JP2003528619A - 糸状菌由来のβ−グルカン - Google Patents

糸状菌由来のβ−グルカン

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セルブマン、ローラ
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ソシエテ デ プロデユイ ネツスル ソシエテ アノニム
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Abstract

(57)【要約】 β−グルカンの製造方法、β−グルカンを供して、食品の構造、テクスチャー、安定性またはそれらの組合せを供するために、非病原性腐生糸状菌またはそれを組成物の使用、β−グルカンを供して、栄養を与えるために、非病原性腐生糸状菌の使用、および免疫疾患、腫瘍または菌の感染の予防あるいは治療のために、医薬または栄養組成物の製造において、カビまたはそれを含む組成物の使用。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明はβ−グルカンの製造方法、β−グルカンを供し、その結果食品の構造
、テクスチャー、安定性、またはそれらの組合せを供する、非病原性腐生糸状菌
またはそれを含む組成物の使用、β−グルカンを供し、その結果栄養を与えるた
めの、非病原性腐生糸状菌の使用、および免疫疾患、腫瘍または菌感染の予防ま
たは治療用医薬または栄養組成物の製造において、糸状菌またはそれを含む組成
物の使用に関する。
【０００２】 本明細書において、用語「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は「他のものを
含む」意味であり、「それのみからなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｏｆ ｏｎｌｙ）
」の意味に解するものではない。
【０００３】 過去１０年間で、栄養組成物において伝統的な植物由来および動物由来のガム
と代替するために、微生物由来のバイオポリマーに多大の関心が寄せられた。新
規のバイオポリマーは、一層容易に製造できかつ精製できる新規で望ましい特性
のある物質の開発を可能にする。この理由で、生化学的および遺伝的レベルでエ
キソポリサッカライド（ＥＰＳ）の特性が研究された。ＥＰＳの利点は、発酵中
に食品級微生物により分泌されうるということであるが、微生物により産生され
るＥＰＳを使うことはつぎのような問題を生じる。即ち、産生量が非常に低い（
５０−５００ｍｇ／ｌ）ことおよびＥＰＳが一度抽出されると、そのテクスチャ
ー特性を失うことである。
【０００４】 ＥＰＳの一例はβ−グルカンである。β−グルカンは１−３または１−６結合
により連結しているβ−グルコースから構成され、食品工業にとって魅力的なつ
ぎのような特性：粘弾性、乳化性、安定性、耐凍結性および免疫刺激活性を有す
る。
【０００５】 カビ類が高量のバイオポリマー（例えば、β−グルカン）を産生しうることが
分かった。一例はスクレログルカンであり、ある種の糸状菌（例えば、スクレロ
チニア、コルチシウムおよびストロマチーナ種）により産生されるポリサッカラ
イドであり、その物理的特性のために、潤滑剤としておよび搾油における圧力補
正物質として使用されてきた（ワイ・ワングおよびビー・マクネイル、１９９６
、スクレログルカン．クリティカル・レビューズ・イン・バイオテクノロジ１６
：１８５−２１５）。
【０００６】 スクレログルカンは各種程度のβ（１−６）グルコース側鎖基を有するβ（１
−３）結合グルコースバックボーンからなる。これらの側鎖基が存在すると、溶
解性を増大し、かつ３重ヘリックスの形成を抑制し、その結果ゲル形成能を減退
させる。スクレログルカン溶液の粘度はｐＨ（ｐＨ１−１１）、温度（コンスタ
ントに１０−９０℃）および電解質の変化（例えば、５％ＮａＣｌ、５％ＣａＣ
ｌ2）に対して高い耐性を示す。さらに、食品工業におけるボディ剤、懸濁剤、
被覆剤およびゲル化剤用の用途が提案されており、抗腫瘍活性と抗菌活性が報告
された（ダブリュ・エム・クリック、エイ・アイ・レットウおよびエイチ・シー
ルキング、１９９７、各種（１→３）−β−Ｄ−グルカンの免疫活性、モル質量
および分子構造間の関係．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．２９７：１３５−１４３）。
【０００７】 ある種の糸状菌は同定されかつ単離され、食品工業に魅力的な特性を示すカビ
性エキソポリサッカライドを産生することが分かった。問題のＥＰＳの２つの特
徴は（イ）テクスチャー特性が良いこと、および（ロ）インビトロとインビボの
免疫試験における免疫刺激効果の促進能である。カビ性ＥＰＳは健康食品（例え
ば、低カロリー製品または新規の免疫刺激製品のテクスチャー性脂肪代替物とし
てのＥＰＳ）に加えることあるいは例えば食品サプルメントとして単独で供する
こともできる。
【０００８】 これらのカビ類は顕著にβ−グルカンを高収量で産生しうることは驚くべきこ
とである。
【０００９】 したがって、第一の特徴では、本発明は非病原性腐生糸状菌を含むサスペンジ
ョンを発酵させ、ついでβ−グルカンをそのサスペンジョンから抽出することか
らなるβ−グルカンの製造方法を供することである。
【００１０】 第二の特徴では、本発明はβ−グルカンを供し、それにより食品の構造、テク
スチャー、安定性またはそれらの組合せを促進するために、非病原性腐生糸状菌
またはそれを含む組成物の使用に関する。
【００１１】 第三の特徴では、本発明はβ−グルカン源を供し、それにより栄養を供するた
めに、非病原性腐生糸状菌またはそれを含む組成物の使用を供する。
【００１２】 第四の特徴では、免疫疾患、腫瘍または微生物感染の予防と治療のために、非
病原性腐生糸状菌またはそれを含む組成物を医薬や栄養組成物の製造に使うこと
である。
【００１３】 β−グルカンの製造方法の態様は、ペニシリウム・チェルメシナム、ペニシリ
ウム・オクロクロロン、リゾクトニア種、フォーマ種またはそれらの混合菌から
なる群から選択した非病原性腐生糸状菌を発酵させることが望ましい。更に望ま
しくは、これらのカビの少なくとも３つを一緒に発酵させることである。
【００１４】 β−グルカンの製造方法の態様は、少なくとも約５０時間、さらには約８０時
間から約１２０時間、一層望ましくは約９６時間発酵させる工程からなることが
望ましい。発酵をこの時間で行うと、高収率のβ−グルカンが得られるという利
点があることが分かった。
【００１５】 β−グルカンの製造方法の態様は、ＮａＮＯ3、ＫＨ2ＰＯ4、ＭｇＳＯ4、ＫＣ
ｌおよび酵母エキスからなる群から選ばれた成分を含む培地にてサスペンジョン
を発酵させる工程からなるのが望ましい。さらに望ましくは、これらの成分の少
なくとも３つを含むことである。最も望ましいのは、これらの成分を全部含むこ
とである。これらの成分を有する培地は高収量のβ−グルカンを生成する利点が
あることが分かった。
【００１６】 β−グルカンの製造方法の態様は、最少培地でカビを培養する工程からなるこ
とが望ましい。この培地はグルコースと塩のみを含有するのが望ましく、生産収
量のために高度に純粋のポリサッカライドを単離できる利点がある。このことは
、ＥＰＳから分離するのが難しいポリサッカライドを酵母エキスが含むからであ
る。最も望ましくは、培地はＮａＮＯ3（１０ｍＭ）、ＫＨ2ＰＯ4（１．５ｇ／
ｌ）、ＭｇＳＯ4（０．５ｇ／ｌ）、ＫＣｌ（０．５）、Ｃ4Ｈ12Ｎ2Ｏ6（１０ｍ
Ｍ）およびグルコース（６０）からなり、ｐＨ４．７に調整する。
【００１７】 本発明の特徴にかかるカビの使用の態様は、望ましくはペニシリウム・チェル
メシナム、ペニシリウム・オクロクロロン、リゾクトニア種、フォーマ種または
それらの混合菌からなる群から選んだカビを使用することからなる。
【００１８】 本発明の付加的特徴および利点はここに記載され、以下に記述する望ましい態
様の記述から明らかである。
【００１９】 １つの態様において、β−グルカンの製造方法は、（ｇ／ｌ）ＮａＮＯ3（３
）、ＫＨ2ＰＯ4（１）、ＭｇＳＯ4（０．５）、ＫＣｌ（０．５）、酵母エキス
（１．０）、グルコース（３０）を含み、ｐＨ４．７に調整した培地にカビを含
むサスペンジョンを発酵させることからなる。発酵は約１８ｒｐｍで振盪させな
がら約２８℃で約９６時間続ける。別の態様では、初めにポリサッカライドを生
成するように思われない菌株を約１６８時間培養する。 つぎの例は説明するためのものであり、本願の主題を限定するものと見なすべ
きではない。
【００２０】 例 １ カビ由来のβ−グルカンの製造 つぎのカビ分離物を単離し、つぎのように分類した。
【００２１】 例 ２ ポリサッカライドの標準的製造 下記の培地ＴＢ１（ｇ／ｌ）を使用した。ＮａＮＯ3（３）、ＫＨ2ＰＯ4（１
）、ＭｇＳＯ4（０．５）、ＫＣｌ（０．５）、酵母エキス（１．０）、グルコ
ース（３０）をｐＨ４．７に調整。 発酵時間は１８０ｒｐｍで振盪させながら２８℃で９６時間であった。任意の
ポリサッカライドを最初に生産しないような菌株については、培養を１６８時間
延長させた。 ポリサッカライドの生産結果はつぎの通りであった。
【００２２】 例 ３ ポリサッカライドの最適生産 リゾクトニア種 Ｐ８２、フォーマ種 Ｐ９８およびペニシリウム・チェルメ
シナムＰ２８によるポリサッカライドの生産を研究した。結果はつぎの通りであ
る。 Ａ．ＴＢ１に培養した炭素源の効果 Ｉ． リゾクトニア種Ｐ８２によるＥＰＳの生産 ＩＩ． フォーマ種Ｐ９８によるＥＰＳの生産 ＩＩＩ ペニシリウム・チェルメシナムＰ２８*によるＥＰＳの生産 Ｂ．ＴＢ１で培養したグルコース濃度の影響 Ｉ．リゾクトニア種Ｐ８２*によるＥＰＳの生産 ＩＩ．フォーマ種Ｐ９８＊によるＥＰＳの生産 炭素源（それぞれリゾクトニア種Ｐ８２とフォーマ種Ｐ９８に対するグルコース
とソルビトール）の濃度を挙げると、両菌株によるＥＰＳの産生は顕著に増大（
約１００％の増加）し、それぞれ最大３５．２と１３．１ｇ／ｌに達した。 Ｃ．ＴＢ１に培養した窒素源の影響 Ｉ． リゾクトニア種Ｐ８２によるＥＰＳの生産 ＩＩ． フォーマ種Ｐ９８によるＥＰＳの生産 硝酸ナトリウム以外に、他の窒素源例えば尿素、硝酸アンモニウム、リン酸ア
ンモニウムおよび硫酸アンモニウムを使用した。尿素では、リゾクトリア種Ｐ８
２とフォーマ種Ｐ９８によるＥＰＳ生産は硝酸ナトリウムで得られたレベルと同
じであった。
【００２３】 例 ４ ＥＰＳの精製と特性 リゾクトニア種Ｐ８２、フォーマ種Ｐ９８およびペニシリウム・チェルメシナ
ムＰ２８により生産されたＥＰＳを精製した。このポリサッカライドは専ら糖類
からなるから、高純度を示すことになる。薄層クロマト（ＴＬＣ）とガスクロマ
ト（ＧＣ）による分析では、リゾクトニア種Ｐ８２とフォーマ種Ｐ９８由来のＥ
ＰＳはグルコースのみからなることを示した。反対に、Ｐ．チェルメシナムＰ８
２由来のものは微量のグルコースとともにガラクトースからなる。 リゾクトニア種とフォーマ種由来のＥＰＳの分子量（ＭＷ）は１００×１ｃｍ
セファロースＣＬ４Ｂゲル（シグマ）カラムを使い、ゲル浸透クロマトグラフィ
により評価し、約２・１０6Ｄａであった。 リゾクトニア種Ｐ８２とフォーマ種Ｐ９８由来のＥＰＳのグルコース結合の位
置の測定をメチル化、全加水分解、還元およびアセチル化の後、ＧＣｍｓとＧＣ
により行った。主生成物はＧＣｍｓ分析によりグルシトール２，４−ジ−Ｏ−メ
チル−テトラアセチル、グルシトール２，４，６−トリ−Ｏ−メチル−トリアセ
チル化およびグルシトール２，３，４，６−テトラ−Ｏ−メチル−ジアセチル化
のものであると同定し、両方のＥＰＳはβ−１，３およびβ−１，６結合で結合
したモノサッカライドで特徴づけられることを示した。フォーマ種由来のＥＰＳ
の場合には、ＧＣの分析では多くの側鎖をもつグルカンに特有の量比の３つのピ
ークを示した。上記の反応生成物以外に、同種の分析では、リゾクトニア種由来
のＥＰＳは他の反応生成物、例えばペンタ−およびエサ−Ｏ−メチル−アセチル
化化合物を生じ、明らかに不完全なメチル化を示した。 ＮＭＲの分析により、両方のポリサッカライドは純粋で、グルコースのみから
なり、β−１，３およびβ−１，６結合により特徴づけられることを確認した。
【００２４】 例 ５ ＥＰＳの免疫刺激効果 リゾクトニア種Ｐ８２およびフォーマ種Ｐ９８由来のＥＰＳはインビトロとイ
ンビボの実験に供した。Ｓ．グルカニカムＮＲＲＬ３００６から得た純粋スクレ
ログルカンをコントロールとして使用した。精製ＥＰＳはソニケーションにより
各種分子量（１・１０6〜１・１０4Ｄａ）の断片にランダムに分解した。ソニケ
ーションした試料の遊離グルコース濃度は増加しなかったから、側鎖は分解され
ていないことを示した。高ＭＷ（ＨＭＷ、ネイティブなＥＰＳ）、中間ＭＷ（Ｍ
ＭＷ、約５・１０5Ｄａ）および低ＭＷ（ＬＭＷ、約５・１０4Ｄａ）のＥＰＳで
行った。 免疫刺激作用はＴＮＦ−α産生、食菌作用の誘導、リンパ球増殖およびＩＬ−
２産生に対する効果を測定してインビトロで評価した。 すべてのＥＰＳは単核細胞を刺激してＴＮＦ−α因子を産生した。その含量は
ポリサッカライド含量が増すにつれて増大し、中間および低ＭＷを使用したとき
最大であった。 ＥＰＳの食菌作用に及ぼす効果を調べるために、２つの方法（ファゴテストお
よびミクロフルオメトリック試験）を使用した。 反対に、ＥＰＳを単独であるいはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と併用して
添加したとき、リンパ球の増殖とＩＬ−２産生に対して有意な効果は見られなか
った。さらに、細胞毒性作用も見られなかった。 リゾクトニア種Ｐ８２由来のＭＭＷ（約５・１０5Ｄａ）グルカンを使ってＥ
ＰＳの免疫刺激活性を調べるためにインビトロの実験を行った。 雌のマウスを皮下（ＳＣ）におよび／または経口的（ＯＲ）に三度ＭＭＷＥＰ
Ｓ（２ｍｇ／１００ｇ体重）とラクトバチルス・アシドフィルスを１，８および
２８日後に接種した。１３日と３３日後に放血を行った。ＥＬＩＳＡ試験により
抗体産生を比較して、インビボの免疫刺激を行った。 グルカンを接種したにもかかわらず、ＯＲバクテリア（３，４および５群）を
受けたすべてのマウスには抗体含量の増大は見られなかった。しかし、抗体産生
の差異はバクテリアでＳＣ接種マウスに観察された。さらに、ＳＣだけのバクテ
リアを受けたマウスの抗体レベルはグルカンとバクテリアＳＣおよびグルカンＯ
ＲとバクテリアＳＣを受けたものより有意に高かった（Ｐ＜０．０１、チューク
試験による）。 興味のあることは、リゾクトニア種由来のＥＰＳは抗体濃度の減少となったこ
とを結果は示している。リゾクトニア種由来のグルカンは単核細胞（ＴＮＦ−α
産生および食菌作用の誘導に関して上記の効果参照）の抗微生物活性を活性化す
ることはこれから結論することができ、その結果細菌数の減少は順次抗体の産生
の一貫性のある減少となる。 結論的には、３つの糸状菌リゾクトニア種Ｐ８２、フォーマ種Ｐ９８およびペ
ニシリウム・チェルメシナムＰ２８は潜在的興味で細胞外ポリサッカライドの驚
くべき生産能を有する。特に、リゾクトニア種Ｐ８２は短時間の発酵、ＥＰＳ産
生レベルが高いおよびＥＰＳ製造段階でβ−グルカナーゼ活性がない点で興味が
ある。さらに、そのＥＰＳならびにフォーマ種Ｐ９８由来のものはβ−１，３お
よびβ−１，６結合で特徴のあるグルカンである。加えて、リゾクトニア種Ｐ８
２により産生されるグルカンの免疫刺激効果に関する結果は、良好な刺激活性の
可能性を指摘している。 本明細書に記載の望ましい態様に対していろいろ変更、修正を加えることは当
業者に自明のことである。そのような変更は本発明の精神と範囲を離れずかつ利
点を減少せずに行うことができる。したがって、かかる変更は請求の範囲により
カバーされることを意図している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/02 Ａ６１Ｐ 37/02 //(Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:80 Ｃ１２Ｒ 1:80） 1:645 (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:645） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ヴァン デン ブローク、ペテル オランダ国 マールン グロインリングラ ーン 90 (72)発明者 シュティンゲレ、フランセスカ スイス国 ルート ドゥ ルール (72)発明者 セルブマン、ローラ イタリア国 ヴィテルボ ヴィア アイ． ガルバーニ 46 Ｆターム(参考） 4B018 MD33 MD80 ME08 MF13 4B064 AF12 CA05 CC03 CD01 CD09 DA05 DA10 4C086 AA01 EA20 MA01 MA04 NA05 ZB07 ZB26 ZB35

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 非病原性腐生糸状菌を含むサスペンジョンを発酵させ、つい
    でこのサスペンジョンからβ−グルカンを抽出することからなる、β−グルカン
    の製造方法。
  2. 【請求項２】 非病原性腐生糸状菌はペニシリウム・チェルメシナム、ペニ
    シリウム・オクロクロロン、リゾクトニア種、フォーマ種またはそれらの混合菌
    からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
  3. 【請求項３】 非病原性腐生糸状菌ペニシリウム・チェルメシナム、ペニシ
    リウム・オクロクロロン、リゾクトニア種およびフォーマ種を一緒に発酵させる
    、請求項１または２記載の方法。
  4. 【請求項４】 発酵工程は少なくとも５０時間行う、請求項１から３のいず
    れか１項記載の方法。
  5. 【請求項５】 発酵工程はＮａＮＯ3、ＫＨ2ＰＯ4、ＭｇＳＯ4、ＫＣｌおよ
    び酵母エキスからなる群から選んだ成分を含む培地にて行う、請求項１から４の
    いずれか１項記載の方法。
  6. 【請求項６】 発酵工程はグルコースと塩のみを含む最小培地にて糸状菌を
    培養して行う、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
  7. 【請求項７】 発酵工程はＮａＮＯ3（１０ｍＭ）、ＫＨ2ＰＯ4（１．５ｇ
    ／ｌ）、ＭｇＳＯ4（０．５ｇ／ｌ）、ＫＣｌ（０．５）、Ｃ4Ｈ12Ｎ2Ｏ6（１０
    ｍＭ）グルコース（６０）を含むｐＨ４．７に調整した培地にて糸状菌を培養し
    て行う、請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
  8. 【請求項８】 非病原性腐生糸状菌またはそれを含む組成物を、β−グルカ
    ンを供しその結果食品の構造、テクスチャー、安定性またはそれらの組合せを促
    進するために使用すること。
  9. 【請求項９】 β−グルカン源を供し、その結果栄養を与えるために、非病
    原性腐生糸状菌またはそれを含有する組成物の使用。
  10. 【請求項１０】 免疫疾患、腫瘍または菌感染の予防または治療用の医薬ま
    たは栄養組成物の製造において、非病原性腐生糸状菌またはそれを含む組成物の
    使用。
  11. 【請求項１１】 非病原性腐生糸状菌はペニシリウム・チェルメシナム、ペ
    ニシリウム・オクロクロロン、リゾクトニア種、フォーマ種またはそれらの混合
    菌からなる群から選択される、請求項８から１０のいずれか１項記載の使用。
  12. 【請求項１２】 糸状菌はペニシリニウム・チェルメシナム、ペニシリニウ
    ム・オクロクロロン、リゾクトニア種およびフォーマ種の組合せである、請求項
    ８から１１のいずれか１項記載の使用。
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