CN101284004B - 两个双倍半萜类化合物在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于医药技术领域，具体为两个双倍半萜类化合物在制备抗肿瘤和抗炎症药物中的应用。所述化合物为中甸兔耳风萜A和中甸兔耳风萜B，可从中甸兔耳风或其它植物中提取分离得到，也可用化学合成方法得到。经研究实验表明，这两种化合物对多种人肿瘤细胞具有良好的抑制作用，而且对炎症也有显著的抑制作用。因此，可以用来制备抗药物和抗炎症药物。

Description

两个双倍半萜类化合物在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用

技术领域

本发明属医药技术领域，具体涉及两个双倍半萜类化合物中甸兔耳风萜A和中甸兔耳风萜B在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用。

背景技术

肿瘤是引起人类死亡的主要原因之一。中国卫生部日前公布2006年城乡居民主要死亡原因。统计显示，恶性肿瘤已成为首要死因。可见肿瘤的预防和治疗十分迫切。药物治疗是肿瘤的主要治疗手段之一。目前，虽然开发出了几十种抗肿瘤药物，有效的延长了患者的生命或者提高了患者的生存质量。其中有些抗肿瘤的药物治疗疗效非常显著，如药物治疗小儿急性白血病等。但肿瘤的药物研究和开发还面临巨大挑战，如抗肿瘤药物多为细胞毒药物，其副作用明显，限制了这些药物疗效的发挥。著名肿瘤病因学家、中国工程院院士程书钧认为：当今医学对于肿瘤的防治依然处于初级阶段。中药有几千年的人体毒性实验的基础，也许中药会在抗肿瘤方面走在世界的前列。从天然产物中寻找高效低毒的抗肿瘤活性的先导化合物一直是新药研究的热点。

兔耳风属(Ainsliaea DC)植物是菊科(Compositae)帚菊木族(Mutisieae Cass)中的一属，全世界70余种，我国有44种4变种，约占总数的37.5％。兔耳风属植物药用种类较多。广泛用于治疗感冒咳喘、风湿痹痛、跌打损伤、泌尿系统疾病等症。我国的兔耳风植物资源主要分布在长江流域及西南华南各省。《上海市药材标准》、《江西省中药材标准》、《云南省药品标准》、《卫生部药品标准》均有收载。

对兔耳风属植物的化学成分研究始于20世纪80年代，主要集中在杏香兔耳风和械叶兔耳风上。据报道兔耳风属植物主要含有倍半萜、甾体、三萜类化合物，研究表明倍半萜类具有很好的抗肿瘤活性。且现代药理及临床应用表明该属植物有很好的抗炎作用。中甸兔耳风是菊科兔耳风属植物，目前对该种植物的研究为空白，我们对采自云南的中甸兔耳风(Ainsliaea fulvioides)进行了系统的化学成分研究，以期从中分离得到具有抗肿瘤活性的化合物。

发明内容

本发明的目的在于提出两个双倍半萜类化合物中甸兔耳风萜A和中甸兔耳风萜B在制备抗肿瘤和抗炎药物中的应用。

本发明还提供以此双倍半萜类化合物为活性成分的，用于治疗肿瘤的药物组合物。本发明所说的中甸兔耳风萜A和中甸兔耳风萜B的结构式为：

中甸兔耳风萜A                         中甸兔耳风萜B

本发明提出的中甸兔耳风萜A和中甸兔耳风萜B可从中甸兔耳风或其它植物中提取，经分离纯化得到，也可以是经化学合成的方法得到。

从中甸兔耳风中提取上述两种化合物的步骤如下：将中甸兔耳风的干燥全草粉碎，以浓度为80％-95％乙醇回流提取3-4次，每次1-2小时，提取液减压浓缩得浸膏。浸膏均匀分散于水中，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取，得到各部位萃取物；氯仿萃取部位经反复硅胶柱色谱(二氯甲烷-甲醇或石油醚-乙酸乙酯)分别得到含有中甸兔耳风萜A和中甸兔耳风萜B的流分。含有中甸兔耳风萜A的流分经过C18半制备液相(甲醇-水)进一步纯化，得到中甸兔耳风萜A纯品；含有中甸兔耳风萜B的流分以甲醇为溶剂反复重结晶，得到中甸兔耳风萜B纯品。

中甸兔耳风萜A为透明针状结晶，ESI/MS给出准分子离子峰m/z 503[M+H]⁺，结合碳谱、DEPT谱和氢谱确定分子式为C₃₀H₃₀O₇。该化合物的光谱数据与文献(Bohlmann，Ferdinand；Ahmed，Maniruddin；Jakupovic，Jasmin；King，Robert M.；Robinson，Harold.Naturallyoccurring terpene derivatives.Part 465.Dimeric sesquiterpene lactones and kolavanederivatives from Gochnatia paniculata.Phytochemistry(1983)，22(1)，191-5.)报道基本一致，故确定其为Gochnatiolide A，命名为中甸兔耳风萜A。

中甸兔耳风萜B为透明块状结晶，ESI/MS给出准分子离子峰m/z 487[M+H]⁺，结合碳谱、DEPT谱和氢谱确定分子式为C₃₀H₃₀O₆。该化合物的光谱数据与文献(Bohlmann，Ferdinand；Zdero，Christa；Schmeda-Hirschmann，Guillermo；Dimeric guaianolides and otherconstituents from Gochnatia species.Phytochemistry(1986)，25(5)，1175-8)报道基本一致，故确定其为Gochnatiolide B，命名为中甸兔耳风萜B。

本发明提出的抗肿瘤药物组合物含有治疗有效量的两个双倍半萜类化合物中的一种或两种，以及一种或多种药学上可接受的载体。

本发明提出的抗炎药物组合物含有治疗有效量的两个双倍半萜类化合物中的一种或两种，以及一种或多种药学上可接受的载体。

所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂如水等，填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明可以组合物的形式通过口服、鼻吸入、直肠或者肠胃外给药的方式施用于需要这种治疗的患者。用于口服时，可将其制成常规的固体制剂如片剂、粉剂、粒剂、胶囊等，制成液体制剂如水或油悬浮剂或其它液体制剂如糖浆、酏剂等；用于肠胃外给药时，可将其制成注射用的溶液、水或油性悬浮剂等。

本发明药物组合物的各种剂型可以按照药学领域的常规生产方法制备。例如使活性成分与一种或多种载体混合，然后将其制成所需的剂型。

具体实施方式

下面的实施例可以使本专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

实施例1

中甸兔耳风(Ainsliaea fulvioides)全草50kg，用80％乙醇回流提取3次，每次1.5小时，合并三次提取液减压浓缩至无醇味的浸膏。浸膏加入适量水稀释至体积约为50L，分别依次以石油醚(50L×3)、氯仿(50L×3)、乙酸乙酯(50L×3)、正丁醇(50L×3)萃取，得氯仿部位浸膏约为485g。该氯仿部位上硅胶柱，以体积比为100∶1～10∶1的二氯甲烷∶甲醇梯度洗脱，通过薄层色谱检测在二氯甲烷∶甲醇的20∶1极性部位含有中甸兔耳风萜A和中甸兔耳风萜B。该部位浓缩至干后继续上硅胶柱，以体积比为10∶1～0∶1的石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，通过薄层色谱检测在1∶1极性部位含有中甸兔耳风萜A，在2∶1极性部位含有中甸兔耳风萜B。含有中甸兔耳风萜A的部位通过C18半制备柱纯化，得到中甸兔耳风萜A纯品4.11g；含有中甸兔耳风萜B的部位浓缩后以甲醇为溶剂进行重结晶处理，结果得到中甸兔耳风萜B纯品1.24g。

实施例2

大头兔耳风(Ainsliaea macrocephala)全草20kg，用95％乙醇回流提取3次，每次2小时，合并三次提取液减压浓缩至无醇味的浸膏。浸膏加入适量水稀释至体积约为20L，分别依次以石油醚(20L×3)、氯仿(20L×3)、乙酸乙酯(20L×3)、正丁醇(20L×3)萃取，得氯仿部位浸膏约为195g。该氯仿部位上硅胶柱，以体积比为100∶1～10∶1的三氯甲烷∶甲醇梯度洗脱，通过薄层色谱检测在二氯甲烷∶甲醇的15∶1极性部位含有中甸兔耳风萜A和中甸兔耳风萜B。该部位浓缩至干后继续上硅胶柱，以体积比为10∶1～1∶1的石油醚∶乙酸乙酯梯度洗脱，通过薄层色谱检测在1∶1极性部位含有中甸兔耳风萜A，在2∶1极性部位含有中甸兔耳风萜B。含有中甸兔耳风萜A的部位通过C18半制备柱纯化，得到中甸兔耳风萜A纯品1.95g；含有中甸兔耳风萜B的部位浓缩后以甲醇为溶剂进行重结晶处理，结果得到中甸兔耳风萜B纯品0.63g。

实施例3

活性成分(上述两种化合物之一种或二种)     8g

微晶纤维素                               80g

玉米淀粉                                 12g

滑石粉                                   5g

                                         制成1000片

制备方法：将活性成分、微晶纤维素和玉米淀粉混合，用水均匀湿润制成软材，把湿润后的混合物制粒，过20目筛，80℃烘干，加入硬脂酸镁，再过筛，然后将混合物压片，每片重105mg，活性成分含量为8mg。本品口服可以用于治疗肿瘤。

实施例4：

取活性成分(上述二种化合物之一种或2种)15g，药用淀粉135g，用95％乙醇湿法制粒，整粒，装1#胶囊，每粒150mg。其它项目应符合中华人民共和国药典2005年版胶囊剂项下的规定。本品口服可以用于治疗急慢性炎症。

实施例5：

取活性成分(上述二种化合物之一种或2种)2g，加入丙二醇和乙醇各100ml，搅拌使溶解，加注射用水稀释至10000ml，过0.22μm的微孔滤膜，灌封，10ml/支，流通蒸汽灭菌30min，检验、包装，得注射液。本品注射可以用于治疗肿瘤、急性炎症。

实施例6：中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B的细胞毒活性实验

1、实验材料

1.1、受试样品

中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B分别用DMSO(Merck)溶解后，加入PBS(-)配成1000μg/ml的溶液或均匀的混悬液，然后用含DMSO的PBS(-)稀释。

1.2、细胞株

A549(人肺癌细胞)

LOVO(人肠癌细胞)

6T-CEM(人T细胞白血病细胞)

MDA-MB-435(人乳腺癌细胞)

1.3、培养液

RPMI1640+15％NBS+双抗

1.4、其他材料

全自动酶标仪：型号：WellscanMK-2，生产厂商：Labsystems

进口96孔培养板等。

2、试验方法

MTT法：96孔板每孔加入浓度为4～6×10⁴个/ml的细胞悬液100μl，置37℃，5％ CO₂培养箱内。24h后，加入样品液，10μl/孔，设双复孔，37℃，5％ CO₂作用72h。每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，作用4h后加入溶解液，100μl/孔，置培养箱内，溶解后用MK-2全自动酶标仪测570nm OD值。

3、试验结果

结果见表1，结果显示，中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B对人肺癌细胞，人肠癌细胞，人T细胞白血病细胞，人乳腺癌细胞均有较好的抑制活性，中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B有很好的抗肿瘤作用。因此，该化合物可用于制备抗肿瘤药物。

实施例7：中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B对小鼠S180肉瘤(实体型)的疗效实验

1、实验材料

1.1受试样品

中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B分别用少量吐温-80助溶后用0.5％CMC配成溶液。

1.2动物

品系：昆明种小鼠

来源：第二军医大学实验动物中心提供。

合格证号：沪动合证字107号

体重：18-20g

性别：雌性。

1.3移植性肿瘤

小鼠S180肉瘤，由上海医药工业研究院传代维持。

2、实验方法

取生长良好的小鼠S180肉瘤腹水，用生理盐水以1∶4稀释，每只小鼠腋皮下接种0.2ml，随机分组，分为对照组，环磷酰胺组(CTX组，20mg/kg，ip×7)、给药(5mg/kg)组，接种后次日起给药，给药体积为0.5ml/20g体重，连续灌胃7天。接种后10日脱颈处死动物，称动物体重后解剖取瘤块，称瘤重。结果判定根据以下公式：

3、实验结果

中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B有显著的抑瘤作用。实验结果见表2。

表2  中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B对小鼠S180肉瘤的抑制作用

与对照组比较：^*P＜0.05，^**P＜0.01。

实施例8：中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B抗炎实验小鼠耳肿胀模型

1实验动物

Swiss种小鼠，雄性，体重20-24g。

2.实验模型和测试方法

取小鼠80只，随机分成8组，按表3所示的剂量灌胃给药3d，于末次给药后1h，用0.05ml的二甲苯将小鼠左耳致炎，用直径为7mm的打孔器将双耳重叠打孔，将打下的圆片在扭力天平(灵敏度为万分之一)上称量，用鼠耳两圆片的重量差表示其肿胀度。

3统计分析：

全部实验结果均以均数±标准误表示。用student t-检验比较各组数据与空白组的显著性差异，P＜0.05，表示差异有显著性意义。

4试验结果：

表3.中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B对小鼠耳肿胀试验的影响

与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果表明，阳性对照药氢化可的松、中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B对小鼠耳肿胀模型引起的炎症有显著的抑制作用。

实施例9：中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B抗炎实验大鼠角叉菜胶足肿胀模型

1实验动物

SD大鼠，雌雄兼用，体重180-220g。

2.实验模型和测试方法

取大鼠80只，随机分成8组，按表4所示的剂量灌胃给药4d，于末次给药前测量致炎前容积；末次给药后30min，于大鼠右后肢足跎皮下注射1％角叉菜胶0.1ml致炎。分别于致炎后2、4、6h测量右踝关节以下容积。

3统计分析：

全部实验结果均以均数±标准误表示。用studentt-检验比较各组数据与空白组的显著性差异，P＜0.05，表示差异有显著性意义。

4试验结果：

表4.中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B对大鼠角叉菜胶足肿胀试验的影响

与空白组比较，^*P＜0.05，^**P＜0.01

结果表明，阳性对照药地塞米松、中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B对大鼠角叉菜胶足肿胀模型所引起的炎症有显著的抑制作用。

实施例10：中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B抗炎实验小鼠腹腔毛细血管通透性试验

1实验动物

NH系小鼠，雌雄兼用，体重18-22g。

2.实验模型和测试方法

取大鼠80只，随机分成8组，按表5所示的剂量灌胃给药1h，尾静脉注射2％依文思蓝生理盐水溶液0.1ml/10g体重，随即腹腔注射0.8％醋酸生理盐水溶液0.20ml/只，20min后脱颈椎处死小鼠，用5ml生理盐水分数次洗涤腹腔，3000转/分，离心15min；取上清液用酶标仪于570nm比色测定其光密度(OD)值。

3统计分析：

全部实验结果均以均数±标准误表示。用student t-检验比较各组数据与空白组的显著性差异，P＜0.05，表示差异有显著性意义。

4试验结果：

表5.中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B对小鼠腹腔毛细血管通透性试验的影响

与空白组比较，^*p＜0.05，^**P＜0.01

结果表明，阳性对照药地塞米松、中甸兔耳风萜A、中甸兔耳风萜B对小鼠腹腔毛细血管通透性试验引起的炎症有显著的抑制作用。

Claims (3)

1.两个双倍半萜类化合物在制备抗肿瘤药物中的应用，所述化合物为中甸兔耳风萜A或中甸兔耳风萜B，其结构式如下：

       中甸兔耳风萜A                 中甸兔耳风萜B。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述的双倍半萜类化合物从植物中提取得到。

3.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于含有如权利要求1中所述的二个双倍半萜类化合物中的一种或2种，以及药学上可以接受的载体。