DE19901270A1

DE19901270A1 - Verfahren zur Flüssigkultivierung von Schizophyllum commune Fr. zur Gewinnung von beta-1,6-verzweigtem-beta-1,3-Glucan und Zusammensetzung der äußerlichen Anwendung, die damit gewonnenes beta-1,6-verzweigtes-beta-1,3-Glucan enthält

Info

Publication number: DE19901270A1
Application number: DE19901270A
Authority: DE
Inventors: Kyung Mok Park; Byung Hwa Park; Sung So; Mu Sung Kim; Jung Su Kim; Young Taek Kim; Sung Gu Lee; Dong Chul Lee
Original assignee: Pacific Corp
Current assignee: Amorepacific Corp
Priority date: 1998-03-24
Filing date: 1999-01-15
Publication date: 1999-10-07
Anticipated expiration: 2019-01-16
Also published as: US6251877B1; FR2776668B1; DE19901270B4; JPH11313667A; US20010029253A1; FR2776668A1

Abstract

Offenbart wird ein Verfahren Flüssigkultivierung von Schizophyllum commune Fr. zur Gewinnung von beta-1,6-verzweigtem-beta-1,3-Glucan und eine Zusammensetzung zur äußerlichen Anwendung, die beta-1,6-verzweigtes-beta-1,3-Glucan als aktiven Bestandteil enthält, und die die Hautalterung verzögern kann, einen Hautaufhellungseffekt bewirken kann und effektiv Hautschäden heilen kann.

Description

Hintergrund der Erfindung 1) Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Flüssigkultivierung von Schizophyllum commune Fr. zur Gewinnung von β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan und eine Zusammensetzung zur äußerlichen Anwendung, die damit gewonnenes β-1,6-verzweigtes-β- 1,3-Glucan enthält.

2) Beschreibung des Standes der Technik

Die Haut hat gegen Einflüsse aus der Umgebung wie Temperatur oder Feuchtigkeit, ultraviolette Strahlung, giftige Substanzen eine Schutzfunktion. Jedoch kann die normale Funktion der Haut durch übermäßige physikalische oder chemische Reizung oder Nährstoffmangel beeinträchtigt sein, was Hautalterung und Hautschäden verursacht. Deshalb wurden im Bereich der Kosmetik physiologisch aktive Materialien, die aus Tieren, Pflanzen oder Mikroorganismen gewonnen werden, als kosmetischer Bestandteil verwendet, um die Haut durch Verhindern dieser Hypergasia schön und gesund zu erhalten.

Zum Beispiel wurde berichtet, daß Pilzextrakte die Fähigkeit zur Feuchtigkeitsspeicherung, zur Verhinderung der Melaninbildung und zur Abschirmung von UV-Strahlung haben und dadurch in einer kosmetischen Zusammensetzung verwendet werden können, um einen Hautaufhellungseffekt oder eine Anti-Oxidationswirkung zu bewirken. Insbesondere wurde ein Extrakt von Schizophyllum commune Fr., der hervorragende Hautaufhellungswirkung und Feuchtigkeitsspeicherungseffekt bewirkt, in JP-5-286-843A offenbart.

Seine wirksame Komponente wurde jedoch noch nicht aufgeklärt. Dies bedeutet, daß weitere Forschungsarbeiten zur Aufklärung, welche Komponente des Extrakts von Schizophyllum commune Fr. effektiv auf die Haut wirken kann, nötig sind. Solche weiteren Forschungsarbeiten können Verfahrensverbesserungen zur effektiven Gewinnung von reinen aktiven Bestandteilen einschließen.

Deshalb haben die hier beteiligten Erfinder umfangreiche Arbeiten durchgeführt, um die aktiven Bestandteile des Extrakts von Schizophyllum commune Fr., die effektiv auf die Haut wirken, aufzuklären. Als ein Ergebnis haben sie gefunden, daß β-1,6-verzweigtes-β-1,3- Glucan, das durch die Flüssigkultivierung von Schizophyllum commune Fr. gewonnen wurde, die Melaninbildung inhibieren kann, die Biosynthese von Hautzellen und Kollagen fördern kann und durch übermäßige Sonneneinwirkung hervorgerufene Verbrennungen heilen kann.

Weiter haben sie gefunden, daß durch Zusatz von Aktivkohle oder Glucose zum Flüssigmedium die Ausbeute an β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan gesteigert werden kann. Ebenso haben sie gefunden, daß durch Zusatz von sowohl Aktivkohle als auch Glucose zum Flüssigmedium die Ausbeute an β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan weiter gesteigert werden kann.

Zusammenfassung der Erfindung

Demgemäß ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Flüssigkultivierung von Schizophyllum commune Fr. zur Gewinnung von β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan zur Verfügung zu stellen.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Zusammensetzung zur äußerlichen Anwendung zur Verfügung zu stellen, die mit dem vorliegenden Verfahren gewonnenes β- 1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan als aktiven Bestandteil enthält, und die die Hautalterung verzögern kann, einen Hautaufhellungseffekt bewirken kann und effektiv Hautschäden heilen kann.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung kann mit einem Verfahren gelöst werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es die folgenden Schritte umfaßt:

(1) Herstellen von Myzelien von Schizophyllum commune Fr.;
(2) Kultivierung der Myzelien in einem Flüssigmedium mit einem pH-Wert von 4.0 bis 8.5, das 1 bis 10 Gew.-% Glucose, 0.1 bis 1 Gew.-% Hefeextrakt, 0.05 bis 0.5 Gew.-% (NH₄)₂HPO₄ oder (NH₄)₂SO₄, 0.05 bis 0.5 Gew.-% KH₂PO₄ und 0.005 bis 0.2 Gew.-% MgSO₄×7 H₂O enthält;
(3) Isolierung von β-1,6-verzweigten-β-1,3-Glucan aus dem flüssigen Medium; und
(4) Reinigung des β-1,6-verzweigten-β-1,3-Glucans.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Kultivierungsverfahren zur Verfügung, das weiterhin einen Schritt der Zugabe von Aktivkohle in das Flüssigmedium während des Schritts (2) umfaßt.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Kultivierungsverfahren zur Verfügung, das weiterhin einen Schritt der Zugabe von Glucose in das Flüssigmedium während des Schritts (2) umfaßt.

Die vorliegende Erfindung stellt ebenso ein Kultivierungsverfahren zur Verfügung, das weiterhin einen Schritt sowohl der Zugabe von Aktivkohle als auch von Glucose in das Flüssigmedium während des Schritts (2) umfaßt.

Weiterhin stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung zur äußerlichen Anwendung zur Verfügung, die dadurch gekennzeichnet ist, daß sie mit dem vorliegenden Verfahren gewonnenes β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan in einer Menge von 0.00001 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zusammensetzung, enthält.

Beschreibung der Zeichnungen

Abb. 1 ist ein Graph, der das Wachstum der Myzelien von Schizophyllum commune Fr. (⬩) und die hergestellte Menge von β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan () in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer zeigt.

Abb. 2 ist ein Infrarot-Absorptionsspektrum von mit dem vorliegenden Verfahren gewonnenen β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan.

Abb. 3 ist ein kernmagnetisches Resonanzspektrum von mit dem vorliegenden Verfahren gewonnenen β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan.

Abb. 4 ist ein Graph, der das Wachstum der Myzelien von Schizophyllum commune Fr. (⬩) und die hergestellte Menge von β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan () in Abhängigkeit von der Kultivierungsdauer, bei dem Verfahren, das einen zweiten Kultivierungsschritt unter Zugabe von sowohl Aktivkohle als auch Glucose in das flüssige Medium, umfaßt, zeigt.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Schizophyllum commune Fr. ist ein holzzersetzender Pilz, der in der Klassifizierung durch R. Singer (The Agaricales in Modern Taxonomy, 1975) zu den Agaricales Tricholomataceae Schizophyllum der Basidiomyceten gehört und in das Extrazelluläre β-1,6-verzweigtes-β-1,3- Glucan absondert. Er kann wild wachsend gesammelt werden und anhand der folgenden morphologischen oder taxonomischen Eigenschaften identifiziert werden:

Sein Fruchtkörper ist 1.0 bis 3.0 Zentimeter groß, er ist ungestielt mit einer muschelartigen Form mit länglichen Lamellen und haarbesetzten Rändern. Die Lamellen sind weiß, werden aber bei Reifung leicht grau oder leicht purpurbraun. Sein Fleisch neigt dazu, runzlig zu werden, lebt aber durch Feuchtigkeitsaufnahme wieder auf. Das Sporenpulver ist weiß. Die Sporen haben zylindrische Form mit einer Größe von 4×1.5 µm bis 6×2 µm und sind glatt und weiß. Schizophyllum commune Fr. steht in Gruppen auf totem Holz oder Hartholzstümpfen. Sein Vorkommen und seine Form sind ausführlicher im "Illustrated Book of Korean Fungus" (Sam Soon KIM et al., YooPong Press, 1990) und in "The Agaricales in Modern Taxonomy" (Singer, R., 1975) beschrieben.

Glucosebindungen vom β-Typ wie β-1,3-Bindungen, β-1,4-Bindungen, β-1,6-Bindungen werden im allgemeinen, ohne spezielle Unterscheidung, als β-Glucan bezeichnet. Die Bindungsart ist aber tatsächlich sehr von ihrer Herkunft abhängig und kann unterschiedliche physikalische oder chemische Eigenschaften und biologische Funktion aufweisen. Das heißt, daß β-Glucan in Abhängigkeit von seiner Herkunft unterschiedliche Zusammensetzung der es aufbauenden Zucker, Verzweigungsgrad, Molekulargewicht oder 3-D-Struktur aufweist. Beispielsweise wird das β-Glucan aus Ganoderma licidum hauptsächlich aus der Zellwand und in untergeordnetem Maße aus dem Extrazellulären isoliert und weist eine Bindung aus Glucose, Mannose und Galactose auf. Das β-Glucan von Coriolus versicolor wird im wesentlichen aus der Zellwand isoliert und weist β-1,3-Bindungen und β-1,4-Bindungen auf. Das β-Glucan von Lentinus edodes wird aus der Zellwand isoliert und ist β-1,6-verzweigtes- β-1,3-Glucan mit zwei β-1,6-Bindungen, die zu jeder fünften β-1,3-Bindung der Hauptkette verzweigt sind. Das β-Glucan von Pleurotus ostrealus wird aus der Zellwand isoliert und weist eine Bindung aus Glucose, Mannose und Galactose auf. Das β-Glucan von Phellinus linteus wird aus der Zellwand isoliert und hat eine Bindung aus 70 bis 90% Glucose, und Mannose und Galactose. Weiterhin wird das β-Glucan von Saccharomyces cervisiae aus der Zellwand isoliert und hat eine heterogene Bindung mit wenig Verzweigungen und ist damit unlöslich.

Das erfindungsgemäß aus Schizophyllum commune Fr. isolierte β-Glucan wurde dagegen als homogenes β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan identifiziert, das zu jeder dritten β-1,3- Bindung der Hauptkette verzweigte β-1,6-Bindungen aufweist und nur aus Glucose zusammengesetzt ist, mit einem Molekular von 2 000 000 bis 5 000 000. Es wird aus dem Extrazellulären gewonnen und hat die Eigenschaften eines stabilen neutralen Polysaccharids.

Das Verfahren zur Flüssigkultivierung von Schizophyllum commune Fr. zur Gewinnung von β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan wird ausführlicher beschrieben.

(1) Schritt zur Herstellung von Myzelien von Schizophyllum commune Fr.

Die Myzelien von Schizophyllum commune Fr. können durch Kultivierung von Sporen wildwachsender Schizophyllum commune Fr. hergestellt werden.

Genauer gesagt werden die Sporen von wildwachsenden Schizophyllum commune Fr. nach einigen Malen Waschen mit destilliertem Wasser, auf einem Hefe-Malzextrakt-Agarmedium (3 g Hefeextrakt, 3 g Malzextrakt, 5 g Pepton, 10 g Glucose, 15 g Agar, 1 L destilliertes Wasser) angeimpft und 7 Tage bei einer Temperatur von 24°C zur Erzeugung von Myzelien gehalten. Die erzeugten Myzelien werden schräg in Reagenzgläsern kultiviert, die das selbe Hefe-Malzextrakt-Agarmedium enthielten, und dann bei einer Temperatur von 4°C gehalten, um monatlich übergangskultiviert zu werden.

(2) Schritt zur Kultivierung der Myzelien in einem flüssigen Medium

Die Myzelien werden aseptisch homogenisiert und anschließend in einer Menge von 0.00001 bis 10 Vol.-%, vorzugsweise 3 Vol.-% in einem flüssigen Medium mit einem pH-Wert von 4.0 bis 8.5, vorzugsweise mit einem pH-Wert von 6.5 angeimpft, das 1 bis 10 Gew.-%, vorzugsweise 3 Gew.-% Glucose, 0.1 bis 1 Gew.-%, vorzugsweise 0.3 Gew.-% Hefeextrakt, 0.05 bis 0.5%, vorzugsweise 0.05 Gew.-% (NH₄)₂HPO₄ oder (NH₄)₂SO₄, 0,05 bis 0,5 Gew.-%, vorzugsweise 0.1 Gew.-% KH₂PO₄ und 0.005 bis 0.2 Gew.-%, vorzugsweise 0.05 Gew.-% MgSO₄×7 H₂O enthält.

Anschließend wird die Flüssigkultivierung der Myzelien durch Halten des Mediums auf einer Temperatur von 20 bis 35°C, vorzugsweise 28°C, unter Rühren mit 100 bis 400 UpM, vorzugsweise 200 UpM und einer Belüftung von 0.3 bis 2 VVM, vorzugsweise 1 VVM, in einem Fermentationstank für drei bis sieben Tage, vorzugsweise fünf Tage durchgeführt.

Der in Abb. 1 dargestellt Graph zeigt, daß die Produktivität zu β-1,6-verzweigtem-β-1,3- Glucan nach zwei Tagen Kultivierung ansteigt und bei einer Kultivierung über fünf Tage das Maximum erreicht. Es ist verständlich, daß die Kultivierung über die ersten beiden Tage dem Wachstum der Myzelien dient und die anschließende Kultivierung der Herstellung von β-1,6- verzweigtem-β-1,3-Glucan. Weiterhin kann im späteren Teil der Kultivierung β-1,6- verzweigtes-p-1,3-Glucan in gewissem Maße zersetzt werden. Deshalb wird die Kultivierung vorzugsweise über fünf Tage durchgeführt.

(3) Schritt zur Isolierung von β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan aus dem flüssigen Medium

β-1,6-Verzweigtes-β-1,3-Glucan kann mittels Adsorption an Aktivkohlepulver isoliert werden. Genauer gesagt wird das Aktivkohlepulver nach Abschluß der Kultivierung in das Flüssigmedium in einer Menge von 0.1 bis 6%, vorzugsweise 1%, zugegeben, und anschließend wird die Mischung gerührt um unnötige Bestandteile wie Pigmente und Proteine zu entfernen. Anschließend wird die Mischung durch eine Filterpresse filtriert, um eine β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan enthaltende Lösung zu ergeben. Zu diesem Zeitpunkt kann die Adsorption mit dem Aktivkohlepulver nach der Filtration mit einer Filterpresse durchgeführt werden.

(4) Schritt der Reinigung von β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan

Die Reinigung von β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan kann durch Fällung mit Ethylalkohol durchgeführt werden.

Genauer gesagt wird die erhaltende Lösung mittels Filtern mit Membranen mit Mikroporen von 1 µm und 0.45 µm feinfiltriert, um entfärbtes oder schwach braunes Filtrat zu ergeben. Dem Filtrat wird Ethylalkohol zugesetzt, um β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan auszufällen. Zur Reinigung des β-1,6-verzweigten-β-1,3-Glucans kann die Fällung mit Ethylalkohol zwei bis fünf Mal wiederholt werden. Die Menge des zuzusetzenden Ethylalkohols liegt vorzugsweise im Bereich des drei- bis vierfachen Volumens, vorzugsweise des 3.5-fachen Volumens des Filtrats und kann bei Wiederholungen der Fällung mit Ethylalkohol verringert werden.

Wenn die Fällung mit Ethylalkohol zwei Mal oder häufiger wiederholt wird, kann die bei der letzten Fällung zugesetzte Menge Ethylalkohol dem Volumen des vorherigen Filtrats entsprechen.

Die Niederschläge werden anschließend gewonnen und bei einer Temperatur von 20 bis 100°C mit heißer Luft getrocknet, um flüchtige Verbindungen wie Ethylalkohol zu entfernen. Abschließend kann das Produkt bei einer Temperatur von -70°C gefriergetrocknet und anschließend gemahlen werden, um β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan in Pulverform zu ergeben.

Wie Abb. 1 entnommen werden kann, können einige Stoffe, die β-1,6-verzweigtes-β- 1,3-Glucan zersetzen und das Wachstum der Myzelien inhibieren, neben β-1,6-verzweigtem- β-1,3-Glucan als Nebenprodukte gebildet werden. Diese Stoffe werden als endo-1,3-β- Glucanase und FIS (Fruchtbildungsinduzierende Substanz, Fruiting Inducing Substance) identifiziert. Endo-1,3-β-Glucanase (Prokop et al., 1994, Can. J. Micobiol. Rev. Band. 40, Nr. 1, Seite 18) kann β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan zersetzen und so die Ausbeute an β-1,6- verzweigtem-β-1,3-Glucan verringern. Und die FIS, beispielsweise (4E,8E)-N-D-2'- Hydroxipalmitoyl-1-O-β-D-glucopyranosyl-9-methyl-4,8-sphingadienin und (4E,8E)-N-D-2'- Hydroxistearoyl-1-O-β-D-glucopyranosyl-9-methyl-4,8-sphingadienin (Mizushina et al., 1998, Biochem. Biophys. Res. Commun. Band 249, Seite 17) kann das Wachstum der Myzelien inhibieren und so die Produktivität zu β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan verringern (Wessels, 1978. Genetics and Morphogenesis in the Basidiomycetes, Seiten 81 bis 104, Academic Press; Prokop et al., 1992, Experimental Mycology, Band 16, Seiten 197 bis 206). Es wurde berichtet, daß diese Nebenprodukte im späteren Teil der Kultivierung von Schizophyllum commune Fr. hergestellt werden.

Deshalb haben die hier beteiligten Erfinder weitere Arbeiten durchgeführt, um diese Nebenprodukte zu entfernen und dadurch die Ausbeute an β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan zu erhöhen. Als ein Ergebnis fanden sie, daß diese Aufgabe durch Zugabe von Aktivkohle in das Flüssigmedium während des Kultivierungsschritts (2) gelöst werden kann. Dies bedeutet, daß die Nebenprodukte mittels Adsorption an Aktivkohle ohne jeden negativen Einfluß auf das Wachstum der Myzelien und die Herstellung von β-1,6-verzweigtem-β-1,3- Glucan entfernt werden können.

Die Zugabe der Aktivkohle wird vorzugsweise nach einer Kultivierung über zwei bis vier Tage durchgeführt und zwar in einer Menge von 0.1 bis 5%. Nach der Zugabe kann die Kultivierung für weitere ein bis vier Tage fortgesetzt werden.

Die Zugabe von Aktivkohle kann die Ausbeute an β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan um etwa 30% erhöhen.

Daneben kann die Ausbeute an β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan durch Zufuhr von Glucose während der Kultivierung zur Herstellung von β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan weiter erhöht werden.

Genauer gesagt kann ein großes C/N-Verhältnis die Produktivität zu β-1,6-verzweigtem-β- 1,3-Glucan verbessern, während ein kleines C/N-Verhältnis das Wachstun der Myzelien fördert. Deshalb kann in der vorliegenden Erfindung das Flüssigmedium durch eine Verringerung der ursprünglichen Menge an Kohlenstoffquelle, beispielsweise 1 bis 3% Glucose und 0.3 bis 0.5% Hefeextrakt während der Kultivierung zum Wachstum der Myzelien auf ein vergleichsweise kleines C/N-Verhältnis, aber durch Zufuhr von Glucose während der Kultivierung zur Herstellung von β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan auf ein vergleichsweise großes C/N-Verhältnis eingestellt werden. Die Zugabe von Glucose wird vorzugsweise dann vorgenommen, wenn die Bildung von β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan rasch ansteigt oder das Wachstum der Myzelien langsamer wird, das heißt nach einer Kultivierung über drei bis fünf Tage, in einer Menge von 1 bis 10%. Nach der Zugabe kann die Kultivierung für weitere ein bis drei Tage fortgesetzt werden. Die Glucosezugabe kann die Ausbeute an β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan um ungefähr 38% steigern.

Weiterhin kann die Ausbeute an β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan zusätzlich durch die Zugabe von sowohl Aktivkohle als auch Glucose in das Flüssigmedium weiter gesteigert werden. Die Zugabe wird vorzugsweise nach einer Kultivierung über drei bis fünf Tage vorgenommen. Das ursprüngliche Medium enthält vorzugsweise 1 bis 3% Glucose und 0.3 bis 0.5% Hefeextrakt als Kohlenstoffquelle, um das C/N-Verhältnis zu verkleinern. Die Mengen an zuzugebender Aktivkohle und Glucose sind vorzugsweise 0.1 bis 5% und 1 bis 10%, respektive.

Nach der Zugabe kann die Kultivierung für weitere ein bis fünf Tage fortgesetzt werden. Die Zugabe kann die Ausbeute an β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan um ungefähr 60% steigern.

Der in Abb. 4 gezeigte Graph lehrt, daß die Produktivität an β-1,6-verzweigtem-β-1,3- Glucan nach einer Kultivierung über zwei Tage ansteigt und bei Kultivierung über sechs Tage das Maximum erreicht. Es ist verständlich, daß die Zugaben von Aktivkohle und Glucose die Produktivität steigern und den Produktionszeitraum verlängern, was zu einer Steigerung der Ausbeute an β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan führt.

Das mit dem obigen Verfahren gewonnene β-1,6-verzweigte-β-1,3-Glucan kann, wie in den folgenden experimentellen Beispielen gezeigt, die Biosynthese von Hautzellen und Kollagen fördern, durch übermäßige Sonneneinwirkung verursachte Verbrennungen heilen und die Melaninbildung inhibieren.

Auf der Grundlage dieser Ergebnisse kann die vorliegende Erfindung eine β-1,6-verzweigtes- β-1,3-Glucan als aktiven Bestandteil enthaltende Zusammensetzung zur äußerlichen Anwendung zur Verfügung stellen. Die Zusammensetzung kann die Hautalterung verzögern, einen hautaufhellenden Effekt bewirken und effektiv Hautschäden heilen. Die Zusammensetzung kann β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan in einer Menge von 0.00001 bis 10 Gew.-% enthalten, wobei die Menge in Abhängigkeit von den Formulierungen oder den letztendlichen Zwecken der Zusammensetzung gewählt werden kann. Weiterhin kann die Zusammensetzung zur äußerlichen Anwendung zu Kosmetika wie Hautweichmachern, Nähr-Toilettenwassern, Massagecremes, Nährcremes, Packungen und Gelen, und Hautarzneimitteln wie Lotionen, Salben, Gelen, Cremes, Pflastern oder Sprays formuliert werden, ist aber nicht darauf beschränkt. Weiterhin können die Zusammensetzungen andere Bestandteile enthalten, die üblicherweise verwendet werden und in Abhängigkeit von der Formulierung gewählt werden können.

Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung

Die vorliegende Erfindung wird mittels der folgenden Beispiele ausführlicher dargestellt. Diese Beispiele werden jedoch nur zum Zwecke des Darstellung aufgeführt und sollten nicht als Beschränkung des Bereichs der Erfindung ausgelegt werden, der eigentlich in den begleitenden Ansprüchen skizziert ist.

Zubereitung 1

Myzelien von Schizophyllum commune Fr. wurden in Reagenzgläsern, die Hefe-Malz extrakt-Agarmedium, (3 g Hefeextrakt, 3 g Malzextrakt, 5 g Pepton, 10 g Glucose, 15 g Agar, 1 L destilliertes Wasser) enthalten, schräg kultiviert, und dann aseptisch homogenisiert. Anschließend wurden die Myzelien in einer Menge von 3 Vol.-% in einem Flüssigmedium mit einem pH-Wert von 6.5, das 3 Gew.-% Glucose, 0.3 Gew.-% Hefeextrakt, 0.05% (NH₄)₂HPO₄, 0.1 Gew.-% KH₂PO₄ und 0.05 Gew.-% MgSO₄×7 H₂O enthält, angeimpft. Die Flüssigkultivierung. Die Flüssigkultivierung wurde durch Halten des Mediums auf einer Temperatur von 28°C, unter Rühren mit 200 UpM, und einer Belüftung von 1 VVM, in einem 30 L-Fermentationstank über fünf Tage durchgeführt. Nach Beendigung der Kultivierung war die Konzentration der Myzelien ungefähr 4.0 g/L, und die Konzentration an β-1,6- verzweigtem-p-1,3-Glucan war ungefähr 9.5 g/L (siehe Abb. 1).

Anschließend wurde dem Flüssigmedium Aktivkohlepulver (Jeil Chemical Co., Ltd., Korea) in einer Menge von 1.0% zugegeben, und dann wurde die Mischung 30 Minuten lang gerührt. Anschließend wurde die Mischung in einer Filterpresse abfiltriert, um eine β-1,6-verzweigtes- β-1,3-Glucan enthaltende Lösung zu ergeben.

Die Lösung wurde erneut filtriert, wobei die Filter Membranmikroporen von 1 µm und 0.45 µm in dieser Reihenfolge aufwiesen, um ein entfärbtes oder hellbraunes Filtrat zu ergeben. Dem Filtrat wurde das 3.5-fache Volumen Ethylalkohol zugesetzt, und anschließend wurde die Mischung zur Fällung über Nacht bei Raumtemperatur gehalten. Der Niederschlag wurde gewonnen und in destilliertem Wasser aufgelöst, um eine Lösung mit einem dem des vorhergehenden Filtrats äquivalenten Volumens zu ergeben. Dieser Lösung wurde das zweifache Volumen Ethylalkohol zugesetzt und anschließend wurde die Mischung zur Fällung über Nacht bei Raumtemperatur gehalten. Der Niederschlag wurde wiederum gewonnen und in destilliertem Wasser aufgelöst, um eine Lösung mit einem dem des vorhergehenden Filtrats äquivalenten Volumen zu ergeben. Dieser Lösung wurde ein äquivalentes Volumen Ethylalkohol zugesetzt, und anschließend wurde die Mischung zur Fällung über Nacht bei Raumtemperatur gehalten. Anschließend wurde der Niederschlag gewonnen und bei 80°C in erwärmter Luft getrocknet. Abschließend wurde das Produkt bei 70°C gefriergetrocknet und dann in einer Mühle gemahlen, um das Pulver zu ergeben.

Die Pulververbindung wurde mittels eines Infrarot-Spektrophotometers (Biorad FTS-40) und einem Kernmagnetischen Resonanz-Spektrophotometers (Varian Gemini-2000, 300 MHz, FT-NMR) identifiziert. Die Ergebnisse sind in den Abb. 2 und 3, respektive, dargestellt. In Abb. 2 wird bei 889.4 nm das β-Anomer bestätigt, was zeigt, daß die Verbindung hauptsächlich β-Glucan ist, und in Abb. 3 wird bestätigt, daß diese Verbindung eine homogene Struktur aufweist, bei der eine β-1,6-D-Glucose zu jeder dritten β-1,3-D-Glucose verzweigt ist.
¹³C-NMR (ppm): C-6(61.15), C-4(68.58), C-6(70.25), C-2(72.74), C-2(73.80), C-3(74.81), C-5(76.40), C-3(86.44), C-1(103.11).

Weiterhin wurde die Reinheit des β-1,6-verzweigten-β-1,3-Glucans mit einem BGSTER A Test gemessen, der die Reaktion von Amöbozytenlysat von Schwertschwanz und β-Glucan (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) verwendet. Er ergab eine Reinheit dieser Verbindung von 99.2%.

Zubereitung 2

Myzelien von Schizophyllum commune Fr. wurden nach aseptischer Honogenisierung in einer Menge von 3 Vol.-% in ein Flüssigmedium mit einem pH-Wert von 6.5, das 3 Gew.-% Glucose, 0.3 Gew.-% Hefeextrakt, 0.05% (NH₄)₂SO₄, 0.1 Gew.-% KH₂PO₄ und 0.05 Gew.-% MgSO₄×7 H₂O enthält, angeimpft. Die Flüssigkultivierung wurde durch Halten des Mediums auf einer Temperatur von 28°C, unter Rühren mit 200 UpM, und einer Belüftung von 1 VVM, in einem 30 L-Fermentationstank über drei Tage durchgeführt. Dann wurden dem Medium Aktivkohlepulver (Jeil Chemical Co., Ltd. Korea) in einer Menge von 0.5% zugegeben, und dann wurde die Kultivierung für weitere drei Tage bei den selben Bedingungen fortgesetzt. Nach Beendigung der Kultivierung betrug die Konzentration der Myzelien ungefähr 3.8 g/L und die Konzentration an β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan ungefähr 12.3 g/L.

Anschließend wurde die Kultur in einer Filterpresse abfiltriert und dann wurden Aktivkohlepulver (Jeil Chemical Co., Ltd., Korea) in einer Menge von 0.5% zugesetzt. Anschließend wurde die Mischung 30 Minuten lang gerührt.

Danach wurde zur Reinigung des β-1,6-verzweigten-β-1,3-Glucans der für Zubereitung 1 beschriebenen Vorgehensweise gefolgt.

Das erhaltene Produkt wurde als β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan mit einer gemessenen Reinheit von 99.5% identifiziert.

Zubereitung 3

Myzelien von Schizophyllum commune Fr. wurden nach aseptischer Honogenisierung in einer Menge von 3 Vol.-% in ein Flüssigmedium mit einem pH-Wert von 6.5, das 2 Gew.-% Glucose, 0.4 Gew.-% Hefeextrakt, 0.05% (NH₄)₂HPO₄, 0.1 Gew.-% KH₂PO₄ und 0.05 Gew.-% MgSO₄×7 H₂O enthält, angeimpft. Die Flüssigkultivierung wurde durch Halten des Mediums auf einer Temperatur von 28°C, unter Rühren mit 200 UpM, und einer Belüftung von 1 VVM, in einem 30 L-Fermentationstank über vier Tage durchgeführt. Dann wurde dem Medium Glucose in einer Menge von 0.3% zugegeben, und dann wurde die Kultivierung für weitere zwei Tage bei den selben Bedingungen fortgesetzt. Nach Beendigung der Kultivierung betrug die Konzentration der Myzelien ungefähr 4.5 g/L und die Konzentration an β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan ungefähr 13.1 g/L.

Anschließend wurde zur Isolierung und Reinigung des β-1,6-verzweigten-β-1,3-Glucans der für Zubereitung 1 beschriebenen Vorgehensweise gefolgt.

Das erhaltene Produkt wurde als β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan mit einer gemessenen Reinheit von 99.4% identifiziert.

Zubereitung 4

Myzelien von Schizophyllum commune Fr. wurden nach aseptischer Honogenisierung in einer Menge von 3 Vol.-% in ein Flüssigmedium mit einem pH-Wert von 6.5, das 2 Gew.-% Glucose, 0.4 Gew.-% Hefeextrakt, 0.05% (NH₄)₂SO₄, 0.1 Gew.-% KH₂PO₄ und 0.05 Gew.-% MgSO₄×7 H₂O enthält, angeimpft. Die Flüssigkultivierung wurde durch Halten des Mediums auf einer Temperatur von 28°C, unter Rühren mit 200 UpM, und einer Belüftung von 1 VVM, in einem 30 L-Fermentationstank über vier Tage durchgeführt. Dann wurden dem Medium 0.5% Aktivkohle und 3% Glucose zugegeben, und dann wurde die Kultivierung für weitere zwei Tage bei den selben Bedingungen fortgesetzt. Nach Beendigung der Kultivierung betrug die Konzentration der Myzelien ungefähr 4.5 g/L und die Konzentration an β-1,6- verzweigtem-β-1,3-Glucan ungefähr 15.1 g/L (siehe Abb. 4).

Anschließend wurde zur Isolierung und Reinigung des β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucans der für Zubereitung 1 beschriebenen Vorgehensweise gefolgt.

Das erhaltene Produkt wurde als β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan mit einer gemessenen Reinheit von 99.6% identifiziert.

Experimentelles Beispiel 1: Proliferation von Fibroblasten

Menschliche Fibroblasten wurden auf nach Dulbeco modifizierten Eagle-Medium (DMEM), das 2.5% Rinderfötenserum enthielt, kultiviert und dann mit 5000 Zellen pro Vertiefung auf eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben.

Die Proben wurden vorbereitet:
β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan aus Zubereitung 1; 1-prozentige Lösung und ihre nachfolgenden Verdünnungen;
β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan aus Zubereitung 4; 1-prozentige Lösung und ihre nachfolgenden Verdünnungen;
GluCare-S, aus Hefe (Cosmoferm) isoliertes β-Glucan; 1-prozentige Lösung und ihre nachfolgenden Verdünnungen; und
das Filtrat vor Fällung mit Ethylalkohol in Zubereitung 1; 100-prozentig und seine folgenden 1/10 Verdünnungen.

Nach der Zugabe jeder Probe in ihre Vertiefung wurde die Platte mit 96 Vertiefungen über vier Tage bei 37°C gehalten. Nach Beendigung der Kultivierung wurden 0.2% 3-[4,5- Dimethlythiazol-2-yl-]-2,5-diphenyltertazoliumbromid (MTT) zu 50 µL pro Vertiefung zugegeben.

Wiederum wurde die Platte über vier Tage bei 37°C gehalten, um Formazan zu ergeben. Nach Auflösung des Formazans in Dimethylsulfoxid wurde mit einem Mikroplattenleser die Absorption bei 570 nm gemessen. Die Proliferation von Fibroblasten wurde durch Vergleich der Absorption mit der der unbehandelten Kontrollgruppe bewertet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Wie in Tabelle 1 gezeigt, führt die Behandlung mit GluCare-S zu einer höchstes 7- prozentigen Steigerung der Proliferation von Fibroblasten. Die Behandlung mit aus Schizophyllum commune Fr. isoliertem β-1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan dagegen führt zu einer höchstens 40-prozentigen Steigerung. Das Filtrat vor Reinigung des β-1,6-verzweigten- β-1,3-Glucans (Extrakt aus Schizophyllum commune Fr.) ist jedoch weniger wirksam für die Fibroblastenproliferation.

Experimentelles Beispiel 2: Poliferation von Keratinozyten

Die im experimentellen Beispiel 1 beschriebene Vorgehensweise wurde mit Keratinozyten anstelle von Fibroblasten durchgeführt, um die Proliferation von Keratinozyten zu bewerten.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Wie in Tabelle 2 gezeigt, führt die Behandlung mit GluCare-S zu einer höchstes 12- prozentigen Steigerung der Proliferation von Keratinozyten. Die Behandlung mit aus Schizophyllum commune Fr. isoliertem β-1,6-verzweigten-β-1,3-Glucan dagegen führt zu einer höchstens 20-prozentigen Steigerung. Das Filtrat vor Reinigung des β-1,6-verzweigten- β-1,3-Glucans (Extrakt aus Schizophyllum commune Fr.) ist jedoch weniger wirksam für die Keratinozytenproliferation.

Experimentelles Beispiel 3: Biosynthese von Fibroblastenkollagen

Die Fibroblasten wurden auf einer Mikrotiterplatte mit 24 Vertiefungen, die dasselbe Medium wie im experimentellen Beispiel 1 enthielten, kultiviert und mit den selben Proben über drei Tage behandelt. Nach Abschluß der Kultivierung wurden 0.5 mL DMEM und 10 µCi L[2,3,4,5-³H]-Prolin in jede Vertiefung zugegeben. 24 Stunden später wurden das in jeder Vertiefung enthaltende Medium und die Zellen gewonnen, mit 5% Trichloressigsäure gewaschen und auf zwei Reagenzgläser aufgeteilt. In eines der Reagenzgläser wurden eine Einheit/µL Typ I-Kollagenase zugegeben und das Reagenzglas über 90 Minuten bei 37°C gehalten. Das andere Reagenzglas wurde bei 4°C inkubiert. Anschließend wurden 0.05 mL 50-prozentiger Trichloressigsäure in jedes der beiden Reagenzgläser zugegeben, die über 20 Minuten bei 4°C gehalten wurden. Die entstehende Lösung wurde 10 Minuten lang bei 12 000 UpM zentrifugiert und dann der Zerfall pro Minute (decay per minute, dpm) der überstehenden Lösung und des Niederschlags mit einem Flüssigszintillationszähler gemessen. Die relative Kollagenbiosynthese (relative collagen biosynthesis, RCB) wird mit der folgenden Gleichung berechnet.

RCB = [Kollagen dpm/{Gesamtkollagen - Kollagen dpm)×5.4 Kollagen dpm}]×100.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.

Tabelle 3

Wie in Tabelle 3 gezeigt, führt die Behandlung mit GluCare-S zu einer höchstes 5- prozentigen Steigerung der Biosynthese von Fibroblastenkollagen, während die Behandlung mit aus Schizophyllum commune Fr. isoliertem β-1,6-verzweigten-β-1,3-Glucan zu einer höchstens 32-prozentigen Steigerung führt. Das Filtrat vor Reinigung des β-1,6-verzweigten- β-1,3-Glucans (Extrakt aus Schizophyllum commune Fr.) ist jedoch weniger wirksam für die Förderung der Kollagenbiosynthese.

Experimentelles Beispiel 4: Heileffekt für durch übermäßige Sonneneinstrahlung hervorgerufene Hautschäden

Die Hautfarbe wurde vor der Bestrahlung mit UV-Strahlen mit einem Chromameter CM2002 gemessen. Am Oberarm eines Freiwilligen wurde mit einem Sonnensimulator MED gemessen und anschließend wurde mit UV-Strahlung bestrahlt, um 1.5 MED einzustellen und Erytheme hervorzurufen. 6, 8, 10, 12, 16 und 24 Stunden nach der Bestrahlung wurden dem Probanden 20 µL derselben Proben (1% β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan und 100% Filtrat) wie im experimentellen Beispiel 1 appliziert. Vor und nach der Behandlung mit den Proben wurde die Hautfarbe mit dem Chromameter 2002 gemessen. Der relative Wert, wenn die Hautfarbe vor der UV-Bestrahlung zu 100 gesetzt wird, wird als "Erythemindex" berechnet, dessen statistische Signifikanz durch einen Anova-Test (p<0.05) verifiziert wurde. Mit diesem Index wurde der Heilungseffekt bei Verbrennungen bewertet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.

Tabelle 4

Wie in Tabelle 4 gezeigt wird, führt die Behandlung mit GluCare-S zu höchstens 5.56- prozentiger Heilungswirksamkeit für die beschädigte Haut, während die Behandlung mit aus Schizophyllum commune Fr. isoliertem β-1,6-verzweigten-β-1,3-Glucan zu höchstens 22.35- prozentiger Heilungswirksamkeit führt. Das Filtrat vor Reinigung des β-1,6-verzweigten-β- 1,3-Glucans (Extrakt aus Schizophyllum commune Fr.) jedoch ist zur Heilung der beschädigten Haut weniger wirksam.

Experimentelles Beispiel 5: Aufhellungseffekt

Auf die Oberarme von 10 gesunden männlichen Freiwilligen wurden opake Bänder mit sechs Löchern mit 1.5 cm Durchmesser angebracht und mit UV-Strahlung mit einer TL20W/090UV Lampe (Philips) und einer TL20W/12UV Lampe (Philips) mit einer Stärke von 200 mJ/cm² bestrahlt. Zwei Wochen später wurden den Probanden 0.1% β-1,6-verzweigtes-β-1,3- Glucan aus Zubereitung 4, 0.1% GluCare-S und eine 25-%ige Verdünnung des Filtrats vor Fällung mit Ethylalkohol aus der Zubereitung 1 zweimal täglich zwei Monate lang appliziert. Vor und nach Behandlung mit den Proben wurde mit einem Chromameter 2002 in gleichen Zeitabständen die Hautfarbe gemessen. Der Unterschied der Helligkeit (AL) verglichen mit der Hauthelligkeit vor Anwendung der Proben wurde berechnet und die Ergebnisse in Tabelle 5 wiedergegeben.

Tabelle 5

Wie in Tabelle 5 gezeigt wird ist aus Schizophyllum commune Fr. isoliertes β-1,6- verzweigtes-β-1,3-Glucan für die Verbesserung der Hauthelligkeit am effektivsten.

Experimentelles Beispiel 6: Verbesserung von Hautrunzeln

Um die Fähigkeit der β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan enthaltenden Zusammensetzung zur Verbesserung von Hautrunzeln zu bewerten, wurde das folgende Experiment durchgeführt. Zehn (10) Freiwillige im Alter zwischen 35 und 45 Jahren verwendeten die Nährcremes aus Beispiel 1 und Vergleichsbeispiel 1.

Drei Monate lang wurde auf die rechte Gesichtshälfte die Nährcreme von Beispiel 1 und auf die linke Gesichtshälfte die Nährcreme von Vergleichsbeispiel 1 appliziert. Die Verbesserung der Hautrunzeln wurde durch Vergleich der Fältchen in Augenwinkel vor und nach der Benutzung der Cremes bewertet. Die Fältchen im Augenwinkel wurden abgeformt und mit einem Visiometersystem (C+K) in einem Raum mit konstanter Temperatur und Feuchtigkeit, eingestellt auf eine Temperatur von 24°C und eine relative Luftfeuchtigkeit von 40% gemessen. Die Verbesserung der Hautrunzeln wurde mit der folgenden Gleichung berechnet:

Verbesserung der Hautrunzeln (Δ%) = {(Tdi-Tdo)/Tdo}×100

(Wobei Tdi der nach der Verwendung der Cremes gemessene Hautrunzelwert und Tdo der vor der Verwendung der Cremes gemessene Hautrunzelwert ist.)

Im Ergebnis betrug die Verbesserung in der linken Gesichtshälfte 3.1 ± 2.2%, während die Verbesserung in der rechten Gesichtshälfte 15 ± 4.1% betrug.

Die β-1,6-verzweigtes-β-1,3-Glucan enthaltenden Zusammensetzungen zur äußerlichen Anwendung werden mittels der folgenden Formulierungen 1 bis 9 ausführlicher veranschaulicht. Diese Formulierungen werden jedoch nur zum Zweck der Veranschaulichung wiedergegeben und sollten nicht als Beschränkung des Bereichs der Erfindung ausgelegt werden, der in den begleitenden Ansprüchen skizziert ist.

Formulierung 1: Hautlotion

Formulierung 2: Milchlotion

Formulierung 3: Nährcreme

Formulierung 4: Massagecreme

Formulierung 5: Packung

Formulierung 6: Gel

Formulierung 7: Salbe

Formulierung 8: Gelartige Salbe

Formulierung 9: Pflaster

Claims

1. Verfahren zur Flüssigkultivierung von Schizophyllum commune Fr. zur Isolierung von β- 1,6-verzweigtem-β-1,3-Glucan, das die folgenden Schritte umfaßt:

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, das weiterhin einen Schritt der Zugabe von Aktivkohle in einer Menge von 0. 1 bis 5% in das besagte Flüssigmedium nach Kultivierung über zwei bis vier Tage, und Kultivierung für weitere ein bis vier Tage umfaßt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das besagte Flüssigmedium 1 bis 3 Gew.-% Glucose, 0.3 bis 0.5 Gew.-% Hefeextrakt, 0.05 bis 0.5% Gew.-% (NH₄)₂HPO₄, oder (NH₄)₂SO₄, 0.05 bis 0.5 Gew.-% KH₂PO₄ und 0.005 bis 0.2 Gew.-% MgSO₄×7 H₂O enthält, und dadurch daß es einen weiteren Schritt der Zugabe von Glucose in einer Menge von 1 bis 10% in das besagte Flüssigmedium nach Kultivierung über drei bis fünf Tage, und Kultivierung für weitere ein bis drei Tage umfaßt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das besagte Flüssigmedium 1 bis 3 Gew.-% Glucose₁ 0.3 bis 0.5 Gew.-% Hefeextrakt, 0.05 bis 0.5% Gew.-% (NH₄)₂HPO₄, oder (NH₄)₂SO₄, 0.05 bis 0.5 Gew.-% KH₂PO₄ und 0.005 bis 0.2 Gew.-% MgSO₄×7 H₂O enthält, und dadurch daß es einen weiteren Schritt der Zugabe von sowohl 0.1 bis 5% Aktivkohle als auch von 1 bis 10% Glucose in das besagte Flüssigmedium nach Kultivierung über drei bis fünf Tage, und Kultivierung für weitere ein bis fünf Tage umfaßt.

5. Zusammensetzung zur äußerlichen Anwendung, die mit einem in irgendeinem der Ansprüche 1 bis 4 beschriebenen Verfahren gewonnenes β-1,6-verzweigtes-β-1,3- Glucan in einer Menge von 0.0001 bis 10 Gew.-% enthält.

6. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Zusammensetzung eine kosmetische Formulierung, ausgewählt aus der von Hautlotionen, Milchlotionen, Nähr-Toilettenwassern, Massagecremes, Nährcremes, Packungen und Gelen gebildeten Gruppe ist

7. Zusammensetzung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die besagte Zusammensetzung eine Hautarzneimittelformulierung, ausgewählt aus der von Lotionen, Salben, Gelen, Cremes, Pflastern und Sprays gebildeten Gruppe ist.