常规方法进行制备。药物如注射剂溶液宜在无菌条件下制造。药物活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天1μg/kg体重～2000mg/kg体重。此外，本发明制备的一个环稀醚萜酯化合物，还可以与其它抗肿瘤药物协同使用。
当本发明墓头回中一个新颖环烯醚萜酯化合物被用做药物时，可将治疗有效剂量的环烯醚萜酯化合物施用于哺乳动物，其中该治疗有效剂量通常至少10μg/kg体重，较佳的给药剂量约为10μg/kg体重～30mg/kg体重。具体剂量还应考虑给药方式、病人健康状况等因素，这些属熟练医师技能范畴以内。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。
尽管本文较多地使用了术语，但并不排除使用其它术语的可能性。使用这些术语仅仅是为了更方便地描述和解释本发明的本质；把它们解释成任何一种附加的限制都是与本发明精神相违背的。

Claims (10)

1.一种环烯醚萜酯类化合物，其特征在于，结构如式(1)式所示：
2.一种如权利要求1所述的环烯醚萜酯类化合物的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
(A)提取：采用提取溶剂对药材进行提取，得到提取液；所述的药材为败酱科败酱属植物的根茎和/或根；
(B)萃取：对步骤(A)得到的提取液进行浓缩，得到的浓缩物加水混悬，然后采用萃取溶剂进行萃取得到萃取液，萃取液经过浓缩，得到环烯醚萜酯粗提物；
(C)柱层析：步骤(B)得到的环烯醚萜酯粗提物上正相色谱柱用洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得到富含所述环稀醚萜酯化合物的提取物；
(D)中压柱层析及制备型高效液相柱层析：步骤(C)得到的提取物进行中压柱层析分离，得到如式(1)所示的化合物的粗产品，然后对所述粗产品进行制备型高效液相柱层析，得到如式(1)所示的化合物。
3.根据权利要求2所述的环烯醚萜酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(A)中，所述的药材为墓头回的根茎和/或根，且所述的药材经打粉、过40目筛后再进行提取。
4.根据权利要求2所述的环烯醚萜酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(A)中，所述的提取溶剂为水和醇溶剂中的一种或两种。
5.根据权利要求2所述的环烯醚萜酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(A)中，所述的提取方法为渗漉法，提取溶剂的用量相当于药材重量的18倍。
6.根据权利要求2所述的环烯醚萜酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(B)中，所述的萃取溶剂包括：乙酸乙酯和正丁醇，萃取时按极性由小到大用单一溶剂等体积进行梯度萃取。
7.根据权利要求2所述的环烯醚萜酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(C)中，所述的正相柱所用的填料为100～200目的柱层析硅胶或氧化铝。
8.根据权利要求2所述的环烯醚萜酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(C)中，所述的洗脱剂包括由体积比为30～0:1的石油醚和乙酸乙酯组成的混合溶剂，并按极性由小到大依次进行梯度洗脱。
9.根据权利要求2所述的环烯醚萜酯类化合物的制备方法，其特征在于，步骤(D)中，中压柱层析及高效液相柱层析所用填料均为十八烷基键合相硅胶；中压柱层析的流动相为55～90％的甲醇水溶液，洗脱时按极性由大到小依次进行梯度洗脱；高效液相柱层析的流动相为35～75％的乙腈水溶液。
10.一种如权利要求1所述的环烯醚萜酯类化合物在制备治疗癌症药物中的应用。
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