KR100929098B1 - 신규한 세스퀴테르펜 화합물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사자발쑥 추출물에 관한 것으로, 특히 사자발쑥으로부터 추출한 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드(3-(2-methyl-butyryloxy)-costu-1(10),4(5)-dien-12,6-olide)에 관한 것이다.
3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드, 사자발쑥, 난소암, 백혈병, 심장순환계 질환

Description

신규한 세스퀴테르펜 화합물{Novel sesquiterpene compound}
본 발명은 사자발쑥 추출물을 포함하는 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 상게하게는 사자발쑥으로부터 추출한 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드(3-(2-methyl-butyryloxy)-costu-1(10),4(5)-dien-12,6-olide)를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.
암에 대한 이해와 치료법은 계속 발전되어 왔으나, 아직도 많은 한계점을 가지고 있어 암은 치료보다 예방이 더욱 강조되어지고 있다. 암의 발생에는 80~90 %가 환경 혹은 화학물질에 대한 노출에 의해 유발되며 이중 40~60 %가 식이와 관련된다고 보고되고 있다. 그러나, 우리가 섭취하는 식품에는 암의 발생을 억제하거나 지연시키는 효과가 있는 성분이 포함되어 있어 이들 성분의 확인과 작용 기작, 물질의 분리나 동정에 대한 연구가 많이 진행되고 있다.
세포사멸(Apoptosis) 유도 물질은 최근 함암 치료의 새로운 표적 (target)으로 부상되고 있다. 세포사멸은 세포를 죽음으로 이끄는 가장 중요한 과정으로서 진핵세포의 항상성 유지와 조직 성장 조절에 있어 매우 중요한 역할을 담당하고 있다(Douglas R Green et al., Science, 281, pp1309-1312, 1998; Michael O et al., Nature, 407, pp770-776, 2002). 세포의 증식 및 사멸은 세포 내 항상성을 유지하기 위해 반드시 필요한 과정이며, 이를 정상적으로 실행하기 위해 세포는 정상상태를 유지할 필요성이 있다. 그러나 세포 내 항상성이 파괴되면 암을 포함한 여러 가지 병이 유발된다(Thompson CB et al., Science, 267, pp1456-1462, 1995).
세포사멸은 세포 외부의 사멸 수용체(death receptor) 의존성 경로와 세포 내부의 미토콘드리아 의존성 경로를 통해서 일어난다. 또한 이러한 세포사멸은 화학요법약제의 처리에 의해서도 유도된다(Kaufmann SH et al., Exp. Cell Res., 256(1), pp42-49, 2000 ; Walker PR et al., Cancer Research, 51, pp1078-1085, 1991). 세포질에서 시스테인 프로테아제(cysteine proteases)의 종에 속하는 카스파제(caspase)는 세포사멸의 실행에 중요한 역할을 담당한다. 최초 시행자인 프로카스파제-8(procaspase-8)은 세포사로 이끄는 자극에 대해서 자가-공정(self-processing)에 의해 활성형인 카스파제-8로 바뀐다. 반면, 프로카스파제-9는 미토콘드리아의 경로에 의해서 활성화된다(Denecker G et al., Cell. Mol. Life Sci., 58, pp356-370, 2001). 이는 미토콘드리아 또한 성장 인자의 결핍, 자외선, 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 에토포사이드(etoposide)와 같은 항암제 등의 신호 전달에 의해 세포를 세포사로 유도하는 데에 중요한 역할을 담당한다는 것을 보여준다(Wilson SE, Exp. Eye Res., 69, pp255-266, 1999). 미토콘드리아 경로는 Bcl-2 종(family) 단백질의 중개로 일어난다. Bcl-2 종 단백질에는 Bcl-2 와 Bax 단백질이 속해 있으며, 이들 단백질은 미토콘드리아에서 시토크롬-c(cytochrome-c)의 이동을 조절한다(Kelekar A et al., Trends Cell Biol., 8, pp.324-330, 1998). 여 러 가지 세포사멸 유도 신호를 받은 세포에서는 자가사멸이 일어나고, 이때 세포에서는 시토크롬-c가 미토콘드리아에서 세포질로 방출된다(Newmeyer DD et al., Cell, 112, pp.481-490, 2003). 방출된 시토크롬-c는 세포질의 아포프토솜 복합체(apoptosome complex) 내에 있는 디옥시아데노신트리포스페이트(dATP), Apaf1(apoptosis protease activating factor 1)과 프로카스파제-9와 서로 상호 작용하며 결과적으로 프로카스파제-9를 활성형인 카스파제-9로 변형시킨다(Chandra J et al., Free Radic. Biol. Med., 29, pp323-333, 2000). 활성화된 카스파제-9는 카스파제-3, 카스파제-6, 카스파제-7과 같은 실행자를 활성화시킨다(Salvesen GS et al., Cell, 91, pp443-446, 1997). 상기 실행자 카스파제들은 폴리 ADP-리보스 중합효소(PARP, poly ADP-ribose polymerase), 세포막(laminas)과 ICAD(inhibitor of caspase activated DNase)를 절단한다. 상기의 절단된 단백질들은 세포사멸의 실행 표적 단백질로 사용된다. 이와 같은 세포사멸에 따른 여러 가지 현상에 의해 세포들은 염색체의 응축, DNA의 단편화, 아폽토시스 소체 형성 등의 형태학적인 특징을 가지게 된다(Germain M et al., J. Biol. Chem., 274, pp28379-28384, 1999).
최근 성인병 증가와 더불어 동맥경화 등의 혈관장애 질환이 크게 증가하고 있다. 대표적인 혈관장애 질환으로서 동맥경화는 지질대사와 관련된 유전적 요인과 식습관, 흡연, 운동부족 등의 환경적 요인에 의하여 동맥이 경화되는 질환으로, 뇌동맥 또는 관상동맥에서 일어나기 쉬우며, 이로 인하여 심장질환, 뇌혈관 질환 등의 순환계 질환으로 발전하게 된다. 뇌동맥경화의 경우에는 두통, 현기증, 정신장애 등을 나타내고 뇌연화증의 원인이 되며, 관상동맥경화의 경우에는 심장부에 동 통과 부정맥을 일으켜 협심증, 심근경색 등의 원인이 되는 것으로 알려져 있다. 또한 이로 인해 고혈압, 심장병, 뇌일혈 등이 유발되어, 동맥경화로 인한 질병이 현대 사회에 있어 특히 50~60 대 남성들에게 가장 큰 사망요인으로 부각되고 있다.
또한 혈중 콜레스테롤 농도가 높으면 관상동맥성 심혈관 질환이 유발되기 쉬우므로 혈중 콜레스테롤 농도를 줄이기 위해서는 콜레스테롤 및 지방의 섭취를 줄이는 식이요법을 시행하거나 지질대사와 관련된 효소를 저해함으로써 콜레스테롤의 흡수를 억제해야 한다. 이에, 콜레스테롤을 에스테르화하는 효소인 아실 코에이: 콜레스테롤 아실 전이효소(acyl-CoA: cholesterol acyltransferase; ACAT)에 관한 연구가 많이 행해지고 있다.
ACAT의 작용 기작은 크게 체내의 장, 간 및 혈관벽 세포의 세 부위에서 일어난다.
첫째, 장에서 ACAT는 섭취된 콜레스테롤을 에스테르의 형태로 바꾸어 장내로 흡수되는 것을 촉진시킨다. 둘째, 외부로부터 흡수되거나 체내에서 생합성된 콜레스테롤은 간에서 VLDL(very low-density lipoprotein)이라는 운반체 안에 축적된 후 혈관을 통해 신체 각 기관으로 공급되는데, 이때 ACAT에 의하여 콜레스테롤이 콜레스테릴 에스테르 형태로 전환됨으로써 운반체 내에 콜레스테롤 축적이 가능하게 된다. 셋째, 동맥혈관벽을 이루는 세포 내에서 ACAT는 콜레스테롤을 그의 에스테르 형태로 전환시켜 세포 내에 콜레스테롤이 축적되는 것을 촉진시키는데, 이는 동맥경화를 일으키는 직접적인 원인이 된다. 또한 ACAT 활성에 의해 거품세포가 콜레스테롤로부터 유도된 다량의 콜레스테릴 에스테르를 포함하기 때문에 실험적, 임 상적인 측면에서 대식세포와 평활근세포로부터 유도된 거품세포의 형성은 매우 중요하다. 혈관벽 내의 거품세포의 증식은 ACAT 활성 증가와 직접적으로 연관되어 있기 때문에 강력한 항동맥경화제로서 ACAT 저해제의 개발은 바람직하다.
따라서, ACAT의 활성을 억제하는 약물은 첫째 장내 콜레스테롤의 흡수를 억제하여 체내로 유입되는 콜레스테롤의 양을 감소시킬 수 있을 것이며, 둘째 간에서 혈관 내로 콜레스테롤이 방출되는 것을 억제하여 혈중 콜레스테롤 농도를 떨어뜨릴 수 있고, 셋째 혈관벽 세포에 콜레스테롤이 축적되는 것을 방지하여 직접적으로 동맥경화를 예방할 수 있을 것으로 기대된다.
지금까지 보고된 ACAT 활성 저해제는 쥐간 마이크로좀 ACAT 또는 쥐간 대식세포(J774) ACAT에 대한 활성 저해제이다. 사람의 ACAT에는 hACAT-1(50 kDa) 및 hACAT-2(46 kDa)가 있는데, hACAT-1은 성인의 간, 부신, 대식세포, 신장에서 주로 작용하며, hACAT-2는 소장 및 간에서 작용한다(Rudel, L. L. et al., Curr. Opin. Lipidol. 12, 121-127, 2001). 사람 ACAT 활성을 저해하는 물질은 음식으로부터 유입되는 콜레스테롤의 흡수를 억제하고, 혈관 내벽에 콜레스테릴 에스테르의 축적을 억제하는 기작을 통해 고콜레스테롤증, 콜레스테롤 결석 또는 동맥경화 예방 및 치료제의 표적이 되고 있다(Buhman, K. K. et al., Nature Med. 6, 1341-1347, 2000).
상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하고자, 본 발명은 암 질환 또는 심장순환계 질환 예방 및 치료용 조성물에 사용이 가능한 신규 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드(3-(2-methyl-butyryloxy)-costu-1(10),4(5)-dien-12,6-olide)를 제공한다.
상기 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드는 사자발쑥으로부터 추출된다.
본 발명의 약학 조성물은 HeLa(난소암) 및 U-937(백혈병) 세포주에 대한 암세포 증식 억제, 세포사멸(apoptosis) 유도 등 강한 세포독성 효과를 가져 난소암 및 백혈병 예방 및 치료에 효율적이다. 또한 항산화 활성(또는 아실 코에이:콜레스테롤 아실 전이효소 억제 활성)을 가져 LDL의 산화(또는 콜레스테릴 에스테르의 합성 및 축적)로 유발되는 고지혈증, 뇌동맥, 관상동맥 심장병, 동맥경화, 심근경색 등에 유용하게 사용될 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 약학 조성물은 사자발쑥으로부터 추출한 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드(3-(2-methyl-butyryloxy)-costu-1(10),4(5)-dien-12,6-olide)를 유효성분으로 포함하여 난소암, 백혈병 등 암 질환 뿐 아니라 고지혈증, 뇌동맥, 관상동맥 심장병, 동맥경화, 심근경색 등 심장순환계 질환을 예방 및 치료할 수 있다.
상기 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드는 건조한 사자발쑥 전초 중량(㎏)의 약 1 내지 15배, 바람직하게는 약 5 내지 10배의 C1 내지 C4의 저급알코올, 바람직하게는 메탄올에 담가 24 시간 동안 반복 정치 추출하고 여과한 후, 감압농축하고 이들을 통상의 분획 공정을 수행하여 얻을 수 있다.
구체적으로, 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드는 건조한 사자발쑥 전초 2.4 ㎏을 80% MeOH 수용액 (15ℓ×2)에 24 시간 동안 담궈 실온에서 추출한다. 상기 추출물을 여과하고 남은 것을 동일한 방법으로 2 회 더 추출하여 얻어진 여액을 모두 합쳐 감압농축하여 MeOH 추출물을 얻을 수 있다. 이렇게 얻어진 MeOH 추출물을 에틸아세테이트(EtOAc, 2ℓ×2)로 분배 추출하고, 물층은 다시 n-butanol(n-BuOH, 2ℓ×2)로 분배 추출한다. 각 층을 감압농축하여 EtOAc 분획(SJBE), n-BuOH 분획(SJBB)과 H2O 분획(SJBW)을 얻는다. 상기 얻어진 SJBE-12 분획을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(n-hexane:EtOAc=5:1)를 실시하여 수득한 10 개의 분획물(SJBE-12-1~SJBE-12-10) 중, SJBE-12-4 분획을 ODS c.c.(MeOH:H2O=2:1)로 정제하여 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드를 분리할 수 있다.
상기와 같이 추출한 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드는 하기 화학식 1로 표시된다.
Figure 112009046691043-pat00001
상기 화학식 1의 화합물(yellowish powder)은 IR spectrum에서 ester(1763 cm-1)의 흡수와 이중결합(1670 cm-1)의 흡수를 관측할 수 있었으며, 분자량은 EI/MS spectrum에서 분자이온 peak([M]+ m/z 332)로부터 332로 결정하였다. 1H-NMR(400MHz, CDCl3) spectrum의 저자장 영역에서 1개의 exomethylene proton signal[(δH 6.25, H-13a), (δH 5.51, H-13b)], 2개의 olefine methine proton signal[(δH 4.89, H-9), (δH 4.86, H-1)], 2개의 oxygenated methine proton signal[(δH 5.18, H-3), (δH 4.56, H-6)]을 관측할 수 있었다. 고자장 영역에서는 δH 1.34~2.55 사이에서 다수의 methine 및 methylene proton signal을 관측할 수 있었고, 2개의 singlet methyl proton signal[(δH 1.69, H-14), (δH 1.44 , H-15)], 1개의 doublet methyl proton signal(δH 0.95, H-3') 과 1개의 triplet methyl proton signal(δH 0.90, H-4')을 관측할 수 있었다. 13C-NMR spectrum(100MHz, CDCl3)에서는 총 20개의 signal을 관측할 수 있었다. 또한, 저자장 영역에서는 carbonyl carbon signal[(δC 175.4, C-1'), (δC 169.9, C-12)] 2개, olefine quaternary carbon signal[(δC 139.4, C-4), (δC 138.8, C-10) 및 (δC 138.6, C-11)] 3개, olefine methine carbon signal[(δC 125.5, C-5) 및 (δC 124.1, C-1)] 2개 및 exomethylene signal (δC 120.2, C-13)을 관측할 수 있었으며, 2개의 oxygenated-methine signal[(δC 81.0, C-6), (δC 78.5, C-3)]을 관측할 수 있었다. 고자장 영역에서는 2개의 methine signal[(δC 50.03, C-7), (δC 41.34, C-2')], 4개의 methylene signal[(δC 41.02, C-8), (δC 32.23, C-2), (δC 28.28, C-9), (δC 26.80, C-3')]과 4개의 methyl signal[(δC 16.8, C-5'), (δC 16.4, C-14'), (δC 12.7, C-15'), (δC 11.7, C-4')]을 관측할 수 있었다. 따라서, 탄소 15개의 sesquiterpene에 isoprenoid 단위가 결합한 구조임을 추정할 수 있었다. gCOSY 스펙트럼으로부터 exomethylene H-13a/b이 H-7(δH 2.56)과 각각 coupling을 보이는 cross peak를 확인할 수 있었다. 또한, H-7이 oxygenated methine[(δH 4.56, H-6), (δH 2.42, H-8a), (δH 2.10, H-8b)]과 각각 cross peak를 보였고, oxygenated methine H-6(δH 4.85, H-5)와 cross peak를 보여 주어, 고리의 부분 구조를 확인할 수 있었다. 또한, oxygenated methine(δH 5.18, H-3)이 methylene H-2a/2b와 각각 coupling을 확인하고, 2개의 methyl H-4'/5'이 각각 H-2'/3'과 coupling하고 있음을 확인할 수 있었다. gHSQC로부터 각 수소와 탄소의 연결관계를 확인할 수 있었으며, 이를 바탕으로 gHMBC로부터 구조를 동정할 수 있었다. H-2'가 methyl C-5'와 carbonyl C-1'과 cross peak를 보여주었고, H-3'가 methyl C-4'와 cross peak를 보임으로써 isoprenoid 단위는 2-methylbutyric acid ester 구조임을 알 수 있었다. Oxygenated methine H-3이 C-1'과 cross peak를 보여주어 위 작용기가 3번에 결합한 sesquiterpene임을 알 수 있었다. 또한, exomethylene proton H-13a/b가 C-7, 8, 11, 12와 각각 cross peak를 보이고, H-6이 C-12와 cross peak를 보임으로써 이 부분구조가 olide 형태를 취하고 있음을 알 수 있었다. 또한 olefine methine H-5가 oxygenated methine C-3 및 olefine quaternary C-4와 각각 cross peak를 보였으며, methyl H-15는 C-4, C-5 및 C-3과 각각 cross peak를 보여주었고, 또한, methyl H-14가 C-10, C-1 및 C-9에 cross peak를 보여주어 위치를 확인할 수 있었다. 이 구조는 germacrane 골격의 costunolide 계열의 화합물임을 알 수 있었다. 따라서, 데이터를 종합하여 본 결과, C-1과 C-10 및 C-4와 C-5 사이에 이중결합을 가지며, C-11의 위치에 exomethylene을 가지며, C-3과 C-6에 ester bond를 가지고, C-3에 2-methylbutyric acid ester를 갖는 sesquiterpene, 즉 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드(3-(2-methylbutyryloxy)-costu-1(10),4(5)-dien-12,6-olide)로 동정하였으며, 문헌을 조사하여 본 결과 천연에서 처음 발견된 신물질로 판명되었다.
본 발명은 상기와 같은 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드를 유효성분으로 포함하는 암 질환 및 심장순환계 질환 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
상기 사주발쑥으로부터 추출한 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드는 HeLa(난소암) 및 U-937(백혈병) 세포주에 대한 암세포 증식 억제, 세포사멸(apoptosis) 유도 등 강한 세포독성 효과를 가질 뿐 아니라, 동시에 항산화 활성(또는 아실 코에이:콜레스테롤 아실 전이효소 억제 활성)을 가져 LDL의 산화(또는 콜레스테릴 에스테르의 합성 및 축적)로 유발되는 고지혈증, 뇌동맥, 관상동맥 심장병, 동맥경화, 심근경색 등에 유용하게 사용될 수 있다.
상기 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드는 본 발명의 약학 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 99 중량%로 포함되는 것이 바람직하다. 그 함량이 상기 범위내일 경우에는 난소암, 백혈병 등의 암 질환과 고지혈증, 뇌동맥, 관상동맥 심장병, 동맥경화, 심근경색 등 심장순환계 질환의 예방 및 치료에 있어 더욱 좋다.
상기 약학 조성물에는 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함될 수 있다.
또한 상기 약학 조성물의 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타약학적 활성 화합물과 결합뿐 아니라 적당한 집합으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물유 등이 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calciumcarbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용 제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서 본 발명의 약학 조성물은 1일 0.0001 내지 100 ㎎/㎏으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 ㎎/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
[실시 예]
이하 실시 예들에서 사용되는 실험재료로 U-937(인체 조직상 임파종 세포주), HeLa(인체 자궁경부암 세포주)는 한국 세포주 은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 또한, RPMI 1640 배지, fetal bovine serum(FBS), penicillin 및 streptomycin은 Life Technologies, Inc의 것을 사용하였으며, 3-(4,5- dimethylthiazole-2-yl)-2,5-diphenyl-tertazolium bromide(MTT)는 Sigma Chemical Co.의 것을 사용하였다.
실시 예 1. 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드 추출
건조한 사자발쑥 전초 2.4 ㎏을 80% MeOH 수용액(15ℓ×2)에 24 시간 동안 담궈 실온에서 추출하였다. 상기 추출물을 여과하고 남은 것을 동일한 방법으로 2회 더 추출하였다. 이렇게 얻어진 여액을 모두 합쳐 감압농축하여 MeOH 추출물을 얻었다. 상기 얻어진 MeOH 추출물을 에틸아세테이트(EtOAc, 2ℓ×2)로 분배 추출하였으며, 물층은 다시 n-butanol(n-BuOH, 2ℓ×2)로 분배 추출하였다. 그 다음, 각 층을 감압농축하여 EtOAc 분획(SJBE), n-BuOH 분획(SJBB)과 H2O 분획(SJBW)을 얻었다. 상기 얻어진 SJBE-12 분획을 실리카 겔 컬럼 크로마토그라피(n-hexane:EtOAc=5:1)를 실시하여 10개의 분획물(SJBE-12-1~SJBE-12-10)을 얻었다. 이 중 SJBE-12-4 분획을 ODS c.c.(MeOH:H2O=2:1)로 정제하여 하기 화학식 1로 표시되는 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드를 분리하였다.
[화학식 1]
Figure 112009046691043-pat00002
3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드: yellowish powder(MeOH); m.p. 103-105 ℃; IR(KBr, cm-1): 1763, 1670, 1450, 1140; EI/MS m/z(70 eV): 332[M]＋, 217, 189, 175, 150, 123, 109, 53; 1H-NMR(400 MHz, CDCl3, δH): 6.27(1H, d, J=3.2 Hz, H-13a), 5.52(1H, d, J=3.2 Hz, H-13b), 4.85(1H, dd, J=4.5, 11.1, Hz, H-1), 4.74(1H, d, J=9.9, Hz, H-5), 4.57(1H, dd, J=8.7, 9.9 Hz, H-6), 2.57(1H, t, J=8.4 Hz, H-7), 1.70(3H, d, J=1.5, Hz, H-15), 1.42(3H, br s, H-14), =13.6, br s Hz, H-9a), 2.11(1H, dd, J=13.6, 2.4 Hz, H-9b), 1.17(3H, d, J=7.2 Hz, H-4'), 1.16(3H, d, J=7.2 Hz, H-3'). 13C-NMR(100 MHz, CDCl3, δC): 175.49(C-1'), 169.95(C-12), 139.45(C-4), 139.45(C-11), 138.84(C-10), 125.50(C-5), 124.19(C-1), 120.02(C-13), 81.03(C-6), 78.57(C-3), 50.03(C-7), 41.34(C-2'), 41.02(C-8), 32.23(C-2), 28.28(C-9), 26.8(C-3'), 12.87(C-5'), 11.72(C-4').
실시 예 2. 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드의 암세포주에 대한 세포독성 측정
상기 실시 예 1에서 추출한 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드의 세포 독성효과를 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
먼저 먼저 암세포주인 U-937(인간 조직상 임파종 세포주) 및 HeLa(인간 자궁경부암 세포주) 세포를 10% FBS, 페니실린(100 유니트/㎖), 스트렙토마이신 설페이트(100㎍/㎖)가 포함된 RPMI 배지에서 37 ℃, 5% 이산화탄소의 습기 있는 환경에서 배양하였다. 각 암세포들은 원심분리 및 스크래퍼로 수집하여 10% FBS를 포함하는 RPMI 1640 배지 100 ㎕를 포함하는 96 웰 플레이트에 1×105/웰을 넣었다. 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드는 디메틸설폭사이드(DMSO) 용매에 용해시켰으며, 모든 시험에서 DMSO의 농도는 0.1 %를 초과하지 않도록 하였다. 하룻밤 경과 후, 시료를 첨가하고 플레이트는 48 시간 동안 배양하였다. 세포들은 한차례 세척한 후 5 ㎎/㎖의 MTT를 함유하는 FBS 없는 배지 50 ㎕를 첨가하였으며, 37 ℃에서 4 시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 세포내에 형성된 포마잔 블루(formazan blue)를 100 ㎕의 DMSO에 녹인 후, 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 암세포 증식억제효과를 IC50 값으로 구하였다. IC50은 화합물을 처리하지 않았을 때에 비하여 세포의 숫자가 50% 감소효과를 나타내는 농도(IC50)를 의미한다. 그 결과는 하기 표 1에 나타내었으며, 제시되는 값은 3회 평균값이다.
구분 U-937 HeLa
IC50 (㎍/㎖) 15.98 19.59
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드는 HeLa(인간 자궁경부암 세포주) 및 U-937(인간 조직상 임파종 세포주) 대하여 IC50가 각각 19.59 ㎍/㎖ 및 15.98 ㎍/㎖으로 암세포의 성장을 억제함을 확인할 수 있었다.
실시 예 3. 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드의 ACAT 활성에 미치는 영향
(ACAT 효소원 제조)
상기 실시 예 1에서 추출한 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드의 사람 ACAT-1 및 ACAT-2의 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 베큘로바이러스 발현체제를 이용하여 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 단백질을 얻었다. 사람 간 cDNA 라이브러리 스크리닝(library screening)을 통하여 얻어진 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 cDNA를 베큘로바이러스 전달 벡터에 삽입하고, 곤충세포인 sf9 세포에 도입하여 바이러스를 제조하였다. 다음으로, 플라크 정제(plaque purification) 방법으로 hACAT-1 및 hACAT-2 각각의 재조합 바이러스를 분리한 후, 3 차례의 증폭과정을 거쳐 저장용 바이러스(viral stock)의 역가(titer)를 높였다. 단백질 발현 효율이 좋은 Hi5 곤충세포에 재조합 바이러스를 감염다중도(Mutiplicity of Infection)가 1이 되도록 감염시킨 후, 27 ℃에서 하루 동안 진탕배양하였다. 배양된 hACAT-1과 hACAT-2가 각각 과량 발현된 Hi5 세포들로부터 마이크로좀 분획을 분리하기 위하여 500 rpm에서 15 분간 원심분리하여 세포들을 모으고 저장완충액(hypotonic buffer)에서 급냉동, 급해동 방법으로 세포를 깬 후, 100,000 rpm에서 한 시간 동안 초원심분리하였다. 이렇게 얻어진 마이크로좀 분획들은 단백질 농도가 8 ㎎/㎖이 되도록 저장완충액으로 현탁하여 사용 전까지 저온냉동기에 보관하였다.
(ACAT 활성 측정)
ACAT 활성의 측정은 [1-14C] 올레오일-코에이(oleoyl-CoA)(56.0 μCi/μmol; Amersham)를 기질로 하여 Brecher & Chan의 방법(P. Brecher and C. Chan, Biochim. Biophys. Acta, 617, 458, 1980)을 일부 수정하여 사용하였다.
상기 실시예 1에서 추출한 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드 10 ㎕, 상기에서 수득한 마이크로좀 용액 4.0 ㎕, 활성분석 완충액(0.5 M KH2PO4, 10 mM DTT, pH 7.4; Sigma) 20.0 ㎕, 지방이 제거된 우혈청알부민(BSA; bovine serum albumin, 저장액 농도 40 ㎎/㎖; Sigma) 15.0 ㎕, 콜레스테롤(저장액 농도 20 ㎎/㎖; Sigma) 2.0 ㎕, 증류수 41.0 ㎕를 가하여 37 ℃에서 15 분간 예비 반응시켰다. 이 반응액에 [1-14C] 올레오일-코에이(0.05 μCi, 최종농도: 10 ㎛) 8 ㎕를 첨가하여 다시 37 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 이소프로판올:헵탄 혼합물(4:1 (v/v)) 1 ㎖을 가하여 반응을 정지시켰다. 여기에 600 ㎕의 헵탄과 200 ㎕의 0.1M KH2PO4(pH 7.4)를 첨가하고, 혼합물을 볼텍서(vortexer)로 격렬하게 혼합한 후, 300 rpm에서 5 분 동안 원심분리를 하였다. 상기 원심분리하여 얻은 100 ㎕의 상층액을 신틸레이션 병(scintillation bottle)에 넣고, 신틸레이션 액(Lipoluma) 4 ㎖을 가하였다. 이 혼합물의 방사선량은 1450 마이크로베타 액체 신틸레이션 계수기(1450 Microbeta liquid scintillation counter, Wallacoy)로 측정하였다.
ACAT 활성은 측정된 방사선량으로부터 시간당 방사선량을 계산하여 1 분 동안 단백질 1 ㎎당 합성된 콜레스테릴 올레이트 피코몰(피코몰/분/㎎ 단백질)로 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.
구분 hACTC-1 (100 ㎍/㎖) hACTC-2 (100 ㎍/㎖)
ACTC 활성 저해율 (%) 36.0 ± 0.5 (IC50 = 29.5 ㎍/㎖) 13.6 ± 7.0 (IC50 = 25.7 ㎍/㎖)
상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 약학 조성물에 유효성분으로 포함되는 3-(2-메틸-부티릴옥시)-코스투-1(10),4(5)-디엔-12,6-올라이드는 ACAT 활성에 대한 억제능이 우수함을 확인할 수 있었다.

Claims (1)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 세스퀴테르펜 화합물.
    <화학식1>
    Figure 112009046691043-pat00003
KR1020090069668A 2009-07-29 2009-07-29 신규한 세스퀴테르펜 화합물 KR100929098B1 (ko)

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