JPS5919121B2 - シンキノヤクリカツセイタトウブンカイブツノ セイゾウホウホウ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 近年、担子菌、子のう菌、不完全菌等の高等菌由来の多
糖の薬理活性に関する研究が盛んに行なわれており、抗
腫瘍作用、抗細菌感染症作用、免疫系に及ほす作用等が
次第に明らかになりつつあり、臨床的に用いられている
ものもある〔小松信彦、化学療法１月号第２〜５頁（１
９６９年）■渡辺貞、ミノフアーゲン メディカル レ
ビュー第１１巻第１２９〜１３５頁；１７３〜１８２頁
（１９６６年）■西川嘉広、フアルマシア第５巻第５４
３〜５４９頁（１９６９年）他〕。

中でも、シゾフイラン並にこれと類似の構造を有するβ
−１、３−およびβ−１、６−グルカン類は他の多糖と
比較して、この種の薬理活性が著るしく高い事、自然界
に分布が広く、種々の原料から抽出して得られるほか、
担子菌をはじめとする高等菌の液内培養によつても培養
液中に生成するので純度の高いものが比較的容易にかつ
随時大量に調製され得る事、水溶性のものが多いため人
や動物への投与が容易である事、また構造と活性の関係
がすでに明らかになつている事等の理由からもつとも有
用なものの一つである〔菊本昭一他、日本農芸化学会誌
第４４巻第３３７〜３４２頁（１９７０年）；同第４５
巻第１６２〜１６８頁（１９７１年）：小松信彦他ガン
（ＧＡＮＮ）第６０巻第１３７〜１４４頁（１９６９年
）■小松信彦、日本細菌学雑誌第２４巻第４４６〜４４
７頁（１９６９年）■小松信彦他、ジャパニーズジャー
ナル オブ アンチビオテイクス（ＪａｐａｎｅｓｅＪ
ｏｕｒｎａｌｏｆＡｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ）第２６巻第
２７７〜２８３頁（１９７３年）他〕。

しかしながらこの種の多糖の唯一の欠点はその水溶液の
粘度が著るしく高く、このため製剤化するに際して精製
および沢過が困難である事の他、人ならびに動物に対し
て投薬する場合にも種々な問題を生ずる。すなわちその
高粘性ゆえに高濃度の薬液の調製がむつかしく、そのた
めに低濃度の薬液を多量に投与しなくてはならないため
、投与経路が著しく制限される。また皮下、筋肉注射で
は局部の疼痛および硬結の原因となる事があり、静脈注
射では時として血管の閉塞など循環器系に障碍を及ほし
、甚しい場合には動物を死に至らしめる。本発明はこの
種の多糖の製剤上及び臨床上の欠点を解決すべく研究を
重ねた結果生まれたもので、多糖溶液を超音波処理する
事により、多糖固有の高粘性を低下せしめる薬剤工程を
著しく容易にすると共に、高濃度でしかも安全性の高い
新規の薬理活性多糖分解物からなる薬液の製造が可能と
なつた。

一般に多糖溶液を低粘度化する場合にはアルカリを用い
たり、溶剤を選択したり、また誘導体にする方法もある
が、分子量を小さくする事が最も容易でかつ有効な方法
である。

すなわち酸等による化学的な加水分解法、酵素による加
水分解法、物理的な処理による分解法が行なわれる。特
に酸、酵素等による化学的分解法では必要以上に低分子
化を生じ薬理活性の弱い或いは全く無いフラクシヨンを
生ずる。中でも物理的方法においては化学反応または酵
素反応と異なり、溶液中に化学物質または酵素を添加す
る必要が無いため処理後にこれ等異物質を取り除く操作
が不用であり、又望ましくない副反応が起る可能性も極
めて少ない。

物理的処理法としては加熱、磨砕或いは紫外線、放射線
、超音波等の照射が考えられるが本発明では加熱、磨砕
を補助手段とした超音波処理により目的を達する事が出
来た。高分子物質を超音波処理する事により低分子化し
ようとする試みはすでに古くから行なわれているが、多
糖についてはスティン一（Ｍ．Ｓｔａｃｅｙ）らによつ
てデキストランの低分子化についての広範な検討が行な
われている他、多くの研究者によつて澱粉、寒天、アル
ギン酸ナトリウム、コントローチッ硫酸、メチルセルロ
ースなどについての研究が行なわれている〔ロツクウツ
ド（Ａ．Ｒ．ＬＯｃｋｗＯＯｄ）他リサーチ サブリメ
ント（ＲｅｓｅａｒｃｈＳｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）４−１
１第４６〜４８頁（１９５１年）；スティン一（Ｍ．Ｓ
ｔａｃｅｙ）、同上第４８頁（１９５１年）；大塚昭信
他、薬剤学第２６巻第２０６〜２０７および２０７〜２
１０頁（１９６６年）；龍原徹他、薬剤学第３２巻第８
６〜９５頁（１９７２年）他〕。

しかしながら、これらの諸研究は超音波処理による高分
子の粘度及び分子量の変化および超音波の作用機作につ
いて論じているが、高分子の薬理活性および臨床的な毒
性またはその他の副作用との関連について述べておらず
その他の文献にもかような言及は見られない。

本発明はシゾフイランおよび類縁多糖の超音波処理によ
る変化を物理的、化学的に追求すると共に、本物質特有
の薬理活性と副作用の変化とを詳細に比較検射する事に
より、至適な処理条件を見出し、高い活性を維持しつつ
副作用を低減せしめ、高濃度でしかも粘性の低い薬液の
調製と能率的な製剤工程を確立する事とを可能としたも
のである。

以下に本発明を具体的に説明する。本発明で原料として
使用するシゾフイラン並に類縁多糖は第１図に示す基本
構造を有するものであつてβ一１，３結合をなす直鎖状
のグルコース残基数個に対して１個の割合で１分子のグ
ルコースがβ−１，６結合を介して分岐している。又、
類縁多糖にはこの他に第１図に示した基本構造式中のβ
−１，６結合を介して直鎖部分に結合しているグルコー
ス残基にさらにβ−１，３結合により数個のグルコース
又は基本構造に示した繰返し単位が結合した構造の多糖
も含まれる。

この様な構造の多糖は多糖の水溶液にＥｘＯ−β一１，
３−グルカナーゼ、例えばバシデイオミセテスＱＭ−８
０６（ＢａｓｉｄｉＯｍｙｃｅｔｅｓＱＭ一８０６）〔
マンデルおよびリース、カナデイアンジヤーナル オブ
マイクロバイオロジ一（Ｒ．Ｔ．ＲｅｅｓｅａｎｄＭ
．Ｍａｎｄｅｌｓ？Ｃａｎ．Ｊ．ＯｆＭｉｃｒＯｂｌＯ
ｌ．）第５巻第１７３頁（１９５９）〕の生産する酵素
を作用させるとすみやかに加水分解を受けて、分解液中
にグルコースとゲンチオビオースとを生成するので他の
多糖と容易に区別する事が出来る。この種の多糖は一部
の例外を除いて水に可溶であるがその水溶液の粘性は極
めて高く、かつ非二ユートン的な粘度特性を有している
。

すなわち多糖水溶液の極限粘度は時として１５０にも達
する事がある。又第２図に示される多糖溶液の粘度特性
の変化はこの種の多糖の非ニユートン的な性質を表わし
ていてＢ型粘度計のローターの回転数によりその粘度は
大きく変化する。シゾフイラン並に類縁多糖は通常キノ
コの子実体或いは菌核菌の菌核の抽出液又は高等菌類の
液内培養により得られる菌糸体の抽出液並に培養沢液に
対し水溶性の有機溶剤例えばアセトン、メタノール、エ
タノール等を加える事により白色繊維状又は雪片状の沈
澱物として得られる。

この沈澱物を必要に応じて乾燥、粉砕、篩別する。超音
波処理に先立つて、繊維状、粉末状のものは水などの溶
媒に分散させ又はこれを溶液とするが、この際に微粉砕
、加熱、機械的破砕による均質化等の処理は多糖分子の
膨潤、溶解を助けるので有用である。

すなわち溶解に先立つて出来るだけ細かいしかも均一の
粒子とする事は粉体中への水の移行を助け、その分散を
容易にする。またこの種の多糖は耐熱性であるので中性
溶液中では１３０℃での数時間の加熱処理に耐える。ワ
ーニングブレンダ一又は摩擦を利用したホモジナイザー
等を用いる機械的破砕は多糖の均一溶液を得るために有
効な手段である。又超音波処理自体も多糖の均一な分散
および溶解を助ける。こうして得た多糖の分散系又は溶
液に対して超音波照射を行なう。

照射の方法は、通常生化学分野で用いられる細胞破壊お
よびエマルジヨン調製の原理と変りない。反応速度はほ
ぼ発振機の出力に比例するので、溶液の量及び反応時間
を考慮して、十分量の出力を持つ装置を用いるべきであ
る。超音波の発生法は電気的、機械的に行ない、振動子
から発生した超音波を適当な伝達子の使用下に溶液に対
して照射するがこの際に伝達子を直接多糖溶液に浸漬す
るか或いは容器の壁面又は適当な媒質を介して照射を行
なう。溶液中の多糖分子に対する超音波の作用は、液中
のキヤビテーシヨンと界面の激しい攪乱作用によるもの
と云われており、多くの実験結果が報告されているが実
際には固体振動面への多糖分子の衝突による作用が大き
く、従つて多糖分子が能率的かつ平均的に振動面と接触
するように反応容器の形を選び、又適当な攪拌装置を用
いる事が望ましい。

本発明で使用する超音波の周波数については特に限定す
るものではないが、普通に工業的に用いられている強力
超音波発振機の周波数は１０〜５００ＫＨｚのものが多
く、従つてこの範囲のものを用いる事が望ましい。

周波数は低過ぎると騒音が発生し、高過ぎると装置の設
計上振幅がとりにく＼なるので好適には５〜１００ＫＨ
ｚのものが使用される。しかしながら本反応には大きな
振幅を持つ超音波がより効果的な事から低周波域のもの
、特に細胞破壊用に市販されている超音波発振機を用い
る事が便利である。

超音波照射の効果を大ならしめるためには振幅は大きい
方が望ましいが振幅が大きすぎると超音波発振ホーンの
先端部の金属腐食が激しくなり、却つて照射効果の低減
や金属微粉の混入による爾後の精製工程の手間の増大を
伴うので、振幅は５〜５００ミクロンの範囲が適当であ
る。第３図に超音波照射による多糖の粘度および分子量
の変化を経時的に示した。

多糖分子は急速に加水分解を受け粘性を失うが分子量、
粘度共にある値に達すると、以後その変化は極めて緩慢
となる。本発明による多糖分解物のパーク・ジヨンソン
法（還元末端法）〔Ｊ．Ｔ．Ｐａｒｋ，Ｍ．Ｊ．ＪＯｈ
ｒｌｓＯｎ：Ｊ．ＢｌＯｌ．Ｃｈｅｍ．，ｌ８ｌ，ｌ４
９（１９４９）〕による分子量は原料多糖の種類により
異なるものであつて通常約１０，０００以下が薬理活性
および副作用の点で好適であると考えられるが分子量は
粘度とも関連を有するので従つてこれらの関連において
考慮されるべきである。

超音波処理後の多糖溶液の極限粘度は通常無処理のもの
の約５〜１０分の１になる。

すなわち、約１〜約６ｄ１／９第２図には処理後の多糖
溶液の粘度特性を無処理のものと対？して示した。処理
した多糖溶液は低粘度化されていると共にその粘度特性
も非ニユートン流体からニユートン流体へと変化してい
る。多糖分子の粘度と還元末端法により測定した分子量
との関係は用いた多糖の種類、処理条件、溶液の濃度に
より必ずしも一定ではない〜 また本発明方法における多糖類は一般に非常に高分子の
ものであつて、その正確な分子量は超遠心分離法や光散
乱法によつて測定しなければ求められないが一つの目安
として還元末端法の値を用いることが出来る。

また還元末端法の中でも測定法によつて異つた結果が得
られる。一方極限粘度はかなり正確な特性値として求め
ることが出来、超遠心分離法や光散乱法で求めた正確な
分子量と、それぞれの多糖の種類毎に、密接な相関関係
を持つものと考えられる。

本発明方法によつて処理した後の多糖の生物学的活性は
、当然その分子量によつて微妙に変化することが予想さ
れるので、現実的には処理後の多糖の特性値として極限
粘度で管理することが望ましい。本発明方法における多
糖の極限粘度とは水溶液中での値を意味する。又メチル
化法、過沃素酸々化法等の化学的方法および各種β−１
，３グルカナーゼを用いた酵素法により処理前後の多糖
の化学構造を比較した結果、本発明による処理が分子鎖
の加水分解による切断以外には多糖の一次構造にほとん
ど影響を与えていない事が明らかとなつた。

さらに本処理は単に分子鎖の加水分解に関与するだけで
、水素結合の切断および分子の立体的構造にも影響を与
えていないものと考えられる。

本処理による多糖のこの様な化学的、物理的変化は不可
逆的なものである。かような粘度の低下と粘度特性の変
化とは本多糖の製剤化に際して極めて望ましい変化であ
る。すなわち超音波処理により能率的な溶解が可能とな
り、均一で凝塊の無い透明感のある溶液を調製する事が
出来る。さらに製剤化工程で不可欠である膜沢過工程が
極めて能率的に行なわれる様になつた。膜沢過は特に注
射薬用の薬液の調製については日本薬局法においても実
施が義務付けられているが、処理前の多糖溶液ではその
高粘性のゆえに極めて困難であるか又は場合によつては
ほとんど不可能である。第１表に最も繁用されている膜
ｆ適用沢材であるミリボアーフイルタ一を用いた多糖溶
液の沢過特性を超音波処理の前後で比較した結果を示す
。膜Ｐ過のみならず製剤化工程で必要に応じて行なわれ
るイオン交換樹脂による脱塩、脱色処理、活性炭処理、
プリコート沢過等の一般▲過操作に際しても作業能率は
著しく増加した。

本処理のもう一つの有用性は高濃度の多糖溶液の調製が
可能になつた点にある。

無処理の多糖はその固有の粘性のゆえに高濃度の溶液の
調製が不可能であつて、一般的には０．４％程度の水溶
液とするのが限界であり、薬液を得るために膜ｆ過工程
を必要とする場合には０．０５〜０．１０％が溶解し得
る最高濃度範囲であつた。しかるに本発明による処理を
行なう事により３％程度或は必要によつてはそれ以上の
濃度の薬液を製剤化工程に何ら支障を来す事無く調製す
る事が可能となつた。この様に低粘度でしかも高濃度の
薬液が得られた事から、従来投薬上問題となつていた本
剤の欠点を悉く払拭する事が出来た。すなわち、希薄な
溶液を大量に投与する必要が無くなつたため静脈、筋肉
、局部、皮下、皮内、経口等の投与経路を自由に選択す
る事が可能となり、さらに大量投与が可能となつた事か
ら医薬品としての有用性は大巾に向上した。また投薬時
における種々の問題点、例えば注射薬においては注射筒
への吸込み、排出、薬液中の気泡除去等が容易になり、
又注射部位における疼痛、硬結、薬液の残留等の望まし
くない症状も著しく軽減された。

また経口投与時の飲みにくさも １改善された。一方本
処理が薬理活性に及ほす影響についても検討した。

後文中の試験例１〜６、第４〜５図および第２，３，４
表には超音波処理前後の多糖の抗腫瘍活性、抗細菌感染
症活性ならびに本多糖の活性発現に密接に関係している
と思われる体液性抗体産生機能の賦活、促進作用につい
ての比較例を示したが、超音波処理は多糖の薬理効果に
何ら不利益な影響を与えないのみならず、むしろ効果の
促進に寄与する事が明らかとなつた。副作用軽減の一例
として超音波処理多糖のマウスに対する静脈注射時の半
数致死量（ＬＤ５Ｏ）について検討したが、未処理多糖
の半数致死量の３０Ｔ１１９／Ｋｇに対して７１８η／
Ｋｇの値が得られた。これは静脈注射時の毒性が約１／
２５に減じた事を示しており予期以上の効果であった。
超音波処理後の分解物の薬理活性および副作用について
も検討した。

副作用については超音波の作用が進行するに従つて低減
する傾向にあつたが、薬理活性については過度の処理は
活性の低下を来すことがある。至適処理条件は多糖の種
類、濃度、超音波の発振周波数および出力、処理容器の
形状と大きさ、攪拌の有無等により著しく異なり、場合
に応じた条件の設定を必要とするが、強いて云えば溶液
の粘度が第３図に示した如き急速な低下を示す初期反応
経過後に反応が鈍化するに至るまでの処理時間の５倍以
内に全処理時間を留める事が望ましい。

超音波照射を行なう場合に、周波数および振巾を変えて
も、それぞれ上記の範囲の条件では照射の効率や収得物
の性質にはほとんど著しい差は認められない。照射によ
つて多糖体の変化する速度は液量または多糖体量に対す
る出力と処理時間とによつておよそ決定される。更に詳
しくは必要なフθ 照射量（出力×処理時間）は処理される液量によつて大
部分決定され、多糖体の量（多糖体濃度）によつてもあ
る程度影響を受ける。

同一濃度の液では液量と必要照射量との関係はおよそ比
例関係になるが、同一液量で濃度が増す場合には必要照
射量は漸増傾向を示すが、明確な関係は明らかでない。
すなわち濃度が１０１０以上になると溶解時の多糖体溶
液は「くずゆ」状となり、粘度が高まり全体の均一な攪
拌が行なわれにくくなり、且つ気泡を巻込むと非ニユー
トニアン流体であるために抜気が不可能となり、照射エ
ネルギーがこの気泡に吸収されて照射効率が低下するの
で処理毎に必要照射量が異なり大巾にバラツイタ結果と
なる。また処理すべき多糖体には一般に不溶解性の不純
物が含まれていることが多く、照射エネルギーは、この
不純物にも吸収されるので上記の関係は厳密なものとは
云い難い。超音波処理後の溶液から再び有機溶剤により
多糖を沈澱せしめさらに再溶解して薬液を調製する事も
出来るが、処理された後の多糖は有機溶剤により沈澱し
にくく、また一度沈澱したものは溶解する事が困難であ
る事から、本発明による処理は製剤化の最終工程で行う
のが最も有用である。

次に本発明の実施例について説明する。実施例 １ スエヒロタケの菌糸体培養により培養液から得た多糖シ
ゾフイランの粉末５００〜を採り、５００ｄの熱水に完
全に溶解した後に発振周波数２０ＫＨｚ１振幅３７ミク
ロン、出力１００Ｗの条件で超音波処理した。

処理前の溶液は極限粘度１４、水に対する相対粘度５、
パーク・ジヨンソン法にもとづく還元末端法による分子
量約５０，０００であつたが、超音波処理３０分後には
極限粘度３．５、相対粘度１．５、分子量４，０００に
減じた。この処理によりシゾフイランの一次構造は変化
を受けず、又薬理活性も無処理のものと差が認められな
かつた。実施例 ２ 実施例１におけるものと同じシゾフイラン粉末１０ｇを
水２２に分散せしめ、１２０℃に２０分間加熱した後に
ワーニングブレンダ一を用いて溶解するまで攪拌した。

この溶液を発振周波数２０Ｋ１１ｚ１振幅２０ミクロン
、出力４００Ｗの条件で攪拌しながら室温で超音波を照
射した。約３０分後に粘度が低下したのを確認してから
さらに１０９のシゾフイランを追加し、分散せしめた後
に同様の処理を行ない、これをさらに２回繰返して全量
で４０９のシゾフイランを溶解させた。全量溶解後にさ
らに６０分間照射を続ける事により多糖濃度２０１０１
極限粘度４．８（Ｄｔ／９）、パーク・ジヨンソン法（
還元末端法）による平均分子量約５，０００、水に対す
る相対粘度約１００の溶液を得た。

Ｂ型粘度計による粘度特性はニユートン流体的性質を示
した。処理前のシゾフイラン水溶液の粘度等の物性値は
溶液がゲル化しており、測定不能であつた。食塩を生理
食塩水濃度（０．８％）になる様に添加した後に前沢適
用フイルタ一、０．８μおよび０．４５μのｆ過孔を持
つミリボアーフイルタ一をその順序で重ねた沢過装置を
用いてＦ過し、透明で低粘度の本発明によるシゾフイラ
ン薬液を得た。各種試験の結果本品の薬理活性は無処理
のものと比較して若干高く、副作用は大巾に減じていた
。実施例 ３ 粗製のシゾフイラン（スエヒロタケの培養沢液から何ら
精製処理を帷すこと無くメタノール沈澱で得たもので少
量の不純物を含み若干着色している）の４０９の実施例
２におけると同様に超音波処理して、かなり濁りのある
溶液２１を得た。

この溶液に脱色用活性炭２０９を添加し、直ちに硅藻土
でプリコートしたブフナ一沢過機を用いて沢過し、不溶
物を沢去すると共に脱色を行なつた。ｆ液をさらにイオ
ン交換樹脂アンバーライトＩＲ−１２０Ｂ（Ｈ型）およ
びＲＡ−４１０（０Ｈ型）（いずれも商標名）のモノベ
ツドを通して脱塩、精製した後にシゾフイラン濃度が１
％になる様に希釈して約２．８１の溶液を得た。２２．
４９の食塩を加え、生理食塩溶液としてから実帷例２の
方法と同様の方法でミリボアープール ５タ一を用いて
沢過し、澄明な薬液を得た。

本法で７時間超音波照射して得た薬液は水に対する相対
粘度３８で、その中のシゾフイランの極限粘度は１．９
〔ｄｌ／９〕、ソモギ一・ネルソン法（還元末端法）に
よる分子量は４，６００、ノ←ク・ ４ジヨンソン法（
還元末端法）による分子量は２，０００〜２，６００で
あつた。

その薬理活性は精製シゾフイラン粉末を用いて調製した
ものと比較して遜色無くまた副作用も認められなかつた
。実施例 ４実施例２の処理に準じて超音波処理したシ
ゾフイラン溶液に対し、ミリボアーフイルタ一により沢
過する事無く、等量のアセトンを加えてシゾフイランを
沈澱せしめ、遠心分離機を用いて脱水の後に乾燥し粉砕
して粉末状の超音波処理シゾフイラン３５９を得た。

本品は水に難溶であつたが加熱、ワーニングブレンダ一
による処理を繰返す事によりほぼ完全に溶解した。溶解
後のシゾフイラン濃度を２％に調整し、食塩を生理食塩
水濃度になる様に添加した後に実施例２におけると同様
にミリボアーフイルタ一によりＰ過して薬液とした。本
品の極限粘度は４．３〔ｄｌ／９〕、パーク・ジヨンソ
ン法（還元末端法）による分子量は約５，０００１水に
対する相対粘度は約１００で、ニユートン流体でありさ
らに化学的性質、物性値、薬理活性、副作用共に沈澱工
程を経ないで調製した薬液と同じであつた。実帷例 ５ シゾフイランと類似の構造を有するスクレ白グルカン（
スクレロチユーム属菌の液内培養により培養沢液中に生
成したものをシゾフイランの処理と同様の処理でアルコ
ール沈澱して得た）４０９を実施例２の処理と同様に処
理した。

処理前の多糖水溶液の極限粘度は約１２０、パーク・ジ
ヨンソン法（還元末端法）による分子量は約１００，０
００であつたが処理後は極限粘度４、分子量７，０００
に減じていて粘度特性もニユートン流体に変化していた
。又薬理活性、副作用についてもシゾフイランとほぼ等
しい薬液を得た。実施例 ６ ナメコおよびエノキタケの子実体の熱水抽出液からアル
コール沈澱により得たシゾフイランと類似の構造と物性
とを有する多糖粉末５００ｍｇをとり、実施例１の処理
に準じて超音波処理を行ない化学的性質、物性、薬理活
性および副作用について、実帷例１での超音波処理で得
られたシゾフイランとほぼ等しい性質を持つ薬液を得た
。

実施例 ７ 腹菌類に属するタマネギモドキ（ＳｃｌｅｒＯｄｅｒｍ
ａｃｅｐａ）、タヌキノチヤブクロ（ＬｙｃＯｐｅｒｄ
Ｏｎｇｅｒｒｌｒｒｌａｔｕｍ）、ノウタケ（Ｃａｌｖ
ａｔｉａｃｒａｎｉ一ＦＯｒｍｉｓ）、およびカニノツ
メ（ＬｉｎｄｅｒａｂｉｃＯｌｕｍｎａｔａ）の子実体
の温水抽出液から得たシゾフイラン類似の構造と物性と
を持つ多糖を実帷例１の方法に準じて処理し、実施例１
の超音波処理シゾフイランとほぼ同じ性質の薬理活性を
有する薬液を得た。

実施例 ８ ベニタケ科に属するドクベニタケ（Ｂｕｓｓｕｌａｅｍ
ｅｔｉｃａ）およびキチヤハツ（ＲｕｓｓｕＩａｓＯｒ
Ｏｒｉａ）の子実体の温水抽出液から得たシゾフイラン
類似の構造を有する水溶性多糖を実帷例１の方法に準じ
て超音波処理して超音波処理シゾフイランとほぼ同様の
性質を持つ薬理活性多糖溶液を得た。

実施例 ９ シイタケ（ＬｅｎｔｉｎｕｓｅｄＯｄｅｓ）、モリノカ
レバタケ（ＣＯｌｌｙｂｉａｄｒｙＯｐｈｉｌａ）、ツ
ヤウチワタケ（ＭｉｃｒＯｐＯｒｕｓａｆｆｉｎｉｓ）
、カヤネダケ（Ｃｒｉｎｉｐｅｌｌｉｓｓｔｉｐｉｔａ
ｔａｒｉａ）、ヒイロタケ（Ｔｒａｍｅｔｅｓｓａｎｇ
ｕｌｎｅａ）およびカイガラタケ（Ｌｅｎｚｉｔｅｓｂ
ｅｔｕｌｌｎａ）の菌糸体をグルコース含有液体培地で
培養する際に培養液中に生成するシゾフイラン類似の多
糖を実施例１の方法に準じて超音波処理し低粘性の薬理
活性多糖を得た。

実帷例 ・１０シゾフイラン粉末５９を水５００ｍ１に
分散せしめ溶解させた。

攪拌しながら室温で発振周波数２０ＫＨｚ１振幅２０ミ
クロン、出力１００Ｗの条件で超音波を照射した。約６
時間後に平均分子量約５，７００、極限粘度５．１およ
び水に対する相対粘度約９０の低粘性の本発明によるシ
ゾフイラン溶液（本明細書においてシゾフイラン薬液と
も称する）を得た。本品の薬理活性は無処理のものと同
等又は同等以上の効果を示した。実柚例 １１ シゾフイラン粉末２０９を水１１に分散せしめ溶解させ
、攪拌しながら室温で発振周波数４０ＫＨｚ１振幅８ミ
クロン、出力５００Ｗの条件で超音波を照射した。

約７時間後に平均分子量約６，０００、極限粘度５．７
および水に対する相対粘度約１１０の本発明による低粘
性シゾフイラン溶液を得た。本品の薬理活性は無処理の
ものと同等又は同等以上の効果を示した。実施例 １２ シゾフイラン粉末４０９を水２１に分散せしめ溶解した
。

この溶液を発振周波数２０ＫＨｚ１振幅３５ミクロン、
出力２ｋＷの条件で攪拌翼を使用し充分に攪拌しながら
室温で超音波を照射した。約２０分後に粘度が低下した
のを確認してから更に、２０９のシゾフイランを追加し
分散せしめた後に同様の処理を行ない、これを更に２回
繰返して全量で１００９のシゾフイランを溶解させた。
超音波照射約１０時間後に平均分子量約６，１００、極
限粘度６．３および水に対する相対粘度約１４０の本発
明によるシゾフイラン溶液を得た。本品の薬理活性は無
処理のものと同等又は同等以上の効果を示した。実施例
１３ シゾフイラン粉末４０９を水１．５１に分散せしめ溶解
させた。

攪拌しながら室温で発振周波数１０ＫＨｚ１振幅４５０
ミクロン、出力１ｋＷの条件で超音波を照射した。約３
時間後に照射を停止したところ、発振ホーンの先端部の
腐食が顕著に観察され、溶液中に金属微粉の混入が認め
られた。この溶液を前沢適用フイールタ一、０．６５μ
および０．４５μの沢過孔を持つミリボアフイルタ一で
順次沢過し、透明で低粘性の本発明によるシゾフイラン
溶液を得た。このシゾフイラン溶液の物性は平均分子量
約４，９００１極限粘度５．８および水に対する相対粘
度約７０であつた。本品の薬理活性は無処理のものより
若干高い効果を示した。試験例 １本例において超音波
処理前後の多糖のマウスに対する制癌効果の比較を行な
つた。

エーリツヒ癌およびザルコーマ１８０を用いて次の方法
で比較した。

体重約２２９の雄マウス１０匹を１群とし、これに、腫
瘍細胞を５００万個の割合で、そけい部に移植し、被検
物すなわちシゾフイラン（対照）および実施例２で製造
されたシゾフイラン分解物（本発明）の各０．５および
２．０η／Ｋ９を腫瘍細胞移植２４時間後より隔日１１
回、腹腔内および筋肉内に投与した。

その間に腫瘍の発育状態を経時的に観察し、２５日目に
腫瘍を摘出して平均増体量・、死亡率、平均腫瘍重量、
腫瘍発育抑制率および腫瘍消失率等を観察した。その結
果第２表に示すとおり、いずれの被検物およびいずれの
投与経路においても０．５〜２．０Ｔｎ９／Ｋｇの投与
量でエーリツヒ固型癌およびザルコーマ１８０固型腫瘍
に対して大部分の群で９０％以上の制癌作用を示し、か
つ腫瘍の完全消失例として２０％〜６０％が認められ、
超音波処理による制癌効果への悪影響は全く認められず
、むしろ効果を増進させている結果が得られた。試験例
２ 本例において細菌感染防御効果の比較を行なつた。

細菌として大腸菌を用い実施例２で超音波処理により製
造されたシゾフイラン分解物と未処理のシゾフイランと
についてマウスの細菌感染症に対する防御効果を比較し
たものである。ただし使用動物：♂ＩＣＲマウス５週今
各群１０匹；感染菌：Ｅ．ｃＯｌｌＧＮ２４ｌｌ（−１
５Ｘ０．３ｍ１／マウスＩｐ）：およびシゾフイラン投
与：５〜／Ｋｇを感染前３回（Ｉｍ）であつた。体重約
２３９（５週＋）の雄マウス１０匹を１群とし、無投与
対照群、シゾフイラン（対照）投与群およびシゾフイラ
ン分解物（本発明）投与群の３群に分け、被検物を菌感
染５日前より５ｍｆ／Ｋ９を隔日３回筋肉内投与し、３
回目の被検物投与の２４時１同後にＥ．ｃＯｌｉの２４
時間培養液を生食液で１５倍希釈しその０．３ｍ１／マ
ウスを腹腔内接種して菌感染を行なわせ、被倹物の効果
をマウスの延命日数（７日間観察）で判定した。

その結果を第４図に示す。

即ち対照群においては２４〜４８時間以内に全例（１０
／１０）死亡したがこれに対し被検物投与群では顕著な
延命効果が認められ、死亡例はシゾフイラン投与群で３
／１０、シゾフイラン分解物投与群では２／１０であり
、この結果から超音波処理による効果の減少は全く認め
られず、むしろ増加している傾向を示した。試験例 ３ 本例において結核菌感染防御効果の比較を示した。

すなわち、ストレプトマイシン、アイナマイシン耐性結
核菌であるＭ．ｔｕｂｅｒｃｕｉＯｓｉｓＳＣＨＡＣＨ
Ｔ株を用いて次の方法で効果を比較した。体重約２３９
（５週今）の雄マウス１０匹を１群とし、菌接種量は１
η／マウスおよび１．５η／マウスの２段階とし尾静脈
より接種した。

被検物を処理前（対照）および処理後（実施例２で製造
されたシゾフイラン分解物）とも２．５ｍｇ／Ｋｇ、５
．０ｍｇ／Ｋｇおよび１０．０〜／Ｋｇの３用量とし、
菌接種２４時間後より隔田こ１０回筋肉内に投与した。
効果を１４０日目までの死亡状況の観察から平均生存日
数を判定した。その結果を第３表に示す。菌感染量１η
／マウスの実験においては対照群の平均生存日数２８．
１１１！こ対し、被検物投与群では処理前群および処理
後群とも２．５Ｗ９／Ｉ＜ｇ投与では６０日前後、５．
０η／Ｋｇ投与では７５日前後および１０．０〜／Ｉ＜
ｇ投与では１００日前後と顕著な延命効果が認められ、
超音波処理による結核菌感染防御効果低下の悪影響は全
く認められなかつた。試験例 ４ 本例において抗体産生能賦活化の比較を行なつた。

三群の被験マウスのそれぞれを無投与対照群、シゾフイ
ラン（対照）投与群およびシゾフイラン分解物（実帷例
１で製造された製品）投与群とし、カニンガム法〔Ａ．
Ｊ．ＣｕｎｎｉｎｇｈａｍａｎｄＡ．Ｓｚｅｎｂｅｒｇ
９（１９６８），ＦｕｒｔｈｅｒＩｍｐｒＯｖｅ一Ｍｅ
ｎｔｓｉｎｔｈｅｐｌａｑｕｅＴｅｃｈｎｉｑｕｅｆＯ
ｒＤｅｆｅｃｔｉｎｇＳｉｎｇｌｅＡｎｔｉｂＯｄｙ−
ＦＯｒｍｉｎｇＣｅｌｌｌｒｒｌｒｎｕｎＯｌＯｇｙ，
ｌ４：５９９〜６００により羊赤血球を上記群のマウス
の腹腔内に投与し、経日的に牌臓を取り出し、牌臓中の
抗体産生細胞数をプラーク数により判足した。第５図に
おいて棒グラフの上に記載してある数字は溶血斑形成細
胞の数であり、これは牌臓細胞中の１／１０６に相当す
る。その誤差を標準誤差で示した。すなわち無投与対照
、シゾフイラン（対照）投与、シゾフイラン分解物（実
帷例１の製品）投与のそれぞれの群について３９５７，
５２９７，５３９４の数値を得た。

第５図においてＳＰＧ＋およびＳＰＧ−はそれぞれシゾ
フイラン投与またはシゾフイラン分解物投与を意味し、
ＳＰＧ＋／ＳＰＧ一比率（ＳＰＧ処理／ＳＰＧ未処理比
率）は無投与対照の場合を１．００として、これにＳＰ
Ｇ処理した群の抗体産生能賦活化を比率をもつて示した
ものである。すなわち５２９７÷３９５７＝１．３４お
よび５３９４÷３９５７＝１．３６となる。この結果シ
ゾフイランおよびシゾフイラン分解物を投与した時の抗
体産生能におよほす効果には有意の差は認められなかつ
た。試験例 ５本例において筋肉内投与時における吸収
の比較を示した。

超音波処理前シゾフイランでは筋肉内または皮下投与に
おいては吸収が悪く局所の膨隆や硬結が認められた。こ
のため臨床の面から上記のような経路での連続投与は不
可能に近かつた。本実験では超音波処理前（対照）およ
び処理後（実施例２の製品）の被検物を次の方法で比較
検討した。体重約３ｋｇの雄ウサギ８匹を用い、被検物
濃度は処理後品（本発明）は１％および２％液を、処理
前品（対照）では０．５％および１．０％液とした。

，なお処理前品は２％濃度では粘度が高く注射筒への吸
入および注射が全く不可能であつた。筋肉内投与方法と
してウサギの背最長筋の胸椎側および腰椎側の２点の両
側（都合４点）に各濃度の被検物を１７０／ずつ筋肉内
投与した。

吸収の程度の判定に当り７２時間後に動物をと殺し局所
筋を剖検・して投与薬剤の残留および投与による局所障
害の有無を精細に観察した。その結果を第４表に示す。

即ち投与７２時間後の剖検所見では処理後品（本発明）
においては１ く％および２％液とも全例完全に吸収さ
れて残留物は全く認められず、かつ局所の出血、壊死等
も認められなかつた。これに反し処理前品（対照）にお
いて０．５％液では中等度に、１％液では強度にＺＵ残
留物が認められ、かつ１％液投与の２例では局所が淡黄
色を呈している変化が認められた。

この結果からシゾフイランを超音波処理することにより
顕著な筋肉内投与における吸収の促進と局所障害の軽減
が証明され、筋肉内または皮下投与による臨床面への有
用性が確認された。試験例 ６ 本例において静脈内投与における急性毒性の比較を示し
た。

実帷例１の超音波処理前品（対照）と処理後品（本発明
製品）とのマウスに対する静脈内投与での致死量（ＬＤ
５Ｏ）は、処理前品では３０η／Ｋｇ、処理後品では７
１８ｍ９／Ｉ＜ｇであつた。

このことは超音波処理することにより急性毒性が１／２
５に軽減されたことを示すものである。試験例 ７ 本例において本発明による多糖分解物の極限粘度及び分
子量範囲とマウス腫瘍発育抑制効果及び投与局所からの
吸収程度との関係を示した。

実施例１で用いたシゾフイラン５９を５００ｍ１の水に
溶解し、攪拌しながら室温で発振周波数１０Ｋ１Ｉｚ１
振幅４０ミクロン、出力１０００Ｗの条件で超音波を照
射した。超音波照射中、適当な時間間隔で約５０ｍ１ず
つの液を取り出し、０．４５ミクロンのメンブランフイ
ルタ一（直径４７ｍｍ）で沢過し、更にイオン交換樹脂
〔｝Ｉ型１Ｒ−１２０Ｂ（商標名）及び０Ｈ型ＲＡ−４
０２（商標名）の混床〕で脱塩処理の後に真空乾燥して
極限粘度及び分子量の異なつた被検物８ロッドを回収し
た。

これらの被検物の分取に際して超音波照射１５分及び２
０分の被検物は０．４５ミクロンフイルタ一での沢過が
困難であり、それぞれ全量沢過するのに１５分超音波照
射の被倹物では沢過圧６ｋｇ４東沢過時間４０分、２０
分超音波照射の被検物では沢過圧４．５ｋｇ／Ｃｄｓ沢
過時間２５分を要した。

超音波照射２５分の被倹物では沢過性が著しく困難とい
うほどではなかつたが沢過圧３．５１＜ｇ／ＣＴｉｌ，
．沢過時間２０分を要した。この他の被検物では沢過圧
１〜２ｋｇ／ｄで約７〜１５分を要して全量を沢過する
ことが出来た。各被検物の極限粘度、パーク・ジヨンソ
ン法による分子量、ザルコーマ１８０に対する腫瘍発育
抑制率および投与７２時間後の投与局所解剖による薬剤
残留状況を第５表に示す。

腫瘍発育抑制率は試験例１に準じて腫瘍細胞５００万個
をマウスそけい部に植え、２４時間後に被検物２．０〜
／Ｋｇを１％生理食塩水溶液状態で筋肉内に投与し、２
５日目に腫瘍を摘出してその重量を測定することによつ
て得られた。局所解剖による薬液の局所残留の判定は試
験例５に準じ、ウサギのを最長筋の胸椎側および腰椎側
の２点の両側，（都合４点）に被検物の１％生理食塩水
溶液１ａずつを筋肉内投与し、７２時間後にウサギをと
殺し局所筋を剖検して薬剤の残留を観察して行なわれた
。超音波照射時間が短く、極限粘度および分子量の比較
的大きな画分は製剤工程での▲過性が悪く且つ投与後の
体内拡散不良による局所疼痛が予想された。

また極度に低分子化された画分では十分な腫瘍発育抑制
効果が認められない。これらの諸点及び上表の結果を考
慮すると本発明による多糖分解物の極限粘度は１〜６ｄ
１／９及び（又は）パーク・ジヨンソン法による分子量
は２０００〜７０００の範囲内にあることが適当である
と結論される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明で使用する原料物質としてのシゾフイラ
ン並に類縁多糖（繰返し単位を有する）を一般的な化学
構造式で示したものである。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ シゾフイラン並にその類縁多糖が有する動物に対す
   る制ガン、細菌感染防御および結核菌感染防御延命に関
   する薬理活性が維持または増加され、しかも低毒性化さ
   れている多糖分解物を該多糖の超音波処理によつて製造
   する方法において、超音波処理条件として周波数を５〜
   １００ＫＨｚ、および振幅を５〜５００ミクロンとし、
   該処理の結果として分解物の極限粘度を１〜６ｄｌ／ｇ
   および（または）パーク・ジヨンソン法（還元末端法）
   による分子量を２０００〜７０００の範囲内に到達させ
   ることを特徴とする前記の方法。