CN114075158B - 丹参素和丹酚酸b含量的提取和检测方法 - Google Patents

丹参素和丹酚酸b含量的提取和检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了丹参素和丹酚酸B含量的提取和检测方法，该检测方法包括：将样品进行第一提取处理，得到第一提取液；其中，样品中含有丹参以及下列至少之一的物质：蒲黄、地黄、墨旱莲、菊花、黄芩、决明子、车前子、茺蔚子、女贞子、夏枯草、龙胆、郁金、木贼、赤芍、牡丹皮、山楂、当归和川芎；第一提取处理所采用的提取液包括：含有甲醇溶液和丙酮的混合液。利用本发明的提取方法可以有效地提取出样品中的丹参素和丹酚酸B，提取效率高、杂质少，适于广泛应用。

Description

丹参素和丹酚酸B含量的提取和检测方法
技术领域
本发明涉及医药领域。具体地，本发明涉及丹参素和丹酚酸B含量的提取和检测方法。
背景技术
丹参(拉丁学名：Salvia miltiorrhiza Bge.)又名赤参、紫丹参、红根等。根入药，含丹参酮，为强壮性通经剂，有祛瘀、生新、活血、调经等效用，为妇科要药，主治子宫出血、月经不调、血瘀、腹痛、经痛、经闭、庙痛，对治疗冠心病有良好效果。此外亦治神经性衰弱失眠、关节痛、贫血、乳腺炎、淋巴腺炎、关节炎、疮疖痛肿、丹毒、急慢性肝炎、肾孟肾炎、跌打损伤，晚期血吸虫病肝脾肿大，癫癎。外用又可洗漆疮。
丹参的化学成分主要有两大类，脂溶性的丹参酮类化合物和水溶性的酚酸类化合物。水溶性成分包括；丹参素(又称丹参酸A)，丹酚酸B(由3分子的丹参素和一分子的咖啡酸缩合而成)，迷迭香酸，迷迭香酸甲酯、原儿茶醛、咖啡酸等成分。丹酚酸B是丹参药材中含量最高的水溶性成分，可以达到2％～8％，丹酚酸B性质不稳定，极易分解。丹参药材随着煎煮时间的延长，丹酚酸B含量下降，转化成丹参素，从而导致丹参素的含量增加。因此，在质量控制中若仅对丹参素进行了含量测定，不能全面地反映制剂中丹参药材的质量，无法准确地评价丹参药材的一致性及制剂质量的稳定性。
目前，含有丹参的中药制剂(如和血明目片)中大多包含有多味药材，每味药材又有多种化学成分，如蒲黄、黄芩、车前子、茺蔚子、木贼中均含有黄酮类成分，地黄和龙胆中含有环烯醚萜苷类成分，女贞子、山楂、当归、川芎中含有有机酸类成分等，这些化学成分中又有多种水溶性成分。另提取过程中各种成分之间又会发生各种化学反应，可能产生新的物质。故现有的提取方法提取出丹参素和丹酚酸B这两种成分难度较大，需要先对水溶性化合物进行提取，再经过一系列的除杂、纯化步骤，留下尽可能少的杂质和尽可能多的目标物。
因此，目前针对丹参素和丹酚酸B的提取和检测方法仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了丹参素和丹酚酸B含量的提取和检测方法、用于提取丹参素和丹酚酸B的提取液、含有甲醇溶液和丙酮的混合液在提取丹参素和丹酚酸B中的用途、含有丹参素和丹酚酸B的样品质量控制方法，利用该提取方法可以有效地提取出样品中的丹参素和丹酚酸B，提取效率高、杂质少，利用该检测方法可以有效地确定丹参素和丹酚酸B含量，具有准确性强、分离度好、检测限低、稳定性强、重现性好、操作简便、快捷、效率高等优点，适于广泛应用。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种丹参素和丹酚酸B的提取方法。根据本发明的实施例，所述提取方法包括：将含有丹参素和丹酚酸B的样品进行第一提取处理，得到第一提取液；所述样品中含有丹参以及下列至少之一的物质：蒲黄、地黄、墨旱莲、菊花、黄芩、决明子、车前子、茺蔚子、女贞子、夏枯草、龙胆、郁金、木贼、赤芍、牡丹皮、山楂、当归和川芎；所述第一提取处理所采用的提取液包括：含有甲醇溶液和丙酮的混合液。由于待检测样品中的药材类型较多，成分较复杂，对丹参素和丹酚酸B的提取造成很大干扰。进而，发明人对提取溶剂进行大量理论研究和实验优化筛选，基于丹参素和丹酚酸B具有水溶性的特性，采用甲醇进行提取。在提取水溶性成分的过程中，相应的其他组分的水溶性杂质同时被提取出来，会对后续实验产生干扰。进而，发明人研究发现，丙酮对丹参水溶性成分具有较好的选择性和溶解性，因此，同时选择丙酮作为提取剂。由此，利用根据本发明实施例的提取方法可以有效地提取出样品中的丹参素和丹酚酸B，提取效率高、杂质少。
根据本发明的实施例，上述丹参素和丹酚酸B的提取方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述混合液中进一步含有磷酸。丹酚酸B分子中含羧基，偏酸性，发明人发现，添加酸性溶剂可以使其酸化呈游离状态，可保留丹酚酸B在提取过程中不易被转化，pH为2-3时效果最好，保证检测结果的稳定性和重现性。其中，磷酸的效果最佳。
根据本发明的实施例，所述甲醇溶液、丙酮和磷酸的体积比为(8～12)：(2.5～3.5)：(0.08～0.12)。发明人经过大量实验得到上述较佳配比，由此，检测结果的准确性强、分离度高、稳定性好。
根据本发明的实施例，所述甲醇溶液的浓度为40～60体积％。由此，可以保证检测结果的准确性。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：利用层析柱对所述第一提取液进行第二提取处理，收集洗脱液并蒸干，用溶剂溶解所述蒸干所得干燥物，得到待测液。由此，可以进一步分离出丹参素和丹酚酸B，除去杂质，尤其是对分子态较大的杂质，去除效果较佳。
根据本发明的实施例，所述层析柱选自大孔吸附树脂柱。由此，可以选择性吸附丹参素和丹酚酸B，其中，D101大孔吸附树脂柱效果较佳。从丹酚酸B的结构分析，用于纯化的树脂应选用非极性的或弱极性的树脂，D-101型大孔吸附树脂为苯乙烯型非极性共聚体，对于不带极性或者弱极性的有机化合物的吸附能力强，尤其适用于丹酚酸B和丹参素。
根据本发明的实施例，所述第二提取处理包括：将所述第一提取液通过所述层析柱，然后先用水洗脱所述层析柱，收集洗脱液，再用乙醇溶液洗脱所述层析柱，合并收集的洗脱液。先用水进行洗脱，以洗去极性较大的杂质。然后，再用乙醇进行洗脱。大孔树脂吸附的是分子态的物质，乙醇洗脱就是和大孔树脂进行对分子态的物质竞争吸附，使丹参素和丹酚酸B溶解于乙醇，从而被乙醇洗脱液带走。
根据本发明的实施例，所述乙醇溶液的浓度为40～60体积％。由此，以便于使吸附于树脂柱上的丹参素和丹酚酸B充分溶解于乙醇溶液，且减少杂质溶解其中，从而达到更好的分离目的。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：在进行所述第二提取处理之前，将所述第一提取液进行第三提取处理；其中，所述第三提取处理所采用的提取液选自乙酸乙酯。
当样品中含有颜色较深的脂溶性醌类物质时，这些物质的存在影响中药制剂中丹参素和丹酚酸B含量的测定，为除去颜色较深的脂溶性醌类物质及分离纯化，发明人经优化筛选发现，采用三氯甲烷、乙酸乙酯、异丙醇进行萃取效果较佳。考虑到三氯甲烷和异丙醇毒性较大，故选用乙酸乙酯萃取，以除去杂质。
根据本发明的实施例，基于25mL所述第一提取液，所述乙酸乙酯的添加量为20～30mL，萃取次数为2～4次，每次萃取后，收集下层液加入乙酸乙酯再次萃取。由此，可以充分萃取出丹参素和丹酚酸B。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种用于提取丹参素和丹酚酸B的提取液。根据本发明的实施例，所述提取液包括：含有甲醇溶液和丙酮的混合液。由此，根据本发明实施例的提取液可以有效地提取出样品中的丹参素和丹酚酸B，提取效率高、杂质少。
根据本发明的实施例，所述混合液中进一步含有磷酸。
根据本发明的实施例，甲醇溶液、丙酮和磷酸的体积比为(8～12)：(2.5～3.5)：(0.08～0.12)。
根据本发明的实施例，所述甲醇溶液的浓度为40～60体积％。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对丹参素和丹酚酸B的提取方法中第一提取处理所采用的提取液和第三提取处理所采用的提取液所描述的特征和优点，同样适用于该用于提取丹参素和丹酚酸B的提取液，在此不再赘述。
在本发明的又一方面，本发明提出了含有甲醇溶液和丙酮的混合液在提取丹参素和丹酚酸B中的用途。采用含有甲醇溶液和丙酮的混合液可以有效地提取出样品中的丹参素和丹酚酸B，提取效率高、杂质少。
根据本发明的实施例，所述混合液进一步含有磷酸。
根据本发明的实施例，所述甲醇溶液、丙酮和磷酸的体积比为(8～12)：(2.5～3.5)：(0.08～0.12)。
根据本发明的实施例，所述甲醇溶液的浓度为40～60体积％。
根据本发明的实施例，所述丹参素和丹酚酸B来源于含有下列至少之一的样品：
蒲黄、地黄、墨旱莲、菊花、黄芩、决明子、车前子、茺蔚子、女贞子、夏枯草、龙胆、郁金、木贼、赤芍、牡丹皮、山楂、当归和川芎。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对丹参素和丹酚酸B的提取方法中第一提取处理所采用的提取液所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
在本发明的又一个方面，本发明提出了一种丹参素和丹酚酸B含量的检测方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将样品进行第一提取处理，得到第一提取液；将所述第一提取液进行高效液相色谱检测，确定丹参素和丹酚酸B含量；其中，所述样品中含有丹参以及下列至少之一的物质：蒲黄、丹参、地黄、墨旱莲、菊花、黄芩、决明子、车前子、茺蔚子、女贞子、夏枯草、龙胆、郁金、木贼、赤芍、牡丹皮、山楂、当归和川芎；所述第一提取处理所采用的提取液包括：含有甲醇溶液和丙酮的混合液。由此，根据本发明实施例的方法可以有效地确定丹参素和丹酚酸B含量，具有准确性强、分离度好、检测限低、稳定性强、重现性好、操作简便、快捷、效率高等优点，适于广泛应用。
根据本发明的实施例，上述丹参素和丹酚酸B含量的检测方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述混合液中进一步含有磷酸。
根据本发明的实施例，所述甲醇溶液、丙酮和磷酸的体积比为(8～12)：(2.5～3.5)：(0.08～0.12)。
根据本发明的实施例，所述甲醇溶液的浓度为40～60体积％。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：利用层析柱对所述第一提取液进行第二提取处理，收集洗脱液并蒸干，用溶剂溶解所述蒸干所得干燥物，得到待测液。
根据本发明的实施例，所述层析柱选自大孔吸附树脂柱。
根据本发明的实施例，所述第二提取处理包括：将所述第一提取液通过所述层析柱，然后先用水洗脱所述层析柱，收集洗脱液，再用乙醇溶液洗脱所述层析柱，合并收集的洗脱液。
根据本发明的实施例，所述乙醇溶液的浓度为40～60体积％。
根据本发明的实施例，所述方法进一步包括：在进行所述第二提取处理之前，将所述第一提取液进行第三提取处理；其中，所述第三提取处理所采用的提取液选自乙酸乙酯。
根据本发明的实施例，基于25mL所述第一提取液，所述乙酸乙酯的添加量为20～30mL，萃取次数为2～4次，每次萃取后，收集下层液加入乙酸乙酯再次萃取。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测所采用的流动相包括：流动相A：乙醇；流动相B：磷酸溶液，浓度为0.09～0.11体积％。由此，可以有效地分离丹参素和丹酚酸B，分离度高，且杂质干扰少。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测中采用如下梯度洗脱方式。发明人发现，若采用等度洗脱，无法同时分离丹参素和丹酚酸B。进而，发明人采用如下梯度洗脱方式，可以有效地分离丹参素和丹酚酸B，分离度高，且杂质干扰少。
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～5 5 95
5～25 5→20 95→80
25～60 20→25 80→75
60～70 25→30 75→70
70～75 30→80 70→20
75～90 80→80 20→20
90～90.01 80→5 20→95
90.01～100 5 95
。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测采用的色谱柱为C18色谱柱，优选汉邦ODS-C18色谱柱。由此，可以有效地分离丹参素和丹酚酸B，分离度高，且杂质干扰少。
根据本发明的实施例，所述高效液相色谱检测采用的流动相流速为0.9～1.1mL/min，检测波长为281nm，柱温为28～32℃。由此，可以有效地分离丹参素和丹酚酸B，分离度高，且杂质干扰少。
根据本发明的实施例，所述样品选自和血明目片。和血明目片含有丹参以及下列至少之一的物质：蒲黄、丹参、地黄、墨旱莲、菊花、黄芩、决明子、车前子、茺蔚子、女贞子、夏枯草、龙胆、郁金、木贼、赤芍、牡丹皮、山楂、当归和川芎，具有凉血止血、滋阴化瘀、养肝明目的功效，用于阴虚肝旺，热伤络脉所引起的眼底出血。采用本发明的方法可以准确地测定和血明目片中丹参素和丹酚酸B含量。
本领域技术人员能够理解的是，前面针对丹参素和丹酚酸B的提取方法所描述的特征和优点，同样适用于该丹参素和丹酚酸B含量的检测方法，在此不再赘述。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种含有丹参素和丹酚酸B的样品质量控制方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用前面所述丹参素和丹酚酸B含量的检测方法检测样品中的丹参素和丹酚酸B含量；当所述丹参素满足丹参素预定含量要求和/或所述丹酚酸B符合丹酚酸B预定含量要求，是所述样品质量达标的指示；当所述丹参素不满足丹参素预定含量要求和/或所述丹酚酸B不符合丹酚酸B预定含量要求，是所述样品质量不达标的指示；所述样品中含有丹参以及下列至少之一的物质：蒲黄、地黄、墨旱莲、菊花、黄芩、决明子、车前子、茺蔚子、女贞子、夏枯草、龙胆、郁金、木贼、赤芍、牡丹皮、山楂、当归和川芎。由此，采用根据本发明实施例的方法可以准确判断出样品是否达标，从而有效地把控质量。
本发明对于丹参素预定含量要求和丹酚酸B预定含量要求不做严格限定，可以根据实际情况灵活选择。前面针对丹参素和丹酚酸B含量的检测方法所描述的特征和优点，同样适用于该制备含有丹参素和丹酚酸B的样品质量控制方法，在此不再赘述。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种和血明目片的质量控制方法，所述和血明目片中含有丹参。根据本发明的实施例，所述方法包括：采用前面所述丹参素和丹酚酸B含量的检测方法检测和血明目片中的丹参素和丹酚酸B含量；当所述丹参素满足丹参素预定含量要求和/或所述丹酚酸B符合丹酚酸B预定含量要求，是所述和血明目片质量达标的指示；当所述丹参素不满足丹参素预定含量要求和/或所述丹酚酸B不符合丹酚酸B预定含量要求，是所述和血明目片质量不达标的指示。由此，采用根据本发明实施例的方法可以准确判断出和血明目片是否达标，从而有效地把控质量。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
中药制剂处方：蒲黄、丹参、地黄、墨旱莲、菊花、黄芩(炒炭)、决明子、车前子、茺蔚子、女贞子、夏枯草、龙胆、郁金、木贼、赤芍、牡丹皮、山楂、当归、川芎。
中药制剂制备方法：以上十九味，菊花、黄芩(炒炭)、部分车前子、部分蒲黄混合粉碎成细粉，备用；剩余车前子、蒲黄与其余各昧加水浸泡，煎煮二次，煎液滤过，滤液减压浓缩成清膏，喷雾干燥，制成膏粉；将膏粉与细粉制成颗粒，加人硬脂酸镁，混匀，压制成片，包糖衣或薄膜衣，即得。
实施例1
本发明中的含量测定项目检测物质为丹参中的丹参素和丹酚酸B，检测波长为281nm，上述中药制剂的各味药材中，在280nm左右出峰的共有五味药材，分别为黄芩、决明子、龙胆、牡丹皮和丹参。
黄芩中的黄芩苷为黄酮类物质，在280nm出峰；决明子中主要成分为蒽醌类物质，如大黄酚和橙黄决明素，均在284nm出峰；龙胆中的龙胆苦苷为环烯醚萜苷类成分，在270nm左右出峰；牡丹皮中的丹皮酚在274nm左右出峰；丹参药材中除了丹参素和丹酚酸B在281nm出峰，原儿茶醛和迷迭香酸亦在280nm左右出峰。故和血明目片在280nm左右进行含量测定，目前能确定名称的物质共有9种，若提取和检测方法不恰当，则可能会出现色谱峰分离不开，分离度差，杂峰堆积等现象。为此，发明人经过大量研究，获得下述最佳的测定中药制剂中丹参素和丹酚酸B的含量：
1、供试品溶液的制备
取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇-丙酮-磷酸(10:3:0.1)溶液25ml，超声处理(功率250W,40kHz)30min，滤过，滤液浓缩至干，残渣加水20ml使溶解，用乙酸乙酯振摇提取3次，每次10ml，收集上层的乙酸乙酯提取液，合并，回收溶液至干，加10ml水溶解后，通过D101大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm，柱高为15cm)，先用100ml水冲洗，弃去洗脱液，继用50％乙醇80ml洗脱，收集洗脱液，蒸干。残渣加50％甲醇溶解并转移至25ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2、对照品溶液的制备
取丹参素钠和丹酚酸B对照品适量，精密称定，加50％甲醇制成每1ml分别含丹参素钠25μg(相当于含丹参素22.5μg)、丹酚酸B 30μg的混合溶液，即得。
3、高效液相色谱检测
表1 高效液相色谱检测条件
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪。
丹参素和丹酚酸B可以完全分离，分离度达1.5以上，检测限为0.01μg。
实施例2
在该实施例中，研究提取液组成对提取效果的影响，具体实验如下：
取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入提取液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHZ)10分钟，放冷，再称定重量，用50％甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
高效液相色谱检测条件同实施例1。
结果如表2所示，可以看出，提取效果为50％甲醇-丙酮-磷酸>50％甲醇-丙酮>50％甲醇，最终，选择50％甲醇-丙酮-磷酸作为最佳提取液。
表2 供试品溶液提取溶剂考察结果
另外，发明人针对不同组成的提取液对黄芩、决明子、龙胆、牡丹皮和丹参的提取分离效果进行了如下研究：
(1)采用50％甲醇-乙酸乙酯-甲酸(2:8:1)溶液分别提取不含黄芩的中药制剂、不含决明子的中药制剂、不含龙胆的中药制剂、不含牡丹皮的中药制剂以及含全部药材的中药制剂，注入高效液相色谱仪，进行含量测定。
结果表明，不含黄芩的中药制剂、不含决明子的中药制剂中，丹参素和丹酚酸B均能完全分离，分离度大于1.5，符合高效液相色谱法的分离要求；不含龙胆的中药制剂、不含牡丹皮的中药制剂中，丹参素色谱峰和黄芩苷色谱峰不能进行分离，丹酚酸B色谱峰和大黄酚峰不能进行分离；含全部药材的中药制剂中的丹参素和丹酚酸B色谱峰与其他杂质峰不能达到有效分离，分离度均小于1.5，黄芩中的黄酮类物质黄芩苷与丹参素色谱峰难以达到分离，决明子中的蒽醌类物质大黄酚与丹酚酸B难以达到分离，丹参中的迷迭香酸与丹参素峰难以达到分离。
(2)采用三氯甲烷-甲醇-甲酸(40:1:1)溶液分别提取不含黄芩的中药制剂、不含决明子的中药制剂、不含龙胆的中药制剂、不含牡丹皮的中药制剂以及含全部药材的中药制剂，注入高效液相色谱仪，进行含量测定。
结果表明，不含龙胆的中药制剂、不含牡丹皮的中药制剂中，丹参素和丹酚酸B均能达到完全分离，分离度大于1.5，符合高效液相色谱法的分离要求；不含黄芩的中药制剂、不含决明子的中药制剂中，丹参素色谱峰和龙胆中的龙胆苦苷色谱峰不能进行分离，丹酚酸B色谱峰和牡丹皮中的丹皮酚色谱峰不能进行分离；含全部药材的中药制剂中的丹参素和丹酚酸B色谱峰与其他杂质峰不能达到有效分离，分离度均小于1.5，龙胆中的环烯醚萜类物质龙胆苦苷与丹参素峰难以达到分离，牡丹皮中的酚类物质丹皮酚与丹酚酸B峰难以达到分离，丹参中的原儿茶醛与丹酚酸B难以达到分离。
(3)采用50％甲醇-丙酮-磷酸(10:3:0.1)溶液分别提取不含黄芩的中药制剂、不含决明子的中药制剂、不含龙胆的中药制剂、不含牡丹皮的中药制剂以及含全部药材的中药制剂，注入高效液相色谱仪，进行含量测定。
结果表明，不含黄芩的中药制剂、不含决明子的中药制剂、不含龙胆的中药制剂、不含牡丹皮的中药制剂以及含全部药材的中药制剂中，丹参素峰与丹酚酸B峰均能达到分离，分离度大于1.5；黄芩中的黄酮类物质黄芩苷、决明子中的蒽醌类物质大黄酚和橙黄决明素、龙胆中的环烯醚萜类物质龙胆苦苷、牡丹皮中的酚类物质丹皮酚以及丹参中的迷迭香酸和原儿茶醛均能够与丹参中的丹参素和丹酚酸B达到有效分离。
实施例3
在该实施例中，研究50％甲醇-丙酮-磷酸提取液中三者的比例对提取效果的影响，具体实验如下：
取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入不同提取液25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHZ)30min，放冷，再称定重量，用上述提取液补足减失的重量，摇匀，滤过，取滤液，即得。
高效液相色谱检测条件同实施例1。
结果如表3所示，可以看出，以50％甲醇-丙酮-磷酸(10:3:0.1)作为提取液，提取出的丹参素和丹酚酸B最多，提取效果最优。
表3 提取液选择
实施例4
在该实施例中，研究乙酸乙酯的添加量和萃取次数对提取效果的影响，具体实验如下：
供试品溶液的制备：取本品20片，除去包衣，精密称定，研细，取约0.5g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50％甲醇-丙酮-磷酸(10:3:0.1)25ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHZ)10分钟，滤过，滤液浓缩至干，残渣加水20ml使溶解,用乙酸乙酯振摇多次提取，每次收集上层的乙酸乙酯提取液，合并，回收溶液至干。残渣加50％甲醇溶解并转移至25ml量瓶中，加50％甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取滤液，进行高效液相色谱检测，具体条件同实施例1。
以丹参酚酸B及丹参素提取峰面积为指标，乙酸乙酯总用量(20ml、30ml)、萃取次数(2、3次)进行了优选。结果如表4所示，可以看出，采用30ml乙酸乙酯萃取3次，提取出的丹参素和丹酚酸B最多，提取效果最佳。
表4 乙酸乙酯总用量及萃取次数
实施例5
在该实施例中，研究流动相组成对提取效果的影响，具体实验如下：
1、供试品溶液和对照品溶液的制备
同实施例1。
2、高效液相色谱检测
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；采用表5和表6的流动相，进行梯度洗脱；检测波长为281nm。理论板数按丹参素峰计算应不低于3000。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪。
结果如表7所示。结果表明：同一条件下，乙腈-0.1％磷酸水溶液为流动相，供试品溶液中丹参素和丹酚酸B与其他组分能够达到基线分离，分离效果最好，因此确定其为测定流动相进行梯度洗脱。
表5 乙腈-0.1％磷酸、乙腈-0.1％甲酸洗脱程序表
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～15 10→20 90→80
15～25 20→25 80→75
25～55 25 75
55～60 25→90 75→10
60～70 90 10
注：进样前平衡10分钟。
表6 甲醇-0.5％醋酸洗脱程序表
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％)
0～15 10→20 90→80
15～25 20→25 80→75
25～55 25 75
55～60 25→90 75→10
60～70 90 10
70～70.01 90→10 10→90
70.01～80 10 90
表7 流动相考察结果
在上述条件下采用PDA检测器多波长检测，考察各主要组分色谱峰最大吸收波长，确定丹参素和丹酚酸B的检测波长。结果见表8。由于丹参素在281nm下有最大吸收，在281nm和286nm处丹酚酸B吸收无显著差别，最终确定检测波长281nm。
表8 最大吸收波长扫描结果
实施例6
在该实施例中，在不同流速(0.8ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min)、柱温(25℃、30℃、35℃)、流动相中磷酸浓度(0.095％、0.1％、0.105％)以及品牌色谱柱(Welch C18、汉邦ODS-C18)条件下测定对照品溶液和供试品溶液，记录主峰理论塔板数、分离度及拖尾因子，并计算含量，考察方法的耐用性，结果见表9。
可以看出，微调色谱条件(柱温、流速、流动相比例)，各检测成分主峰理论塔板数、分离度及拖尾因子均符合要求，均达到基线分离，分离效果良好，含量测定RSD＜2.0％，表明本方法的耐用性较好。最终，选择表1中的色谱条件作为最佳条件。
表9 耐用性
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (16)

1.一种丹参素和丹酚酸B的提取方法，其特征在于，包括：
将含有丹参素和丹酚酸B的样品进行第一提取处理，得到第一提取液；
所述样品中含有丹参以及下列至少之一的物质：蒲黄、地黄、墨旱莲、菊花、黄芩、决明子、车前子、茺蔚子、女贞子、夏枯草、龙胆、郁金、木贼、赤芍、牡丹皮、山楂、当归和川芎；
所述第一提取处理所采用的提取液包括：含有甲醇溶液、磷酸和丙酮的混合液，所述甲醇溶液的浓度为40～60体积％；
利用层析柱对所述第一提取液进行第二提取处理，收集洗脱液并蒸干，用溶剂溶解所述蒸干所得干燥物，得到待测液；
所述第二提取处理包括：
将所述第一提取液通过所述层析柱，然后先用水洗脱所述层析柱，再用乙醇溶液洗脱所述层析柱，收集洗脱液；
在进行所述第二提取处理之前，将所述第一提取液进行第三提取处理，所述第三提取处理所采用的提取液选自乙酸乙酯。
2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述甲醇溶液、丙酮和磷酸的体积比为(8～12)：(2.5～3.5)：(0.08～0.12)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述层析柱选自大孔吸附树脂柱；
所述乙醇溶液的浓度为40～60体积％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述层析柱选自D101大孔吸附树脂柱。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，基于25mL所述第一提取液，所述乙酸乙酯的添加量为20～30mL，萃取次数为2～4次，每次萃取后，收集下层液加入乙酸乙酯再次萃取。
6.一种丹参素和丹酚酸B含量的检测方法，其特征在于，包括：
将样品进行第一提取处理，得到第一提取液；
利用层析柱对所述第一提取液进行第二提取处理，收集洗脱液并蒸干，用溶剂溶解所述蒸干所得干燥物，得到待测液；
所述第二提取处理包括：
将所述第一提取液通过所述层析柱，然后先用水洗脱所述层析柱，再用乙醇溶液洗脱所述层析柱，收集洗脱液；
将所述待测液进行高效液相色谱检测，确定丹参素和丹酚酸B含量；
其中，所述样品中含有丹参以及下列至少之一的物质：
蒲黄、地黄、墨旱莲、菊花、黄芩、决明子、车前子、茺蔚子、女贞子、夏枯草、龙胆、郁金、木贼、赤芍、牡丹皮、山楂、当归和川芎；
所述第一提取处理所采用的提取液包括：含有甲醇溶液、磷酸和丙酮的混合液；
所述甲醇溶液的浓度为40～60体积％；
在进行所述第二提取处理之前，将所述第一提取液进行第三提取处理；
其中，所述第三提取处理所采用的提取液选自乙酸乙酯。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述甲醇溶液、丙酮和磷酸的体积比为(8～12)∶(2.5～3.5)∶(0.08～0.12)。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述层析柱选自大孔吸附树脂柱；
所述乙醇溶液的浓度为40～60体积％。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述层析柱选自D101大孔吸附树脂柱。
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，基于25mL所述第一提取液，所述乙酸乙酯的添加量为20～30mL，萃取次数为2～4次，每次萃取后，收集下层液加入乙酸乙酯再次萃取。
11.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测所采用的流动相包括：
流动相A：乙醇；
流动相B：磷酸溶液，浓度为0.09～0.11体积％；
所述高效液相色谱检测中采用如下梯度洗脱方式：
时间(分钟) 流动相A(％) 流动相B(％) 0～5 5 95 5～25 5→20 95→80 25～60 20→25 80→75 60～70 25→30 75→70 70～75 30→80 70→20 75～90 80→80 20→20 90～90.01 80→5 20→95 90.01～100 5 95
；
所述高效液相色谱检测采用的色谱柱为C18色谱柱；
所述高效液相色谱检测采用的流动相流速为0.9～1.1mL/min，检测波长为281nm，柱温为28～32℃。
12.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述高效液相色谱检测采用的色谱柱为汉邦ODS-C18色谱柱。
13.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述样品选自和血明目片。
14.一种含有丹参素和丹酚酸B的样品质量控制方法，其特征在于，包括：
采用权利要求6～12任一项所述丹参素和丹酚酸B含量的检测方法检测样品中的丹参素和丹酚酸B含量；
当所述丹参素满足丹参素预定含量要求和/或所述丹酚酸B符合丹酚酸B预定含量要求，是所述样品质量达标的指示；
当所述丹参素不满足丹参素预定含量要求和/或所述丹酚酸B不符合丹酚酸B预定含量要求，是所述样品质量不达标的指示；
所述样品中含有丹参以及下列至少之一的物质：
蒲黄、地黄、墨旱莲、菊花、黄芩、决明子、车前子、茺蔚子、女贞子、夏枯草、龙胆、郁金、木贼、赤芍、牡丹皮、山楂、当归和川芎。
15.根据权利要求14所述的方法，其特征在于，所述样品选自和血明目片。
16.一种和血明目片的质量控制方法，所述和血明目片中含有丹参，其特征在于，包括：
采用权利要求6～13任一项所述丹参素和丹酚酸B含量的检测方法检测和血明目片中的丹参素和丹酚酸B含量；
当所述丹参素满足丹参素预定含量要求和/或所述丹酚酸B符合丹酚酸B预定含量要求，是所述和血明目片质量达标的指示；
当所述丹参素不满足丹参素预定含量要求和/或所述丹酚酸B不符合丹酚酸B预定含量要求，是所述和血明目片质量不达标的指示。
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WO2010111935A1 (zh) * 2009-03-30 2010-10-07 天津天士力制药股份有限公司 一种新的丹酚酸化合物l、其制备方法和用途
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