KR102444743B1 - 피부외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

별고사리 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

Description

피부외용제 조성물{SKIN EXTERNAL COMPOSITION}

피부외용제 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체와 환경 사이에서 장벽 역할을 한다. 피부에서 활동일주기(circadian rhythm) 조절은 피부장벽, 경피수분손실(trans-epidermal water loss, TEWL), 피지 분비, 피부 온도, 피부 수화(hydration), 피부 pH 등과 관련이 되어 있다. 세포는 밤 시간 동안 DNA 회복과 복제 과정을 거치면서, 낮 시간 동안에의 자외선(UV) 노출에 스스로 대비한다. 자외선, 급격한 온도 변화, 수면 방해와 같은 환경에 지속적으로 노출되면 피부의 활동일주기 균형이 무너지면서 피부가 손상되게 된다.

또한, 피부는 자외선을 받으면 활성산소(reactive oxygen species, ROS)를 생성하여 피부 손상이 발생하게 되는데, 멜라토닌(melatonin)이라는 물질이 ROS 생성을 억제하여 피부 손상을 막고, 멜라토닌은 MMP-1 발현을 억제하여 피부 주름 개선 효과를 나타낸다(Dermatoendocrinol. ; 2012 ; 4(3) ; 245-52, Int. J. Mol. Sci. ; 2018 ; 19 ; 1995-2005).

한편, 피부장벽의 기능은 지질의 조성(composition) 및 구조(organization)에 크게 영향을 받는다. 각질세포간 지질은 세라마이드, 콜레스테롤, 자유 지방산이 동일한 몰비(equimolar ratio)로 구성되는데, 건조피부나 아토피피부염, 여드름 피부, 노화 피부 등 피부장벽이 손상된 피부에서 세라마이드가 감소되어 있다고 보고되어 있다. 아토피피부염 환자의 피부에서는 피부장벽 기능의 이상이 관찰되며, 경피수분손실(transepidermal water loss, TEWL)이 2배 내지 5배 정도 증가되고, 각질층의 수분 함량이 감소되어 있는데, 이는 각질층 지질의 감소, 특히 세라마이드의 감소가 주 원인으로 밝혀져 있다. 이러한 피부에서 피부장벽을 개선하기 위하여 세라마이드(혹은 합성 유사세라마이드)를 이용한 다양한 형태의 국소 치료법이 시도되고 있다. 그러나 천연 세라마이드는 가격이 비싸고 안전성 논란으로 사용 상에 제한이 있으며, 천연 세라마이드와 동일하거나 유사한 합성 세라마이드 역시 고가의 가격과 낮은 용해도로 인하여 다양한 제형에 도입하기 어려운 문제점이 있다.

일 구현예는 부작용이 없고 인체에 안전하면서도 피부 항상성 조절능, 자외선으로 인한 피부 손상 방지 및 피부 주름 개선 효능, 그리고 피부장벽 개선 효능이 우수한 피부외용제 조성물을 제공한다.

일 구현예는 별고사리(Cyclosorus acuminatus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부외용제 조성물을 제공한다.

상기 별고사리 추출물의 농도는 0.1 μg/mL 내지 500 μg/mL 일 수 있다.

상기 별고사리 추출물은 상기 피부외용제 조성물의 총량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있다.

상기 별고사리 추출물은 세라마이드 생합성을 촉진할 수 있다.

상기 별고사리 추출물은 세린 팔미토일 전이효소(serine palmitoyl transferase, SPT), 세라마이드 합성효소(ceramide synthase, CerS) 또는 이들의 조합을 포함하는 효소를 활성화할 수 있다.

상기 별고사리 추출물은 Period 유전자, Bmal 유전자 또는 이들의 조합을 포함하는 피부의 시계유전자 발현을 조절함으로써 피부의 활동일주기(circadian rhythm)를 정상화할 수 있다.

상기 별고사리 추출물은 피부의 멜라토닌 발현을 증가시킬 수 있다.

상기 별고사리 추출물은 기질 금속단백질 분해효소-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 활성을 억제할 수 있다.

상기 피부외용제 조성물은 피부 항상성 유지용, 피부장벽 개선용, 자외선으로 인한 피부 손상 방지 및 주름 개선용, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 피부외용제 조성물은 화장료 조성물, 두피 개선용 모발 조성물, 약학 조성물, 또는 이들의 조합일 수 있다.

일 구현예에 따른 피부외용제 조성물은 부작용이 적고 인체에 안전할뿐 아니라, 피부의 활동일주기(circadian rhythm)를 정상화하여 피부 항상성 조절능이 향상되고, 자외선으로 인한 피부 손상 방지 및 피부 주름 개선 효능과 피부장벽 개선 효능이 우수하여, 화장료 조성물, 두피 개선용 모발 조성물 및 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 일 구현예에 따른 별고사리 추출물을 각질형성세포에 처리한 경우 세라마이드 생합성 증가 정도를 나타낸 그래프이다.
도 2는 사람 각질형성세포를 UVB(ultraviolet B)로 조사한 경우 Bmal 1 유전자 및 Period 3 유전자의 발현 변화 정도를 나타낸 그래프이다.
도 3은 일 구현예에 따른 별고사리 추출물을 UVB 조사된 각질형성세포에 처리한 경우 멜라토닌 생성 증가 정도를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 1 및 비교예 1에 따른 피부외용제 조성물을 도포한 경우의 경피수분손실량 변화 정도를 나타낸 그래프이다.

이하, 구현예들에 대하여 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 구현예들은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예에 한정되지 않는다.

일 구현예에 따른 피부외용제 조성물은 별고사리(Cyclosorus acuminatus) 추출물을 유효성분으로 포함할 수 있다.

상기 별고사리 추출물을 피부외용제 조성물에 사용할 경우 피부의 시계유전자의 발현을 조절함으로써 피부의 활동일주기(circadian rhythm)를 정상화하여 피부 수분, 피지 등의 피부 항상성을 조절하는 효과를 가지며, 또한 피부의 멜라토닌 발현을 증가시킴으로써 자외선으로 인한 피부 손상 방지 및 피부 주름을 개선시킬 뿐 아니라, 피부 자체 내에서 세라마이드 생합성을 촉진하여 피부장벽 기능을 개선시킬 수 있다. 뿐만 아니라, 천연 유래 식물을 사용함으로써 피부에 자극이 적고 인체에 안전하며 장기간 사용해도 부작용이 없다.

상기 별고사리 추출물은 별고사리(Cyclosorus acuminatus (Houtt.) Nakai ex H. It

)를 추출하여 얻어질 수 있다.

상기 별고사리는 고사리목 처녀고사리과의 여러해살이풀로서, 이삭고사리라고도 한다. 한반도 남부에 자생하며, 타이완, 인도네시아, 일본, 중국, 필리핀 등에 분포하며, 산 속이나 길가 양지 등 비교적 해가 잘 드는 곳에서 지생하는 양치식물이다.

상기 별고사리를 추출하는 방법은 열수 추출법, 냉침 추출법, 용매 추출법, 수증기 증류법, 용출법, 압착법, 초음파 추출법, 여과법, 환류 추출법 등이 있으며, 이들을 단독으로 또는 2종 이상의 방법을 병용하여 수행할 수 있다. 상기 방법 중 예를 들면, 열수 추출법 또는 용매 추출법으로 별고사리를 추출할 수 있다.

상기 용매 추출법은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합물의 추출용매를 사용하여 추출하는 것으로, 예를 들면 유기용매를 사용할 수 있다.

상기 유기용매는 C1 내지 C4의 알코올일 수 있고, 예를 들면, 메탄올, 에탄올, 프로필알코올, 부틸알코올, 글리세린, 프로필렌글라이콜 및 부틸렌글라이콜로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있다.

상기 별고사리 추출물은 건조시킨 별고사리를 분쇄하여 추출용매를 첨가하고, 일정 시간 침적시키면서 적절한 시간 간격으로 교반한 후 얻어진 용액을 여과하여 회수하는 용매 추출법으로 얻을 수 있다.

상기 추출용매의 양은 별고사리의 전체 부피 대비 1배 내지 50배일 수 있고, 예를 들면, 별고사리의 건조 중량 1g 당 5㎖ 내지 20㎖ 일 수 있다. 실온에서 1일 내지 7일 동안 침적 추출하거나 50℃ 내지 95℃의 가온 조건에서 1시간 내지 5시간 동안 추출할 수 있다. 상기 온도 범위에서 추출하는 경우 부패, 변색 및 변취의 예방에 효과적이며, 상기 시간 범위에서 추출하는 경우 추출이 잘 이루어져 충분한 활성 성분을 확보할 수 있다.

상기 별고사리 추출물의 농도는 0.1 μg/mL 내지 500 μg/mL 일 수 있고, 예를 들면, 0.5 μg/mL 내지 200 μg/mL 일 수 있고, 2.5 μg/mL 내지 50 μg/mL 일 수 있다. 별고사리 추출물의 농도가 상기 범위 내일 경우 피부의 시계유전자, 예를 들면, Period 유전자, Bmal 유전자 또는 이들의 조합을 포함하는 피부의 시계유전자의 발현이 조절됨으로써 피부의 활동일주기를 정상화하여 피부 항상성 조절능을 증대시킬 수 있으며, 또한 피부의 멜라토닌 발현이 증가됨으로써 자외선으로 인한 피부 손상 방지 및 피부 주름이 개선될 뿐 아니라, 세라마이드 생합성이 촉진됨으로써 피부장벽 기능이 개선될 수 있다.

상기 별고사리 추출물은 상기 피부외용제 조성물의 총량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로 포함될 수 있고, 예를 들면, 0.001 중량% 내지 5 중량%, 0.01 중량% 내지 5 중량%, 0.1 중량% 내지 1 중량%로 포함될 수 있다. 별고사리 추출물이 상기 함량 범위 내로 포함되는 경우 제형의 안정성이 향상되고 화장료 등으로 제조시 향이 우수할 뿐만 아니라, 피부 항상성 조절능, 자외선으로 인한 피부 손상 방지 및 피부 주름 개선 효과, 그리고 피부장벽 기능 개선 효과가 우수하여, 화장료 조성물, 두피 개선용 모발 조성물 및 약학 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

일 구현예에 따른 별고사리 추출물은 세라마이드 생합성을 촉진할 수 있다. 또한, 세라마이드 생성과 관련된 효소를 활성화시킬 수 있으며, 예를 들면, 세린 팔미토일 전이효소(serine palmitoyl transferase, SPT), 세라마이드 합성효소(ceramide synthase, CerS) 또는 이들의 조합을 포함하는 효소를 활성화시킬 수 있다.

상기 별고사리 추출물은 피부의 시계유전자, 예를 들면, Period 유전자, Bmal 유전자 또는 이들의 조합을 포함하는 피부의 시계유전자 발현을 조절함으로써 피부의 활동일주기(circadian rhythm)를 정상화시킬 수 있다. 구체적으로, 사람 각질형성세포를 UVB(ultraviolet B)로 조사한 경우 Bmal 유전자의 발현은 감소되고 Period 유전자의 발현은 증가하는데, 일 구현예에 따른 별고사리 추출물을 상기 UVB 조사된 각질형성세포에 처리한 경우 상기 UVB 조사에 의해 감소된 Bmal 유전자의 발현을 증가시키고 상기 UVB 조사에 의해 증가된 Period 유전자의 발현을 감소시킴으로써, 흐트러진 생체시계 유전자를 조절할 수 있다.

또한, 상기 별고사리 추출물은 피부의 멜라토닌 발현을 증가, 즉, 피부의 멜라토닌 분비를 촉진시킬 수 있다.

또한, 상기 별고사리 추출물은 기질 금속단백질 분해효소-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 활성을 억제할 수 있어, 피부의 탄력 저하 및 주름 형성을 예방할 수 있다.

이에 따라, 일 구현예에 따른 피부외용제 조성물은 피부 항상성 유지용으로, 피부장벽 개선용으로, 자외선으로 인한 피부 손상 방지 및 주름 개선용으로, 또는 이들의 조합으로 사용될 수 있다.

일 구현예에 따른 피부외용제 조성물은 상기 별고사리 추출물 외에 용도에 따라 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 보습제, 증점제, 계면활성제, 유상기제, 방부제, 산화방지제, 알코올, 향료, pH 조절제, 천연추출물 등을 단독으로 또는 2종 이상 사용할 수 있다.

일 구현예에 따른 피부외용제 조성물은 화장료 조성물, 두피 개선용 모발 조성물, 약학 조성물, 또는 이들의 조합일 수 있다.

상기 화장료 조성물의 제형은 특별히 제한되지 않으며, 목적하는 바에 따라 적절히 선택할 수 있다. 예를 들어, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 마사지 크림, 에센스, 영양 크림, 팩, 파우더, 납상크림 등의 제형으로 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 두피 개선용 모발 조성물은 샴푸, 린스, 트리트먼트, 헤어팩 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 약학 조성물은 로션, 연고, 겔, 크림, 패치, 분무제 등과 같은 경피 투여형 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 약학 조성물은 상처치유 및 피부재생, 피부장벽 개선용으로 사용될 수 있으며, 예를 들면, 아토피성 피부염, 살갗의 거칠어짐 등으로 인한 피부염, 땀띠, 진무름, 동상, 기저귀로 인한 피부병, 접촉성 피부염, 지루성 피부염, 여드름, 비달 태선, 화폐상 습진, 주부 습진, 일광 피부염, 충자증, 피부 소진증, 양진, 약진, 중독진, 건선, 유건선, 손바닥 농포증, 편평 태선, 광택 태선, 모공성 홍생 비당증, 지베르트 장미색 비당증, 홍반증, 홍피증, 원판상 홍반성낭창, 전신성 홍반상 낭창, 천포창, 유천포창, 두링 포진상 피부염, 원형 탈모증, 심상성 백반, 사르코이드시스, 피부아밀로라이드시스, 켈로이드, 비후성 반혼, 창상, 욕창, 피부 궤양, 탈모, 양모, 육모 등의 질환에 사용될 수 있다.

일 구현예에 따른 피부외용제 조성물은 제형, 사용 목적 등에 따라 추가 성분들을 당업자가 어려움 없이 선정하여 추가로 배합할 수 있으며, 이 경우 추가 성분과 동시에 적용할 경우 상승효과가 일어날 수 있다.

일 구현예에 따른 피부외용제 조성물은 다양한 제형으로 제형화가 가능하다.

이하에서는 본 발명의 구체적인 실시예들을 제시한다. 　다만, 하기에 기재된 실시예들은 본 발명을 구체적으로 예시하거나 설명하기 위한 것에 불과하며, 이로서 본 발명이 제한되어서는 아니된다. 또한, 여기에 기재되지 않은 내용은 이 기술 분야에서 숙련된 자이면 충분히 기술적으로 유추할 수 있는 것이므로 그 설명을 생략한다.

제조예 1: 별고사리 추출물의 제조

별고사리를 분쇄하여 분말화한 후, 80% 에탄올을 별고사리 양의 2배 정도의 부피만큼 가하여 3일간 냉침시킨 다음, 용액을 모두 모아 여과지로 여과한 후, 증발기를 이용하여 용매를 제거한 다음, 동결 건조기에서 건조하여 48시간 이상 건조시켜 분말 상태로 만들었다.

실험예 1: 세라마이드 생성량 증가 확인

별고사리 추출물에 의한 세라마이드 생성량 증가를 측정하기 위하여, 사람 각질형성세포(human keratinocyte)를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% P/S를 포함한 DMEM(Dulbecco Modified Eagle Medium) 배지로 배양하여 2.5×10⁵ 세포/웰(cells/well)의 농도로 6웰 플레이트에 접종한 후, 24시간 후에 제조예 1에 따른 별고사리 추출물을 각 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL 및 50 μg/mL의 농도가 되도록 하여 사람 각질형성세포에 적용하였다. 48시간 배양 후 배지에 용출된 세라마이드 양을 Ceramide ELISA assay kit (Mybiosource, USA)를 이용하여 측정하였다. 음성대조군으로는 별고사리 추출물을 처리하지 않은 군을 사용하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1은 일 구현예에 따른 별고사리 추출물을 각질형성세포에 처리한 경우 세라마이드 생합성 증가 정도를 나타낸 그래프이다. 도 1을 참고하면, 일 구현예에 따른 별고사리 추출물에 의해 세라마이드 생성량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 세라마이드 생성 과정과 관련된 효소 발현 평가

별고사리 추출물에 의한 세라마이드 생성 관련 효소 발현 평가를 위하여, 먼저 사람 각질형성세포(Human keratinocyte)를 10% FBS, 1% P/S를 포함한 DMEM 배지로 배양하여 2.5×10⁵ 세포/웰(cells/well)의 농도로 6웰 플레이트에 접종한 후, 24시간 후에 제조예 1에 따른 별고사리 추출물을 각 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL 및 50 μg/mL의 농도가 되도록 하여 사람 각질형성세포에 적용하였다.

유전자 발현량을 측정하기 위하여 easy-spin™ Total RNA extraction kit(iNtRoN, Korea)를 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Maxime RT PreMix(iNtRON, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였으며, ABI 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용한 Real-time PCR을 수행하여 세린 팔미토일 전이효소(serine palmitoyl transferase, SPT), 세라마이드 합성효소(ceramide synthase, CerS)의 유전자 발현량을 확인하였다. 이때, 음성대조군으로는 별고사리 추출물을 처리하지 않은 군을 사용하고, 내부대조군으로는 GAPDH의 mRNA를 사용하였다.

유전자 발현량은 대조군의 값(control-treated = 1)에 대비한 비율로 나타내었으며, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

(control-treated = 1)	SPT1	SPT2	CerS3
별고사리 추출물 5 μg/mL	1.0	1.1	1.2
별고사리 추출물 10 μg/mL	1.1	1.6	1.3
별고사리 추출물 20 μg/mL	1.2	1.8	1.5
별고사리 추출물 50 μg/mL	1.2	2.2	1.8

상기 표 1을 통하여, 일 구현예에 따른 별고사리 추출물의 처리에 의해 세라마이드 생성과 관련된 효소 SPT 및 CerS의 유전자 발현이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 시계유전자 Period 및 Bmal 발현 조절 평가

별고사리 추출물에 의한 피부 생체시계 유전자 조절 효과를 측정하기 위해, 사람 각질형성세포(HaCaT cell)를 10% FBS, 1% P/S를 포함한 DMEM 배지로 배양하여 2.5×10⁵ 세포/웰(cells/well)의 농도로 6웰 플레이트에 접종한 후, 24시간 후에 자외선 조사기(Bio-Link Crosslinker, Vilber Lourmat, france)를 이용하여 312nm 파장의 UVB(25 mJ/㎠)를 세포에 조사(irradiation)함으로써 생체시계 유전자 교란을 유도하였다. UVB 조사한 사람 각질형성세포에 제조예 1에 따른 별고사리 추출물을 각 5 μg/mL, 10 μg/mL, 20 μg/mL 및 50 μg/mL의 농도가 되도록 하여 적용하였다.

유전자 발현량을 측정하기 위하여 easy-spin™ Total RNA extraction kit (iNtRoN, Korea)를 사용하여 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 추출한 RNA는 Maxime RT PreMix(iNtRON, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하였으며, ABI 7500 Fast Real-Time PCR system (Applied Biosystems, USA)를 이용한 Real-time PCR을 수행하여 시계유전자 Period 3 및 Bmal 1 유전자 발현량을 도 2 및 하기 표 2를 통해 확인하였다.

도 2는 사람 각질형성세포를 UVB(ultraviolet B)로 조사한 경우 Bmal 1 유전자 및 Period 3 유전자의 발현 변화 정도를 나타낸 그래프이다. 도 2를 참고하면, 사람 각질형성세포를 UVB로 조사했을 때 대조군(control), 즉, UVB 조사하지 않은 군에 비해 Bmal 1 유전자는 감소되고, Period 3 유전자는 발현이 증가한 것을 볼 수 있다.

반면, UVB 단독 처리군 대비 별고사리 추출물을 처리한 군에서의 생체시계 유전자 Bmal 1 및 Period 3 의 발현율은 하기 표 2에서와 같다. 유전자 발현율은 UVB 단독 처리군의 값(control-treated = 1)에 대비한 비율로 나타내었다.

	Baml 1 유전자 발현율(UVB-treated = 1)	Period 3 유전자 발현율(UVB-treated = 1)
UVB 단독 처리군	1	1
별고사리 추출물 5 μg/mL	1.25	0.6
별고사리 추출물 10 μg/mL	1.36	0.55
별고사리 추출물 20 μg/mL	1.58	0.42
별고사리 추출물 50 μg/mL	2.48	0.38

상기 표 2를 통하여, 일 구현예에 따른 별고사리 추출물은 UVB 조사로 인해 감소된 Bmal 1 유전자의 발현을 증가시키고, UVB 조사로 인해 증가된 Period 3 유전자의 발현을 감소시킴으로써, 흐트러진 생체시계 유전자를 조절시킴을 알 수 있다.

실험예 4: 피부각질세포를 이용한 멜라토닌 발현 조절 평가

별고사리 추출물에 의한 멜라토닌 발현 조절 효과를 측정하기 위해서, 사람 각질형성세포(HaCaT cell)를 10% FBS, 1% P/S를 포함한 DMEM 배지로 배양하여 2.5×10⁵ 세포/웰(cells/well)의 농도로 6웰 플레이트에 접종한 후, 24시간 후에 자외선 조사기(Bio-Link Crosslinker, Vilber Lourmat, france)를 이용하여 312nm 파장의 UVB(25 mJ/㎠)를 세포에 조사(irradiation)하였다. 이후 제조예 1에 따른 별고사리 추출물을 각 2.5 μg/mL, 5 μg/mL, 10 μg/Ml 및 20 μg/mL의 농도가 되도록 하여 사람 각질형성세포에 적용하였다. 24시간 배양 후 배지에 용출된 멜라토닌 양을 Melatonin ELISA assay kit(AVIVA, San Diego, USA)를 이용하여 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3은 일 구현예에 따른 별고사리 추출물을 UVB 조사된 각질형성세포에 처리한 경우 멜라토닌 생성 증가 정도를 나타낸 그래프이다. 도 3에서, 멜라토닌 생성량은 UVB 조사하지 않은 대조군의 값(=1)에 대비한 비율로 나타내었다.

도 3을 참고하면, UVB 조사하지 않은 대조군 대비 각질형성세포에 UVB를 조사한 경우 멜라토닌 양이 감소함을 볼 수 있고, 각질형성세포에 UVB 조사 처리만 한 경우 대비 일 구현예에 따른 별고사리 추출물을 UVB 조사된 각질형성세포에 처리한 경우 멜라토닌 양이 증가함을 볼 수 있다. 다시 말해, 각질형성세포에서 UVB 조사에 의해 멜라토닌 양이 감소한 반면, 일 구현예에 따른 별고사리 추출물에 의해 멜라토닌 생성량이 증가한 것을 확인할 수 있었다.

실험예 5: 기질 금속단백질 분해 효소-1(MMP-1) 활성 억제 평가

기질 금속단백질 분해효소-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 활성 억제 평가는 assay kit(Enzo, USA)를 이용하여 수행하였다. 96-웰 플레이트(well plate)의 각 웰에 기질 금속단백질 분해효소-1(MMP-1) 20 ㎕, 제조예 1에 따른 별고사리 추출물 시료 20 ㎕ 및 완충용액 50 ㎕를 넣은 후에 37℃에서 30분 내지 60분 동안 반응시켰다. 마지막 단계로 기질(substrate)로서 1 mM 티오펩타이드(thiopeptide)를 넣은 후 ELISA reader를 이용하여 37℃ 조건, 475 nm에서 15분 동안 1분 간격으로 흡광도를 측정하였다. 이때, 상기 별고사리 추출물 시료를 넣지 않은 경우를 대조군으로 하였다.

MMP-1 활성 억제율은 하기 수학식 1에 따라 산출했으며, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[수학식 1]

MMP-1 활성 억제율(%) = (1 - A/B) X 100

(상기 수학식 1에서,

A는 별고사리 추출물 시료의 시간에 따른 흡광도 변화 기울기이고,

B는 대조군의 시간에 따른 흡광도 변화 기울기이다.)

	MMP-1 활성 억제율(%)
별고사리 추출물 5 μg/mL	44
별고사리 추출물 10 μg/mL	52
별고사리 추출물 20 μg/mL	76
PBS(Phosphate-buffered saline)	0

상기 표 3을 통하여, 일 구현예에 따른 별고사리 추출물의 기질 금속단백질 분해효소-1(MMP-1)의 활성 억제 효과가 우수하다는 사실을 확인할 수 있었고, 이를 바탕으로 일 구현예에 따른 피부외용제 조성물은 MMP-1의 발현을 효과적으로 억제함으로써 피부의 탄력 저하 및 주름 형성을 예방할 수 있음을 기대할 수 있다.

실험예 6: 피부에 대한 안전성 평가

피부에 대한 자극 정도를 평가하기 위하여, 피부첩포시험(Human patch test)을 시행하였다. 피부첩포시험은 20세 이상의 정상인 30명을 대상으로 실시하였으며, 제조예 1에 따른 별고사리 추출물 시료를 0.1 중량%, 1 중량% 및 10 중량%의 수용액으로 만든 다음 핀 챔버(Finn chamber)를 이용하여 48시간 동안 상박 안쪽 부위에 부착한 뒤 제거한 후에 첫 판독을 하고, 72시간이 경과한 후에 2차 판독을 시행하여 피부 반응 결과를 판정하였다. 평가기준과 자극지수의 계산은 하기 표 4 및 수학식 2와 같으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.

반응	가중치	평가기준
-	0.0	무반응
±	0.5	의심되는 양성 반응
+	1.0	약양성반응
++	2.0	강양성반응
+++	3.0	극양성반응

[수학식 2]

피부자극지수 = Σ(가중치 X 반응인 수)/(최고 가중치 X 총 피험자 수) X 100

	피부자극지수	자극정도
별고사리 추출물 0.1 중량%	0.0	무자극
별고사리 추출물 1 중량%	0.0	무자극
별고사리 추출물 10 중량%	0.4	무자극

상기 표 5를 참고하면, 일 구현예에 따른 별고사리 추출물은 10 중량% 이하에서는 피부에 대하여 무자극인 것으로 나타났으며, 피부외용제의 원료로 사용시 피부에 자극이 없을 것으로 판단되었다.

실험예 7: 피부장벽 개선 평가

일 구현예에 따른 피부외용제 조성물의 피부장벽 개선 효과를 확인하기 위하여, 하기 표 6과 같이 실시예 1 및 비교예 1의 피부외용제 조성물, 구체적으로 크림 조성물을 제조하였다.

성분명	함량 (중량%)
	실시예 1	비교예 1
별고사리 추출물	1.0	-
글리세린	5.0	5.0
스테아릭애씨드	8.0	8.0
스쿠알란	5.0	5.0
자기유화형 모노스테아린산 글리세린	2.5	2.5
모노스테아린산 폴리옥시에틸렌 솔비탄	1.5	1.5
프로필렌글라이콜	4.0	4.0
스테아릴글리시레티네이트	0.2	0.2
페트롤라툼	2.0	2.0
산화방지제	0.5	0.5
향료	0.1	0.1
방부제	0.5	0.5
정제수	잔량	잔량

피부장벽 개선은 상기 실시예 1 및 비교예 1의 피부외용제 조성물을 피부에 도포하여 사용한 후 경피수분손실량(transepidermal water loss, TEWL) 측정을 통해 평가하였다.

구체적으로, 연령 25세 내지 45세의 성인 10명을 대상으로 피험자의 전완 내측부에 1.5㎝ × 1.5cm의 영역을 두 군데 설정하고, 이것을 시험 부위로 실시예 1과 비교예 1의 피부외용제 조성물을 사용하여 시험하였다.

먼저, 경피수분손실량 측정 장치(Vapometer, Delfin Technologies, Finland)를 사용하여 시험 부위의 경피수분손실량을 측정한 후, 테이프 스트리핑(tape stripping)을 통해 시험 부위의 각질층을 제거하여 피부장벽을 인위적으로 손상시켰다. 피부장벽 손상 후, 시험 부위에 실시예 1과 비교예 1의 피부외용제 조성물을 1일 2회 도포하도록 하고, 1일, 3일 및 5일 경과시의 경피수분손실량을 측정하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4는 실시예 1 및 비교예 1에 따른 피부외용제 조성물을 도포한 경우의 경피수분손실량 변화 정도를 나타낸 그래프이다.

도 4를 참고하면, 일 구현예에 따라 별고사리 추출물을 포함하는 실시예 1의 피부외용제 조성물을 도포한 경우 비교예 1 대비 경피수분손실량 값이 감소되어 피부장벽 개선 효과가 우수함을 알 수 있었다.

이하, 상기한 실험예의 결과를 근거로 하여, 별고사리 추출물을 이용한 여러 제형예를 조성하여 제시한다. 그러나, 이들 제형예는 일 구현예를 설명하기 위한 것으로, 일 구현에의 제형이 이들 제형예에만 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명한 것이다.

제형예 1: 유연 화장수(skin toner)

성분명	함량 (중량%)
별고사리 추출물	0.5
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글라이콜	3.0
에탄올	5.0
폴리옥시에틸렌노닐페닐에테르	0.5
향료	0.1
방부제	0.5
정제수	잔량

제형예 2: 수렴 화장수(astringent)

성분명	함량 (중량%)
별고사리 추출물	0.5
글리세린	3.0
시트릭애씨드	0.1
에탄올	10.0
폴리옥시에틸렌올레일에테르	1.0
솔비톨	2.0
향료	0.1
방부제	0.5
정제수	잔량

제형예 3: 로션(emulsion)

성분명	함량 (중량%)
별고사리 추출물	0.5
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글라이콜	8.0
스쿠알란	10.0
모노올레인산폴리옥시에틸렌솔비탄	2.0
트리에탄올아민	1.5
글리세릴스테아레이트	0.5
스테아릴글리시레티네이트	0.2
카르복시비닐폴리머	0.1
알지닌	0.1
향료	0.1
방부제	0.5
정제수	잔량

제형예 4: 크림(cream)

성분명	함량 (중량%)
별고사리 추출물	0.5
글리세린	5.0
스테아릭애씨드	8.0
스쿠알란	5.0
자기유화형 모노스테아린산 글리세린	2.5
모노스테아린산 폴리옥시에틸렌 솔비탄	1.5
프로필렌글라이콜	4.0
스테아릴글리시레티네이트	0.2
페트롤라툼	2.0
산화방지제	0.5
향료	0.1
방부제	0.5
정제수	잔량

제형예 5: 연고(ointment)

성분명	함량 (중량%)
별고사리 추출물	1.0
세테아릴알코올	2.0
자기유화형 모노스테아린산	2.0
스테아릭애씨드	1.0
비즈왁스	4.0
스쿠알란	7.0
모노스테아린 글리세린	3.0
모노스테아린산 솔비탄	1.0
폴리솔베이트80	3.0
글리세린	5.0
프로필렌글라이콜	4.0
향료	0.1
페트롤라툼	잔량

상기 표 7 내지 11과 같이, 일 구현예에 따라 별고사리 추출물을 이용하여 여러 제형을 조성한 피부외용제 조성물은 피부 항상성 유지, 자외선으로 인한 피부 손상 방지 및 주름 개선, 피부 장벽 개선에 우수한 효과를 나타낼 수 있다.

이상을 통해 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 특허청구범위와 발명의 상세한 설명 및 첨부한 도면의 범위 안에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고 이 또한 본 발명의 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims (10)

1. 별고사리(Cyclosorus acuminatus) 추출물을 유효성분으로 포함하고,
   상기 별고사리 추출물의 농도는 0.5 μg/mL 내지 200 μg/mL인 것인 피부외용제 조성물.
2. 삭제
3. 제1항에서,
   상기 별고사리 추출물은 상기 피부외용제 조성물의 총량에 대하여 0.0001 중량% 내지 10 중량%로 포함되는 것인 피부외용제 조성물.
4. 제1항에서,
   상기 별고사리 추출물은 세라마이드 생합성을 촉진하는 것인 피부외용제 조성물.
5. 제1항에서,
   상기 별고사리 추출물은 세린 팔미토일 전이효소(serine palmitoyl transferase, SPT), 세라마이드 합성효소(ceramide synthase, CerS) 또는 이들의 조합을 포함하는 효소를 활성화하는 것인 피부외용제 조성물.
6. 제1항에서,
   상기 별고사리 추출물은 Period 유전자, Bmal 유전자 또는 이들의 조합을 포함하는 피부의 시계유전자 발현을 조절함으로써 피부의 활동일주기(circadian rhythm)를 정상화하는 것인 피부외용제 조성물.
7. 제1항에서,
   상기 별고사리 추출물은 피부의 멜라토닌 발현을 증가시키는 것인 피부외용제 조성물.
8. 제1항에서,
   상기 별고사리 추출물은 기질 금속단백질 분해효소-1(matrix metalloproteinase-1, MMP-1) 활성을 억제하는 것인 피부외용제 조성물.
9. 제1항에서,
   상기 피부외용제 조성물은 피부 항상성 유지용, 피부장벽 개선용, 자외선으로 인한 피부 손상 방지 및 주름 개선용, 또는 이들의 조합인 것인 피부외용제 조성물.
10. 제1항 및 제3항 내지 제9항 중 어느 한 항에서,
    상기 피부외용제 조성물은 화장료 조성물, 두피 및 모발 개선용 조성물, 또는 상처치유 및 피부재생용 또는 피부장벽 개선용 약학 조성물인 것인 피부외용제 조성물.

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