BR112014000219B1 - Dispositivo de ensaio para detecção de enzima ativa, métodos de determinação da presença de enzima ativa e kit - Google Patents

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Abstract

DISPOSITIVO DE ENSAIO PARA DETECÇÃO DE ENZIMA ATIVA, MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA DE ENZIMA ATIVA E KIT. A presente invenção divulga um dispositivo de ensaio (1) para detecção de uma enzima ativa em uma amostra. O referido dispositivo de ensaio (1) compreende os seguintes componentes: - (a) uma região de colocação (10) sobre a qual a amostra pode ser colocada, (b) uma matriz (20) operacionalmente conectada à referida região de colocação (10) de modo a que a amostra, quando presente (por exemplo, quando colocada) sobre a referida região de colocação (10) pode migrar ao longo da referida matriz (20); (c) pelo menos um local de captura distinto (30) sobre a referida matriz (20), em que cada local de captura distinto (30) é levado para longe da região de colocação (10), e em que a amostra pode migrar para Ionge do referido local de captura distinto (30), (d) meios de captura (40) estão presentes, ou definem, cada local de captura distinto (30), em que os referidos meios de captura (40) são capazes de ligar à referida enzima de modo que pelo menos uma porção da referida amostra da referida enzima é retida em pelo menos um local de captura distinto (30), e (e) os meios de indicação seletiva (50) ou pelo menos um componente destes fornecem uma indicação (...).

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[01] A presente invenção diz respeito ao campo de ensaios enzimáticos.
[02] Em particular, a presente invenção refere-se a ensaios em tiras para a atividade enzimática.
[03] Mais especificamente, a presente invenção refere-se a dispositivos de ensaio e métodos usando os mesmos e o uso dos mesmos. Os dispositivos de ensaio e os ensaios podem detectar a enzima ativa. A enzima ativa pode ser uma fosfatase, tal como uma fitase ou fosfatase ácida, ou uma glicosídeo hidrolase, tal como uma xilanase, uma β-glicanase ou uma amilase. Em um aspecto mais preferido, a enzima ativa é uma fitase.
[04] A presente invenção é útil para a aplicação de uma variedade de aplicações industriais, tal como a detecção de enzima ativa na produção de biocombustíveis, composições detergentes e detecção de enzima ativa em alimentos e rações.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[05] Determinar a presença ou ausência de um analito, em particular uma enzima, é frequentemente necessário no laboratório, e também em áreas tão diversas como as áreas de alimentos e rações, áreas de produção de biocombustíveis e sabões e pó. Normalmente, são usados ensaios como os imunoensaios para esta finalidade.
[06] O ensaio imunoadsorvente enzima-associado (ELISA) pode ser utilizado para detectar a presença de um anticorpo ou antígeno em uma amostra. Em tal método, um anticorpo se liga a um antígeno que está fixado a uma superfície, ou vice-versa. Este anticorpo é ligado a uma enzima que pode criar o sinal detectável, que geralmente é uma mudança de cor.
[07] Outro tipo comum de ensaio ou imunoensaio é o ensaio de fluxo lateral. Em tal ensaio, a presença de um analito é detectada em uma amostra que flui ao longo de um suporte sólido. O analito, ou um reagente tal como um anticorpo que se liga ao analito, em seguida, liga-se às linhas ou zonas no suporte que foram tratadas com antígenos ou com anticorpos.
[08] Tanto os ensaios de ELISA quantos os ensaios de fluxo lateral podem também ser ensaios do tipo ‘sanduíche’. Isto significa que a amostra, primeiro contata com um anticorpo de captura que se liga ao antígeno a ser detectado. O antígeno então se liga a outro anticorpo, que provavelmente está fixado em uma linha de teste no caso de ensaios de fluxo lateral. O antígeno é então intercalado (formando um sanduíche) entre pelo menos dois anticorpos. O segundo anticorpo é ligado a um sinal detectável.
[09] Muitas ou imunoensaios dos tipos descritos acima determinam a presença de uma enzima específica.
[10] No entanto, em algumas amostras a enzima existe, mas foi inativada, por exemplo, pelo calor ou por inativação química. Nestes casos, os ensaios existentes continuam a detectar a presença da enzima.
[11] Por exemplo, a patente US4425438 descreve um ensaio que utiliza uma coluna ao invés do sistema de fluxo lateral. A amostra flui através das zonas contendo esferas que são revestidas com um material absorvente do analito. As zonas nas quais a ligação do analito ocorre dá uma medida da quantidade de analito. Outro ensaio em coluna é descrito na US5073484, onde a determinação quantitativa de um analito em líquido ocorre utilizando zonas espaçadas ao longo do trajeto de escoamento.
[12] Os dispositivos de fluxo lateral, por exemplo, aqueles descritos na Patente US5451504, geralmente possuem zonas diferentes para depósito da amostra, aprisionamento ou imobilização do analito e a detecção do analito preso ou analito complexado. Tais dispositivos não quantificam o analito ou identificam a atividade se o analito é uma enzima.
[13] O ensaio de fluxo lateral descrito na US6183972 utiliza múltiplos locais de captura ou faixas para capturar o anticorpo anti-analito marcado e fornece um sinal detectável. As bandas fornecem um padrão único de sinais, que quando combinados matematicamente, a fim de criar uma curva de dose-resposta monótona, indica a concentração do analito na amostra.
[14] A Patente US5229073 descreve um ensaio de fluxo lateral que utiliza múltiplos locais de captura, a fim de semiquantificar a quantidade de analito em uma amostra.
[15] As moléculas grandes (por exemplo, > 3000 daltons) podem ser detectadas utilizando o dispositivo de fluxo lateral da Patente US6358548. Dependendo do exemplo de realização, a intensidade de cor do número de linhas nos locais de captura dá uma indicação da quantidade do analito.
[16] A US7425302 descreve um método de fluxo lateral no qual os reagentes são secos. A adição da amostra líquida reconstitui os reagentes secos. Este método quantifica o analito com base na intensidade da mudança de cor. A atividade da enzima G6PD específica é determinada pela quantidade de tempo que leva para ocorrer uma mudança de cor, que é uma medida da rapidez que a G6PD reage com seu substrato. No entanto, o método da US7425302 é limitado especificamente para a G6PD e nenhuma enzima é mantida em um local de captura distinto.
[17] A publicação W02005/014847 descreve o uso de um imunoensaio de fluxo lateral padrão do tipo sanduíche para detectar enzimas como as fitases, xilanases e amilases. A quantidade de enzimas pode ser pelo menos parcialmente determinada pela intensidade da mudança de cor resultante. A publicação W02007/001895 descreve um ensaio tipo sanduíche em ouro coloidal, que é utilizado especificamente para detectar fitase de E. coli. Este ensaio tipo sanduíche com ouro coloidal compreende um anticorpo monoclonal primário que reconhece imunologicamente a fitase e um anticorpo secundário que está conjugado aos meios de detecção.
[18] Consequentemente, alguns dos ensaios utilizados anteriormente só podem proporcionar a determinação quantitativa de uma enzima em uma amostra, mas não são capazes de determinar a atividade da enzima ou não identificam especificamente uma enzima ativa. Outros ensaios requerem análises matemáticas complexas das bandas de captura a fim de determinar a concentração do analito.
[19] Existe, portanto, uma necessidade de um ensaio que detecta apenas as formas ativas de uma enzima. Além disso, seria vantajoso se tal ensaio pudesse fornecer, pelo menos, alguma informação semiquantitativa.
[20] A presente invenção procura superar alguns dos problemas dos dispositivos e métodos da técnica anterior.
[21] A presente invenção será agora descrita. Para facilitar a referência, nós descrevemos elementos da invenção presente sob um ou mais títulos. Deve ser observado que os ensinamentos sob cada um dos títulos também se aplica aos ensinamentos dos outros títulos. Por exemplo, cada um dos elementos e aspectos preferidos indicados em relação ao dispositivo da presente invenção é igualmente um elemento ou aspecto preferido em relação ao processo da presente invenção, ou em relação ao uso da presente invenção. Do mesmo modo, cada um dos elementos e aspectos preferidos indicados sobre o método ou o uso da presente invenção é igualmente um elemento ou aspecto preferido em relação ao dispositivo da presente invenção.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[22] Em um aspecto amplo, a presente invenção refere-se a um ensaio enzimático e um dispositivo que detecta a enzima ativa em uma amostra, e métodos para a determinação da presença da enzima ativa em uma amostra.
[23] De modo particular, a presente invenção refere-se a dispositivos e kits para realizar tais ensaios, especificamente ensaios de fluxo lateral e dispositivos para a realização de ensaios de fluxo lateral e imunoensaios.
EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO GERAIS
[24] Em um exemplo de realização, a presente invenção provê um dispositivo de ensaio para detecção de uma enzima ativa em uma amostra.
[25] O dispositivo compreende: (a) uma região de colocação sobre a qual a amostra pode ser colocada, (b) uma matriz operacionalmente ligada à referida região de colocação de modo a que a amostra, quando presente (por exemplo, colocada) sobre a referida região de colocação pode migrar ao longo da referida matriz; (c) pelo menos um local de captura distinto sobre a referida matriz, em que cada local de captura distinto é levado para longe da região de colocação, e em que a amostra pode migrar através do referido local de captura distinto, (d) meios de captura estão presentes, ou definem cada local de captura distinto, em que os referidos meios de captura são capazes de ligar à referida enzima de modo que pelo menos uma porção da referida amostra da referida enzima é retida em pelo menos um local de captura distinto, e (e) meios de indicação seletiva ou pelo menos um componente destes para fornecer uma indicação seletiva da presença da enzima ativa ligada aos referidos meios de captura.
[26] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um método de determinação da presença de uma enzima ativa em uma amostra, em que a amostra é colocada na região de colocação do dispositivo de ensaio da presente invenção e os meios de indicação seletiva do dispositivo indicam se a enzima ativa está presente.
[27] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um método de determinação dos níveis de enzima ativa em uma amostra, em que a amostra é colocada na região de colocação do dispositivo de ensaio da presente invenção e os meios de indicação seletiva do dispositivo indicam a quantidade de enzima ativa presente de maneira semiquantitativa.
[28] Em outro exemplo de realização, a presente invenção fornece um kit que compreende ou é capaz de formar o dispositivo de ensaio da presente invenção.
[29] Em outro exemplo de realização a presente invenção provê um método de determinação da presença de uma enzima ativa em uma amostra, em que o método compreende as etapas de: a) contato de pelo menos uma porção da amostra com um meio de captura pelo qual a enzima é capturada pelo referido meio de captura; b) fornecimento de um substrato adequado para a enzima capturada em que o referido substrato reage com a referida enzima capturada para produzir um produto de enzima; c) fornecimento de uma espécie reativa capaz de reagir com o produto de enzima em que a referida espécie reativa reage com o referido produto de enzima para produzir um produto insolúvel; e d) detecção do produto insolúvel obtido na etapa (c), em que a referida detecção se correlaciona com a presença e/ou quantidade de uma enzima ativa na referida amostra.
ALGUMAS VANTAGENS
[30] Uma vantagem da presente invenção é que o dispositivo e os métodos que utilizam o mesmo permitem que um operador identifique a enzima ativa em uma amostra.
[31] Uma vantagem adicional da presente invenção é que o dispositivo e os métodos que utilizam o mesmo permitem que um operador identifique de modo simples a enzima ativa em uma amostra e, em alguns casos, pelo menos de uma maneira semiquantitativa.
[32] O termo “semiquantitativa”, conforme utilizado na presente invenção, significa uma quantidade relativa, um valor aproximado ou uma quantidade dentro de uma faixa conhecida.
[33] Preferencialmente, o termo “semiquantitativo” significa uma estimativa do nível de enzima ativa, ou seja, um nível “baixo”, “aceitável” ou “alto” de enzima ativa. Ele, porém, não exclui uma determinação quantitativa precisa de unidades. Isto poderia, por exemplo, ser obtido pela presença de mais locais de captura distintos nas regiões de captura ou pela medição ou observação da intensidade de uma formação de cor ou pela medição ou observação de uma alteração de cor.
[34] As vantagens adicionais da presente invenção são mencionadas no presente documento.
ASPECTOS GERAIS
[35] Em um aspecto, o dispositivo de ensaio compreende uma ‘região de colocação’ onde uma amostra pode ser colocada. Preferencialmente, a amostra é uma amostra líquida. De preferência, a mesma é uma amostra de alimentos ou ração ou uma amostra compreendendo um componente de alimento ou ração. A matriz encontra-se operacionalmente ligada à região de colocação de tal forma que a amostra pode migrar da região de colocação ao longo da matriz. Preferencialmente, a matriz é um material tal como a nitrocelulose.
[36] A matriz do dispositivo de ensaio do presente pedido compreende, pelo menos, um local de captura distinto, que é posicionado longe da região de colocação da amostra. A amostra pode migrar através do local de captura. Preferencialmente, pelo menos dois locais de captura são utilizados. Preferencialmente, pelo menos três locais de captura são utilizados. Preferencialmente, três locais de captura são utilizados.
[37] Em cada local de captura no dispositivo de ensaio da presente invenção, os meios de captura estão presentes. Os meios de captura são capazes de se ligar à enzima a ser detectada pelo dispositivo de ensaio.Pelo menos uma amostra de enzima é retida em pelo menos um local de captura. Os meios de captura são preferencialmente anticorpos e de modo mais preferencial os meios de captura são anticorpos que se ligam à enzima. Os anticorpos podem ser criados contra a enzima per se, ou contra um componente desta (por exemplo, um fragmento desta e/ou um epítopo desta).
[38] Os meios de indicação seletiva são utilizados no dispositivo de ensaio da presente invenção para fornecer a indicação seletiva da presença da enzima ativa ligada aos meios de captura. Preferencialmente, a indicação seletiva compreende uma reação de precipitação e/ou proporciona uma alteração mensurável no comprimento de onda visível ou UV, que ocorre após a formação do produto. A alteração de cor pode ser causada pela reação de um substrato com a enzima. A reação com um substrato indica que a enzima está ativa e não apenas presente em uma forma inativa ou desnaturada.
[39] Preferencialmente, uma mudança de cor visível significa uma mudança de cor que pode ser observada a olho nu ou utilizando um leitor mecânico e/ou leitor eletrônico.
[40] Todos ou, pelo menos, alguns componentes dos meios de indicação seletiva estão presentes no dispositivo de ensaio. Para alguns exemplos de realização todos os meios de indicação seletiva estão presentes no e/ou sobre o dispositivo de ensaio. Em outros exemplos de realização, o dispositivo de ensaio é composto por pelo menos um dos componentes dos meios de indicação seletiva e o dispositivo é fornecido com (por exemplo, como um kit) com o(s) outro(s) componente(s) dos meios de indicação seletiva. Assim, no uso, o utilizador tem todos os componentes requeridos dos meios de indicação seletiva para utilizar o dispositivo de ensaio para a enzima ativa.
[41] A presente invenção é vantajosa, uma vez que proporciona um novo e simples ensaio que pode ser usado para detectar enzima ativa. Isso é particularmente útil nas indústrias de bioetanol, detergente, alimentos e rações onde as enzimas podem ser detectadas quando presentes utilizando ensaios disponíveis atualmente, mas seriam inacessíveis - por exemplo, devido à inativação causada pelo calor ou tratamento químico. Além disso, os ensaios e métodos da invenção podem ser úteis para determinar se uma enzima ativa adicional de um aditivo alimentar ou de ração é necessária. Este método também poderia ser usado para o controle de qualidade de um produto, tal como um produto alimentar ou ração.
[42] Outro aspecto da invenção é que ela fornece um método para determinar de maneira semiquantitativa a quantidade de enzima ativa em uma amostra. Preferencialmente, esta abordagem semiquantitativa é relativa ao número de regiões de captura que indicam a presença da enzima ligada.
[43] Um aspecto adicional da presente invenção é que ela proporciona um método de determinação dos níveis de enzima ativa em um alimento ou ração, e um método para determinar se uma enzima adicional ou um aditivo alimentar ou de ração é necessário. Este método também poderia ser usado para o controle de qualidade de um produto, tal como um produto alimentar ou ração.
[44] A presente invenção pode ser apresentada sob a forma de um kit. Tal kit irá permitir o operador realizar o ensaio preferencialmente fora do laboratório. O kit pode fornecer todos os reagentes necessários para realizar o ensaio. Todos ou alguns destes reagentes podem estar na forma seca.
[45] Preferencialmente, a enzima ativa detectada pelo ensaio ou dispositivo de ensaio da presente invenção é uma fosfatase ou glicosídeo hidrolase, de preferência uma fosfatase ácida, uma fitase, uma xilanase, uma amilase, ou uma β-glicanase.
[46] Em um aspecto mais preferido, a enzima ativa detectada pelo dispositivo de ensaio ou ensaio da presente invenção é uma fosfatase, de preferência uma fosfatase ácida, mais preferencialmente uma fitase.
[47] O termo “fitase” significa uma proteína ou polipeptídeo que é capaz de catalisar a hidrólise de ésteres de ácido fosfórico, incluindo fitato/ ácido fítico, e a liberação de fosfato inorgânico. Algumas fitases, além do fitato, são capazes de hidrolisar pelo menos alguns dos fosfatos de inositol de graus intermediários de fosforilação.
[48] A fração polissacarídeo não amiláceo (NSP) de alguns cereais, tais como trigo e cevada aumentam a viscosidade no intestino, o que compromete a difusão de nutrientes. Este efeito antinutricional pode ser reduzido pela adição de xilanase e/ou beta-glicanase, que fragmenta polímeros de hemicelulose, xilano e beta-glicano, respectivamente.
[49] As alfa-amilases, entre outros suplementos, são adicionadas à ração para melhorar a utilização do amido da ração.
[50] As enzimas fitase, como, por exemplo, a 6-fitase BP17 derivada de Buttiauxella sp., são adicionadas à ração para aumentar a disponibilidade de fosfato, aumentando assim o valor nutricional do produto. O processamento dos alimentos, por exemplo, sob calor e pressão elevada, podem desnaturar a fitase e reduzir a sua atividade. A presente invenção provê um ensaio semiquantitativo que pode especificamente dar uma indicação dos níveis de pós-processamento da atividade fitase presente no alimento.
[51] Em um aspecto altamente preferido, a enzima ativa detectada pela presente invenção é uma fitase, mais em particular, uma 6-fitase.
[52] Em um aspecto altamente preferido, a enzima ativa a ser detectada é a BP17. A BP17 é uma enzima variante de uma fitase de Buttiauxella sp. A sequência para BP17 (com exceção do peptídeo sinal) é a seguinte:NDTPASGYQVEKWILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSI YVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNT TLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNV YFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFER LADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRWSQSVEPGCQLQ
[53] Em um exemplo de realização, a enzima ativa a ser detectada é a BP11. A BP11 é uma enzima variante de uma fitase de Buttiauxella sp. A BP11 é usada na produção de bioetanol. A sequência para BP11 (com exceção do peptídeo sinal) é a seguinte: NDTPASGYQVEKWILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPNTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILSQGSCPTPNSI YVWTDVDQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQHYIPSLALMNT TLNFSKSPWCQKHSADKSCDLGLSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQAAWGNIHSEQEWALLLKLHNV YFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFER LADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPAGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRWSQSVEPGCQLQ
[54] Em outro exemplo de realização, a enzima ativa a ser detectada é a BP111. A BP111 é uma enzima variante de uma fitase de Buttiauxella sp. A BP111 é usada na produção de bioetanol. A sequência para a BP111 (com exceção do peptídeo sinal) é a seguinte: NDTPASGYQVEKWILSRHGVRAPTKMTQTMRDVTPYTWPEWPVKLGYITPRGEHLISLMGGFYRQKFQQQGILPRGSCPTPNSI YVWTDVAQRTLKTGEAFLAGLAPQCGLTIHHQQNLEKADPLFHPVKAGICSMDKTQVQQAVEKEAQTPIDNLNQRYIPELALMNT ILNFSKSPWCQKHSADKPCDLALSMPSKLSIKDNGNEVSLDGAIGLSSTLAEIFLLEYAQGMPQVAWGNIHSEQEWALLLKLHNV YFDLMERTPYIARHKGTPLLQAISNALNPNATESKLPDISPDNKILFIAGHDTNIANIAGMLNMRWTLPGQPDNTPPGGALVFER LADKSGKQYVSVSMVYQTLEQLRSQTPLSLNQPPGSVQLKIPGCNDQTAEGYCPLSTFTRWSQSVEPGCQLQ
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[55] A presente invenção será descrito pela referência às seguintes Figuras: Figura 1 - apresenta dois diagramas; Figura 2 - apresenta um diagrama (Formato 1: Captura de Enzimas e Ensaio de Precipitação do Substrato); Figura 3 - apresenta uma série de fotografias (etapas envolvidas no Formato Semi-Seco); Figura 4 - apresenta uma fotografia (Resultados de uma diluição seriada de fitase BP17 utilizando o formato semi-seco); Figura 5 - apresenta um diagrama (Formato 2: Ensaio Sanduíche com Anticorpo Conjugado com Ouro); Figura 6 - apresenta uma série de fotografias (Um exemplo de um ensaio no formato Seco); Figura 7 - apresenta uma série de fotografias (Resultados de amostras preparadas em tampão acetato, água MilliQ e água de torneira); Figura 8 - apresenta uma série de fotografias (Amostragem em diferentes intervalos de tempo); Figura 9 - apresenta uma série de fotografias (SDS-PAGE e Western blot de amostras de alimentos e fitase BP17 purificada); Figura 10 - apresenta uma série de fotografias (Comparação do formato Sanduíche-Ouro e o formato da atividade da enzima pela Precipitação de Substrato utilizando um inibidor MIHS específico para BP17); Figura 11 - apresenta um diagrama e uma fotografia (Representação esquemática do Formato de Fluxo Passante ); Figura 12 - apresenta um diagrama (Representação Esquemática do Formato Dip Stick (bastão de imersão)); Figura 13 - apresenta uma fotografia (Resultados dos ensaios no formato Dip-stick); Figura 14 - apresenta um diagrama (Representação Esquemática do Formato Wicking Stick (bastão de absorção)); Figura 15 - apresenta uma série de fotografias (Resultados do ensaio no Formato Wicking Stick); Figura 16 - apresenta uma série de fotografias (Resultados do ensaio no Formato Wicking Stick usando diferentes agentes bloqueadores); Figura 17 - apresenta uma série de fotografias (Variando a concentração da linha teste para modular a natureza semiquantitativa do ensaio. Formato Wicking Stick); Figura 18 - apresenta uma série de fotografias (Comparação entre NBT e INT usando o Formato Wicking Stick); Figura 19 - apresenta uma série de fotografias (Avaliação de uma vasta gama de tipos de nitrocelulose a fim de determinar a mais apropriada); Figura 20 - apresenta uma fotografia (Ensaio de redução da concentração do agente bloqueador de caseína na presença de tensoativo (Tween-20)); Figura 21 - apresenta uma série de fotografias (Adição dos reagentes de bloqueio diretamente na nitrocelulose para testar se resultados satisfatórios poderiam ser obtidos); Figura 22 - apresenta uma série de fotografias (Uma diluição seriada de concentrações de fitase BP17 testada com NC bloqueada e tensoativo sozinho com os substratos INT e NBT para testar a sensibilidade deste método). Figura 23 - apresenta uma série de fotografias (Avaliação da secagem e armazenamento de vários componentes do substrato misturados entre si); Figura 24 - apresenta uma série de fotografias (Uma comparação entre o formato semi-seco e o formato Totalmente em Solução); Figura 25 - apresenta uma série de fotografias (Avaliação periódica de soluções para a atividade sugere que a solução de tetrazólio tem boa estabilidade); Figura 26 - apresenta uma fotografia de soluções de avaliação para a atividade de xilanase; Figura 27 - apresenta uma fotografia de soluções de avaliação para a atividade de xilanase; Figura 28 - apresenta um diagrama esquemático para a avaliação da atividade de xilanase ativa; Figura 29 - apresenta uma série de diagramas esquemáticos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[56] A presente invenção fornece um dispositivo para a detecção de uma enzima ativa. O dispositivo pode ser usado no laboratório e também fora do laboratório em diversos campos.
[57] A presente invenção provê um dispositivo de ensaio (1) para detecção de uma enzima ativa em uma amostra. O dispositivo de ensaio (1) compreende os seguintes componentes: (a) uma região de colocação (10) sobre a qual a amostra pode ser colocada, (b) uma matriz (20) operacionalmente conectada à referida região de colocação (10) de modo a que a amostra, quando presente (por exemplo, colocada) sobre a referida região de colocação (10) pode migrar ao longo da referida matriz (20); (c) pelo menos um local de captura distinto (30) sobre a referida matriz (20), em que cada local de captura distinto (30) é levado para longe da região de colocação (10), e em que a amostra pode migrar para longe do referido local de captura distinto (30), (d) meios de captura (40) estão presentes, ou definem cada local de captura distinto (30), em que os referidos meios de captura (40) são capazes de ligar à referida enzima de modo que pelo menos uma porção da referida amostra da referida enzima é retida em pelo menos um local de captura distinto (30), e (e) meios de indicação seletiva (50) ou pelo menos um componente deste para fornecer uma indicação seletiva da presença da enzima ativa ligada aos referidos meios de captura (40).
[58] A detecção da presença de uma enzima ativa, bem como a quantidade de tal enzima, é de particular importância no campo da alimentação humana e animal. A ausência da enzima ativa pode potencialmente levar a deficiências de nutrientes e minerais em seres humanos e animais que ingerem o alimento ou ração. A capacidade para detectar a presença de uma enzima pode não igualar a capacidade de detectar a presença da enzima ativa utilizando métodos existentes.
[59] Como um exemplo particular, o fitato é a principal forma de armazenamento de fósforo em cereais e leguminosas. No entanto, os animais monogástricos, tais como suínos, aves e peixes, não são capazes de metabolizar ou absorver o fitato (ou ácido fítico) que, portanto, é excretado, levando a poluição por fósforo em áreas de intensa produção pecuária. Além disso, o ácido fítico também atua como um agente antinutricional em animais monogástricos por agentes quelantes de metais como o cálcio, cobre e zinco.
[60] Por meio da ação da fitase, o fitato é geralmente hidrolisado para formar fosfatos de inositol menores e fosfato inorgânico. As fitases são úteis como aditivos alimentares onde elas melhoraram a disponibilidade de fósforo orgânico para o animal e diminuem a poluição do meio ambiente pelo fosfato (Wodzinski RJ, Ullah AH. Adv Appl Microbiol. 42, 263-302 (1996)). No entanto, se a fitase contida em uma matéria-prima está inativa, esta não terá qualquer efeito sobre a hidrolisação da fitase, o que poderia levar à desnutrição em animais. Assim, a presente invenção permite que um operador tal como um detentor de animal, agricultor, veterinário, tratador de zoológico, produtor de aditivo alimentar, produtor de ração, cientista ou membro do público para testar uma ração possa ver se um dado produto contém a enzima ativa, como por exemplo, a fitase, e a quantidade de enzima ativa, tal como a fitase.
[61] A presente invenção também pode ser utilizada em um método de controle de qualidade para a preparação de rações ou alimentos ou produção de biocombustível ou composições de detergente para os quais uma enzima, tal como uma fosfatase ou uma glicosídeo hidrolase, de preferência uma fosfatase ácida, fitase, xilanase, uma amilase, ou uma β-glicanase, foi adicionada.
ENSAIOS E DISPOSITIVOS
[62] O termo “dispositivo de ensaio” tal como utilizado na presente invenção significa um dispositivo, conjunto de aparelhos ou equipamentos.
[63] Um dispositivo ou aparelho de ensaio compreendendo as caraterísticas listadas em (a) a (e) acima é mostrado na Figura 1.
[64] Com referência à Figura 1, o dispositivo de ensaio (1) da presente invenção é mostrado como dois exemplos de realização - apresentados na Figura 1(a) (exemplo de realização 1) e na Figura 1 (b) (exemplo de realização 2).
[65] Em ambos os exemplos de realização, o dispositivo de ensaio (1) compreende uma região de colocação (10) operacionalmente conectada a uma matriz (20). Pelo menos um local de captura distinto (30) está presente sobre a matriz (20). Meios de captura (40) estão presentes ou definem cada local de captura distinto (30). Em uso, o operador coloca a amostra sobre a região de colocação (10) e a amostra migra ao longo da matriz (20) na direção indicada pelas setas. No exemplo de realização 1, os meios de indicação seletiva (50) (não mostrado), ou pelo menos um componente do mesmo (não mostrado), são adicionados a, ou estão constituídas no local de captura (30). Em um aspecto, os meios de indicação seletiva compreendem um reagente (espécies reativas) que pode gerar uma alteração de cor observável quando a enzima ativa reage com um substrato. Nesse aspecto, o reagente pode ser fornecido na forma líquida para o dispositivo em uso.
[66] O exemplo de realização 2 do dispositivo de ensaio (1) funciona da mesma maneira como no exemplo de realização 1. No entanto, neste caso, o dispositivo de ensaio (1) consiste de duas metades opostas (2) e (3) que são unidas pela seção de dobragem ou linha de dobragem (70). A região de colocação da amostra (10), operacionalmente conectada à matriz (20) é colocada em uma metade (2) do dispositivo. O(s) local(ais) de captura (30) e meios de captura (40) são colocados sobre a matriz (20). A mesma metade ou a metade oposta (3) do dispositivo compreende os meios de indicação seletiva ou, pelo menos, um componente destes, e a metade oposta (3) compreende opcionalmente uma almofada absorvente para absorver o excesso de amostra (60).
[67] Os meios de indicação seletiva (50), ou pelo menos um componente dos mesmos, no exemplo de realização 2 é colocado em contato com a matriz (20) e os meios de captura (40), quando o operador dobra a linha de dobragem (70). O operador pode precisar adicionar os meios de indicação seletiva (50) ou algum(alguns) componente(s) dos meios de indicação seletiva (50) ao dispositivo na forma líquida. Alternativamente, os meios de indicação seletiva ou, pelo menos, alguns componentes dos meios de indicação seletiva podem estar presentes na forma seca, na posição (90).
[68] Opcionalmente preferido, o exemplo de realização 2 compreende uma janela de visualização (80) que permite que o operador visualize o resultado do dispositivo de ensaio (em outras palavras, visualize os locais de captura), uma vez que as duas metades (2) e (3) do dispositivo estejam fechadas. A janela de visualização (80) pode ser feita de um material plástico, ou pode ser uma abertura.
[69] No exemplo de realização 2, uma das metades (2, 3) pode ser feita de materiais plásticos ou materiais de cartão, suficientemente rígidos para fornecer suporte.
[70] Conforme mencionado, o dispositivo de ensaio (1) compreende uma ‘região de colocação’ onde uma amostra pode ser colocada. Preferencialmente, a amostra é uma amostra líquida. A matriz (20) encontra-se operacionalmente ligada à região de colocação (10) de tal forma que a amostra pode migrar da região de colocação (10) ao longo da matriz (20). Preferencialmente, a matriz (20) é um material que permite que a amostra migre, tal como a nitrocelulose. A matriz (20) do dispositivo de ensaio (1) do presente pedido compreende pelo menos um local de captura distinto (30), que é posicionado longe da região de colocação (10) da amostra. A amostra pode migrar através do local de captura (30). Preferencialmente, três locais de captura (30) são utilizados. Em cada local de captura (30) no dispositivo de ensaio (1) da presente invenção, os meios de captura (40) estão presentes. Os meios de captura (40) são capazes de se ligar à enzima a ser detectada pelo dispositivo de ensaio (1). Pelo menos uma amostra de enzima é retida em pelo menos um local de captura (30). Os meios de captura (40) são preferencialmente anticorpos e de modo mais preferencial os meios de captura (40) são anticorpos que se ligam à enzima. Os anticorpos podem ser criados contra a enzima per se, ou contra um componente desta (por exemplo, um fragmento desta e/ou um epítopo desta).
[71] Os meios de indicação seletiva (50) são utilizados no dispositivo de ensaio (1) da presente invenção para fornecer a indicação seletiva da presença da enzima ativa ligada aos meios de captura (40). Preferencialmente, os meios de indicação seletiva, ou pelo menos um componente dos mesmos, se encontra na posição (90) na metade oposta do dispositivo de ensaio (1) em comparação com a matriz (20). Preferencialmente, os meios de indicação seletiva (50) compreendem uma reação de precipitação e/ou proporcionam uma alteração de cor visível. A alteração de cor pode ser causada pela reação de um substrato com a enzima. A reação com um substrato indica que a enzima está ativa e não apenas presente em uma forma inativa ou desnaturada.
[72] Em um aspecto preferido, o dispositivo é semiquantitativo - no sentido em que a quantidade de enzima ativa (quantidade de analito) é indicada pelo número de locais de captura (30) no dispositivo que apresentam uma alteração de cor e/ou alteração de intensidade de cor no(s) local(s) de captura se os meios de indicação seletiva gerarem uma alteração de cor quando a enzima ativa estiver presente.
[73] O dispositivo de ensaio (1) da presente invenção compreende preferencialmente diversas regiões que estão operacionalmente ligadas. As regiões incluem preferencialmente uma região de colocação (10). Mais preferivelmente, o dispositivo de ensaio (1) da presente invenção é um dispositivo de fluxo lateral.
[74] O dispositivo de ensaio (1) da presente invenção pode opcionalmente compreender uma “região indicadora” ou “linha indicadora” (91) que indica se o dispositivo de ensaio funcionou corretamente. Preferencialmente, a região ou linha indicadora indica que ensaio funcionou através de uma cor ou alteração de cor. A região ou linha indicadora opcional pode compreender anticorpos. Estes anticorpos podem ser criados contra uma enzima per se, ou contra um componente desta (por exemplo, um fragmento e/ou um epítopo desta), em que a referida enzima está relacionada com a enzima ativa a ser detectada. Adicionalmente, ou alternativamente, a linha indicadora pode compreender uma enzima relacionada ou não, que pode reagir com pelo menos alguns dos componentes do substrato. Em um exemplo de realização da invenção, o dispositivo e o ensaio são utilizados para detectar a enzima fitase ativa. Em tal caso, a enzima relacionada ou não relacionada na linha indicadora pode ser uma enzima possuindo atividade de fosfatase. A título de exemplo, a linha indicadora pode compreender uma enzima relacionada ou a mesma enzima, como aquela a ser detectada, por exemplo, a linha indicadora pode compreender uma fitase BP17 em um ensaio para a detecção de fitase BP17. Como um exemplo adicional, a linha indicadora pode compreender uma enzima e um anticorpo, em que o anticorpo pode ser específico para a enzima da linha indicadora ou outra enzima.
[75] Um “ensaio” é a análise da composição química ou a força de uma substância. Isto pode incluir a detecção de um componente específico em uma mistura. O dispositivo de ensaio (1) é usado para realizar o ensaio da invenção, que é a de detectar uma enzima ativa.
[76] Os termos “imunoensaio” e “ensaio” são utilizados de maneira indiferente neste pedido de patente, em que o termo “ensaio” pode abranger um “imunoensaio”. Um imunoensaio é uma forma especifica de ensaio que usa a ligação entre um antígeno e seu anticorpo para identificar uma substância em uma amostra a específica.
[77] O dispositivo de ensaio pode compreender, de preferência, um reagente de bloqueio, ou um reagente de bloqueio pode ser adicionado ao dispositivo.
[78] O termo “reagente de bloqueio” refere-se a um agente que modula a interação da enzima ativa a ser detectada (ou seja, dos analitos) com os meios de captura, de preferência quando os meios de captura compreendem anticorpos. O reagente de bloqueio permite o movimento da amostra ao longo da matriz do dispositivo de modo a que toda a amostra não é bloqueada pelos primeiros meios de captura. O reagente de bloqueio pode ser, ou pode compreender um tensoativo. Exemplos de reagentes de bloqueio ou componentes de reagentes de bloqueio apropriados incluem caseína e Dehquart CC6.
[79] A matriz (20) pode compreender o reagente de bloqueio. Alternativamente, o reagente de bloqueio ou um componente do mesmo pode ser adicionado ao dispositivo. O reagente de bloqueio pode ser adicionado sobre ou próximo, ou mesmo distante dos componentes (30) do dispositivo de ensaio. O reagente de bloqueio pode estar ligado à matriz (20), ou ser aplicado sobre uma almofada na matriz (20). O agente de bloqueio pode estar na forma seca e/ou forma desidratada.
ENZIMAS
[80] O termo “enzima”, conforme utilizado na presente invenção refere-se a uma proteína que catalisa as reações químicas de outras substâncias sem que ela própria seja destruída ou alterada após a conclusão das reações.
[81] A enzima detectada pela presente invenção pode ser uma enzima do tipo selvagem, que é uma enzima presente na natureza, ou uma enzima variante. “Variante” é uma enzima que tem uma sequência de aminoácidos que possui uma ou diversas inserções, deleções e/ou substituições, em comparação com a sequência original a partir da qual a variante é derivada, tal como uma enzima tipo selvagem ou mesmo outra enzima variante, e que mantém uma propriedade funcional e/ou aumenta uma propriedade funcional, por exemplo, uma atividade aumentada da enzima. Conforme utilizado no presente, o termo “sequência de aminoácidos” é sinônimo do termo “polipeptídeo” e/ou “proteína”.
[82] O termo “enzima ativa” conforme utilizado no presente refere-se a uma enzima que mantém a sua função catalítica. Por exemplo, a fitase é capaz de catalisar a hidrólise de ésteres de ácido fosfórico.
[83] O termo “enzima inativa” refere-se à enzima que está presente em uma amostra, mas é incapaz de realizar a sua função catalítica. A inativação pode ocorrer devido a desnaturação da enzima causada pelo tratamento térmico ou tratamento químico ou tratamento ou processamento por outra enzima tal como a proteólise por uma protease ou desglicosilação por uma glicosidase. A inativação também pode ser devido a um inibidor químico. No caso em que a enzima é a fitase, por exemplo, a fitase BP17, um inibidor que pode ser usado é o Hexasulfato de mio-inositol (MIHS).
[84] Exemplos de enzimas detectadas pela presente invenção incluem fosfatases e glicosídeo hidrolases.
[85] As fosfatases ou hidrolases de monoéster fosfórico (EC 3.1.3) são enzimas capazes de libertar grupos fosfato de seu substrato. As fosfatases úteis incluem, mas não estão limitadas a, fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1), fosfatase acídica/ácida (EC3.1.3.2), 3-fitase (EC 3.1.3.8) ou 6-fitase (EC 3.1.3.26). Preferencialmente, a enzima detectada pelo dispositivo de ensaio da presente invenção é uma fitase. Preferencialmente a enzima é 6-fitase e mais preferivelmente a enzima é 6-fitase (BP17) derivada de Buttiauxella sp.
[86] A 6-fitase é também denominada de “4-fitasse” ou “fitato 6- fosfatase”. Fitases adicionais incluem as fitases de histidina ácida (HAP), que é um grupo que compreende os membros encontrados entre os procariotos (por exemplo, fitase Appa de Escherichia coli) e eucariotos (phyA e B de Aspergillus sp., fitases HAP de levedura e de plantas. As fitases HAP compartilham um motivo de sítio ativo comum, RHGXRXP, na extremidade N-terminal e um motivo HD na extremidade C-terminal em suas sequências de DNA. Isto permite um mecanismo de duas etapas na hidrólise de fosfomonoésteres. A phyA e phyB de A. niger e a appA de E. coli são os representantes que foram mais caracterizados.
[87] Em um aspecto preferido, a enzima é uma fitase e a atividade da enzima ativa é determinada pela redução de uma espécie reativa - por exemplo, um sal de tetrazólio - para produzir um efeito visualmente observável, tal como um precipitado visualmente observável que pode ser colorido. O dispositivo é semiquantitativo e a quantidade de analito é indicada pelo número de locais de captura (30) do dispositivo que apresentam uma alteração de cor devido ao precipitado. A redução de tetrazólio que produz a cor é, em essência, uma medida indireta da ação da enzima fosfatase sobre seu próprio substrato. A este respeito, é gerado um agente redutor ou porção reativa, que em seguida age sobre o tetrazólio para gerar o corante formazano.
[88] Em um exemplo de realização a enzima detectada pela presente invenção é uma 6-fitasse, por exemplo, de Buttiauxella sp. Trichoderma reesei, E. coli, Aspergillus niger, Citrobater braakii, Citrobater freundii, Peniphora lycii ou Penicillium funiculosum.
[89] Em um exemplo de realização, a fitase é uma fitase derivada de Citrobater, por exemplo, Citrobater freundii, de preferência C. freundii NCIMB 41247 e as suas variantes, por exemplo, conforme divulgado no documento W02006/038062 (incorporado ao presente pela referência) e W02006/038128 (incorporado ao presente pela referência), Citrobater braakii YH-15, tal como o descrito no documento WO 2004/085638, Citrobater braakii ATCC 51113 como descrito no documento W02006/037328 (incorporado ao presente pela referência), bem como suas variantes, por exemplo, conforme divulgado no W02007/112739 (incorporado ao presente pela referência) e W02011/117396 (incorporado ao presente pela referência), Citrobater amalonaticus, preferencialmente Citrobater amalonaticus ATCC 25405 ou Citrobater amalonaticus ATCC 25407, como divulgado no W02006037327 (incorporado ao presente pela referência), Citrobater gillenii, preferencialmente o Citrobater gillenii DSM 13694 conforme divulgado no documento W02006037327 (incorporado ao presente pela referência), ou Citrobater intermedius, Citrobater koseri, Citrobater murliniae, Citrobater rodentium, Citrobater sedlakii, Citrobater werkmanii, Citrobater youngae, polipeptídeos das espécies Citrobater ou variantes dos mesmos.
[90] Em um exemplo de realização a fitase pode ser uma fitase de Citrobater, por exemplo, a partir da Citrobater freundii, como a(s) enzima(s) fitase ensinadas na publicação W02006/038128, cuja referência é incorporada ao presente pela referência.
[91] Em alguns exemplos de realizações preferidos, a fitase é preferencialmente uma fitase de E. coli comercializada sob o nome Phyzyme XPTM pela DuPont Nutrition Biosciences ApS.
[92] Alternativamente, a fitase pode ser uma fitase de Buttiauxella, por exemplo, uma fitase de Buttiauxella agrestis, por exemplo, as enzimas fitases ensinadas nos documentos WO 2006/043178, WO 2008/097619, WO 009/129489, WO 2008/092901 e WO010/122532 todos os quais são incorporados ao presente pela referência.
[93] Em um exemplo de realização a fitase pode ser uma fitase de Hafnia, por exemplo, a partir da Hafnia alvei, como a(s) enzima(s) fitase ensinadas na publicação US2008263688, cuja referência é incorporada ao presente pela referência.
[94] Em um exemplo de realização a fitase pode ser uma fitase de Aspergillus, por exemplo, a partir do Apergillus orzyae.
[95] Em um exemplo de realização a fitase pode ser uma fitase de Penicillium, por exemplo, a partir do Penicillium funiculosum.
[96] Deve se compreender que, tal como utilizado no presente, 1 FTU (unidade de fitase) é definida como a quantidade de enzima necessária para libertar 1 μmol de ortofosfato inorgânico a partir de um substrato em um minuto sob as condições de reação definidas no ensaio de fitase ISO 2009 - Um ensaio padrão para a determinação da atividade da fitase e 1 FTU pode ser encontrado na norma internacional ISO/DIS 30024: 1-17, 2009.
[97] Alternativamente, conforme utilizado no presente, uma unidade de fitase (FTU) é definida como a quantidade de enzima que liberta 1 micromole de fósforo inorgânico/min a partir de 0,00015 mol/L de fitato de sódio em pH 5,5 a 37 °C (Denbow, L.M., Ravindran, V., Kornegay, E.T., Yi, Z, e Hulet, R.M. 1995. Improving phosphorus availability in soybean meal for broilers by supplemental phytase. Poult. Sci. 74:1831-1842).
[98] Em um exemplo de realização a enzima é adequadamente classificada usando a classificação EC acima, e a classificação EC designa uma enzima possuindo atividade quando testada no ensaio ensinado na presente invenção para determinação de 1 FTU.
[99] Outro grupo de enzimas que podem ser detectadas pelo dispositivo de ensaio e método da presente invenção é o grupo das glicosídeo- hidrolases (EC 3.2.1), ou seja, enzimas que hidrolisam compostos O- e S-glicosil. Outra propriedade comum deste grupo de enzimas é que elas liberam, por exemplo, um fragmento ou produto possuindo um grupo terminal redutor (contendo um grupo aldeído). Exemplos deste grupo inclui xilanases, tais como endo-1,4-β-xilanase (EC 3.2.1.8) e xilano endo-1,3-β-xilosidase (EC 3.2.1.32), preferencialmente xilano 1,4-beta- xilosidase (EC 3.2.1.37); a-amilase (EC 3.2.1.1), β-amilase (EC 3.2.1.2); oligo-1 ,6-glicosidase (EC 3.2.1.10); glicano-1,4- alfa-glicosidase (EC 3.2.1.3); pululanase (EC 3.2.1.41); celulase (EC 3.2.1.4); endo-1,3(4)-beta-glicanase (EC 3.2.1.6), ou glicano-endo-1,3-beta-D-glicosidase (EC 3.2.1.39).
[100] A xilanase é o nome dado a uma classe de enzimas que degradam o polissacarídeo linear beta-1,4-xilano em xilose, quebrando assim as hemiceluloses, um dos principais componentes da parede celular de plantas.
[101] A xilanase para uso na presente invenção pode ser qualquer xilanase comercialmente disponível.
[102] Adequadamente, a xilanase pode ser uma endo-1,4-β-D- xilanase (classificada como EC 3.2.1.8) ou uma 1,4 β-xilosidase (classificada como EC 3.2.1.37).
[103] Em um exemplo de realização, preferencialmente a xilanase é uma endoxilanase, por exemplo, uma endo-1,4-β-D-xilanase. A classificação de uma endo-1,4-β-D-xilanase é EC 3.2.1.8.
[104] As amilases também podem ser detectadas pelo dispositivo de ensaio e método da presente invenção.
[105] A amilase é o nome dado a um grupo de enzimas capazes de hidrolisar o amido em oligossacarídeos de cadeia mais curta, tal como a maltose. A porção glicose pode então ser mais facilmente transferida a partir de maltose para um monoglicerídeo ou glicosilmonoglicerídeo do que a partir da molécula de amido original.
[106] O termo amilase inclui uma α-amilases (EC 3.2.1.1), amilases formadoras de G4 (EC 3.2.1.60), β-amilases (EC 3.2.1.2) e Y—amilases (EC 3.2.1.3).
[107] Em um exemplo de realização, a amilase é preferencialmente uma α-amilase. As α-amilases são classificadas como (EC 3.2.1.1).
[108] Preferencialmente o substrato é um substrato de fosfatase alcalina e mais preferencialmente o substrato da fosfatase é o ácido 2-fosfo-L-ascórbico trisódico (ASAP).
AMOSTRA
[109] O termo “amostra”, conforme utilizado no presente, significa uma amostra ou extração da substância ou composição coletada para análise para determinar se uma enzima ativa está presente.
[110] A amostra é preferencialmente um líquido. A amostra é preferencialmente obtida pela colocação, dissolução, liquefação ou trituração da substância ou composição a ser analisada em um solvente, tal como a água. Preferencialmente, a amostra é uma amostra aquosa. Pode ser usada a água da torneira ou água purificada e deionizada tal como uma água MilliQ ou outra solução aquosa adequada. Prevê-se que, para preparar a amostra alguma forma de extração pode ser necessária para permitir que a substância ou composição a ser analisada se misture, quebrar e/ou dissolva com o solvente. Por exemplo, a agitação pode ser usada.
[111] Prevê-se que um kit será produzido para quer o operador encha um recipiente de extração de amostra (por exemplo, um tubo, saco ou vasilha plástica) até um nível pré-determinado (marcada por uma linha no recipiente) com o alimento ou ração ou biocombustível ou composição detergente e, em seguida, o operador deve encher o tubo até uma segunda linha com a água, tal como água de torneira, água purificada ou deionizada. Subsequentemente, o recipiente de extração é de preferência agitado. Isto permitirá o operador fazer a amostra de maneira uniforme.
[112] A amostra da presente invenção pode ser derivada, extraída ou feita a partir de um alimento ou ração, ou a partir de uma composição de alimento ou ração, ou a partir de um detergente, ou a partir de uma composição de detergente, ou a partir de etanol ou produção de biocombustível. Aqui, o termo “alimento” é usado em um sentido amplo - e abrange alimentos para consumo humano, bem como alimentos para animais (ou seja, uma ração). Em um aspecto preferido, o alimento é para o consumo humano. Em outro aspecto preferido, o alimento é um alimento não humano (ração) usado apenas para animais.
[113] O alimento ou ração pode estar na forma de uma solução ou suspensão semifluida; ou como um sólido, tal como um pellet - dependendo da utilização e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.
[114] Os termos “alimento” e “ração” também podem se referir a um ingrediente alimentar. A amostra da presente invenção pode ser derivada, extraída ou feita a partir de um ingrediente alimentar.
[115] Conforme utilizado no presente o termo “ingrediente alimentar ou de ração” inclui uma formulação que é, ou pode ser adicionada aos alimentos funcionais ou produtos alimentares como um suplemento nutricional e/ou suplemento de fibras. O termo “alimento ou ingrediente alimentar”, conforme utilizado na presente invenção refere-se também a formulações que podem ser usadas a níveis baixos em uma grande variedade de produtos para conferir efeitos funcionais benéficos relevantes para a alimentação ou produto alimentar particular desejado, incluindo, mas não se limitando a gelificação, texturização, estabilização, emulsificação, suspensão, formação de película e estruturação, retenção de suculência e sabor melhorado, sem adição de viscosidade.
[116] Em um exemplo de realização adicional, “alimento ou ingrediente alimentar” inclui alimentos intermediários tais como composições para melhorar pão ou massas antes do cozimento. Na área de aplicação de padaria, enzimas são tipicamente adicionadas às composições da massa de pão antes dp cozimento, e em exemplos de realização preferidos, a desnaturação das enzimas durante o processo de cozimento abole ainda mais a atividade da enzima. Portanto, o ensaio enzimático da presente invenção deve ser realizado na massa ou composição de ingrediente da massa antes do cozimento. Em outro exemplo de realização, a presente invenção pode ser utilizada em composições de alimentos lácteos contendo componentes de cereais, preferencialmente aveia, centeio, arroz, trigo, farelo de trigo, ou derivados processados dos mesmos. Preferencialmente, a referida composição de alimentos lácteos é um iogurte, queijo ou bebida fermentada.
[117] O ingrediente alimentar pode estar na forma de uma solução ou suspensão semifluida; ou como um sólido, tal como um pellet - dependendo da utilização e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.
[118] Os termos “alimento” e “ração” também podem se referir a um aditivo alimentar. A amostra da presente invenção pode ser derivada, extraída ou feita a partir de um aditivo alimentar.
[119] Tal como utilizado na presente invenção, o termo “aditivo alimentar ou de ração” inclui formulações que melhoram a digestão dos alimentos e rações. Em particular, “aditivo de alimentos ou de ração” refere-se às fitases que podem ser utilizadas para melhorar a digestão de fosfato em alimentos e rações.
[120] O aditivo alimentar ou de ração pode estar na forma de uma solução ou suspensão semifluida; ou como um sólido, tal como um pellet - dependendo da utilização e/ou do modo de aplicação e/ou do modo de administração.
[121] A composição alimentar e/ou aditivo alimentar podem compreender um ou mais material alimentar selecionado a partir do grupo que compreende: a) cereais, tais como de grãos pequenos (por exemplo, trigo, cevada, centeio, aveia e combinações destes) e/ou de grãos grandes, tal como o milho ou sorgo; b) produtos à base de cereais, como a farinha de glúten de milho, Grãos de Destilação Secos com Solúveis (DDGS) (particularmente Grãos de Destilação Secos com Solúveis a base de milho - cDDGS), farelo de trigo, sêmea de trigo, farelo de trigo de segunda escolha (wheat shorts), farelo de arroz, casca de arroz, casca de aveia, semente de palma, e polpa cítrica; c) proteínas obtidas a partir de fontes como a soja, girassol, amendoim, tremoço, ervilhas, favas, algodão, canola, farinha de peixe, proteína de plasma seco, farinha de carne e osso, proteína de batata, soro de leite, copra e gergelim, d) óleos e gorduras obtidos a partir de fontes vegetais e animais; e) minerais e vitaminas.
[122] A presente invenção é útil para a detecção da enzima ativa na produção de biocombustíveis, tais como a produção de bioetanol.
ESTRUTURA DO DISPOSITIVO DE ENSAIO
[123] O dispositivo de ensaio (1) da presente invenção compreende uma região de colocação (10) da amostra. O termo “região de colocação”, é utilizado no presente para referir-se a uma região do dispositivo de ensaio (1) sobre a qual a amostra pode ser colocada. Preferencialmente, a região de colocação (10) é uma almofada absorvente. A região de colocação (10) está operacionalmente ligada a uma matriz (20). A região de colocação (10) pode ser contígua ou contínua com a matriz (20). A região de colocação (10) pode ser uma região integral da matriz (20). Preferencialmente, a região de colocação (10) está em uma extremidade da matriz (20). Opcionalmente uma almofada absorvente adicional está presente para absorver o excesso de amostra (60).
[124] No contexto da atual descrição “operacionalmente ligado” ou “operacionalmente conectado” significa que está unido, ligado entre si, ou em contato com, durante o funcionamento do dispositivo.
[125] Preferencialmente, a matriz (20) é ou compreende um material absorvente. Mais preferencialmente, a matriz (20) é ou compreende nitrocelulose. Por exemplo, a matriz (20) pode ser ou pode compreender nitrocelulose do tipo MDI 90 CNPH, MDI SS12 12 μ ou SS12 15 μ.
[126] Quando presente, ou colocado sobre a região da amostra (10), a amostra pode migrar ao longo da matriz (20). Preferencialmente, a migração é uma migração de líquidos, tal como pela ação capilar. Preferencialmente, a migração ocorre em uma direção longitudinal, e ainda mais preferencialmente ocorre quando o dispositivo de ensaio (1) é uma tira ou bastão. Preferencialmente, o bastão ou tira está contida em uma caixa.
[127] Um reagente de bloqueio pode ser adicionado ao dispositivo de ensaio. A matriz (20) pode compreender o reagente de bloqueio. O reagente de bloqueio pode estar ligado à matriz (20) e o agente de bloqueio pode estar em uma forma seca ou desidratada. Na presente invenção, o termo “ligado” inclui acoplado ou anexado. O reagente de bloqueio pode estar ligado direta ou indiretamente à matriz. O reagente de bloqueio pode ser qualquer reagente de bloqueio adequado. Um exemplo de um reagente de bloqueio é a caseína. O reagente de bloqueio pode ser, ou pode compreender um tensoativo. O reagente de bloqueio preferencialmente compreende um agente tensoativo. O reagente de bloqueio é, preferencialmente, um tensoativo não iônico e/ou um tensoativo zwiteriônico (anfôtero). Por exemplo, o tensoativo pode ser o Tween-20 ou Dehquart CC6.
[128] O dispositivo de ensaio (1) da presente invenção compreende pelo menos um local de captura distinto (30) na matriz (20). Cada local de captura (30) é distanciado para longe da região de colocação (10) e a amostra pode migrar através dos locais de captura distintos (30). “Distinto”, conforme utilizado no presente contexto, significa separado a partir dos outros locais de captura (30).
[129] O dispositivo de ensaio (1) da presente invenção pode compreender múltiplos locais de captura distintos (30), de preferência mais do que dois locais de captura distintos (30) e mais preferencialmente o dispositivo compreende três locais de captura distintos (30).
[130] O dispositivo de ensaio (1) pode possui duas ou mais regiões do local de captura, cada região compreendendo um ou mais locais de captura discretos (30). Por exemplo, quando se tem três regiões de locais de captura discretos, pode ser possível capturar pelo menos três tipos diferentes de enzimas, como, por exemplo, fitase, xilanase e amilase em uma amostra e uma medição.
[131] Em cada local de captura (30) existem meios de captura (40). Os meios de captura (40) de cada local de captura (30) podem ser diferentes ou podem ser iguais. Os meios de captura (40) são capazes de se ligar à enzima a ser detectada pelo dispositivo de ensaio (1). Isso resulta na retenção de pelo menos uma amostra ou parte da amostra de enzima em pelo menos um local de captura distinto (30). A ligação entre os meios de captura (40) e a enzima é preferencialmente resultado da ligação anticorpo/antígeno. Os meios de captura (40) sozinhos podem definir o local de captura (30).
[132] A quantidade de meios de captura (40) em cada local de captura distinto (30) do dispositivo de ensaio (1) pode ser diferente ou igual. A quantidade de meios de captura (40) em cada local de captura distinto (30) pode aumentar a ainda mais a distância entre o local de captura e a região de colocação (10). A quantidade de meios de captura (40) em cada local de captura distinto (30) pode diminuir a distância entre o local de captura e a região de colocação (10).
[133] Em alguns exemplos de realização, a quantidade de meios de captura (40) em cada local de captura distinto (30) do dispositivo de ensaio (1) pode ser substancialmente a mesma.
[134] O dispositivo de ensaio (1) da presente invenção pode opcionalmente compreender uma região ou linha indicadora (91) que indica se o dispositivo de ensaio funcionou corretamente. Preferencialmente, a região ou linha indicadora indica que ensaio funcionou através de uma alteração de cor. A região ou linha indicadora opcional pode compreender anticorpos. Estes anticorpos podem ser criados contra uma enzima per se, ou contra um componente desta (por exemplo, um fragmento e/ou um epítopo desta), em que a referida enzima está relacionada com a enzima ativa a ser detectada. Além disso ou alternativamente, a linha indicadora pode compreender uma enzima não relacionada, que pode reagir com pelo menos alguns dos componentes do substrato.
ANTICORPOS
[135] Os meios de captura (40) da presente invenção são preferencialmente anticorpos que se ligam à enzima ativa a ser detectada pelo dispositivo de ensaio (1). Os anticorpos podem ser criados contra a enzima per se, ou contra um componente desta (por exemplo, um fragmento desta e/ou um epítopo desta).
[136] A região ou linha indicadora opcional (91) do dispositivo de ensaio (1) da presente invenção pode compreender anticorpos.
[137] Mais preferivelmente, os meios de captura (40) são anticorpos produzidos contra uma fitase ou componente da mesma (por exemplo, um fragmento desta e/ou um epítopo desta), tal como as fitases BP17, BP11 ou BP111.
[138] Os anticorpos podem ser produzidos por técnicas convencionais, como por imunização com a enzima de interesse, como uma mistura, amostra purificada ou um fragmento ou pelo uso de uma biblioteca de exibição em fagos.
[139] Para os propósitos da presente invenção, o termo “anticorpo”, a menos que especificado de outra forma, inclui, mas não está limitado a, anticorpos policlonais, monoclonais, quiméricos, de cadeia simples, fragmentos Fab, fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, bem como miméticos dos mesmos. Tais fragmentos incluem fragmentos de anticorpos completos que retêm a sua atividade de ligação a uma substância alvo, fragmentos Fv, F(ab') e F(ab')2 , bem como anticorpos de cadeia simples (scFv), proteínas de fusão e outras proteínas sintéticas que compreendem o sítio de ligação ao antígeno do anticorpo. Além disso, os anticorpos e seus fragmentos podem ser anticorpos humanizados.
[140] Os anticorpos neutralizantes (ou seja, aqueles que inibem a atividade biológica dos polipeptídeos da substância, e que são vulgarmente utilizados na terapêutica) não são preferidos para o dispositivo ou ensaio da presente invenção.
[141] Se forem desejados anticorpos policlonais, um animal selecionado (por exemplo, camundongo, coelho, cabra, cavalo, galinha, etc), é imunizado com a enzima a ser detectada (ou fragmento polipeptídico que compreende um epítopo imunológico da mesma). Dependendo da espécie hospedeira, vários adjuvantes podem ser utilizados para aumentar a resposta imunológica.
[142] O soro do animal imunizado é coletado e tratado de acordo com procedimentos conhecidos. Se o soro contendo os anticorpos policlonais para a enzima a ser detectada pelo dispositivo de ensaio da presente invenção, e/ou a sequência de aminoácidos da enzima (ou sequência que compreende um epítopo imunológico da mesma) contém anticorpos para outros antígenos, os anticorpos policlonais podem ser purificados por cromatografia de imunoafinidade. As técnicas para a produção e processamento de soros policlonais são bem conhecidas no estado da técnica (por exemplo, Harboe N, Ingild A. Immunization, isolation of immunoglobulins, Estimation of antibody titre. Scand J Immunol Suppl. 1973, 1:161-4). Na seção de Exemplos, o método de Harboe (ibid) foi utilizado para gerar anticorpos para a enzima fitase BP17. No entanto, outras técnicas podem ser usadas e/ou outras enzimas podem ser utilizadas para gerar anticorpos adequados.
[143] Os anticorpos monoclonais direcionados contra a enzima a ser detectada pelo dispositivo de ensaio (1) da presente invenção, e/ou a sequência de aminoácidos daquela enzima (ou sequência que compreende um epítopo imunológico da mesma) podem também ser facilmente produzidas por um técnico hábil no assunto e incluem, mas não estão limitadas a, técnica de hibridoma de Koehler e Milstein (1975 Nature 256 :495-497), técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor et al, (1983) Immunol Today 4:72.; Cote et al, (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80 :2026-2030) e a técnica de hibridoma de EBV (Cole et al, (1985.) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Rickman Liss Inc, págs 77 - 96).
[144] Além disso, podem ser utilizadas as técnicas desenvolvidas para a produção de “anticorpos quiméricos”, o splicing de genes de anticorpos de camundongos para genes de anticorpos humanos para a obtenção de uma molécula com especificidade ao antígeno e atividade biológica apropriadas (Morrison et al., (1984) Proc Natl Acad. Sci. 81 :6851-6855; Neuberger et al, (1984) Nature 312: 604-608; Takeda et al,(1985) Nature 314 :452-454).
[145] Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia simples (US4946779) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia simples específicos para a substância.
[146] Os fragmentos de anticorpo que contêm sítios de ligação específicos para a substância também podem ser gerados. Por exemplo, tais fragmentos incluem, mas não estão limitados a, o F(ab')2 que pode ser produzido pela digestão da molécula de anticorpo com pepsina e os fragmentos Fab que podem ser gerados pela redução das pontes bissulfeto dos fragmentos F(ab')2. Alternativamente, as bibliotecas de expressão de Fab podem ser construídas para permitir a identificação rápida e fácil de fragmentos Fab monoclonais com a especificidade pretendida (Huse WD et al., (1989) Science 256:1275-128 1).
[147] Em alguns exemplos de realização, os anticorpos preferencialmente são anticorpos policlonais.
[148] Os anticorpos podem ser modificados - por exemplo, derivatisado para atender ainda melhor o dispositivo ou ensaio. Por exemplo, o anticorpo pode ser acoplado com um ou mais grupos químicos que permitem a ligação específica / acoplamento de matrizes, tais como plásticos derivatizados.
MEIOS DE INDICAÇÃO SELETIVA
[149] O dispositivo de ensaio da presente invenção compreende meios de indicação seletiva (50) ou, pelo menos, um componente do mesmo para proporcionar a indicação seletiva da presença da enzima ativa ligada aos meios de captura (40). Os meios de indicação seletiva (50) podem compreender uma reação de precipitação.
[150] Em um aspecto, o dispositivo de ensaio compreende totalidade ou substancialmente todos os meios de indicação seletiva.
[151] Em outro aspecto, o dispositivo de ensaio é fornecido com pelo menos um componente dos meios de indicação seletiva. Nesse caso, o dispositivo de ensaio é fornecido com o(s) outro(s) componente (s) dos meios de indicação seletiva. Em um aspecto, os meios de indicação seletiva são constituídos sobre e/ou no dispositivo de ensaio quando o dispositivo de ensaio está em uso. O termo “constituído” inclui a mistura ou o contato dos componentes para gerar o meios de indicação seletiva.
[152] Em outro aspecto, é fornecido um kit em que é fornecido um dispositivo que pode ser utilizado como o dispositivo de ensaio da presente invenção e em que o kit é fornecido com os meios de indicação seletiva. Em uso, a totalidade ou alguns dos componentes dos meios de indicação seletiva são adicionados ao dispositivo de modo a formar o dispositivo de ensaio da presente invenção.
[153] O termo “fornecer”, “fornecido”, tal como utilizado no presente refere-se à capacidade de fornecer a indicação per si ou como parte de um sistema. Alternativamente, o termo “fornecer” ou “fornecido” refere-se a um kit ou dispositivo que contém ou que compreende o componente identificado.
[154] Os meios de indicação seletiva (50) podem compreender ou fornecer uma alteração de cor visível. A alteração de cor é preferencialmente provocada pela reação de um substrato da enzima para formar uma porção que reage com uma espécie reativa. O substrato pode estar ligado à matriz (20).
[155] O material sobre o qual uma enzima age é referido como seu “substrato”. Preferencialmente, o substrato da enzima está ligado ao dispositivo de ensaio (1). Na presente invenção, o termo “ligado” inclui acoplado ou anexado. O substrato pode estar ligado diretamente ou indiretamente ao dispositivo. De modo mais preferencial, o substrato está ligado à matriz (20) do dispositivo de ensaio (1), ou pode estar presente na metade oposta (3) do dispositivo na posição (50). O substrato está preferencialmente em uma forma seca.
[156] Preferencialmente, a enzima atua sobre o seu substrato para gerar um grupo reativo. O referido grupo reativo pode então atuar sobre uma espécie reativa para gerar um efeito funcional, de preferência um efeito visualmente observável tal como uma alteração de cor.
[157] O referido grupo reativo pode também ser referido na presente invenção como uma porção, uma porção redutora, espécies redutoras ou um agente redutor.
[158] O substrato pode ser um substrato da fosfatase, ou um composto com um grupo doador de fosfato. Preferencialmente, o substrato é um substrato da fosfatase ácida. Para alguns aspectos, a remoção do grupo doador fosfato produz um agente de redução, ou porção reativa. Preferencialmente, o substrato da fosfatase é o ácido 2-fosfo-L-ascórbico trissódico (AsAP). Outros exemplos incluem análogos, como os sais ascorbil 2-fosfato alternativos (por exemplo, magnésio, zinco, cálcio) ou derivados de 3-O-fosfato. Outros exemplos possíveis incluem versões esterificados do fosfato de ascorbila (palmitato de fosfo ascorbila).
[159] Quando os meios de indicação seletiva (50) compreendem uma alteração de cor causada pela reação de um substrato da enzima para formar uma porção que reage com uma espécie reativa, as espécies reativas podem ser um composto de tetrazólio. A este respeito, a alteração de cor causada pela formação de um corante formazano como um resultado da reação enzimática.
[160] Os sais de tetrazólio têm sido utilizados na indústria para remover as substâncias que poderiam perturbar a alteração de cor de uma reação redox. Por exemplo, vide a Patente US 5.196.314. Além disso, a alteração de cor de um sal de tetrazólio tem sido utilizada como indicador da presença de um analito na US 5.360.595.
[161] Na presente invenção, a espécie reativa pode ser um composto nitroazul de tetrazólio. As espécies reativas podem ser cloreto de nitroazul de tetrazólio (NBT). As espécies reativas podem ser, alternativamente, um composto halonitrotetrazólio. As espécies reativas podem ser, preferencialmente, um composto de iodonitrotetrazólio. Preferencialmente, a espécie reativa é cloreto de iodonitrotetrazólio (INT).
[162] Para os meios de indicação seletiva, e mais preferencialmente para as espécies reativas, pode ser adicionado um conjunto capaz de reduzir ou prevenir a difusão do precipitado. Isto melhora a qualidade do resultado, e mais preferencialmente melhora as linhas visuais do precipitado. Mais preferencialmente, esta entidade é o polietileno-glicol e mais preferivelmente ele é adicionado aos sais de tetrazólio.
[163] Assim, em um aspecto preferido, é descrito um dispositivo de ensaio de fluxo lateral (1), que detecta a enzima ativa em uma amostra. Preferencialmente a enzima é uma fosfatase ácida e a atividade da enzima é determinada pela redução de um sal de tetrazólio para produzir um precipitado colorido. O dispositivo é semiquantitativo e a quantidade de analito é indicada pelo número de locais de captura (30) do dispositivo que apresentam uma alteração de cor devido ao precipitado.
[164] Quando os meios de indicação seletiva (50) compreendem um substrato da fosfatase, tal como descrito acima, o substrato da fosfatase pode reagir com as espécies reativas, conforme descrito acima, na presença de um intensificador de reação. O intensificador de reação pode estar ligado a uma matriz secundária. O intensificador de reação pode ser um composto de fenazina.
[165] Preferivelmente, o intensificador de reação é um composto de metossulfato. Mais preferivelmente, o intensificador de reação é metossulfato de fenazina (PMS).
[166] Em exemplos de realização preferidos, a enzima ativa a ser detectada age sobre o substrato para gerar um grupo reativo, ou agente de redução que, em seguida, atua sobre uma entidade que produz um efeito observável.
[167] Em um exemplo de realização preferido, a enzima é a fitase, o substrato é o substrato de fosfatase, ou um composto com um grupo doador de fosfato.
[168] Em outro exemplo de realização preferido, a enzima éxilanase, o substrato é xilano e o grupo reativo é xilose.
[169] Em outro exemplo de realização preferida, a enzima é a amilase, o substrato é o amido e a porção reativa é a glicose.
[170] Em um exemplo de realização preferido, a entidade é um sal de tetrazólio e o efeito observável é um efeito visível, mais preferivelmente, uma alteração de cor.
EXEMPLOS DE REALIZAÇÃO PREFERIDOS
[171] Dois exemplos de realização preferidos do dispositivo de ensaio (1) da presente invenção são mostrados na Figura 1A e Figura 1B.
[172] Preferencialmente, o dispositivo de ensaio (1) é uma tira ou bastão. Ao longo desta tira ou bastão uma amostra líquida pode fluir longitudinalmente na direção indicada pelas setas na Figura 1. O corpo da tira ou bastão compreende a matriz (20). Como no exemplo de realização 1 do dispositivo (Figura 1a), a região de colocação (10) está preferencialmente em uma extremidade da tira ou bastão. Os locais de captura (30) estão preferencialmente na extremidade oposta da tira ou bastão em relação à região de colocação (10).
[173] Os meios de indicação seletiva (50) ou um componente dos mesmos podem ser adicionados ao dispositivo de ensaio quando em uso. Preferencialmente, estes meios de indicação ou, pelo menos, um componente destes está na forma líquida. Preferencialmente, todos os reagentes são secos com exceção dos meios de indicação seletiva (50) ou de alguns dos componentes dos meios de indicação seletiva (50). Alternativamente, todos os reagentes podem estar na forma seca ou desidratada.
[174] O exemplo de realização 2 preferido do dispositivo de ensaio (1) é mostrado na Figura 1b. Neste caso, o dispositivo de ensaio (1) é constituído por duas metades opostas, que estão ligadas por uma seção ou linha de dobragem (70). A região de colocação da amostra (10), operacionalmente conectada à matriz (20) é colocada em uma metade (2) do dispositivo. O(s) local(ais) de captura (30) e meios de captura (40) são colocados sobre a matriz (20). A mesma metade (2) ou a metade oposta (3) do dispositivo compreende os meios de indicação seletiva ou, pelo menos, um componente destes, e opcionalmente a metade oposta (3) compreende uma almofada absorvente para absorver o excesso de amostra (60).
[175] Ao utilizar o exemplo de realização 2, o operador coloca a amostra na região de colocação (10). Ele/ela, em seguida, permite que a amostra flua para, pelo menos, uma posição necessária. Em seguida ele/ela fecha o dispositivo ao longo da secção de dobragem (70). Isto leva os meios de indicação seletiva (50), ou pelo menos um componente dos mesmos, em contato com a matriz (20) e com os meios de captura (40). O operador pode precisar adicionar os meios de indicação seletiva (50) ou algum(alguns) componente(s) dos meios de indicação seletiva (50) ao dispositivo na forma líquida.
[176] Para alguns exemplos de realização, os meios de indicação seletiva ou alguns componentes dos meios de indicação seletiva podem estar presentes em forma seca na posição (90). Preferencialmente, todos os reagentes são secos. Em alguns exemplos de realização uma solução de tetrazólio INT ou NBT pode ser adicionada pelo operador na posição (50) ou (30).
[177] Opcionalmente preferido, o exemplo de realização 2 compreende uma janela de visualização (80) que permite que o operador visualize o resultado do dispositivo de ensaio (em outras palavras, visualize os locais de captura), uma vez que as duas metades (2) e (3) do dispositivo estejam fechadas.
[178] O dispositivo de ensaio (1) da presente invenção pode opcionalmente compreender uma região ou linha indicadora que indica se o dispositivo de ensaio funcionou corretamente. Preferencialmente, a região ou linha indicadora indica que ensaio funcionou através de uma alteração de cor. A região ou linha indicadora opcional pode compreender anticorpos. Estes anticorpos podem ser criados contra uma enzima per se, ou contra um componente desta (por exemplo, um fragmento e/ou um epítopo desta), em que a referida enzima está relacionada com a enzima ativa a ser detectada. Além disso ou alternativamente, a linha indicadora pode compreender uma enzima não relacionada, que pode reagir com pelo menos alguns dos componentes do substrato.
[179] Adicionalmente ou alternativamente a região indicadora pode compreender uma fosfatase ácida ou fitase não relacionada com a fitase a ser detectada.
[180] Em um exemplo de realização, a presente invenção provê um dispositivo de ensaio para detecção de uma enzima ativa em uma amostra, em que o dispositivo compreende: (a) uma região de colocação sobre a qual a amostra pode ser colocada, (b) uma matriz operacionalmente ligada à referida região de colocação de modo a que a amostra, quando presente (por exemplo, colocada) sobre a referida região de colocação pode migrar ao longo da referida matriz; (c) pelo menos um local de captura distinto sobre a referida matriz, em que cada local de captura distinto é levado para longe da região de colocação, e em que a amostra pode migrar através do referido local de captura distinto, (d) meios de captura estão presentes, ou definem cada local de captura distinto, em que os referidos meios de captura são capazes de ligar à referida enzima de modo que pelo menos uma porção da referida amostra da referida enzima é retida em pelo menos um local de captura distinto, e (e) meios de indicação seletiva ou pelo menos um componente destes para fornecer uma indicação seletiva da presença da enzima ativa ligada aos referidos meios de captura.
[181] Preferencialmente, a enzima é fitase.
[182] Em um aspecto, a presente invenção provê um dispositivo de ensaio para detecção de uma enzima ativa em uma amostra, em que o dispositivo em uso compreende: (a) uma região de colocação sobre a qual a amostra pode ser colocada, (b) uma matriz operacionalmente ligada à referida região de colocação de modo a que a amostra, quando presente (por exemplo, colocada) sobre a referida região de colocação pode migrar ao longo da referida matriz; (c) pelo menos um local de captura distinto sobre a referida matriz, em que cada local de captura distinto é levado para longe da região de colocação, e em que a amostra pode migrar através do referido local de captura distinto, (d) meios de captura estão presentes, ou definem cada local de captura distinto, em que os referidos meios de captura são capazes de ligar à referida enzima de modo que pelo menos uma porção da referida amostra da referida enzima é retida em pelo menos um local de captura distinto, e (e) meios de indicação seletiva para fornecer uma indicação seletiva da presença da enzima ativa ligada aos referidos meios de captura.
[183] Preferencialmente, a enzima é fitase.
[184] Em um exemplo de realização, a presente invenção provê um dispositivo de ensaio para detecção de uma enzima ativa em uma amostra, em que o dispositivo compreende: (a) uma região de colocação sobre a qual a amostra pode ser colocada, (b) uma matriz operacionalmente ligada à referida região de colocação de modo a que a amostra, quando presente (por exemplo, colocada) sobre a referida região de colocação pode migrar ao longo da referida matriz; (c) pelo menos um local de captura distinto sobre a referida matriz, em que cada local de captura distinto é levado para longe da região de colocação, e em que a amostra pode migrar através do referido local de captura distinto, (d) meios de captura estão presentes, ou definem cada local de captura distinto, em que os referidos meios de captura são capazes de ligar à referida enzima de modo que pelo menos uma porção da referida amostra da referida enzima é retida em pelo menos um local de captura distinto, e (e) meios de indicação seletiva ou pelo menos um componente destes para fornecer uma indicação seletiva da presença da enzima ativa ligada aos referidos meios de captura, e em que a enzima é uma fitase, e em que os meios de indicação seletiva compreendem uma fosfatase ácida.
MEDIÇÃO SEMIQUANTITATIVA
[185] O dispositivo de ensaio (1) da presente invenção pode fornecer, pelo menos, uma medição semiquantitativa da quantidade de enzima ativa em uma amostra.
[186] Preferencialmente, a quantidade é relativa ao número de locais de captura (30) que indicam a presença da enzima ligada. Alternativamente, a medição semiquantitativa pode ser realizada utilizando a intensidade de uma alteração de cor no(s) local(ais) de captura (30).
[187] A intensidade da alteração de cor pode ser avaliada usando um cartão de pontuação ou cartão de referência, de preferência onde operador compara a intensidade de cor da reação na matriz (20) com o cartão de pontuação. Adicionalmente ou alternativamente, o usuário pode usar um dispositivo eletrônico que pode fazer a leitura da alteração de cor e informar ao usuário o(s) resultado(s) de sua análise. A título de exemplo, o dispositivo eletrônico pode ser um telefone móvel que pode compreender um “aplicativo” adequado.
[188] A medição semiquantitativa pode determinar se a quantidade de enzima ativa está acima ou abaixo de um determinado valor ou concentração, por exemplo, acima ou abaixo de 300 FTU/g.
MÉTODOS E APLICAÇÕES DA INVENÇÃO
[189] Conforme descrito acima, a presente invenção fornece um método ou uso (por exemplo, uso do dispositivo da presente invenção) para determinar se há uma enzima ativa presente em uma amostra. Preferencialmente, este método é semiquantitativo. O método envolve o uso do dispositivo de ensaio (1) descrito na presente invenção, com uma amostra, e comparando os resultados com outras amostras.
[190] Uma amostra que contém uma enzima mais ativa faz com que mais locais de captura (30) indiquem a presença de enzima ativa ligada.
[191] Alternativamente ou adicionalmente, uma amostra que causa uma forte alteração de cor (por exemplo, mais escura) nos locais de captura, contém uma enzima mais ativa.
[192] Preferencialmente, o método é usado para determinar a fosfatase ativos ou hidrolases fosfórico monoéster (CE 3.1.3) e glicosídeo hidrolases (EC 3.2.1), incluindo a fosfatase alcalina (EC 3.1.3.1), fosfatase ácida (EC3.1.3.2) , 3-fitase (EC 3.1.3.8), 6-fitase (EC 3.1.3.26), endo-1, 4-β-xilanase (EC 3.2.1.8) e xilano endo-1,3-β-xilosidase (EC 3.2 .1.32), preferencialmente xilano 1,4-beta-xilosidase (EC 3.2.1.37), α-amilase (EC 3.2.1.1), β-amilase (EC 3.2.1.2), oligo-1,6-glucosidase (EC 3.2.1.10), glicano 1,4-alfa-glucosidase (EC 3.2.1.3), pululanase (EC 3.2.1.41), celulase (EC 3.2.1.4), endo-1,3 (4)-beta- glicanase (EC 3.2 .1.6), e glicano endo-1,3-beta-D-glucosidase (EC 3.2.1.39). De modo mais preferido são determinados os níveis de 6-fitase ativa, tal como a fitase BP17.
[193] Em outro aspecto da presente invenção é fornecido um método para a determinação dos níveis de enzima ativa em uma composição de alimentos ou rações ou biocombustível ou detergente. Este método envolve a preparação de uma amostra de alimento ou ração ou biocombustível ou composição detergente, de preferência uma amostra aquosa. Em seguida, a amostra é colocada na região de coloção (10) do dispositivo de ensaio (1) da invenção, e o dispositivo de ensaio (1) é usado para determinar a quantidade de enzima ativa na amostra de maneira semiquantitativa. A quantidade de enzima ativa em várias amostras pode ser comparada entre elas e/ou comparada com uma amostra de referência. Mais preferivelmente este método é utilizado para determinar os níveis de fitase ativa, preferencialmente os níveis de fitase BP17 ativa, em alimentos e ração.
[194] A presente invenção fornece ainda um método para determinar se uma enzima adicional ou um aditivo alimentar ou de ração é necessário. Se uma quantidade de enzima ativa for menor do que uma determinada quantidade ou quantidade relativa quando detectada usando o método descrito acima, isso indica que a enzima adicional deve ser adicionada. Mais preferencialmente este método é utilizado para determinar se uma fitase suplementar, preferencialmente uma fitase BP17 ativa, deve ser adicionada a um alimento ou ração.
[195] Os métodos descritos acima podem ser utilizados para o controle de qualidade. Tal método compreende a utilização do dispositivo de ensaio (1) da presente invenção para determinar os níveis de enzima ativa em uma amostra e, em seguida, determinar se essas enzimas respeitam o nível de controle de qualidade de enzima. Preferencialmente, tal método pode ser utilizado para determinar os níveis de fitase em uma ração ou aditivo alimentar e, em seguida, determinar se a ração ou um aditivo alimentar deve ser usado.
[196] A presente invenção fornece adicionalmente um método de determinação da presença de uma enzima ativa em uma amostra, em que o método compreende as etapas de: a) contato de pelo menos uma porção da amostra com um meio de captura pelo qual a enzima é capturada pelo referido meio de captura; b) fornecimento de um substrato adequado para a enzima capturada em que o referido substrato reage com a referida enzima capturada para produzir um produto de enzima; c) fornecimento de uma espécie reativa capaz de reagir com o produto de enzima em que a referida espécie reativa reage com o referido produto de enzima para produzir um produto insolúvel; e d) detecção do produto insolúvel obtido na etapa (c), em que a referida detecção se correlaciona com a presença e/ou quantidade de uma enzima ativa na referida amostra.
[197] Preferencialmente, a amostra é uma amostra de alimento ou ração ou componente de alimentos ou ração, ou amostra de biocombustível ou composição detergente. Preferencialmente, a amostra é seca, reidratada ou é uma amostra aquosa. Mais preferencialmente, a amostra é uma amostra líquida.
[198] Preferencialmente, a enzima ativa detectada pelo método da fosfatase é uma glicosídeo hidrolase ou, mais preferencialmente, uma fosfatase ácida, fitase, xilanase, amilase, ou β-glicanase.
[199] Preferencialmente, os meios de captura da presente invenção são anticorpos que se ligam à enzima ativa a ser detectada pelo dispositivo de ensaio (1). Os anticorpos podem ser criados contra a enzima per se, ou contra um componente desta (por exemplo, um fragmento desta e/ou um epítopo desta).
[200] Preferencialmente, o substrato para a enzima capturada pode ser um substrato fosfatase, ou um composto com um grupo doador de fosfato. Preferencialmente o substrato é um substrato de fosfatase ácida e mais preferencialmente o substrato fosfatase é o ácido 2 -fosfo-L-ascórbico trisódico (AsAP).
[201] Preferencialmente, as espécies reativas usadas no método podem ser um composto de tetrazólio. Mais preferencialmente, as espécies reativas podem ser um composto de nitroazul de tetrazólio. As espécies reativas podem ser cloreto de nitroazul de tetrazólio (NBT). As espécies reativas podem ser, alternativamente, um composto halonitrotetrazólio. As espécies reativas podem ser, preferencialmente, um composto de iodonitrotetrazólio. Preferencialmente, a espécie reativa é cloreto de iodonitrotetrazólio (INT).
[202] O produto insolúvel é preferencialmente um precipitado, mais preferencialmente um precipitado visualmente detectável ou observável, de preferência, um precipitado de cor.
[203] O produto insolúvel é preferencialmente detectado ou observado visualmente ou eletronicamente. Mais preferencialmente ele é detectável devido a uma alteração de cor.
KITS
[204] A presente invenção pode ser apresentada sob a forma de um kit. Tal kit irá permitir que o operador realize o ensaio, de preferência, fora do laboratório. O kit pode fornecer um ou mais ou todos os reagentes necessários para realizar o ensaio. Esses reagentes podem estar em uma forma seca ou desidratada. Os reagentes desidratados podem ser reconstituídos pela amostra em um solvente, de preferência uma amostra aquosa. Preferencialmente, todos os reagentes são secos com exceção dos meios de indicação seletiva (50) ou de alguns dos componentes dos meios de indicação seletiva (50). Esse kit pode ser conhecido como um “Formato Semi-Seco”. Preferencialmente todos os reagentes são secos exceto as espécies reativas. Mais preferencialmente todos os reagentes são secos com exceção de uma solução de tetrazólio INT ou NBT. O operador adiciona o líquido aos reagentes secos para realizar o ensaio.
[205] Preferencialmente, o dispositivo de ensaio (1) é fornecido na forma de um bastão ou mais preferencialmente como uma tira. Mais preferencialmente os reagentes secos estão ligados à tira ou bastão, como é apresentado. Os kits da presente invenção podem também compreender uma ou mais bolsas (por exemplo, bolsas plásticas), pipetas, seringas, tubos ou tubos de ensaio. Preferencialmente, a tira ou bastão está contido em uma caixa, por exemplo, uma caixa de plástico, cartão ou papelão.
[206] O dispositivo de ensaio da presente invenção pode ser fornecido em um kit, como mostrado no exemplo de realização 1 da Figura 1 ou exemplo de realização 2 da Figura 1.
[207] Um kit da presente invenção pode compreender ou ser capaz de formar o dispositivo de ensaio e todos os componentes do dispositivo de ensaio, incluindo: (a) uma região de colocação (10) na qual a amostra pode ser colocada; (b) uma matriz (20) operacionalmente ligada à referida região de colocação (10) de tal modo que a amostra, quando presente (por exemplo, colocada) sobre a referida região de colocação (10) pode migrar ao longo da referida matriz (20); (c) pelo menos um local de captura distinto (30) sobre a referida matriz (20), em que cada local de captura distinto (30) é levado para longe da região de colocação (10), e em que a amostra pode migrar através do referido local de captura distinto (30); (d) meios de captura (40) presentes, ou definindo cada local de captura distinto (30), em que os referidos meios de captura (40) são capazes de ligar à referida enzima de modo que pelo menos uma porção da referida amostra da referida enzima é retida em pelo menos um local de captura distinto (30); e (e) meios de indicação seletiva (50) ou pelo menos um componente deste para fornecer uma indicação seletiva da presença da enzima ativa ligada aos referidos meios de captura.
[208] Um kit da presente invenção pode compreender todos ou substancialmente todos os componentes do dispositivo de ensaio (a)-(d) e em que os meios de indicação seletiva (50) são fornecidos, e em seguida são adicionados a um dispositivo em uso.
[209] Um kit da presente invenção pode compreender todos os componentes do dispositivo de ensaio (a)-(d) e pelo menos um componente dos referidos meios de indicação seletiva e em que o kit compreende adicionalmente outro(s) componente(s) dos meios de indicação seletiva (50) os quais são, em seguida, adicionados a um dispositivo em uso.
[210] Um kit da presente invenção pode compreender todos os componentes do dispositivo de ensaio (a) - (e).
[211] Um solvente tal como a água - ou outra solução aquosa adequada - pode estar incluído ou ser adicionado a um kit ou dispositivo da presente invenção. O mesmo, ou qualquer um dos componentes do kit pode ser disperso, dissolvido ou reidratado em um solvente, tal como a água, água purificada ou água deionizada.
[212] Um kit da presente invenção pode ser fornecido com um cartão de pontuação ou cartão de referência. A intensidade da alteração de cor pode ser avaliada usando um cartão de pontuação ou cartão de referência, de preferência onde operador compara a intensidade de cor da reação na matriz (20) com o cartão de pontuação. A medição semiquantitativa pode ser realizada utilizando o cartão de pontuação, por exemplo, quando a quantidade de enzima ativa está acima ou abaixo de um determinado valor ou concentração, por exemplo, acima ou abaixo de 300 FTU/g, isto pode ser determinado utilizando o cartão de pontuação.
[213] O cartão de pontuação ou cartão de referência pode ser feito de papel, cartão ou outros materiais físicos. Alternativamente, o cartão de pontuação ou cartão de referência pode ser consultado por via eletrônica, por exemplo, em um telefone, smartphone, computador ou outro dispositivo computacional. O cartão de pontuação pode ser comparado a uma referência eletrônica e/ou o cartão de pontuação pode ser lido eletronicamente.
EXEMPLOS
[214] A presente invenção será descrita apenas a título de exemplo em que é feita referência às seguintes Figuras.
[215] Parte 1 da seção de Exemplos fornece detalhes sobre os dispositivos de ensaio e os métodos da presente invenção para a determinação da presença de fitase ativa em uma amostra.
[216] Parte 2 da seção de Exemplos fornece detalhes sobre a metodologia que pode ser usada para dispositivos de ensaio e métodos da presente invenção para determinação da presença de fitase ativa em uma amostra.
GERAÇÃO DE ANTICORPOS PARA OS DISPOSITIVOS DE ENSAIO E MÉTODOS DA INVENÇÃO
[217] Os anticorpos para o uso no dispositivo de ensaio e métodos da presente invenção podem ser gerados por meio da metodologia de Harboe N, Ingild, A. Immunization, isolation of immunoglobulins, Estimation of antibody titre. Scand J Immunol Suppl. 1973, 1:161- 4).
[218] Na Parte 1 da secção de exemplos, os anticorpos contra a fitase BP17, para uso no dispositivo de ensaio e métodos da presente invenção, foram gerados seguindo a metodologia de Harboe N (1973) (ibid). A sequência para BP17 (com exceção do peptídeo sinal) é exibida acima.
PARTE 1
[219] No trabalho que antecedeu e que resultou na presente invenção foram tomadas duas linhas diferentes de investigação.
[220] Uma abordagem resultou em um dispositivo de acordo com a presente invenção (genericamente representado na Figura 1) e métodos usando o mesmo e kits compreendendo o mesmo. Esta linha de abordagem nós denominamos de Formato 1. Este dispositivo e etc é discutido em detalhe nos Exemplos 1, etc.
[221] Nós também trabalhamos em um ensaio de fluxo lateral tipo sanduíche com anticorpo conjugado com ouro. Esta linha de abordagem nós denominamos de Formato 2. Pelas razões explicadas aqui, esta linha de abordagem foi considerada como não sendo adequada. As informações sobre o Formato 2 (ou seja, o ensaio de fluxo lateral tipo sanduíche com anticorpo conjugado com ouro), tal como na Figura 5 e seu comentário associado, foram adicionados por razões comparativas (vide a Seção - Exemplo Comparativo).
[222] Além disso, na seção do Exemplo Comparativo foi realizada uma comparação direta do Formato 1 com o Formato 2 para um aspecto dos experimentos.
EXEMPLOS 1 - 9 FORMATO 1 - DISPOSITIVOS DE ENSAIO E MÉTODOS DA PRESENTE INVENÇÃO EXEMPLO 1
[223] O ensaio e dispositivo da presente invenção estão relacionados a um anticorpo de captura com precipitação do substrato de ensaio (por exemplo, Figura 1 e Figura 2 e Figura 3).
[224] A este respeito, o anticorpo de captura com o ensaio de Precipitação de Substrato foi caraterizado. Um substrato de fosfatase ácida adequado foi identificado, com a principal caraterística sendo a redução de um sal de tetrazólio para produzir um precipitado de cor, e subsequentemente foi mostrado que funciona em um ensaio do tipo fluxo lateral com um sinal de resposta dose-dependente.
[225] Diversos obstáculos no desenvolvimento de um anticorpo de captura com precipitação do substrato teste foram anotados, tal como a complexidade do substrato e a migração do precipitado gerado devido ao fluxo do ensaio. Entretanto, este ensaio foi mais adequado do que o ensaio tipo sanduíche com conjugado de ouro (Figura 5), uma vez que mede diretamente a atividade da enzima, ao invés de simplesmente contar com a ligação da enzima ao anticorpo.
[226] A captura de anticorpo com o ensaio de precipitação de substrato (Figura 2) foi extensivamente desenvolvida. Múltiplos formatos foram investigados e o ensaio refinado a partir de um projeto inicialmente complexo com um substrato multicomponente e manipulação do bastão de ensaio pós- amostra para uma configuração simples com poucos passos para o usuário.
[227] O aspecto semiquantitativo do ensaio é determinado por uma região de três linhas de teste onde o resultado de três linhas representa altos níveis de enzima ativa (um resultado de aprovação), duas linhas representam níveis intermediários (limítrofe) e um ou zero de linhas que indicam baixos níveis de enzimas (reprovação).
[228] A evolução deste ensaio resultou no desenvolvimento de um formato muito útil - ou seja, o que chamamos de “Formato Semi-Seco”. A Figura 3 mostra as etapas envolvidas no Formato Semi-Seco da presente invenção.
[229] A este respeito, e tal como ilustrado na Figura 3, o formato semi-seco requer o operador para produzir uma amostra teste em água que é aplicada no bastão de ensaio. Um dos componentes do complexo de substrato em solução é aplicado “diretamente a partir da garrafa” (sem a necessidade de preparação pelo operador) para a matriz do bastão de ensaio (nitrocelulose, neste exemplo), que é coberto com uma almofada contendo os outros componentes do substrato que estão secos. Em seguida, é deixado que o ensaio seja revelado e o resultado é lido após 20-30 minutos (Figura 4). Aqui, a Figura 4 apresenta os resultados obtidos a partir de diluições seriadas de 6 - fitase (denominada BP17) usando o formato semi-seco da Figura 3. A 6-fitase é derivada de Buttiauxella sp. conforme descrito acima.
[230] Um “Formato seco” também foi investigado em que todos os componentes são secos no teste de modo que o operador teria que aplicar apenas a amostra (Figura 6). Aqui o operador simplesmente adiciona a amostra e revela o teste. Um ensaio final poderia ser alojado em um estojo ou cassete e o contrapeso representado na Figura 6 não seria necessário. No exemplo ilustrado, um doador de fosfato - ácido 2-fosfo-L-ascórbico trissódico (AsAP) e o intensificador de reação metossulfato de fenazina (PMS) são secos na matriz de nitrocelulose (NC) e um bloco de nylon de substrato de tetrazólio, cloreto de iodonitrotetrazólio (INT) é colocado de forma segura em cima. A amostra líquida é adicionada como habitual, e esta é a própria solução da amostra que hidrata os componentes do substrato.
[231] Assim, na Figura 6 (ou seja, um exemplo de um ensaio no formato Seco), o operador simplesmente adiciona a amostra e revela o teste. Nesta Figura, ácido 2-fosfo-L-ascórbico trissódico = AsAP; o intensificador de reação metossulfato de fenazina = PMS; matriz de nitrocelulose = NC, e substrato de tetrazólio cloreto de iodonitrotetrazólio = INT.
EXEMPLO 2 PREPARAÇÃO DA AMOSTRA Solvente
[232] O método de preparação da amostra foi realizado em água. Para os propósitos de continuidade foi usada água MilliQ. MilliQ refere-se a água que foi purificada e deionizada a um grau elevado por um sistema de purificação de água.
[233] A Figura 7 exibe os resultados obtidos quando 1 grama de ração peletizada (pellet) foram extraídos durante 30 minutos em tampão acetato 0,25 M, pH 5,0, água MilliQ ou em água de torneira e submetido ao ensaio no formato fluxo passante em triplicatas (vide também a Figura 11). Em cada caso, a linha inferior representa a linha de teste e a linha superior é a linha de controle. Os ensaios foram fotografados aos 10 e 30 minutos após a aplicação do substrato.
[234] Experimentos têm mostrado que o uso de água da torneira também produz resultados satisfatórios com o formato de semi-seco. A água da torneira dá um ligeiro aumento do sinal visual quando comparado com os outros dois solventes testados.
Tempo de Agitação
[235] No exemplo ilustrado na Figura 7, 1 g de ração peletizada (pellet) de ração foi extraído com 10 mL de água MilliQ e a extração prosseguiu durante 10 minutos sob agitação constante. No entanto, experimentos adicionais demonstraram que a simples agitação da extração por 5 minutos produz uma extração total da fitase BP17 na fase aquosa (Figura 8). Assim, a preparação da amostra de teste é um procedimento rápido e simples, gerenciável por um operador com um mínimo de treinamento.
[236] A Figura 8 exibe os resultados de amostras em intervalos de tempo diferentes. 1 grama de ração peletizada (pellet) foram adicionados a 10 mL de água MilliQ e a solução resultante foi amostrada em diferentes intervalos de tempo desde zero até 60 minutos. Após 5 minutos a extração parece ser suficiente para a realização dos ensaios.
[237] Em um aspecto, o operador irá encher um tubo de extração de amostra ou um saco até um nível predeterminado (marcado por uma linha no tubo) com a ração peletizada (pellet) e, em seguida, encher o tubo até uma segunda linha com água da torneira. As linhas serão marcadas de forma a otimizar a proporção ração/água. Embora uma proporção de 1:10 tem sido utilizada, esta proporção pode ser alterada para variar a concentração de enzima eficaz, se necessário.
[238] Nos experimentos apresentados na presente invenção uma mistura (mosto) de ração em branco (sem fitase BP17) foi usada e extraída conforme descrito acima e a fitase BP17 purificada foi adicionada a esta para fornecer quantidades definidas de enzima.
EXEMPLO 3 DESENVOLVIMENTO DO ENSAIO COM ANTICORPO DE CAPTURA E SUBSTRATO DE PRECIPITAÇÃO Substrato de Precipitação
[239] Para o ensaio de atividade foi identificado um substrato. Este substrato é um substrato de fosfatase ácida genérico usando um doador de fosfato (ácido 2-fosfo-L-ascórbico trissódico, AsAP) um intensificador de reação (metossulfato de fenazina, PMS) e uma espécie reativa (cloreto de nitroazul tetrazólio, NBT). Na presença destes produtos químicos e fosfatase ácida o sal de tetrazólio solúvel irá ser reduzido, resultando na produção de um precipitado insolúvel (a formazam derivado do sal de tetrazólio). No caso de nitroazul de tetrazólio, este resulta na formação de um precipitado de cor azul/púrpura.
Desenvolvimento do Formato de Ensaio
[240] Vários formatos foram analisados durante a fase de viabilidade do projeto.
Formato de fluxo passante
[241] Esta abordagem utiliza uma metodologia de “fluxo passante (flow-through)”. Em contraste com a metodologia padrão de fluxo lateral, um ensaio de fluxo passante envolve a aplicação da amostra diretamente no topo de uma membrana de nitrocelulose especializada (listrada com anticorpos anti fitase BP17) e a amostra é puxada através da nitrocelulose por meio de uma almofada absorvente subjacente. Após a aplicação da amostra, o substrato é aplicado da mesma maneira e o ensaio é então deixado desenvolver (Figura 11).
[242] A Figura 11 é uma representação esquemática do Formato Fluxo Passante. O formato da figura 11 é muito simples e fornece um resultado visualmente limpo. No entanto, para alguns aspectos, pode ser desejável ter um formato semiquantitativo ainda melhor. Assim, para facilitar o operador na interpretação dos resultados deste modo, decidiu-se produzir formatos de ensaio de múltiplas linhas em que o número de linhas ensaio visíveis após a conclusão do teste indicam os níveis de enzima presente na amostra.
Formato Bastão de Imersão (Dip Stick)
[243] Este formato adota a abordagem de linhas múltiplas. Inicialmente, a nitrocelulose foi listrada com 6 linhas de concentrações crescentes, e todo o bastão de ensaio foi submerso (mergulhado) na amostra de extrato de ração. Após a incubação, o bastão é lavado em água e, em seguida, a solução de substrato é aplicada e o teste é deixado desenvolver (Figura 12).
[244] Figura 12 - apresenta uma representação esquemática do Formato Bastão de Imersão (Dip Stick). Este formato foi muito fácil de executar e uma vantagem foi que não havia almofadas absorventes (pads) presentes no bastão de ensaio, o que significa que não foi necessária nenhuma manipulação do bastão de ensaio após a adição da amostra. O ensaio funcionou, mas há casos em que um resultado ainda melhor semiquantitativo é desejado. Aqui, todas as linhas de teste eram visíveis quando a enzima testada - fitase BP17 - estava presente, embora com intensidades visuais dose-dependentes. Idealmente as linhas de teste com baixas concentrações de anti-fitase BP17 não apareceriam quando desafiadas com amostras com baixo nível de fitase BP17, mas este não foi o caso (Figura 13).
[245] A Figura 13 mostra os resultados do ensaio no Formato Bastão de Imersão. Aqui, de nitrocelulose foi estriada com 6 linhas de teste em 4, 2, 1, 0,5, 0,25 e 0,125 mg/mL de anti-fitase BP17 (direita para a esquerda na foto). Os bastões de ensaio foram adicionados diretamente aos tubos de extração da ração (7 mL, com 0-1,0 U/mL de fitase BP17) e incubados durante 20 minutos sob agitação. Os bastões foram removidos, e rapidamente enxaguados em água MilliQ e o substrato foi adicionado aos bastões. Os ensaios foram deixados desenvolver por 30 minutos e em seguida fotografados. O resultado não parece ser semiquantitativo, e parece que uma elevada reação de fundo também foi observada, que foi proporcional à quantidade de fitase BP17 na amostra.
Formato Bastão de Absorção (Wicking Stick)
[246] Aqui foi usado um bastão de ensaio semelhante ao do Formato Bastão de Imersão, mas com a execução do ensaio de uma maneira diferente. Ao invés de submergir a todo o bastão de ensaio, aqui a amostra foi deixada migrar ao longo do bastão de ensaio por ação capilar. Uma vez completo, o substrato foi aplicado de uma forma similar e foi deixado que uma linha de teste se desenvolvesse (Figura 14).
[247] Figura 14 - apresenta uma representação esquemática do Formato Bastão de Absorção (Wicking Stick). Este formato de ensaio foi executado com a amostra verticalmente em um poço de placa de microtitulação e após a amostra ter sido absorvida o bastão foi removido do poço e colocado na horizontal para permitir a adição do substrato.
[248] Inicialmente, um ensaio com múltiplas linhas e várias quantidades de anti-fitase BP17 foi utilizado e foi demonstrado que a ordem em que a amostra se encontrava nas linhas era importante para o desenvolvimento do ensaio. Parecia que a fitase BP17 na amostra ligaria a primeira linha de teste, e se ainda houvesse fitase não ligada BP17, ela iria avançar para a segunda linha e assim por diante. Assim, se a primeira linha de teste continha um nível elevado de anticorpos anti-fitase BP17, então a maior parte da amostra pode se ligar a essa linha deixando pouca carga para se ligar as linhas subsequentes. Por outro lado, se a primeira linha encontrada continha níveis baixos de anticorpos, então esta linha pode rapidamente tornar-se saturada e a maioria das fitases BP17 iriam continuar para a próxima linha de teste (Figura 15). Isto mostra que o nível mais baixo de anticorpos deve de preferência estar mais próximo ao da região de colocação.
[249] A Figura 15 mostra os resultados do ensaio no Formato Bastão de Absorção. Aqui, a nitrocelulose foi estriada com linhas de ensaio a 4, 1 e 0,25 mg/mL de anti-fitase BP17. As amostras foram diluídas em água a 0,2, 0,05, 0,012, 0,006 U/mL de fitase BP17. As amostras absorvidas na NC pelo toque da extremidade na solução permite que a solução viaje pelo bastão por ação capilar. Duas orientações do bastão foram testadas: De 4 a 0,25 mg/mL, e 0,25-4 mg/ml. Após 10 minutos os bastões foram expostos a solução de substrato e deixou-se desenvolver durante 30 minutos. A orientação das concentrações da linha ensaio tem um impacto significativo sobre o sucesso do funcionamento do teste.
[250] Para simplificar o sistema de ensaio foram testadas várias linhas em concentração única de anti-fitase BP17. Inicialmente verificou-se que a grande maioria da fitase BP17 na amostra se ligou na primeira linha de teste. No entanto, este problema percebido foi contornado pela adição de reagentes de bloqueio na amostra, com a proteína caseína de leite demonstrando os melhores resultados (Figura 16).
[251] A Figura 16 mostra os resultados do ensaio no Formato Bastão de Absorção usando deferentes agentes de bloqueio. As amostras foram preparadas em 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025 U/mL de fitase BP17 e controle zero em extratos de mistura em branco (água ou caseína). Os bastões de ensaio foram colocados em poços de placas de microtitulação contendo 40 μL de amostras e foi deixado que amostra fosse absorvida pelo bastão durante 10 minutos. Os bastões foram secos com papel absorvente, na horizontal, e 40 μL de solução de substrato foram pipetados sobre a nitrocelulose. Os bastões foram deixados desenvolver por 30 minutos e em seguida fotografados (vide o Exemplo 6).
[252] Figura 17 - exibe os resultados relativos a variação na concentração da linha de teste para modular a natureza semiquantitativa do ensaio. (Formato Bastão de Absorção). Os resultados mostram que a concentração do anticorpo na linha ensaio influencia a natureza semiquantitativa do teste, e uma concentração de 0,4-0,6 mg/mL parece ser ótima para a especificação necessária e, portanto, mostra que a amostra é capaz de se deslocar entre os meios de captura.
[253] Em mais detalhe, a Figura 17 mostra os resultados da variação da concentração da linha teste para modular a natureza semiquantitativa do teste, usando o formato Bastão de Absorção. A nitrocelulose foi estriada em três linhas de teste com a mesma concentração, seja ela 0,4, 0,6, 0,8 ou 1,0 mg/mL de anti-fitase BP17. O extrato da mistura em branco foi preparado com 1 g de mistura em 10 mL de solução de caseína a 50 mg/mL e incubado durante 10 minutos em misturador de rolo. A fitase BP17 pura foi adicionada ao extrato de mistura a 0,2, 0,1, 0,05, 0,025,0,0125, 0,00625 e 0,003125 U/mL. 40 μL de amostras foram pipetadas nos poços de placas de microtitulação, os bastões foram inseridos e foi permitido que as amostras fossem absorvidas pelo bastão por ação capilar durante 10 minutos. Os bastões foram removidos, secos com papel absorvente, e 40 μL da solução de substrato foram pipetados sobre os bastões para o desenvolvimento da reação durante 30 minutos. A concentração do anticorpo na linha teste influencia a natureza semiquantitativa do ensaio, e uma concentração de 0,4-0,6 mg/ml parece ser ótima para a especificação exigida. Estes resultados mostram que, com o bloqueio adequado, a variação da concentração da linha ensaio pode ser usada para modular a natureza semiquantitativa do teste.
[254] Tal como acontece com o Formato Bastão de Imersão (DipStick), a vantagem do Formato Bastão de Absorção era que não havia almofadas absorventes (pads) presentes no bastão de ensaio e, portanto, o operador não precisaria manipular o bastão de teste nas adições pós-amostra e pré-substrato. No entanto, um formato vertical não pode ser altamente desejável para algumas utilizações, especialmente se o bastão precisa ser reorientado antes da adição do substrato.
[255] Para resolver esta questão, foi desenvolvido um formato horizontal com materiais muito semelhantes, sendo a única adição de uma almofada de amostra absorvente a montante da porção de nitrocelulose no bastão de ensaio. Esta abordagem deu um resultado de alta qualidade e abriu a possibilidade de um maior desenvolvimento, que não teria sido possível com o formato 2. Em alguns casos, a adição de bloqueadores pode ser necessária. Em alguns casos, pode ser que seja necessária a remoção da almofada de amostra antes da adição do substrato.
EXEMPLO 4 SUBSTRATOS DE TERTRAZÓLIO
[256] Neste exemplo, um substrato de tetrazólio foi testado, o cloreto de iodonitrotetrazólio (INT). Este substrato resultou em um precipitado vermelho na linha de teste (em vez de azul/roxo obtido com o NBT).
[257] A Figura 18 exibe uma comparação entre o NBT e INT com o ensaio no formato Bastão de Absorção (Wicking stick). Um extrato de mistura utilizada como branco foi preparada com 1 g de mistura (mosto) em 10 ml. 50 mg/mL de solução de caseína foi incubada durante 10 minutos no misturador de rolo. A fitase BP17 pura foi adicionada ao extrato de mistura a 0,4, 0,2, 0,1, 0,05, 0,025, 0,0125 e 0,00625 U/mL. 40 μL de amostras foram pipetadas nos poços de placas de microtitulação, os bastões foram inseridos e foi permitido que as amostras fossem absorvidas pelo bastão por ação capilar durante 10 minutos. A solução de INT foi feita em 4,45 mg/mL em tampão acetato, o que dá a mesma molaridade da solução de NBT. Os bastões foram removidos, secos com papel absorvente, e 40 μL da solução de substrato foram pipetados sobre os bastões que foram incubados durante 1 minuto. A solução de substrato foi então removida, os bastões foram secos com papel absorvente e deixados para desenvolverem a reação por 30 minutos.
[258] Como pode ser observado na Figura 18, os resultados mostraram que o uso de INT como substrato forneceu resultados semelhantes aos obtidos com o uso de NBT. Tanto NBT quanto INT foram usados indistintamente a partir deste ponto.
EXEMPLO 5 TIPOS DE NITROCELULOSE
[259] Como o formato horizontal foi considerado como um formato promissor um experimento foi realizado testando uma ampla gama de tipos de nitrocelulose a fim de determinar o mais adequado para este formato (Figura 19).
[260] A Figura 19 apresenta os resultados da avaliação de série de tipos de nitrocelulose a fim de determinar a mais apropriada. Uma variedade de tipos de nitrocelulose foram estriadas com três linhas de ensaio a 0,5 mg/mL de anti-fitase BP17. As amostras de fitase BP17 foram diluídas a partir da enzima purificada em extratos de mistura em branco (1 g em 10 mL de água) para dar 0,2 e 0,04 U/mL de fitase BP17 (mais apenas a ração que foi usada como controle zero). Os extratos foram pipetados sobre as almofadas (pads) de amostra dos bastões de ensaio e amostra foi deixada migrar ao longo do bastão por ação capilar. As pads de amostra foram removidas e 40 μL de substrato foram aplicados. O ensaio foi deixado prosseguir por 20 minutos e depois fotografados.
[261] Uma das membranas de nitrocelulose testada, a MDI 90 CNPH, apresentou os melhores resultados (vide a Figura 19) e, de fato ela foi a nitrocelulose de escolha, conforme determinado a partir dos experimentos anteriores com formatos anteriores. Esta nitrocelulose está prontamente disponível. Dois outros tipos de nitrocelulose (MDI SS12 12μ e SS12 15μ) também deram resultados satisfatórios. Todas as membranas testadas resultaram em uma resposta.
EXEMPLO 6 REAGENTES DE BLOQUEIO
[262] Até este ponto, o reagente de bloqueio (por exemplo, a caseína) foi adicionado à amostra, pós-extração. Decidiu-se que esta abordagem não era a ideal, uma vez que exige que solução seja fornecida com o ensaio final e exige que o operador adicione a mesma ao extrato da ração. Desse modo, foram realizados experimentos para resolver esta questão. A caseína pode ser de difícil dissolução em água. Entretanto, um sal de sódio de caseína foi encontrado por possuir vantagens neste quesito. Isto permitiu a possibilidade de acrescentar caseína de sódio em quantidades definidas diretamente na extração de ração. Esta abordagem foi funcional. No entanto, para alguns aspectos, esta abordagem pode ser ainda mais otimizada, uma vez que ela exige que quantidades definidas de caseína de sódio seja fornecida no tubo de extração de amostra, que pode ser deslocada durante o transporte e perdida durante a abertura do tubo. Por isso, decidiu-se testar a possibilidade de fornecer o reagente de bloqueio dentro do próprio bastão de ensaio.
[263] Os experimentos foram concebidos para colocar o reagente de bloqueio seco em uma almofada entre a almofada de amostra e a nitrocelulose.
[264] A Figura 20 exibe os resultados do ensaio de redução da concentração do agente bloqueador de caseína na presença de tensoativo (Tween-20)). As pads conjugadas de poliéster foram saturadas com soluções de caseína em várias concentrações e secas a 37 ° C. As padsforam então colocadas ‘a montante’ dos bastões de ensaio (juntamentoe com uma almofada de amostra adicional). A mistura em branco foi extraída em água (1 g em 10 ml.) e enzima purificada diluída nos extratos. As amostras foram pipetadas sobre a almofada de amostra que então fluiu através das pads contendo caseína e para os bastões de ensaio. As pads de amostra e conjugado foram removidas e 40 μL de substrato foram aplicados. Os ensaios foram deixados prosseguir por 20 minutos e depois fotografados. Foi observado o resultado surpreendente de que a presença de tensoativo sozinho foi o suficiente para permitir o que o ensaio fosse realizado satisfatoriamente. Assim, a almofada sem caseína não exibiu a mesma intensidade de cor como as pads com caseína.
[265] Encorajados por esta descoberta, os experimentos foram projetados para adicionar os reagentes de bloqueio diretamente na nitrocelulose de ensaio, a fim de determinar se esta abordagem também daria um resultado satisfatório.
[266] A Figura 21 mostra os resultados obtidos através da adição dos reagentes de bloqueio diretamente na nitrocelulose de ensaio para avaliar se resultados satisfatórios poderiam ser obtidos.
[267] Em mais detalhes, a Figura 21 ilustra os resultados de um experimento com a adição dos reagentes de bloqueio diretamente à nitrocelulose. Tiras de nitrocelulose foram incubadas em várias soluções de caseína/Tween durante 5 minutos e, em seguida, secas a 55 °C durante 10 minutos. A nitrocelulose foi laminada para o cartão de suporte com a almofada de amostra não tratada (sem almofada de conjugado). Um conjunto de bastões de controle com NC não bloqueada e almofada com conjugado caseína/Tween também foi construído. As amostras de fitase BP17 foram diluídas a partir da enzima purificada em extrato de mistura em branco (1 g em 10 mL de água) para dar 0,2 e 0,04 U/mL de fitase BP17 (mais apenas a ração que foi usada como controle zero). Os extratos foram pipetados sobre as almofadas (pads) de amostras dos bastões de ensaio e amostra foi deixada migrar ao longo do bastão por ação capilar. As pads de amostra e de conjugado foram removidas e 40 μL de substrato foram aplicados. Os ensaios foram deixados prosseguir por 20 minutos e depois fotografados.
[268] Mais uma vez uma situação em que o agente tensoativo sozinho, na ausência de caseína, deu excelentes resultados (Figura 21).
[269] Uma diluição em série em várias concentrações de fitase BP17 foi testada com NC bloqueada e tensoativo sozinho com os substratos INT e NBT para testar a sensibilidade deste método.
[270] Figura 22 exibe os resultados de uma diluição seriada em várias concentrações de fitase BP17 testada com NC bloqueada e tensoativo sozinho com os substratos INT e NBT para testar a sensibilidade deste método. Uma nitrocelulose em tira foi incubada em solução de Tween-20 a 0,25% durante 5 minutos e, em seguida, seca a 55 °C por 10 minutos. As amostras de fitase BP17 foram diluídas a partir da enzima purificada em extrato de mistura em branco (1 g em 10 mL de água) para dar uma série de diluições de 0,4 - 0,0015 U/mL de fitase BP17 (mais apenas a ração que foi usada como controle zero).
[271] Em mais detalhes, a Figura 22 exibe os resultados deste experimento. Uma nitrocelulose em tira foi incubada em solução de Tween-20 a 0,25% durante 5 minutos e, em seguida, seca a 55 °C por 10 minutos. As amostras de fitase BP17 foram diluídas a partir da enzima purificada em extrato de mistura em branco (1 g em 10 mL de água) para dar uma série de diluições de 0,4 - 0,0015 U/mL de fitase BP17 (mais apenas a ração que foi usada como controle zero). Os extratos foram pipetados sobre as almofadas (pads) de amostras dos bastões de ensaio e amostra foi deixada migrar ao longo do bastão por ação capilar. As pads de amostra e de conjugado foram removidas e 40 μL de substrato (a base de NBT e INT) foram aplicados. Os ensaios foram deixados prosseguir por 20 minutos e depois fotografados. Os resultados mostram que ambos os substratos tiveram desempenho similares e a sensibilidade geral e natureza semiquantitativa do método pareceram excelentes.
[272] O apelo de um método para bloquear diretamente a nitrocelulose com tensoativo é que esta abordagem elimina a necessidade de incluir uma “almofada de bloqueio” secundária no bastão de ensaio e, portanto, elimina um nível de complexidade em relação à montagem do ensaio. Além disso, a inclusão do reagente de bloqueio no próprio teste anula a necessidade do operador fazer alguma outra etapa além da de adicionar ração e água a um tubo vazio para a preparação da amostra.
[273] O bastão de ensaio produzido é um projeto muito simples, onde ele composto de tiras de nitrocelulose estriada com três linhas de anticorpos anti-fitase BP17, todos na mesma concentração e bloqueou, após a estriagem, com 0,1% de solução Tween-20 em água acoplada a uma almofada de amostra não tratada em branco.
EXEMPLO 7 EXPERIMENTOS DE ENTREGA DE SUBSTRATO
[274] Em todos os experimentos detalhados acima a solução de substrato foi adicionada por mistura dos três componentes juntos (AsAP, PMS e tetrazólio, INT ou NBT) imediatamente antes da utilização. A fim de simplificar este procedimento para o operador, foram realizados experimentos com o intuito de secar estes componentes no formato de ensaio final. Isto significaria que o operador não seria responsável pela composição do substrato e anularia a exigência de fornecimento de componentes de ensaio líquidos.
[275] Os experimentos iniciais foram realizados em que diversos componentes de substrato foram misturados e utilizados para saturar pads absorventes após secagem e armazenamento a 37 °C e os resultados são exibidos na Figura 23.
[276] A Figura 23 exibe os resultados obtidos quando o ensaio de secagem e armazenamento de vários componentes de substrato foram misturados juntos. Pedaços de 1 centímetro quadrado de absorvente foram embebidos em diversas combinações de substratos (pré-misturados) durante 5 minutos. As pads foram secas com papel absorvente e colocadas em uma incubadora a 37 °C. Em 30 minutos as pads foram consideradas secas, e este ponto foi determinado como Tempo=0’. As pads foram monitoradas em intervalos regulares de tempo, procurando especificamente alterações de cores que tendiam para roxo (NBT) ou vermelho (INT). São mostrados os resultados para o tempo zero e durante a noite.
[277] Neste experimento, pedaços de 1 centímetro quadrado de absorvente foram embebidos em diversas combinações de substratos (pré- misturados) durante 5 minutos. As pads absorventes foram secas com papel e colocadas em uma incubadora a 37 °C. Em 30 minutos as pads foram consideradas secas, e este ponto foi determinado como Tempo=0’. As pads foram monitoradas em intervalos regulares de tempo, procurando especificamente alterações de cores que tendiam para roxo (NBT) ou vermelho (INT). São mostrados os resultados para o tempo zero e durante a noite na Figura 23. Depois da incubação de um dia para o outro parece que as combinações mais utilizáveis são: NBT ou INT sozinhos; AsAP + PMS; PMS; AsAP + INT parece ser moderadamente estável, e mais estável do que AsAP + NBT.
[278] A partir deste experimento ficou evidente que a mistura da solução de tetrazólio, NBT ou INT, ou a mistura com qualquer um dos outros componentes de ensaio resultou na eventual precipitação do tetrazólio ao longo do tempo.
[279] Também foi demonstrado que a mistura e secagem do AsAP e PMS apareceu estável ao longo do tempo. Experimentos para utilizar todos estes componentes secos foram realizados, pois há experimentos em que alguns dos componentes de substrato são secos, enquanto que outros são usados em solução. Parece possível que todos os componentes de ensaio possam ser fornecidos na forma seca. Potencialmente o uso de uma amostra aquosa pode reidratar os componentes secos.
[280] Assim, na Figura 6 (ou seja, um exemplo de um ensaio no formato Seco), o usuário (operador) simplesmente adiciona a amostra e revela o teste. Nesta Figura, ácido 2-fosfo-L-ascórbico trissódico = AsAP; o intensificador de reação metossulfato de fenazina = PMS; matriz de nitrocelulose = NC, e substrato de tetrazólio cloreto de iodonitrotetrazólio = INT.
EXEMPLO 8 FORMATO SECO
[281] Foram realizados experimentos de modo secar todos os componentes de ensaio no ensaio a fim de que o operador simplesmente necessite adicionar um extrato ao ensaio e, em seguida, ler o resultado, sem quaisquer acréscimos ou manipulações. Aqui as almofadas (pads) com todos os componentes secos, poderá ser incorporada em várias partes do sistema de ensaio. Tal como foi mostrado anteriormente, todos os três componentes não podem ser pré-misturados e secos em uma única almofada, e por isso um ensaio com um sistema em que os vários componentes podem ser separados, ou, pelo menos, utilizando combinações que são estáveis, deve ser determinada bem como as suas posições variadas dentro do teste. Um exemplo de tal ensaio contemplado pode ser visto na Figura 6. Assim, a Figura 6 apresenta um diagrama de um ensaio no Formato Seco.
[282] No ensaio no Formato Seco da Figura 6, o operador simplesmente adiciona a amostra e revela o teste. Um ensaio final poderia ser alojado em um estojo ou cassete e o único contrapeso representado na Figura 6 não seria necessário. No exemplo ilustrado o PMS/AsAP está seco na nitrocelulose e uma almofada de nylon de INT é colocada de forma segura na parte de cima. A amostra é adicionada como habitual, e esta é a própria solução da amostra que hidrata os componentes do substrato.
EXEMPLO 9 FORMATO SEMI-SECO
[283] Como uma alternativa para o Formato seco (acima), experimentos onde alguns dos componentes foram fornecidos em uma forma seca e outros permanecem em solução foram realizados. Isso produziu um sistema de ensaio conhecido como o Formato Semi-Seco.
[284] No formato semi-seco a amostra é executado ao longo do bastão horizontal como antes, e uma vez concluído a solução de tetrazólio é pipetada diretamente sobre a nitrocelulose do teste. Esta é então coberta com uma almofada de nitrocelulose contendo AsAP/PMS secos e o ensaio é deixado desenvolver. Esta abordagem é ilustrada na Figura 3 (Etapas envolvidas no Formato Semi-Seco).
[285] Este formato tem diversas vantagens. O operador não tem que preparar os reagentes de substrato antes do ensaio, e embora o formato exija que a solução de tetrazólio seja fornecida, ela necessita simplesmente ser adicionada 'direto da garrafa. Uma das vantagens observadas com este formato é que a necessidade da remoção da almofada absorvente é eliminada. Parece que a presença da almofada AsAP/PMS corrige o precipitado no lugar e, mesmo na presença da almofada de amostra, o precipitado resultante não migra.
[286] Uma comparação entre o Formato Semi-Seco e o formato anterior (totalmente em solução) é mostrada na Figura 24.
[287] A Figura 24 exibe uma comparação entre o formato semi- seco e o formato totalmente em solução. As amostras de fitase BP17 foram diluídas a partir da enzima purificada em extrato de mistura de ração em branco (1 g em 10 mL de água) para dar uma série de diluições de 0,4 - 0,0015 U/mL de fitase BP17 (mais apenas a ração que foi usada como controle zero). Os extratos foram pipetados sobre as almofadas de amostras dos bastões de ensaio e amostra foi deixada migrar ao longo do bastão por ação capilar. Para o formato Totalmente em Solução as pads de amostra foram retirados e 40 μL de substrato completo foi aplicado. Para o formato Semi-Seco 20 μL da solução INT foram adicionados à nitrocelulose de teste e uma almofada de PMS/AsAP foi colocado sobre a parte de cima. Os ensaios foram deixados prosseguir por 20 minutos e depois fotografados.
[288] Os resultados do experimento da Figura 24 mostram que a sensibilidade do método Semi-Seco é aceitável no que diz respeito às especificações do ensaio.
[289] A fim de que este formato Semi-Seco seja aceitável, é importante que a solução de tetrazólio permaneça estável durante o período de vida útil proposto do ensaio final. Foram iniciados experimentos para resolver esta questão. Os resultados de tal experimento são apresentados na Figura 25.
[290] No experimento da Figura 25, as amostras de fitase BP17 foram diluídas a partir da enzima purificada em extrato de mistura de ração em branco (1 g em 10 mL de água) para dar 0,2 e 0,04 U/mL de BP17. O INT foi preparado a 40 mg/mL em metanol 50%, tampão acetato 0,125 M aquecido a 60 °C para a dissolução. Esta solução estoque foi diluída para 10 mg/mL em 0,25 M de tampão de acetato. As alíquotas foram guardadas congeladas a -20 °C, em temperatura ambiente (RT) e a 55 °C. 40 μL de cada extratos foram pipetados sobre as almofadas de amostras dos bastões de ensaio e amostra foi deixada migrar ao longo do bastão por ação capilar. Os ensaios foram realizados em triplicatas. 20 μL de solução INT foram pipetados à NC de ensaio e uma tira de NC PMS/AsAP foi colocada em cima. O ensaio foi deixado prosseguir por 20 minutos e então foi fotografado. Um ensaio “tempo = zero” foi realizado imediatamente com a solução INT preparada na hora para fornecer o sinal basal (de referência). Após 14 dias, as amostras congeladas, em temperatura ambiente (RT) e a 55 °C foram comparadas visualmente para fornecer uma comparação da estabilidade das soluções INT. Após 14 dias nenhuma deterioração da solução INT foi observada na amostra RT ou 55 °C. Com o teste a -20 °C, o sinal foi menor do que as outras temperaturas, o que se acredita ser devido a alguma precipitação do INT durante o armazenamento e descongelamento.
[291] Assim, após 2 semanas nenhuma diferença na atividade foi notada entre todas as temperaturas, o que sugere que a solução de tetrazólio tem uma boa estabilidade ao longo do tempo (Figura 25).
EXEMPLO 10 KIT
[292] A Figura 29 ilustra o uso de um dispositivo/kit/ensaio da invenção.
[293] No painel 1 da Figura 29, um saco de coleta é preenchido com a amostra até a primeira linha indicada, em seguida, o saco é preenchido com água até a segunda linha indicada.
[294] No painel 2 o saco é selado e agitado até que a amostra seja quebrada.
[295] No painel 3 a carcaça (como para um exemplo de realização 1, ilustrado na Figura 1) é aberta como um livro.
[296] No painel 4 de uma pipeta é preenchida com algum extrato da amostra a partir do saco, e é aplicada sobre a região de colocação sobre a carcaça.
[297] No painel 5 o utilizador aguarda até que o líquido tenha migrado para o topo do bastão. Isso pode ser indicado por uma mudança de cor.
[298] No painel 6 um ou mais componentes dos meios de indicação seletiva são adicionados ao dispositivo.
[299] No painel 7 a dispositivo (carcaça) é fechado e selado.
[300] No painel 8 a carcaça é colocada sobre uma superfície plana para desenvolver a reação.
[301] No painel 9, uma, duas e três linhas de resultado são mostradas.
EXEMPLO COMPARATIVO Formato 2 - Ensaio tipo sanduíche de anticorpo conjugado com ouro
[302] O sanduíche de anticorpo conjugado de ouro ilustrado na Figura 5 discrimina entre amostras de alimentos contendo alto e baixo nível de atividade de fitase BP17. A força do sinal gerada neste ensaio pode ser atenuada pela da inclusão de anticorpos livres anti-fitase BP17, as concentrações destes Acs demonstraram ser capazes de deslocar a resposta linear do ensaio no intervalo de atividade fitase BP17 desejado.
[303] No entanto, com esta metodologia, o soro policlonal de coelho anti-fitase BP17 empregado reage com a enzima nativa e desnaturada.
[304] Além disso, com o ensaio sanduíche com ouro houve a suspeita de que a amostra inativa foi sendo depletada de enzima, e que o processo de inativação destruiu a enzima ao invés levar a uma simples inativação.
[305] Para resolver esta questão, SDS-PAGE e Western blotting das amostras foram realizados e demonstraram que esta teoria estava correta e que as amostras inativas foram efetivamente depletadas de enzima (Figura 9).
[306] Figura 9 refere-se ao SDS-PAGE e Western blot de amostras de alimentos e fitase BP17 purificada. Os resultados mostraram que os pellets “Trial 5” tinham muito pouca fitase BP17 detectável em comparação com a mistura (mosto), e que a fitase BP17 inativa não teve a banda da fitase BP17 discernível (embora uma mancha geral de material tenha sido observada por Western blot). A fitase BP17 purificada e a fitase BP17 ativa (linhas 9 e 10) deram uma banda forte na coloração de proteína, mas resultaram em uma infinidade de bandas no Western Blot, provavelmente devido a níveis de fundo de multímeros da fitase BP17 e produtos da degradação, e nenhuma destas bandas foi encontrada com a amostra inativada pelo calor (linha 8).
[307] De modo mais detalhado, a Figura 9 mostra os resultados do SDS-PAGE e Western blotting de amostras de alimentos e fitase BP17 purificada. Amostras de fitase BP17 ativo e inativo foram 30 vezes concentradas utilizando microconcentradores. Os pellets e a mistura a partir da “Trial 5” foram usados, pois haviam demonstrado possuir alto nível de fitase BP17 na mistura e quantidades insignificantes nos pellets processados. Os pellets e a mistura de alimentos foram extraídos em água MilliQ por 10 minutos e as extrações resultantes submetidas a SDS-PAGE. As proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose e coradas para a proteína total com Ponceau S (painel da esquerda). O blotting foi sondado com anticorpo primário anti-fitase BP17, seguido pelo anticorpo secundário de cabra anti-coelho biotinilado e visualizado com o conjugado estreptoavidina-Qdot 625 (Invitrogen). Os resultados mostraram que os pellets “Trial 5” tinham muito pouca fitase BP17 detectável em comparação com a mistura, e que a fitase BP17 inativa não teve a banda da fitase BP17 discernível (embora uma mancha geral de material tenha sido observada por Western blot). A fitase BP17 purificada e a fitase BP17 ativa deram uma banda forte na coloração de proteína, mas resultaram em uma infinidade de bandas no Western Blot, provavelmente devido a níveis de fundo de multímeros da fitase BP17 e produtos da degradação, nenhuma das quais foi encontrada com a amostra inativa.
[308] Este achado coloca em dúvida a validade do ensaio com ouro na determinação dos níveis de enzima ativa em uma determinada amostra.Embora pareça provável que a fitase BP17 experimentalmente inativado e o alimento com baixa atividade de fitase BP17 pós-processamento sejam mecanicamente comparáveis (ou seja, a fitase BP17 sendo destruída em ambos os casos), o ensaio à base de ouro não seria capaz de detectar uma situação em que a inativação da fitase BP17 tivesse ocorrido pela desnaturação ao invés da destruição.
[309] Para testar isto o inibidor específico de fitase BP17 Hexasulfato de Mioinositol (MIHS) foi utilizado para inibir a atividade da fitase BP17 sem destruir a enzima. Aqui, o ensaio com ouro ainda foi capaz de detectar a presença da enzima inibida enquanto que o ensaio de atividade demonstrou uma grande diminuição de sinal (Figura 10).
[310] A Figura 10 exibe uma comparação do formato de sanduíche com ouro (Formato 2) e o formato de atividade da enzima pela Precipitação de Substrato (Formato 1 - ou seja, o ensaio da presente invenção), usando o inibidor específico de fitase BP17 - MIHS.
[311] Os resultados para o ensaio tipo sanduíche com ouro são apresentados na Figura 10 - na parte superior. Aqui, a fitase BP17 purificada foi preparada em tampão de glicina-HCI 75 mM, pH 2,5 em diversas concentrações, com ou sem MIHS - 2,5 mM e foi incubada durante 20 minutos antes do ensaio. Os ensaios com ouro foram executados contra amostras de 100 μL.
[312] A título de comparação, os ensaios de precipitação de substrato também estão apresentados na Figura 10 - parte inferior. Os ensaios de precipitação de substrato foram executados contra amostras de 40 μL em diversas concentrações. 40 μL de MIHS 2,5 mM em 75 mM de tampão de glicina (ou apenas tampão no controle) foram aplicados às tiras de ensaio e incubados durante 15 minutos. A solução foi então removida e uma solução de substrato (AsAP, PMS, cloreto de nitroazul tetrazólio (NBT) em 2% de Tween-20) foi adicionada. Esta foi incubada durante 1 minuto, e removida e permitiu-se o desenvolvimento dos bastões de ensaio. O ensaio foi fotografado após 20 minutos. Os resultados sugerem que o ensaio com ouro detecta a fitase BP17 estando ela inibida ou não, enquanto que o ensaio de precipitação de substrato claramente detecta apenas a enzima ativa.
[313] A partir da Figura 10, que é uma comparação do formato tipo sanduíche com ouro e o formato de atividade da enzima pela Precipitação de Substrato usando o inibidor específico da fitase BP17 MIHS (que inibe a atividade da fitase BP17 sem destruir a enzima), pode-se observar que o ensaio com ouro (em cima) ainda era capaz de detectar a presença da enzima inibida, enquanto que o ensaio de atividade (em baixo) mostrou uma grande diminuição de sinal.
[314] Assim, o formato tipo sanduíche de anticorpo conjugado com ouro (Figura 5) apenas detecta a presença da enzima e não a sua atividade. A inativação funcional da fitase BP17 com um inibidor específico ainda fornece um resultado positivo com este tipo de ensaio.
[315] Estes resultados demonstram claramente a necessidade de um ensaio em que a atividade de uma enzima como a fitase BP17 possa ser diretamente mensurada, ao invés de confiar na suposição de que a enzima está ativa simplesmente porque ela ainda está presente. O dispositivo de ensaio da presente invenção satisfaz essa necessidade.
[316] Os documentos WO 2005/014847 e WO 2007/001895 descrevem um ensaio que é baseado no mesmo princípio que o ensaio com ouro. Supostamente, os ensaios só detectam a fitase ativa com a medição do alimento tratado termicamente com o kit de ELISA descrito. Isto pode não ser correto, pois a fitase é destruída e removida juntamente com a matriz alimentar na preparação da amostra. O kit pode, consequentemente, não ser realmente capaz de discriminar entre a fitase ativa que está presente da fitase não-ativa que está presente.
PARTE 2
[317] Nestes experimentos nós fornecemos detalhes sobre a metodologia de detecção para detectar a xilanase ativa em uma amostra usando o dispositivo e os métodos da presente invenção.
EXEMPLOI
[318] A metodologia utilizada neste exemplo é um sistema de detecção baseado em uma metodologia de açúcares redutores. A este respeito, adaptou-se a metodologia descrita em Chong et al “Determination of reducing sugars in the nanomole range with tetrazolium blue” (Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115). Nesse método (que é um ensaio em placa), um açúcar redutor (tal como a xilose) é detectado por meio do aquecimento (95 °C durante 3 minutos ou a 55 °C por 1 hora), da amostra de açúcar com cloreto de tetrazólio azul e tartarato de sódio e potássio em NaOH.
[319] Na nossa metodologia para detectar a xilanase ativa em uma amostra usando o dispositivo e os métodos da presente invenção, nos detectamos a produção do açúcar redutor (por exemplo, a xilose) pela atividade enzimática da xilanase em seu substrato xilano pela incubação à temperatura ambiente pela substituição de cloreto de azul de tetrazólio por cloreto de nitroazul de tetrazólio. O cloreto nitroazul de tetrazólio é da mesma família de substrato que é utilizado na metodologia da fitase descrita na Parte 1 (acima).
[320] Os dados são apresentados na Figura 26. A este respeito: Fileira superior (da Figura 26), da esquerda para a direita: Xilose pura (5 μL solução de 1%), seguido por diluições duplicantes (0,5-0,0001% xilose) e um controle de zero no lado mais à direita. Fileira inferior (da Figura 26), da esquerda para a direita: Ensaios de xilanase contendo 5 μL de xilanase a 10 U/mL no primeiro poço, seguido por diluições duplicantes da enzima (5-0,001 U/ml de xilanase) e um controle de zero no lado mais à direita. Cada poço continha 5 μL de xilano 1% (substrato), em tampão de acetato (0,25 M, pH 4,5). Após a xilanase e o xilano serem misturados em cada poço, a placa foi incubada durante 60 minutos a 37 °C para permitir que a enzima reagisse com o seu substrato.
[321] Em nossa metodologia, 200 μL de 'solução de revelação' foram adicionados a cada poço e a placa colocada a 55 °C durante 1 hora e depois fotografadas. A solução de revelação contém 1 mg/mL de azul de tetrazólio, 0,5 M de tartarato de sódio e potássio e 0,05 M de NaOH.
[322] Nossa metodologia de açúcares redutores detecta 5 μL de 0,031% xilose (linha superior, poço 6 do lado esquerdo) e cerca de 5 μL de xilanase a 0,1 U/mL no ensaio enzimático (linha inferior, poço 7 do lado esquerdo).
EXEMPLO II
[323] A metodologia utilizada neste exemplo também é um sistema de detecção baseado em uma metodologia de açúcares redutores. A metodologia utilizada neste Exemplo é a mesma utilizada para o Exemplo i na linha superior (xilose 1-0,0001%) - exceto que o azul de tetrazólio foi substituído por nitroazul de tetrazólio e a reação foi deixada desenvolver em temperatura ambiente durante 60 minutos. Os dados são apresentados na Figura 27.
EXEMPLO III
[324] A metodologia descrita no Exemplo I ou Exemplo II pode ser utilizada em um dispositivo de ensaio ou método de acordo com a presente invenção para detectar a xilanase ativa em uma amostra. A este respeito, a metodologia de detecção da xilanase é incorporada em um ensaio rápido, semelhante ao descrito na Parte 1 (acima).
[325] Assim, de um modo semelhante ao ensaio da fitase mencionado acima, a xilanase a partir de um extrato de alimento complexo é capturado em um anticorpo produzido contra uma xilanase desejada ou apropriada. No método, a enzima xilanase é exposta ao substrato xilano e a xilose resultante produzida é detectada, por exemplo, pelo ensaio do açúcar redutor com tetrazólio. A Figura 28 apresenta uma representação esquemática deste método.
[326] Todas as publicações mencionadas no relatório descritivo acima são incorporadas ao presente pela referência. Várias modificações e variações dos métodos e sistemas descritos na presente invenção serão evidentes e óbvias para os técnicos hábeis no assunto sem se afastar do escopo e espírito da presente invenção. Embora a presente invenção tenha sido descrita em relação aos exemplos de realizações específicos preferidos, deve-se compreender que a presente invenção, conforme reivindicado, não deve ser indevidamente limitada a tais exemplos específicos. De fato, pretende-se que as várias modificações nas realizações da invenção que são óbvias para os técnicos hábeis nas áreas de bioquímica ou campos relacionados, estejam inclusas no escopo das reivindicações a seguir.

Claims (15)

1. DISPOSITIVO DE ENSAIO (1) PARA DETECÇÃO DE ENZIMA ATIVA em uma amostra, caracterizado por compreender: (a) uma região de colocação (10) na qual a amostra pode ser colocada; (b) uma matriz (20) operacionalmente ligada à referida região de colocação (10) de tal modo que a amostra quando presente, tal como colocada, sobre a referida região de colocação (10) pode migrar ao longo da referida matriz (20); (c) pelo menos um local de captura distinto (30) sobre a referida matriz (20), em que cada local de captura distinto (30) é levado para longe da região de colocação (10), e em que a amostra pode migrar através do referido local de captura distinto (30); (d) meios de captura (40) estando presentes no ou definindo cada local de captura distinto (30), em que os referidos meios de captura (40) são capazes de ligar à referida enzima de modo que pelo menos uma porção da referida amostra da referida enzima é retida em pelo menos um local de captura distinto (30); (e) meios de indicação seletiva (50) ou pelo menos um componente deste para fornecer indicação seletiva da presença de enzima ativa ligada aos referidos meios de captura (40), em que os meios de indicação seletiva (50) compreendem um reagente ou espécies reativas; e (f) um substrato de referida enzima, em que referido substrato está ligado ao dispositivo de ensaio (1); em que referida enzima atua sobre referido substrato para gerar um grupo reativo; adicionalmente em que referido grupo reativo atua sobre referido reagente ou espécies reativas para gerar um efeito funcional.
2. DISPOSITIVO (1), de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela referida região de colocação (10) ser uma almofada absorvente, em que a referida região de colocação (10) está em uma extremidade da referida matriz (20).
3. DISPOSITIVO (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por compreender múltiplos locais de captura distintos (30).
4. DISPOSITIVO (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por compreender um reagente de bloqueio,em que o referido reagente de bloqueio está diretamente ligado ao referido dispositivo (1), em que o referido reagente de bloqueio compreende tensoativo.
5. DISPOSITIVO (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pela matriz (20) compreender nitrocelulose.
6. DISPOSITIVO (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo reagente ou espécies reativas ser(em) um composto tetrazólio.
7. DISPOSITIVO (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo referido substrato ser um substrato fosfatase utilizando/possuindo um doador de fosfato.
8. DISPOSITIVO (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelos meios de captura (40) serem anticorpos.
9. DISPOSITIVO (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pela referida amostra ser derivada de um alimento ou um aditivo alimentar.
10. DISPOSITIVO (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pela referida enzima ser uma fosfatase ácida.
11. DISPOSITIVO (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pela referida migração ser em uma direção longitudinal e em que os referidos locais de captura (30) são perpendiculares ao fluxo migratório da amostra.
12. DISPOSITIVO (1), de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por ser uma tira ou um bastão.
13. MÉTODO DE DETERMINAÇÃO DA PRESENÇA DE ENZIMA ATIVA em uma amostra, caracterizado pela amostra ser colocada na região de colocação (10) do dispositivo de ensaio (1) conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12 e os meios de indicação seletiva (50) do referido dispositivo (1) indicarem se enzima ativa está presente.
14. KIT, caracterizado por compreender o dispositivo de ensaio (1) conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 12.
15. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado por compreender as etapas de: (a) contato de pelo menos uma porção da amostra com um meio de captura (40) pelo qual a enzima é capturada pelo referido meio de captura (40); (b) fornecimento de um substrato adequado para a enzima capturada, em que o referido substrato reage com a referida enzima capturada para produzir um produto de enzima; (c) fornecimento de uma espécie reativa capaz de reagir com o produto de enzima, em que a referida espécie reativa reage com o referido produto de enzima para produzir um produto insolúvel; e (d) detecção do produto insolúvel obtido na etapa (c) em que a referida detecção se correlaciona com a presença e/ou quantidade de uma enzima ativa na referida amostra.
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