KR20230108755A - 큰금계국 꽃 유래 페닐헵타트리인을 포함한 항염증용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 항염증용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에서는 큰금계국(Coreopsis lanceolata) 꽃으로부터 페닐헵타트리인을 추출하고 이의 뛰어난 항염증 효과를 확인하였으며, 상기 조성물은 퇴행성 신경 질환의 치료제 등으로 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 큰금계국 꽃 유래 페닐헵타트리인을 포함한 항염증용 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 이는 여러 염증 질환, 예를 들면 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료 분야에서 사용될 수 있다.
인간의 평균 수명이 증가함에 따라 많은 국가에서 고령화 사회가 급속히 발전하고 있으며 전 세계적으로 노화 방지에 대한 태도가 활발히 변화하고 있다. 노화는 면역 조절 장애, 산화 스트레스 및 자유 라디칼 생성과 관련이 있으며, 장기 기능 저하 및 재생 능력 상실을 동반한다. 이러한 기능 장애 중 산화 스트레스는 염증 노화(inflammatory aging)라고 불리는 노화 관련 만성 염증 과정에 기여한다.
염증은 사이토카인, 케모카인과 같은 염증유발 매개체가 합성되어 방출되는 현상으로, 만성 염증은 생리적, 환경적 요인에 반응하여 염증성 사이토카인과 케모카인이 증가하여 면역 체계가 낮은 수준에서 계속 기능하도록 하는 상태를 의미한다. 만성염증의 원인으로는 유전적 감수성, 내장비만, 만성감염, 세포노화 등이 있다.
큰금계국(Coreopsis lanceolata)은 Compositae 과의 식물로, Compositae 식물은 감기, 두통 및 고혈압을 치료하는 데 오랫동안 사용되어 왔다. Compositae과 식물에서는 수많은 천연 화합물이 분리되고 플라보노이드 유형 화합물이 보고된 바 있다.
큰금계국은 또한 항산화 및 항암 효과가 있으며 혈당을 낮추는 것으로 알려진 다양한 플라보노이드를 함유하고 있으나, 항신경염 및 항염 특성에 대한 효과는 보고된 바가 없다.
본 발명에서는 큰금계국 꽃에서 다양한 유효성분을 분리하고 in vitro 모델을 이용하여 BV2 소교세포와 RAW264.7 대식세포에 대한 항염 효과를 조사한 결과, 천연 화합물을 이용한 효과적인 항염증 조성물 개발에 성공하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 항염증 효과가 있는 조성물 및 이를 이용한 약학적 조성물, 건강기능식품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 큰금계국 꽃에서 천연 화합물을 추출하여 항염증용 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는 항염증용 조성물:
[화학식 1]
(식 중, R은 C1 내지 C10의 알킬기임).
2. 위 1에 있어서, 상기 식 중 R은 메틸인 항염증용 조성물.
3. 위 1에 있어서, 상기 염증은 신경 염증인 항염증용 조성물.
4. 위 1 또는 2의 조성물을 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
5. 위 4에 있어서, 상기 퇴행성 신경 질환은 알츠하이머병 또는 파킨슨병인 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
6. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 항염증용 건강기능식품:
[화학식 1]
(식 중, R은 C1 내지 C10의 알킬기임).
7. 큰금계국(Coreopsis lanceolata) 꽃으로부터 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 얻는 단계;를 포함하는 항염증용 조성물 제조 방법:
[화학식 2]
.
8. 위 7에 있어서, 상기 큰금계국 꽃을 알코올로 추출하는 단계; 및 상기 알코올 추출물을 디클로로메테인으로 분획하는 단계;를 포함하는, 항염증용 조성물 제조 방법.
9. 위 8에 있어서, 상기 알코올은 에탄올인 항염증용 조성물 제조 방법.
본 발명을 이용하여 세포독성이 없고 항염증 효과가 뛰어난 항염증용 조성물을 얻을 수 있으며, 이는 퇴행성 신경 질환을 예방 또는 치료하기 위한 목적으로 이용될 수 있다.
본 발명의 방법을 이용하여 큰금국계국(Coreopsis lanceolata) 꽃으로부터 항염증 효과를 가지는 천연 화합물을 추출할 수 있다.
도 1은 C. lanceolata 꽃에서 분리한 화합물 1-5의 화학 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 BV2 미세아교세포(a) 및 RAW264.7 대식세포(b)에 대한 C. lanceolata 꽃에서 분리된 5가지 천연 화합물의 세포독성을 나타낸 것이다. 세포 독성은 10~80μM의 화합물 1-5로 48시간 동안 처리된 세포에서 평가되었다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 대 대조군.
도 3은 BV2 미세아교세포 및 RAW264.7 대식세포에서 아질산염 및 PGE2 생성에 대한 각 화합물의 억제 효과를 나타낸 것이다. BV2(a) 및 RAW264.7(b) 세포에서 아질산염 생성 억제 효과는 5-20μM의 화합물 1-5로 전처리한 다음 LPS로 처리하여 18시간 동안 유도되었다. BV2(c) 및 RAW264.7(d) 세포에서 PGE2 생성 억제 효과는 2.5-20μM의 화합물 1-5로 전처리한 다음 LPS로 처리하여 18시간 동안 유도되었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 대 LPS.
도 4는 BV2 미세아교세포 및 RAW264.7 대식세포에서의 각 화합물의 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 억제 효과를 나타낸 것이다. BV2(a) 및 RAW264.7(b) 세포에서 TNF-α 생성 억제 효과는 2.5-20 μM의 화합물 1-5로 전처리한 후 LPS로 처리하여 18시간 동안 유도되었다. BV2(c) 및 RAW264.7(d) 세포에서 IL-6 생성 억제 효과는 2.5-20μM의 화합물 1-5로 전처리한 후 LPS로 처리하여 18시간 동안 유도되었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. ** p < 0.01, *** p < 0.001 대 LPS.
도 5는 LPS 유도 BV2 미세아교세포(a) 및 RAW264.7 대식세포(b)에서 산화질소 합성효소(iNOS) 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 단백질 발현 수준에 대한 화합물 1의 효과를 나타낸 것이다. pro-inflammatory protein iNOS와 COX-2의 발현 억제 효과는 10-20μM의 화합물 1로 전처리한 후 LPS 처리에 의해 18시간 동안 세포에서 유도되었다. 웨스턴 블롯 분석으로 얻은 3가지 독립적인 실험의 대표적인 블롯을 나타내었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 대 LPS.
도 6은 LPS 유도 BV2 미세아교세포(a) 및 RAW264.7 대식세포(b)에서 핵 NF-κB 전위에 대한 화합물 1의 억제 효과를 나타낸 것이다. 세포를 18시간 동안 0.5㎍/mL LPS의 존재 하에 10-20μM의 화합물 1로 처리하였다. 웨스턴 블롯 분석을 수행하고 3개의 독립적인 실험의 대표적인 블롯을 표시하였다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 대 LPS.
도 7은 화합물 1 유도 BV2 미세아교세포(a) 및 RAW264.7 대식세포(b)에서 HO-1의 발현을 나타낸 것이다. CoPP를 양성 대조군으로 사용하였다. 세포를 20μM의 CoPP 또는 화합물 1로 처리한 다음 12시간 동안 인큐베이션하였다. 웨스턴 블롯 분석을 수행하고 4개의 독립적인 실험의 대표적인 블롯을 표시하였다. 데이터는 4개의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. *** p < 0.001 대 LPS.
도 8은 BV2 미세아교세포(a) 및 RAW264.7 대식세포(b)에서 HO-1 활성 조절을 통한 아질산염 생성에 대한 화합물 1의 억제 효과를 나타낸 것이다. 세포를 5μM의 SnPP 및 화합물 1로 처리한 다음 18시간 동안 LPS(0.5μg/mL)에 노출시켰다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. *** p < 0.001 대 LPS. ### p < 0.05 대 LPS 및 화합물 1.
도 9는 C. lanceolata L. 70% EtOH 추출물의 CH2Cl2 분획에서 세 가지 화합물의 분리 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 10은 C. lanceolata L. 70% EtOH 추출물의 EtOAc 분획에서 세 가지 화합물의 분리 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 BV2 미세아교세포(a) 및 RAW264.7 대식세포(b)에 대한 C. lanceolata 꽃에서 분리된 5가지 천연 화합물의 세포독성을 나타낸 것이다. 세포 독성은 10~80μM의 화합물 1-5로 48시간 동안 처리된 세포에서 평가되었다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 대 대조군.
도 3은 BV2 미세아교세포 및 RAW264.7 대식세포에서 아질산염 및 PGE2 생성에 대한 각 화합물의 억제 효과를 나타낸 것이다. BV2(a) 및 RAW264.7(b) 세포에서 아질산염 생성 억제 효과는 5-20μM의 화합물 1-5로 전처리한 다음 LPS로 처리하여 18시간 동안 유도되었다. BV2(c) 및 RAW264.7(d) 세포에서 PGE2 생성 억제 효과는 2.5-20μM의 화합물 1-5로 전처리한 다음 LPS로 처리하여 18시간 동안 유도되었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 대 LPS.
도 4는 BV2 미세아교세포 및 RAW264.7 대식세포에서의 각 화합물의 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6의 억제 효과를 나타낸 것이다. BV2(a) 및 RAW264.7(b) 세포에서 TNF-α 생성 억제 효과는 2.5-20 μM의 화합물 1-5로 전처리한 후 LPS로 처리하여 18시간 동안 유도되었다. BV2(c) 및 RAW264.7(d) 세포에서 IL-6 생성 억제 효과는 2.5-20μM의 화합물 1-5로 전처리한 후 LPS로 처리하여 18시간 동안 유도되었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. ** p < 0.01, *** p < 0.001 대 LPS.
도 5는 LPS 유도 BV2 미세아교세포(a) 및 RAW264.7 대식세포(b)에서 산화질소 합성효소(iNOS) 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2)의 단백질 발현 수준에 대한 화합물 1의 효과를 나타낸 것이다. pro-inflammatory protein iNOS와 COX-2의 발현 억제 효과는 10-20μM의 화합물 1로 전처리한 후 LPS 처리에 의해 18시간 동안 세포에서 유도되었다. 웨스턴 블롯 분석으로 얻은 3가지 독립적인 실험의 대표적인 블롯을 나타내었다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 대 LPS.
도 6은 LPS 유도 BV2 미세아교세포(a) 및 RAW264.7 대식세포(b)에서 핵 NF-κB 전위에 대한 화합물 1의 억제 효과를 나타낸 것이다. 세포를 18시간 동안 0.5㎍/mL LPS의 존재 하에 10-20μM의 화합물 1로 처리하였다. 웨스턴 블롯 분석을 수행하고 3개의 독립적인 실험의 대표적인 블롯을 표시하였다. 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001 대 LPS.
도 7은 화합물 1 유도 BV2 미세아교세포(a) 및 RAW264.7 대식세포(b)에서 HO-1의 발현을 나타낸 것이다. CoPP를 양성 대조군으로 사용하였다. 세포를 20μM의 CoPP 또는 화합물 1로 처리한 다음 12시간 동안 인큐베이션하였다. 웨스턴 블롯 분석을 수행하고 4개의 독립적인 실험의 대표적인 블롯을 표시하였다. 데이터는 4개의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. *** p < 0.001 대 LPS.
도 8은 BV2 미세아교세포(a) 및 RAW264.7 대식세포(b)에서 HO-1 활성 조절을 통한 아질산염 생성에 대한 화합물 1의 억제 효과를 나타낸 것이다. 세포를 5μM의 SnPP 및 화합물 1로 처리한 다음 18시간 동안 LPS(0.5μg/mL)에 노출시켰다. 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균 ± SD 값으로 표시되었다. *** p < 0.001 대 LPS. ### p < 0.05 대 LPS 및 화합물 1.
도 9는 C. lanceolata L. 70% EtOH 추출물의 CH2Cl2 분획에서 세 가지 화합물의 분리 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 10은 C. lanceolata L. 70% EtOH 추출물의 EtOAc 분획에서 세 가지 화합물의 분리 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는 항염증용 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
(식 중, R은 C1 내지 C10의 알킬기임)
상기 식 중 알킬기는 탄소원자를 1 내지 10개 포함하고, 하나 이상의 이중결합을 포함하는 사슬형 또는 가지형 구조의 포화 히드로카빌 치환기를 의미한다.
상기 C1-10 알킬기는 예를 들면 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, 이차부틸, 삼차부틸, n-펜틸 등 일 수 있고, 구체적으로 메틸일 수 있다.
상기 항염증은 염증을 억제하는 것을 의미한다. 상기 염증은 예를 들면 생물학적(세균, 진균, 바이러스 등) 인자가 생체에 작용하여 생체는 그것에 대해서 방어적 반응을 일으킨 상태를 의미한다.
병원체가 생체 내 물리적 장벽을 깨고 침입하면 염증반응이 발발하며, 염증반응 시 초기단계에 면역반응을 담당하는 백혈구들이 염증성 사이토카인을 발현한다.
예를 들면, 대식세포는 식세포작용(phagocytosis)을 하는 면역세포로서 대부분의 인체 조직에 존재하는 내재성 면역반응의 중요한 1차 방어 기능을 담당한다. 상기 식세포작용은 상기 대식세포가 세균이나 이물질을 탐색, 제거하는 작용으로 상기 대식세포는 상처부위로 모여들어 침입한 세균을 공격한다. 이에, 상처부위에 혈장이 축적되고 혈류가 증가되어 발열, 홍반, 부종, 통증 현상 등의 외적 증상이 일어나게 되며, 대식세포는 TNF-α, IL-6 등의 다양한 종류의 사이토카인(cytokine)을 분비하고 항원에 대한 면역 반응에 중추적인 역할을 한다. 따라서 세포 내 염증성 사이토카인의 발현양은 염증반응 활성화의 지표가 될 수 있다.
본 발명의 실시예에서 사용된 LPS(lipopolysaccharide)는 염증반응의 유도 물질이다. LPS는 백혈구와 같은 면역세포와 상호작용을 하며, 단핵세포의 대식세포들에 있어서 iNOS 이소 형태의 활성화에 의한 산화질소 농도의 증대에 의한 염증 반응에 있어서 중요한 역할을 한다.
상기 염증은 예를 들면 신경 염증일 수 있다. 신경 염증은 중추신경계에 손상이 오게 될 때 백혈구(leukocyte), 미세아교세포(microglia), 별아교세포(astrocyte)가 활성화되고 다양한 염증 관련 물질들이 분비되는 것으로 정의된다.
상기 염은, 본 발명에 따른 특정 화합물과 비교적 무독성인 산 또는 염기를 이용해서 조제되는 염을 의미한다. 염은 예를 들어 산 부가염 또는 금속염일 수 있다. 염은 약학적으로 허용 가능한 염일 수 있다.
상기 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물에 함유될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오즈, 덱스트로즈, 수크로스, 덱스트린, 말토덱스트린, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제되나, 이에 제한되지 않는다.
경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며 이에 제한되지는 않으나, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
한편, 본 발명의 조성물은 자체적으로 항염증 효과를 가지고 있거나 항염증 효과를 보조하는 것으로 잘 알려져 있는 성분을 추가로 함유시킬 수 있으며, 이로써 보다 바람직한 항염증 효과를 얻을 수 있다.
본 발명은 상기 조성물을 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기 퇴행성 신경 질환은, 중추신경계와 말초신경계의 구조와 기능이 시간이 지남에 따라서 서서히 변하게 됨으로써 발생하게 되는 신경계 질환들을 통칭한다. 예를 들면 알츠하이머병(Alzheimer’s disease), 파킨슨병(Parkinson’s disease)이 포함된다.
퇴행성 신경 질환이 발생하는 정확한 원인은 명확하지 않고 질환의 진행을 멈출 수 있는 치료 역시 개발되지 못한 상태이나, 퇴행성 신경 질환의 발병과 질병의 경과에서 신경염증반응(neuroinflammation)은 중요 인자 중 하나로 알려져 있다.
뇌신경에서 만성적 신경 염증 상태는 미세아교세포(microglia) 등의 교세포(glia)를 활성화 시키고, 이들로부터 여러 가지 cytokine의 분비를 촉진하고, 예를 들면, 상기 미세아교세포는 Aβ 또는 Tau와 결합하면서 iNOS, TNF-α, NO, IL-6 등 다양한 염증매개물질을 분비하는데, 이러한 면역 반응들로 인해 신경 손상이 지속적으로 이루어지는 것이다.
상기 기전을 통한 만성신경염증 반응에 의한 신경세포 퇴화 과정은 알츠하이머를 포함하여 파킨슨병, 외상성뇌손상(traumatic brain injury) 후에 발생하는 만성 외상성뇌병증(chronic traumatic encephalo-pathy), 루게릭병(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 등 다양한 퇴행성 뇌신경질환에서 공통적으로 관찰되는 것이다.
예를 들면 알츠하이머병 동물 모델을 통한 PET 연구 등을 통해 알츠하이머병에서 미세아교세포가 활성화된다는 것이 확인되었으며, 이러한 실험결과들은 미세아교세포가 알츠하이머병의 진행과 밀접한 관련이 있고, 특히 신경염증반응에서 중요한 역할을 함을 시사한다(Cai Z, Hussain MD, Yan LJ. Microglia, neuroinflammation, and beta-amyloid protein in Alzheimer's disease. Int J Neurosci. May 2014;124(5):307-21., Valotassiou V, Malamitsi J, Papatriantafyllou J, et al. SPECT and PET imaging in Alzheimer's disease. Ann Nucl Med. Nov 2018;32(9):583-593. 참조).
또한, 파킨슨병에서 M1 microglia의 발현이 중요한 역할을 한다는 것은 사후에 채취한 검체의 substantia nigra뿐만 아니라 striatum에서도 IL-1β, IL-6, TNFα의 증가가 발견되면서 알려졌다(Ho MS. Microglia in Parkinson's Disease. Adv Exp Med Biol. 2019;1175:335-353. 참조). 만성적으로 활성화된 미세아교세포는 많은 염증 매개체를 분비하여 뉴런을 손상시키고 미세아교세포를 더욱 활성화시켜 염증과 신경 퇴행을 촉진하는 사이클을 촉진한다.
상기 화학식 1의 화합물은 상기 미세아교세포에서 염증 매개 물질인 NO, PGE2, 염증성 사이토카인 TNF-α 및 IL-6을 억제하고, 염증 물질 생성에 관여하는 iNOS, COX-2의 단백질 발현 수준을 낮추는 등의 높은 항염증 효과가 확인되었으며, 따라서 이를 퇴행성 신경 질환의 예방이나 치료를 위한 용도로 사용할 수 있다.
본 발명은 상기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 항염증용 건강기능식품에 관한 것이다.
상기 화학식 1에 대하여는 전술한 바와 같다.
상기 건강기능식품이라 함은, 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
상기 항염증은 염증을 억제하는 것을 의미하며, 구체적으로 염증은 생물학적(세균, 진균, 바이러스 등) 인자가 생체에 작용하여 생체는 그것에 대해서 방어적 반응을 일으킨 상태를 의미한다.
상기 염증은 예를 들면 신경 염증일 수 있다. 신경 염증은 중추신경계에 손상이 오게 될 때 백혈구(leukocyte), 미세아교세포(microglia), 별아교세포(astrocyte)가 활성화되고 다양한 염증 관련 물질들이 분비되는 것으로 정의된다.
상기 건강기능식품은 항염증 효과가 있으므로, 염증 질환의 예방 또는 개선을 위해 사용될 수 있다.
예를 들면, 상기 건강기능식품은 염증 질환의 증상 개선에 도움을 줄 수 있으며, 이를 통해 만성 염증이 촉진시키는 퇴행성 신경 질환, 즉 알츠하이머 병이나 파킨슨 병의 증상을 개선하는 것일 수 있다.
상기 건강기능식품은 항염증을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.
상기 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.
상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 상기 펩타이드를 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.
캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 상기 펩타이드를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 펩타이드를 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.
환 형태의 건강기능식품은 상기 펩타이드와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.
과립 형태의 건강기능식품은 상기 펩타이드와 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류. 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복함제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.
또한, 본 발명은 큰금계국(Coreopsis lanceolata, C. lanceolata) 꽃으로부터 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 얻는 단계;를 포함하는 항염증용 조성물 제조 방법에 관한 것이다.
[화학식 2]
상기 항염증은 염증을 억제하는 것을 의미하며, 구체적으로 염증은 생물학적(세균, 진균, 바이러스 등) 인자가 생체에 작용하여 생체는 그것에 대해서 방어적 반응을 일으킨 상태를 의미한다.
상기 염증은 예를 들면 신경 염증일 수 있다. 신경 염증은 중추신경계에 손상이 오게 될 때 백혈구(leukocyte), 미세아교세포(microglia), 별아교세포(astrocyte)가 활성화되고 다양한 염증 관련 물질들이 분비되는 것으로 정의된다.
상기 큰금계국 꽃으로부터 상기 화합물을 얻는 단계는, 상기 큰금계국 꽃을 추출 및 분획하여 수행되는 것일 수 있다.
상기 추출은 예를 들면 알코올을 통해 수행될 수 있다. 상기 알코올은 예를 들면 탄소수 1 내지 4의 알코올일 수 있고, 구체적으로 메탄올, 에탄올일 수 있으며, 바람직하게는 에탄올일 수 있다.
상기 추출은 다양한 방법으로 수행될 수 있고, 예를 들면 냉침 추출, 환류냉각추출법, 용매추출법, 수증기증류법, 초음파추출법, 용출법, 압착법 등의 방법으로 추출된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 분획 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용하는 방법에 따라 수행될 수 있다. 즉 상기 분획은 본 발명의 통상의 기술자가 상기 화합물을 분리하기에 적절한 용매를 선택하여 수행될 수 있는 것이고, 예를 들면 유기 용매를 사용할 수 있으며, 구체적으로 디클로로메테인을 사용하는 것일 수 있다.
상기 분획은 다양한 용매를 처리하여 수행하는 용매 분획법, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 수행하는 한외여과 분획법, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)를 수행하는 크로마토그래피 분획법, 및 이들의 조합 등이 있다.
예를 들면 상기 화합물은 큰금계국 꽃을 알코올로 추출하는 단계; 및 상기 알코올 추출물을 디클로로메테인으로 분획하는 단계;를 포함할 수 있다. 상기 알코올은 구체적으로 에탄올일 수 있다.
이후 예를 들면 상기 분획물을 크로마토그래피를 이용하여 각 성분으로 용리할 수 있다. 예를 들면 헥산-아세톤 기울기 용리 시스템 및 CHCl3-아세톤 등용매 용리 시스템 등을 수행하여 상기 화합물을 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다.
실시예
실험 방법
1. 식물 재료
C. lanceolata 꽃(CL19-001)은 2019년 8월 전라남도 영광시 불갑면에서 채집하였다. 바우처 표본(CL19-001)은 조선대학교 천연물화학연구실(한국 광주)에 기탁되었다.
2. 분리에 사용된 재료 및 도구
개방형 컬럼 크로마토그래피(C.C.)에 사용된 수지는 실리카겔 60(40-63 및 63-200 μm, Merck, Darmstadt, Germany), LiChroprep RP-18(40-63 μm, Merck), Sephadex LH-20(25- 100 μm, Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA)와 ODS-A(12 nm, S-75 μm, YMC, Kyoto, Japan)를 사용하였으며, sand(50-70 mesh, Sigma-Aldrich)이 샘플을 배치하기 위해 사용되었다. 핵 자기 공명(NMR) 스펙트럼(1 및 2차원) 400MHz(1H의 경우 400MHz, 13C의 경우 100MHz)를 JNM ECP-400 분광계(JEOL, Tokyo, Japan)에서 얻었다. COSY(상관 분광법), DEPT(편극 전달에 의한 왜곡 없는 향상), HSQC(이핵 단일 양자 상관 관계) 및 HMBC(이핵 다중 결합 상관 관계)를 표준 JEOL 펄스 시퀀스를 사용하여 기록했다. 600 MHz NMR 스펙트럼은 KBSI-Gwangju Center에서 VNMRS 600 MHz NMR 분광기(Varian, Palo Alto, CA, USA)를 사용하여 기록되었으며 화학적 이동은 ppm(δ)으로 표시되었다. 분석에 사용된 용매인 CDCl3 및 DMSO-d6은 Sigma-Aldrich에서 구입했다.
3.
C. lanceolata
꽃에서 화합물 (1-5)의 분리
건조된 C. lanceolata(400g)를 80℃에서 3L의 70% 에탄올로 2회 추출하여 40g의 추출물을 얻었다. 추출물을 CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH 및 H2O를 사용하여 순차적으로 분획하여 CH2Cl2 분획 4.482 g, EtOAc 분획 3.663 g, n-BuOH 분획 8.051 g 및 H2O 분획 22.273 g을 얻었다.
CH2Cl2 분획(4445 mg)에 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(C.C.)를 수행하고 헥산-아세톤 기울기 용리 시스템(1:0-0:1, v/v)을 사용하여 용리하여 7개의 하위 분획(DM1-DM7)을 얻었다. 분획 DM-1을 실리카겔 C.C.에서 추가로 크로마토그래피하였다. CHCl3-아세톤 등용매 용리 시스템(10:1, v/v)을 사용하여 4개의 하위 분획(DM11-DM14)을 얻었다. 분획 DM11을 실리카겔 C.C.에서 추가로 크로마토그래피하였다. CHCl3-아세톤 등용매계(10:1, v/v)를 사용하여 화합물 1(DM113, 54.5 mg)을 얻었다. 이어서, 분획 DM-2를 실리카겔 C.C. 상에서 추가로 크로마토그래피하였다. 헥산-아세톤 구배 시스템(1:0-0:1, v/v)을 사용하여 7개의 하위 분획(DM21-DM27)을 얻었다. 분획 DM24를 실리카겔 C.C. 상에서 추가로 크로마토그래피하였다. 헥산-아세톤 등용매 시스템(2:1, v/v)을 사용하여 7개의 하위 분획(DM241-DM247)을 얻었다. 분획 DM241을 C-18 C.C.에서 추가로 크로마토그래피했다. MeOH-H2O 구배 시스템(1:0-0:1, v/v)을 사용하여 두 개의 하위 분획(DM2411-DM2412)을 얻었다. 분획 DM2411을 C-18 C.C.에서 추가로 크로마토그래피했다. MeOH-H2O 구배 시스템(2:1-1:0, v/v)을 사용하여 7개의 하위 분획(DM24111-DM24117)을 얻었고, 화합물 2(DM24117, 0.5 mg)를 얻었다. 이어서 MeOH-H2O 등용매 시스템(1:1, v/v)을 사용하여 Kinetex® 5 μm EVO C18 100 Å LC 컬럼과 결합된 HPLC로 분획 DM24116을 얻어 화합물 3(DM241161, 0.8 mg)을 얻었다(도 9).
EtOAc 분획(1500 mg)에 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(C.C.)를 수행하고 CHCl3-MeOH-H2O 구배 시스템(10:1:0.1-1:1:0.1, v/v/v)으로 용리하여 두 개의 하위 분획(EA1 및 EA2)을 얻었다. 분획 EA-1을 ODS-A C.C에서 추가로 크로마토그래피했다. MeOH-H2O 구배 시스템(1:3-1:1, v/v)을 사용하여 화합물 4(EA12, 15 mg)를 포함한 6개의 하위 분획(EA11-EA16)을 얻었다. 이어서, 분획 EA14를 ODS-A C.C. 상에서 추가로 크로마토그래피하였다. MeOH-H2O 등용매 시스템(2:3, v/v)을 사용하여 9개의 하위 분획(EA141-EA149)을 생성하였다. 분획 EA142를 LH-20 C.C에서 추가로 크로마토그래피하였다. CHCl3-MeOH 등용매 시스템(7:1, v/v)을 사용하여 4개의 하위 분획(EA1421-EA1424)을 얻었다. 분획 EA1422를 C-18 C.C에서 추가로 크로마토그래피하였다. MeOH-H2O 등용매 시스템(1:1, v/v)을 사용하여 화합물 5(EA14223, 20.3 mg)를 얻었다(도 10).
화합물 1을 노란색검(gum)으로 얻었다. 1H- 및 13C- NMR 데이터를 분석한 결과 분자식은 C13H8인 것으로 확인되었다. 1H-NMR(CDCl3, 400MHz): δ: 7.51-7.49(2H, m, H-2' 및 6'), 7.39-7.29(3H, m, H-3', 4' 및 5'), 2.0 (3H, s, H-1); 13C-NMR(CDCl3, 100MHz): δ: 4.7(C-1), 75.3(C-2), 65.0(C-3), 67.5(C-4), 59.0(C-5), 74.7(C -6), 78.3(C-7), 133.0(C-2'), 128.5(C-3'), 129.5(C-4'), 128.5(C-5'), 133.0(C-6').
화합물 2를 녹색 검(gum)으로 얻었다. 1H- 및 13C-NMR 데이터를 분석한 결과, 분자식은 C18H18O5인 것으로 확인되었다. 1H-NMR(CDCl3, 600MHz): δ: 13.54(1H, s, 2'-OH), 7.86(1H, d, J=8.4Hz, H-7), 7.84(1H, d, J=1.8Hz , H-6'), 7.44(1H, d, J = 15.6Hz, H-8) 7.26(1H, d, J = 1.8Hz, H-2), 7.17(1H, d, J = 1.8Hz, H -6), 6.50(1H, d, J = 2.4Hz, H-3'), 6.49(1H, dd, J = 7.2Hz, H-5'), 3.97(3H, s, 5-OCH3), 3.94 (3H, s, 4-OCH3), 3.87 (3H, s, 4'-OCH3); 13C-NMR(CDCl3, 150MHz): δ: 127.8(C-1), 151.6(C-4), 149.3(C-5), 144.6(C-7), 123.3(C-8), 191.7(C-9), 166.1(C-1'), 168.6(C-2'), 101.1(C-3'), 107.6(C-4'), 114.1(C-5'), 110.1(C-6').
화합물 3을 노란색 검(gum)으로 얻었다. 1H- 및 13C- NMR 데이터를 분석한 결과 분자식은 C17H16O4인 것으로 확인되었다. 1H-NMR(CDCl3, 600MHz): δ: 7.87(1H, d, J=8.8Hz, H-5), 7.41(2H, d, J=8.4Hz, H-2' 및 6'), 6.96( 2H, d, J = 8.4Hz, H-3' 및 5'), 6.62(1H, dd, J = 8.8, 2.4Hz, H-6) 6.48(1H, d, J = 2.4Hz, H-8) , 5.42(1H, dd, J= 16.2, 3.0Hz, H-2), 3.84(3H, s, 7-OCH3), 3.83(3H, s, 4'-OCH3), 3.06(1H, dd, J= 16.8, 13.3Hz, H-3a), 2.80(1H, dd, J = 16.8, 2.9Hz, H-3b); 13C-NMR(CDCl3, 150MHz): δ: 79.8(C-2), 44.1(C-3), 190.9(C-4), 128.7(C-5), 110.2(C-6), 166.1(C -7), 100.8(C-8), 163.6(C-9), 114.7(C-10), 130.6(C-1'), 127.7(C-2' 및 C-6'), 114.0(C- 3' 및 C-5'), 159.9(C-4'), 55.6(7'-OCH3), 55.4(4'-OCH3).
화합물 4를 레드 검(gum)으로 얻었다. 1H- 및 13C-NMR 데이터를 분석한 결과, 분자식은 C16H14O6인 것으로 확인되었다. 1H-NMR(DMSO-d6, 400MHz): δ: 7.40(1H, d, J=9.0Hz, H-5), 6.92(1H, d, J=1.2Hz, H-6'), 6.77(2H , d, J= 3.2Hz, H-2' 및 3'), 6.57(1H, d, J= 8.8Hz, H-6) 5.42(1H, dd, J=14.8, 2.4Hz, H-2), 3.70(3H, s, 7-OCH3), 3.05(1H, dd, J = 29.2, 12.4Hz, H-3a), 2.66(1H, dd, J = 19.6, 2.8Hz, H-3b), 13C-NMR(DMSO-d6, 100MHz): δ: 79.8(C-2), 43.7(C-3), 190.8(C-4), 122.6(C-5), 110.8(C-6), 157.2 (C-7), 135.9(C-8), 155.3(C-9), 114.9(C-10), 130.5(C-1'), 118.3(C-2'), 115.9(C-3') , 145.7(C-4'), 146.2(C-5'), 114.8(C-6'), 60.7(OCH3).
화합물 5를 빨간색 검(gum)으로 얻었다. 1H- 및 13C-NMR 데이터를 분석한 결과, 분자식은 C16H12O6인 것으로 확인되었다. 1H-NMR(DMSO-d6, 400MHz): δ: 10.84(1H, s, OH), 9.73(1H, s, OH), 9.35(1H, s, OH), 7.45(1H, d, J = 2.0 Hz, H-2'), 7.34(1H, d, J = 8.4Hz, H-4), 7.26(1H, dd, J = 10.0, 1.6Hz, H-6'), 6.86(1H, d, J = 8.4Hz, H-5'), 6.78(1H, d, J= 8.4Hz, H-5), 4.03(3H, s, OCH3), 13C-NMR(DMSO-d6, 100MHz): δ: 181.9(C-3), 158.6(C-8), 158.3(C-6), 148.7(C-2), 146.14(C-3'), 146.06(C-4'), 132.8(C-7), 125.1(C-6'), 123.8(C-1'), 119.9(C-2'), 118.4(C-5'), 116.6(C -4), 115.3(C-9), 113.9(C-10), 112.8(C-5), 61.3(7-OCH3).
4. 세포 배양 및 MTT 분석
Murine microglia BV2 세포와 RAW264.7 세포는 원광대학교 김윤철 교수(한국 익산)가 기증한 것이다. 세포(5 × 106 세포/플레이트)는 스트렙토마이신(100μg/mL), 10% 열 비활성화 FBS 및 페니실린 G(100 units/mL)를 함유하는 α-MEM(BV2) 또는 RPMI-1640(RAW264.7)의 100mm 접시에 접종했다. 그런 다음 37°C에서 가습된 대기(5% CO2 및 95% 공기)에서 배양했다. 모든 화합물을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 녹여 각 실험에 사용하였다. 세포 생존력을 결정하기 위해 세포를 ~2 × 104cells/well의 밀도로 유지한 다음 화합물로 처리했다. 표시된 시간 동안 인큐베이션한 후, 세포 배양 배지를 각 웰에서 제거하고 각 웰에서 200μL의 새로운 배지로 교체했다. 세포를 0.5 mg/mL의 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT)와 함께 1시간 동안 인큐베이션하고, 형성된 포르마잔을 DMSO에 용해시켰다. 용해된 포르마잔의 흡광도는 ELISA 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, San Jose, CA, USA)를 사용하여 540 nm의 파장에서 측정하였다.
5. 산화질소(NO) 발생 측정
산화질소(NO)의 생성을 측정하기 위해 마우스 미세아교세포 BV2 세포와 마우스 대식세포 RAW 264.7 세포를 지질다당류(LPS)와 5가지 화합물로 처리했다. 18시간 동안 배양한 후 상층액을 Griess Reagent와 혼합하여 반응시켰다. 그 후, 570 nm의 파장에서 ELISA 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 측정을 수행하였다(Molecular Devices).
6. 프로스타글란딘(PGE2) 분석
배양 배지를 수집하고 R&D Systems(Minneapolis, MN, USA)에서 시판되는 키트를 사용하여 각 샘플에 존재하는 PGE2의 수준을 결정했다. 분석은 제조업체의 지침에 따라 수행되었다.
7. 인터루킨(IL)-6 및 종양 괴사 인자(TNF)-α 분석
배양 배지를 수집하고, BioLegend(San Diego, CA, USA)에서 시판되는 키트를 사용하여 각 샘플에 존재하는 IL-6 및 TNF-α의 수준을 결정하였다. 분석은 제조업체의 지침에 따라 수행되었다.
8. 웨스턴 블롯 분석 및 세포질 및 핵 세포 분획 추출
웨스턴 블로팅은 다음과 같이 수행하였다. 수확 후, 세포를 3분 동안 원심분리하여 펠렛화하였다. 다음으로, 세포를 PBS로 세척하고 프로테아제 억제제 혼합물(0.1mM 페닐메탄설포닐 플루오라이드, 5mg/mL 아프로티닌, 5mg/mL 펩스타틴 A 및 1mg/mL 키모스타틴)을 함유하는 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4)에 용해시켰다. 단백질 농도는 Lowry 단백질 분석 키트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 결정되었다. 각 샘플의 단백질(30mg)은 7.5% 및 12% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 사용하여 분리한 다음 Hybond 강화 화학 발광(ECL) 니트로셀룰로오스 멤브레인(Bio-Rad, Hercules, 캘리포니아, 미국)에 전기영동으로 전달하였다. 5% 탈지유로 막을 막고 1차 항체와 양고추냉이 과산화효소가 결합된 2차 항체를 차례로 배양한 후 ECL 검출(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA)을 하였다. IκBα, NF-κB p65, β-액틴(Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), HO-1(Merck), iNOS(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA), PCNA( Millipore, Middlesex, MA, USA) 및 Anti-COX2/사이클로옥시게나제 2(Abcam, Cambridge, UK). 또한, Cayman Nuclear Extraction Kit(Cayman Chemical)을 이용하여 세포질 및 핵 분획을 추출하고, 각 분획을 제조사의 지시에 따라 용해시켰다.
9. 통계 분석
모든 데이터는 3개의 독립적인 실험으로 수집되었으며 평균 ± SD로 표시되었다. GraphPad Prism 소프트웨어 버전 3.03(GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA)을 사용하여 통계 분석을 수행했다. 평균 차이는 일원 분산 분석(one-way ANOVA)에 이어 Tukey의 다중 비교 검정에 의해 결정되었으며 통계적 유의성은 p < 0.05로 정의되었다.
실험 결과
1.
C. lanceolata
꽃에서 플라보노이드의 분리 및 식별
C. lanceolata의 말린 꽃을 70% EtOH로 추출하고 CH2Cl2, EtOAc, n-BuOH 및 H2O로 분획하였다. CH2Cl2와 EtOAc 분획을 실리카겔, C-18, Sephadex LH-20 컬럼크로마토그래피를 통해 5종의 화합물을 얻었다. 분리된 화합물은 1D-NMR(1H, 13C, DEPT) 및 2D-NMR(COSY, HSQC, HMBC) 분광법으로 분석하였다. 페닐헵타트리인(1), 2'-히드록시-3,4,4'-트리메톡시칼콘(2), 4',7-디메톡시플라바논(3)은 CH2Cl2 분획에서, 8-메톡시부틴(4) 및 렙토시딘(5)는 EtOAc 분획에서 구조적으로 확인되었다(도 1).
화합물 1을 노란색 검(gum)으로 얻었다. 1H- 및 13C-NMR(CDCl3) 데이터를 분석한 결과 분자식은 C13H8인 것으로 나타났다. 화합물 1의 1H-NMR 스펙트럼은 5개의 방향족 양성자(δ 7.51-7.49 및 7.39-7.29)와 메틸 양성자(δ = 2.0)를 나타냈다. 13C-NMR 및 DEPT 데이터는 5개의 올레핀계 탄소(δ 128.5, 129.5 및 133.0), 방향족 4차 탄소(δ 121.2), 6개의 sp 탄소(δ 59.0, 65.0, 67.5, 74.7, 및 75.3), 및 메틸 탄소(δ 4.7). 1H- 및 13C-NMR 데이터의 분석으로부터, 이 화합물의 구조는 메틸트리아세틸렌기가 부착된 페닐기를 갖는 것으로 추측되었다. 문헌의 1H- 및 13C-NMR 데이터와의 비교에서 화합물 1의 구조는 헵타-1,3,5-트리이닐벤젠(페닐헵타트리인)으로 결정되었다.
화합물 2를 노란색 검(gum)으로 얻었다. 1H- 및 13C-NMR(CDCl3) 데이터를 분석한 결과 분자식은 C18H18O5인 것으로 나타났다. 화합물 2의 1H-NMR 데이터는 수산기(δ 13.54), 2개의 트랜스 올레핀계 양성자(δ 7.44, 7.86 및 15.6Hz), 6개의 올레핀계 양성자(δ 6.49, 6.50, 6.91, 7.17, 7.26) 및 및 3개의 메톡시 양성자(δ 3.87, 3.94 및 3.97). 13C-NMR 데이터는 카르보닐 탄소(δ 191.8), 4개의 산소화된 방향족 탄소(δ 149.3, 151.6, 166.1 및 166.6), 2개의 α,β-불포화 탄소(δ 144.6, 131.1) 그리고 3개의 메톡시 탄소(δ 55.6, 56.00 및 56.02)를 포함한 18개의 신호의 존재를 보여주었다. 1H- 및 13C-NMR 데이터의 분석으로부터, 이 화합물의 구조는 칼콘(chalcone) 골격을 갖는 것으로 추측되었다. HMBC 데이터를 추가로 분석하여 메톡시 및 하이드록시 그룹의 위치를 확인했다. 이전 문헌의 1H- 및 13C-NMR 데이터와의 비교로부터, 화합물 2의 구조는 (E)-3-(3,4-디메톡시페닐)-1-(2-히드록시-4-메톡시페닐)프로프-2-엔-1-온(2'-히드록시-3,4,4'-트리메톡시칼콘)인 것으로 결정되었다.
화합물 3을 노란색 검(gum)으로 얻었다. 1H- 및 13C-NMR(CDCl3) 데이터를 분석한 결과 분자식은 C17H16O4인 것으로 나타났다. 화합물 3의 1H-NMR 데이터는 7개의 올레핀계 양성자[δ 6.48, 6.62, 6.96(2H), 7.41(2H) 및 7.87], 산소화된 메틴 양성자(δ 5.42), 2개의 메톡시 양성자(δ 3.84), 3.8 및 메틸렌 양성자(δ 3.06, 2.80). 13C-NMR 데이터는 카르보닐 탄소(δ 190.9), 3개의 산소화된 방향족 탄소(δ 159.9, 163.6 및 166.1), 1개의 산소화된 메틴 탄소(δ 79.8), 2개의 메톡시 탄소(δ 55.4 및 55.6) 및 메틸렌 탄소(δ 44.1)를 포함한 17개의 신호의 존재를 보여주었다. 1H- 및 13C-NMR 데이터의 분석으로부터, 이 화합물의 구조는 플라바논 골격을 갖는 것으로 추측되었다. 문헌의 1H- 및 13C-NMR 데이터와의 비교에 기초하여, 화합물 3의 구조는 7-메톡시-2-(4-메톡시페닐)크로멘-4-온(4',7-디메톡시플라바논)인 것으로 결정되었다.
화합물 4를 빨간색 검(gum)으로 얻었다. 1H- 및 13C-NMR(DMSO-d6) 데이터를 분석한 결과 분자식은 C16H14O6인 것으로 나타났다. 화합물 4의 1H- 및 13C-NMR 데이터는 누락된 메톡시기 및 3개의 추가된 히드록실기를 제외하고 그 구조가 화합물 3의 구조와 유사함을 시사하였다. HMBC 데이터의 분석으로부터, 이 화합물은 화합물 3과 달리, 위치 7'과 3'에 2개의 히드록시기가 부착된 것으로 밝혀진 반면, 위치 4'의 메톡시기는 히드록시기로 치환되었다. 이전 문헌의 1H- 및 13C-NMR 데이터와의 비교에서, 화합물 4의 구조는 2-(3,4-디히드록시페닐)-7-히드록시-8-메톡시-2,3-디히드로크로멘-4-원 (8-메톡시부틴)인 것으로 결정되었다.
화합물 5를 빨간색 검(gum)으로 얻었다. 1H- 및 13C-NMR(DMSO-d6) 데이터를 분석한 결과 분자식은 C16H12O6인 것으로 나타났다. 화합물 5의 1H-NMR 데이터는 3개의 히드록시기(δ 9.35, 9.73 및 10.84), 6개의 올레핀 양성자(δ 6.68, 6.78, 6.86, 7.26, 7.34 및 7.45) 및 메톡시 양성자(δ.4)를 나타내었다. 13C-NMR 데이터는 카르보닐 탄소(δ 181.9), 5개의 산소화된 올레핀 탄소(δ 146.05, 146.14, 148.8, 158.3 및 158.6) 및 메톡시 탄소(δ 61.3)를 포함하는 16개 신호의 존재를 보여주었다. 1H- 및 13C-NMR 데이터의 분석으로부터, 이 화합물의 구조는 오론의 골격을 갖는 것으로 추측되었다. 추가 HMBC 분석은 3개의 하이드록시 및 메톡시 그룹의 존재를 확인했다. 이전 문헌의 1H- 및 13C-NMR 데이터와의 비교에 기초하여, 화합물 5의 구조는 (2Z)-2-[(3,4-디히드록시페닐)메틸리덴]-6-히드록시-7-메톡시-1-벤조푸란-3-원 (렙토시딘)인 것으로 결정되었다.
2. 아질산염 및 PGE2 생산에 대한 5가지 화합물의 억제 효과
대식세포와 미세아교세포는 유해한 자극이 있을 때 체내에서 활성화되어 체내 항상성을 유지하는 데 중요한 역할을 한다. 그러나 외부 자극에 의해 비정상적으로 활성화되면 pro-inflammatory mediators, ROS, inflammatory cytokine이 분비된다. 염증 매개체의 분비는 세포와 뇌의 손상을 일으켜 알츠하이머, 파킨슨병과 같은 퇴행성 뇌질환을 유발할 수 있다(Pratico, D.; Trojanowski, J.Q. Inflammatory hypotheses: Novel mechanisms of Alzheimer's neurodegeneration and new therapeutic targets. Neurobiol. Aging 2000, 21, 441-445., Good, P.G.;Werner, P.; Hsu, A.; Olanow, C.W.; Perl, D.P. Evidence of neuronal oxidative damage in Alzheimer’s disease. Am. J. 참조). 대식세포와 미세아교세포가 외부 자극에 의해 활성화되면 산화질소(NO)와 프로스타글란딘 E2(PGE2)와 같은 염증유발 물질이 분비된다. 활성 염증 물질의 분비를 억제하면 세포 손상을 예방할 수 있다. 따라서 본 발명자들은 LPS에 의해 유도된 BV2 미세아교세포 및 RAW264.7 대식세포에 대한 화합물의 신경염증 억제 효과를 평가하였다.
먼저 화합물의 독성을 평가했다. 어떤 화합물에 대해서도 BV2 미세아교세포에서 독성이 관찰되지 않았지만 RAW264.7 대식세포에서는 화합물 4 및 5에 대해 독성이 관찰되었다(도 2).
독성 평가 결과 화합물의 처리 농도를 화합물 1의 경우 최대 20μM, 화합물 2, 3, 4, 5의 경우 최대 10μM로 설정하여 아질산염 생성 억제 효과를 확인하였다. LPS로 유도된 BV2 미세아교세포와 RAW264.7에서 화합물 2를 제외한 모든 화합물은 아질산염 생성에 대한 억제 효과를 나타냈으며, 화합물 1이 가장 큰 억제 효과를 나타냈다(도 3a, b). 또한, PGE2 생성에 대한 화합물의 억제 효과를 평가하였다. 화합물 중 화합물 1만이 BV2 미세아교세포 및 RAW264.7 대식세포에서 PGE2 생성을 억제했다(도 3c,d).
3. C. lanceolate 꽃에서 분리한 5가지 천연 화합물의 사이토카인 생성 억제 효과
TNF-α, IL-1β, IL-6 및 프로스타글란딘과 같은 다양한 세포 내 염증성 사이토카인은 여러 염증 조절제의 매개체로 기능한다. 그러나 외부 자극에 의해 세포가 활성화되면 사이토카인이 과도하게 분비되어 염증의 상향조절을 조절한다. 본 발명에서 연구자들은 LPS로 유도된 BV2 소교세포와 RAW264.7 대식세포에서 염증성 사이토카인 생성에 대한 화합물의 억제 효과를 관찰했다. 먼저, TNF-α 생성에 대한 화합물의 억제 효과를 측정하였다. 화합물 5를 제외한 모든 화합물은 RAW264.7에서 TNF-α 생성을 억제하는 것으로 밝혀졌으며 화합물 2와 3은 BV2 미세아교세포에서 TNF-α 생산에 억제 효과를 나타냈다(도 4a, b). 다음으로, IL-6 생성에 대한 화합물의 억제 효과를 측정하였다. 결과적으로 모든 화합물은 RAW264.7에서 IL-6 생성을 억제했으며 화합물 1과 3은 BV2 미세아교세포의 생성을 억제했다(도 4c,d). 따라서 화합물 1과 3에 대한 역학 연구를 추가로 수행하고자 하였으나, 본 발명에서 얻은 화합물 3의 양이 0.8mg에 불과하여 화합물 1만을 사용하여 추가 실험을 수행하였다.
4. iNOS 및 COX-2 발현에 대한 페닐헵타트리인의 억제 효과
염증성 사이토카인과 NO는 LPS나 병원체 존재하에서 대식세포가 활성화될 때 빠르게 생성되는 활성 염증물질이다. 이러한 염증 물질의 생성은 염증 유발성 단백질 유도성 산화질소 합성효소(iNOS) 및 사이클로옥시게나제-2(COX-2)에 의해 증가되었다. 본 발명에서는 염증성 사이토카인에 대한 가장 강력한 억제 효과를 나타내는 화합물 1에 대한 pro-inflammatory protein iNOS 및 COX-2의 발현 정도를 Western blot analysis를 통해 확인하였다. 화합물 1은 농도 의존적으로 iNOS 및 COX-2의 발현을 억제하였다(도 5a,b).
5. NF-κB 전위에 대한 페닐헵타트리인의 억제 효과
NF-κB는 iNOS와 COX-2 발현을 조절하는 전사 인자이다. 정상적인 NF-κB는 IκBα와 같은 조절 단백질과 복합체를 형성하여 불활성 형태로 남아 있다. 그러나 NF-κB가 LPS에 의해 활성화되면 IκBα는 인산화에 의해 분해되고 NF-κB는 핵으로 전위된다. 그곳에서 염증매개체 유전자의 프로모터에 결합하여 염증매개체의 발현을 유도한다. 도 5에서 화합물 1에 의해 전염증성 단백질의 발현이 억제되는 것으로 밝혀졌다. 따라서 화합물 1이 NF-κB 활성화를 조절하는지 여부를 확인하였다. 그 결과, 화합물 1이 농도 의존적으로 p-IκBα 인산화를 억제함을 확인하였다. 또한, p65의 핵으로의 전위는 농도 의존적 방식으로 억제되었다(도 6).
6. Phenylhpetatriyne에 의한 HO-1 발현 및 HO-1 활성 조절을 통한 Phenylhpetatriyne의 아질산염 생성 억제 효과
Hemeoxygenase-1(HO-1)은 세포의 강력한 항산화 신호 시스템인 핵인자 E2 관련 인자 2(Nrf2)의 표적이며, 일산화탄소(CO), 빌리버딘 및 헴(heme)에서 철의 유리를 촉진하는 효소이다. HO-1은 염증성 사이토카인의 생성을 감소시키고 항염증성 사이토카인의 생성을 촉진한다. 또한, HO-1은 염증 및 산화 스트레스로부터 세포를 보호하는 데 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있지만 활성화된 대식세포에서 아질산염 생성을 조절하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서는 화합물 1이 HO-1의 발현 수준을 증가시켰는지 여부를 조사하기 위해 웨스턴 블로팅을 사용했다. 이 과정에서 HO-1-유도제인 CoPP(Cobalt protoporphyrin)를 양성 대조군으로 사용하였다. 결과는 화합물 1이 HO-1의 발현을 상향 조절함을 보여주었다(도 7a,b).
또한, 아질산염 생성에 대한 화합물 1의 억제 효과가 HO-1에 의존하는지 여부를 조사하였다. 사용된 조사 방법은 HO-1 활성의 강력한 억제제인 프로토포르피린 IX(SnPP)를 사용하여 HO-1이 LPS에 의해 유발된 염증 반응에 대한 화합물 1의 보호 효과를 매개하는지 여부를 결정하는 것이다. 화합물 1 처리군은 LPS로 유도된 BV2 미세아교세포와 RAW264.7 모두에서 아질산염 생성에 유의한 억제 효과를 나타냈지만 SnPP를 사용한 동시 처리는 아질산염 생성에 대한 억제 효과를 나타내지 않았다(도 8).
Claims (9)
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 염을 포함하는 항염증용 조성물:
[화학식 1]
(식 중, R은 C1 내지 C10의 알킬기임).
- 청구항 1에 있어서, 상기 식 중 R은 메틸인 항염증용 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 염증은 신경 염증인 항염증용 조성물.
- 청구항 1 또는 2의 조성물을 포함하는 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 청구항 4에 있어서, 상기 퇴행성 신경 질환은 알츠하이머병 또는 파킨슨병인 퇴행성 신경 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 식품학적으로 허용되는 염을 포함하는 항염증용 건강기능식품:
[화학식 1]
(식 중, R은 C1 내지 C10의 알킬기임).
- 큰금계국(Coreopsis lanceolata) 꽃으로부터 하기 화학식 2로 표시되는 화합물을 얻는 단계;를 포함하는 항염증용 조성물 제조 방법:
[화학식 2]
.
- 청구항 7에 있어서, 상기 큰금계국 꽃을 알코올로 추출하는 단계; 및 상기 알코올 추출물을 디클로로메테인으로 분획하는 단계;를 포함하는, 항염증용 조성물 제조 방법.
- 청구항 8에 있어서, 상기 알코올은 에탄올인 항염증용 조성물 제조 방법.
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