CN103649754A - 测定法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了用于检测样品中的活性酶的测定装置(1)。所述测定装置(1)包含以下组件：(a)其上可放置样品的放置区(10)；(b)基质(20)，其与所述放置区(10)可操作连接，使得样品当出现(例如放置)在所述放置区(10)时可沿所述基质(20)迁移；(c)在所述基质(20)上的至少一个独特捕获位置(30)，其中各独特捕获位置(30)远离放置区(10)，以及其中样品可跨越所述独特捕获位置(30)迁移；(d)存在于各独特捕获位置(30)或者界定各独特捕获位置(30)的捕获工具(40)，其中所述捕获工具(40)能够与所述酶结合，使得所述酶的所述样品的至少一部分保留在至少一个独特捕获位置(30)；和(e)提供与所述捕获工具(40)结合的活性酶存在情况的选择性指示的选择性指示工具(50)或者其至少一个组分。
Description
发明领域
本发明涉及酶测定法的领域。
具体而言，本发明涉及酶活性条(strip)测定法。
更具体而言，本发明涉及使用所述测定法的测定装置和方法以及所述方法的用途。所述测定装置和测定法可检测活性酶。所述活性酶可以是诸如植酸酶或酸性磷酸酶等磷酸酶，或者是糖苷水解酶，例如木聚糖酶、β-葡聚糖酶或淀粉酶。在一个更优选的方面，所述活性酶为植酸酶。
本发明对用于多种工业应用有用，例如检测生物燃料生产、去污剂组合物中的活性酶以及检测食品和动物饲料中的活性酶。
发明背景
测定分析物特别是酶的存在与否，在实验室以及在如食品和动物饲料、生物燃料生产及洗衣皂和洗衣粉等多个领域中时常为必需的。通常将诸如免疫测定法等测定法用于此目的。
酶联免疫吸附测定法(ELISA)可用于检测样品中抗体或抗原的存在情况。在所述方法中，抗体与固定在表面的抗原结合，反之亦然。此抗体与可产生可检测信号的酶连接，所述可检测信号通常为颜色变化。
另一种常见类型的测定法或免疫测定法为侧流测定法。在所述测定法中，检测沿固体支持物流动的样品中分析物的存在情况。分析物或者诸如抗体等与所述分析物结合的试剂，然后与支持物中已用抗原或抗体处理过的线或区结合。
ELISA和侧流测定法二者亦可以是夹心测定法。这意味着样品首先与捕获抗体接触，所述捕获抗体与待测抗原结合。然后所述抗原与另外的抗体结合，在侧流测定法的情况下所述抗体可能位于固定的测试线。由此所述抗原夹在至少两种抗体之间。所述第二抗体与可检测信号相关。
许多上述类型的测定法或免疫测定法确定特定酶的存在情况。
然而，在一些样品中，酶虽然存在但是已通过例如热或化学灭活而失活。在所述情况下，现有测定法仍然检出酶的存在。
例如，US4425438描述使用柱而不是侧流系统的测定法。样品流过覆盖有分析物吸收剂的珠粒区。其中分析物结合发生的区得到分析物量的测定。另一种柱测定法在US5073484中描述，其中液体分析物的定量测定利用沿流动路径的间隔区进行。
例如在US5451504中描述的侧流装置，通常具有不同的区用于样品的沉积、分析物的捕获或固定以及捕获分析物或分析物复合物的检测。这类装置并未定量所述分析物或者当分析物为酶时未确定活性。
在US6183972中公开的侧流测定法使用多个捕获位置或捕获带来捕获标记的抗分析物抗体并提供可检测信号。所述带提供独特的信号模式，其当以数学法组合以产生单调的剂量-反应曲线时，指示样品中分析物的浓度。
US5229073描述一种侧流测定法，其使用多个捕获位置以半定量样品中分析物的量。
大分子(例如>3000道尔顿)可利用US6358548的侧流装置检测。根据所述实施方案，捕获位点处线条数的色度(colour intensity of number of lines)给出分析物的量的指示。
US7425302公开了其中反应物为干燥的的侧流法。加入液体样品使干反应物复溶。此方法基于颜色变化的强度定量分析物。特定酶G6PD的活性通过发生颜色变化所耗费的时长来确定，该时长为G6PD与其底物反应的迅速程度的衡量。然而，US7425302的方法特别地限于G6PD并且酶并未保留在不同的捕获位置。
WO2005/014847描述标准侧流夹心免疫测定法检测诸如植酸酶、木聚糖酶和淀粉酶等酶的用途。通过所得颜色变化的强度可至少部分地确定所述酶的量。WO2007/001895描述胶体金夹心测定法，其特别地用于检测大肠杆菌(E. coli)植酸酶。此胶体金夹心测定法包含免疫识别植酸酶的第一单克隆抗体和缀合至检测工具的第二抗体。
因此，先前使用的某些测定法可能仅提供样品中酶的定量测定，但并不能确定所述酶的活性或者不能特异地鉴别活性酶。其它测定法需要对捕获条带进行复杂的数学分析以确定分析物浓度。
因此需要仅检测酶的活性形式的测定法。如果该测定法可提供至少某些半定量信息，其亦将是有利的。
本发明试图克服先有技术装置和方法的某些问题。
现在将阐述本发明。为便于参考的目的，我们在一个或多个标题下阐述本发明的要素。要注意的是，各标题下的教导亦适用于其它标题下的教导。例如，各阐述的关于本发明装置的优选要素和方面同样是关于本发明方法或者本发明用途的优选要素或方面。同样，各阐述的关于本发明的方法或用途的优选要素和方面同样是关于本发明的装置的优选要素或方面。
概述方面
在大的方面，本发明涉及检测样品中活性酶的酶测定法和装置，以及涉及用于确定样品中活性酶的存在情况的方法。
具体而言，本发明涉及用于进行所述测定法、特别是侧流测定法的装置和试剂盒，以及用于进行侧流测定法和免疫测定法的装置。
一般实施方案
在一个实施方案中，本发明提供用于检测样品中活性酶的测定装置。
所述装置包含：(a)其上可放置样品的放置区；(b)基质，其与所述放置区可操作连接，手段样品当存在(例如放置)于所述放置区时可沿所述基质迁移；(c)在所述基质上的至少一个独特的捕获位置，其中各独特的捕获位置远离放置区，以及其中样品可跨越所述独特捕获位置迁移；(d)存在于各独特捕获位置或者界定各独特捕获位置的捕获工具，其中所述捕获工具能够与所述酶结合，使得所述酶的所述样品的至少一部分保留在至少一个独特捕获位置；和(e)提供与所述捕获工具结合的活性酶存在情况的选择性指示的选择性指示工具或者其至少一个组分。
在另一个实施方案中，本发明提供确定样品中活性酶存在情况的方法，其中将所述样品置于本发明的测定装置的放置区以及所述装置的选择性指示工具指示活性酶是否存在。
在另一个实施方案中，本发明提供确定样品中活性酶水平的方法，其中将所述样品置于本发明的测定装置的放置区以及所述装置的选择性指示工具半定量地指示存在的活性酶的量。
在另一个实施方案中，本发明提供包含本发明的测定装置或者能够形成本发明的测定装置的试剂盒。
在另一个实施方案中，本发明提供确定样品中活性酶存在情况的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)使至少一部分样品与捕获工具接触，籍此酶被所述捕获工具捕获；
b)给捕获的酶提供合适底物，其中所述底物与所述捕获的酶反应生成酶产物；
c)提供能够与所述酶产物反应的活性物质，其中所述活性物质与所述酶产物反应生成不溶性产物；和
d)检测在步骤c)中获得的不溶性产物，其中所述检测与所述样品中活性酶的存在情况和/或量相关。
某些优势
本发明的一个优势为，所述装置和使用所述装置的方法使操作者能够鉴定样品中的活性酶。
本发明另一个优势为，所述装置和使用所述装置的方法使操作者能够以简单的方式鉴定样品中的活性酶，以及在一些情况中至少以半定量的方式鉴定。
本文所用术语“半定量的”意指相对量、近似量或已知范围内的量。
优选术语“半定量的”意指活性酶水平的估计量，即活性酶的“低的”、“可接受的”或“高的”水平。然而，其不排除对单位的精确定量测定。例如这可通过捕获区中更多的独特捕获位置或者通过测定或观察颜色形成的强度或者通过测定或观测颜色变化来获得。
本发明另外的优势在本文中提及。
一般方面
在一方面，所述测定装置包含其中可放置样品的放置区。优选所述样品为液体样品。优选所述样品为食品或饲料样品或者包含食品或饲料组分的样品。将基质与所述放置区可操作连接，使得样品可沿基质自放置区迁移。优选所述基质为诸如硝酸纤维素等材料。
本申请的测定装置的基质包含远离放置区的至少一个独特捕获位置。样品可跨越所述捕获位置迁移。优选使用至少两个捕获位置。优选使用至少三个捕获位置。优选使用三个捕获位置。
本发明的测定装置中的各捕获位置，均存在捕获工具。所述捕获工具能够与待通过所述测定装置检测的酶结合。至少一个酶样品保留在至少一个捕获位置。所述捕获工具优选为抗体以及最优选所述捕获工具为与酶结合的抗体。可针对酶本身或者针对其组分(例如其片段和/或其表位)产生所述抗体。
将选择性指示工具用于本发明的测定装置以提供与捕获工具结合的活性酶存在情况的选择性指示。优选所述选择性指示工具包含沉淀反应和/或提供在产物形成后发生的可见或紫外波长的可测定变化。颜色变化可通过底物与酶的反应引起。与底物的反应表明所述酶为活性的以及不只是以无活性或变性形式存在。
优选可见颜色变化意指可通过肉眼或者通过机械读数器和/或通过电子读数器观测到的颜色变化。
所述选择性指示工具的全部或至少某些组分存在于测定装置中。对于一些实施方案，全部选择性指示工具均存在于测定装置之中和/或之上。在其它实施方案中，所述测定装置包含所述选择性指示工具的至少一个组分并且所述装置提供有选择性指示工具的其它组分(例如作为试剂盒)。因此，在使用中，使用者拥有选择性指示工具的全部必要组分以利用所述装置测定活性酶。
本发明为有利的，因其提供可用于检测活性酶的新型而简单的测定法。这在生物乙醇、去污剂以及食品和饲料工业中尤其有用，其中可利用目前可得的测定法将酶检测为存在，但例如由于热处理或化学处理所致的失活而为不可得的。此外，本发明的测定法和方法可用于确定是否需要饲料或食品添加剂的额外的活性酶。所述方法亦可用于诸如食品或饲料产品等产品的质量控制。
本发明的另一方面为，其提供半定量地确定样品中活性酶的量的方法。优选此半定量方法与指示结合酶存在情况的捕获区的数量有关。
本发明又一方面为，其提供确定食品或饲料中活性酶水平的方法，以及确定是否需要额外的酶或者饲料或食品添加剂的方法。所述方法亦可用于诸如食品或饲料产品等产品的质量控制。
本发明可以试剂盒的形式出现。所述试剂盒将使操作者能够优选在实验室外进行所述测定法。所述试剂盒可提供进行所述测定法所需的全部试剂。所述试剂的全部或某些可以呈干燥形式。
优选通过本发明的测定法或测定装置检测的活性酶为磷酸酶或糖苷水解酶，优选酸性磷酸酶、植酸酶、木聚糖酶、淀粉酶或β-葡聚糖酶。
在一个更优选的方面，通过本发明的测定法或测定装置检测的活性酶为磷酸酶，优选酸性磷酸酶，更优选植酸酶。
术语“植酸酶”意指这样的蛋白质或多肽，其能够催化包括植酸盐/植酸在内的磷酸的酯的水解，并释放无机磷酸盐。除植酸盐之外，某些植酸酶能够水解至少某些中度磷酸化的肌醇磷酸盐。
诸如小麦和大麦等某些谷类的非淀粉多糖(NSP)部分增加肠内粘度，其妨碍营养物的扩散。此抗营养作用可通过添加木聚糖酶和/或β-葡聚糖酶来减少，所述酶分别分解半纤维素聚合物木聚糖和β-葡聚糖。
向饲料中添加在其它补充剂中的α-淀粉酶以改善饲料的淀粉利用。
向动物饲料中添加植酸酶，例如来源于布丘氏菌属(Buttiauxella sp.)的6-植酸酶BP17，以增加磷酸盐可用性，从而增加产品的营养价值。例如在加热和高压下的饲料加工，可使植酸酶变性并降低其活性。本发明提供一种半定量测试法，其可具体地得到存在于饲料中的植酸酶活性的加工后水平的指示。
在一个非常优选的方面，通过本发明检测的活性酶为植酸酶，更具体为6-植酸酶。
在一个非常优选的方面，待测活性酶为BP17。BP17为布丘氏菌属植酸酶的酶变体。BP17的序列(不包括信号肽)如下：
在另一个实施方案中，待测活性酶为BP11。BP11为布丘氏菌属植酸酶的酶变体。BP11用于生物乙醇生产。BP11的序列(不包括信号肽)如下：
在另一个实施方案中，待测活性酶为BP111。BP111为布丘氏菌属植酸酶的酶变体。BP111用于生物乙醇生产。BP111的序列(不包括信号肽)如下：
附图简述
将通过参考以下附图阐述本发明：
图1-显示两幅图。
图2-显示一幅图(形式1：酶捕获和沉淀底物测定法)。
图3-显示一系列照片(涉及半干式(Semi-Dry Format)的步骤)。
图4-显示一张照片(利用半干式的来自植酸酶BP17稀释系列的结果)。
图5-显示一幅图(形式2：金缀合抗体夹心测定法)。
图6-显示一系列照片(干式(Dry Format)测试法的实例)。
图7-显示一系列照片(用醋酸盐缓冲液、MilliQ水和自来水配制的样品的结果)。
图8-显示一系列照片(在不同的时间间隔取样)。
图9-显示一系列照片(饲料样品和纯化植酸酶BP17的SDS-PAGE和蛋白质印迹)。
图10-显示一系列照片(利用植酸酶BP17特异性抑制剂MIHS进行金夹心形式和沉淀底物酶活性形式的比较)。
图11-显示一幅图和一张照片(流过式的示意图)。
图12-显示一幅图(浸量尺式的示意图)。
图13-显示一张照片(浸量尺式测试结果)。
图14-显示一幅图(毛细棒式(Wicking Stick Format)的示意图)。
图15-显示一系列照片(毛细棒式测试结果)。
图16-显示一系列照片(使用不同封闭剂的毛细棒式测试结果)。
图17-显示一系列照片(改变测试线浓度以调整测试的毛细棒式的半定量性质)。
图18-显示一系列照片(利用毛细棒式进行的NBT和INT之间的比较)。
图19-显示一系列照片(测试大范围的硝酸纤维素类型以确定最适当的)。
图20-显示一张照片(在表面活性剂(吐温-20)存在下测试减少封闭剂酪蛋白的浓度)。
图21-显示一系列照片(直接在测试硝酸纤维素上添加封闭试剂以测试可否获得满意结果)。
图22-显示一系列照片(使用INT和NBT底物二者用仅由表面活性剂封闭的NC测试植酸酶BP17浓度的稀释系列，以测试此方法的灵敏性)。
图23-显示一系列照片(测试干燥并储存混合在一起的不同底物组分)。
图24-显示一系列照片(半干式和全溶液式之间的比较)。
图25-显示一系列照片(对溶液定期测试活性表明四唑
溶液具有良好稳定性)。
图26-显示用于木聚糖酶活性的试液的照片。
图27-显示用于木聚糖酶活性的试液的照片。
图28-显示用于测试活性木聚糖酶活性的示意图。
图29-显示一系列示意图。
发明详述
本发明提供用于测定活性酶的装置。所述装置可在多样化领域用于实验室以及实验室之外。
本发明提供用于检测样品中的活性酶的测定装置(1)。所述测定装置(1)包含以下组件：(a)其上可放置样品的放置区(10)；(b)基质(20)，其与所述放置区(10)可操作连接的，使得样品当出现(例如放置)在所述放置区(10)时可沿所述基质(20)迁移；(c)在所述基质(20)上的至少一个独特捕获位置(30)，其中各独特捕获位置(30)远离放置区(10)，以及其中样品可跨越所述独特捕获位置(30)迁移；(d)存在于各独特捕获位置(30)或者界定各独特捕获位置(30)的捕获工具(40)，其中所述捕获工具(40)能够与所述酶结合，使得所述酶的所述样品的至少一部分保留在至少一个独特捕获位置(30)；和(e)提供与所述捕获工具(40)结合的活性酶存在情况的选择性指示的选择性指示工具(50)或者其至少一个组分。
检验活性酶的存在情况以及所述酶的量，在食品和饲料领域中特别重要。活性酶的缺失可能导致摄取所述食品或饲料的人和动物中的营养缺乏和矿物质缺乏。检测酶的存在情况的能力并不等同于利用现有方法检测活性酶的存在情况的能力。
作为一个具体实例，植酸盐为磷在谷类和豆类中的主要储存形式。然而，诸如猪、家禽和鱼等单胃动物不能代谢或吸收植酸盐(或植酸)并因此将其排泄，导致密集畜牧生产地区的磷污染。此外，植酸亦通过螯合诸如钙、铜和锌等金属物质来充当单胃动物中的抗营养物质。
通过植酸酶的作用，植酸盐通常水解得到低级肌醇-磷酸盐和无机磷酸盐。植酸酶用作动物饲料的添加剂，其中它们增进有机磷对于动物的可用性并降低环境的磷酸盐污染(Wodzinski RJ, Ullah AH. Adv Appl Microbiol. 42, 263-302 (1996))。然而，如果包含在饲料中的植酸酶为无活性的，这将不具有植酸酶水解作用，这可导致动物中的营养不良。因此本发明使诸如动物饲养员、农户、兽医、动物园管理员、饲料添加剂生产者、饲料生产者、科学家或公众成员等操作者能够测试动物饲料以得知其是否含有诸如植酸酶等活性酶以及诸如植酸酶等活性酶的量。
本发明亦可在质量控制的方法中用于饲料或食品的制备、生物燃料生产或去污剂组合物的制备，已向其中添加诸如磷酸酶或糖苷水解酶等酶，优选酸性磷酸酶、植酸酶、木聚糖酶、淀粉酶或β-葡聚糖酶。
测定法和装置
本文所用术语“测定装置”意指器具、器具的集合或设备。
包含上文(a)-(e)所列特征的测定装置或器具在图1中显示。
参照图1，本发明的测定装置(1)作为两个实施方案显示-以图1(a) (实施方案1)和以图1(b) (实施方案2)显示。
在两个实施方案中，测定装置(1)包含与基质(20)可操作连接的放置区(10)。至少一个独特捕获位置(30)位于基质(20)上。捕获工具(40)位于各独特捕获位置(30)或者界定各独特捕获位置(30)。在使用中，操作者将样品置于放置区(10)上以及所述样品以箭头所示方向沿基质(20)迁移。在实施方案1中，选择性指示工具(50) (未显示)或其至少一个组分(未显示)被加至捕获位置(30)，或者构成于捕获位置(30)。在一方面，所述选择性指示工具包含这样的试剂(活性物质)，其当活性酶与底物反应后可产生可观察的颜色变化。在所述方面，可以液体形式给使用中的装置提供所述试剂。
测定装置(1)的实施方案2以与实施方案1相同的方式起作用。然而，在此情况下，测定装置(1)由两个相对的对半(2)和(3)组成，所述对半通过折面或折线(70)连接。与基质(20)可操作连接的放置区(10)位于装置的一个对半(2)。捕获位置(30)和捕获工具(40)位于基质(20)上。所述装置的同一对半或相对对半(3)包含选择性指示工具或其至少一个组分，以及相对对半((3)任选包含吸收垫以吸收过量的样品(60)。
当操作者折叠折线(70)时，实施方案2的选择性指示工具(50)或其至少一个组分与基质(20)和捕获工具(40)接触。操作者可能需要以液体形式向所述装置添加选择性指示工具(50)或选择性指示工具(50)的某些组分。或者选择性指示工具或选择性指示工具的至少某些组分可以干燥形式存在于位置(90)。
任选优选的实施方案2包含观察窗(80)，其允许操作者在所述装置的两个对半(2)和(3)闭合后立即观察测定装置的结果(换言之，观察捕获位置)。观察窗(80)可由塑料材料制成或者其可以是开孔。
在实施方案2中，一个或各个对半(2、3)可由塑料或卡片材料制成，该材料硬到足以提供支持。
如所提及的，测定装置(1)包含其中可放置样品的放置区。优选所述样品为液体样品。基质(20)与放置区(10)可操作连接，使得样品可沿着基质(20)自放置区(10)迁移。优选基质(20)为允许样品迁移的材料，例如硝酸纤维素。本申请的测定装置(1)的基质(20)包含远离放置区(10)的至少一个独特捕获位置(30)。样品可跨越捕获位置(30)迁移。优选使用三个捕获位置(30)。在本发明的测定装置(1)中的各捕获位置(30)，均存在捕获工具(40)。所述捕获工具(40)能够与酶结合而被测定装置(1)检测。所述酶的至少一个样品保留在至少一个捕获位置(30)。所述捕获工具(40)优选为抗体以及最优选所述捕获工具(40)为与酶结合的抗体。所述抗体可针对酶本身或者针对其组分(例如其片段和/或其表位)产生。
将选择性指示工具(50)用于本发明的测定装置(1)以提供与捕获工具(40)结合的活性酶存在情况的选择性指示。优选所述选择性指示工具或其至少一个组分存在于相对于基质(20)的测定装置(1)的相对对半上的位置(90)。优选所述选择性指示工具(50)包含沉淀反应和/或提供可见的颜色变化。所述颜色变化可通过底物与酶的反应引起。与底物的反应表明所述酶为活性的以及不只是以无活性或变性形式存在。
在一个优选方面，所述装置为半定量的——在这种意义上，如果所述选择性指示工具在活性酶存在时产生颜色变化的话，活性酶的量(分析物量)通过显示颜色变化的所述装置的捕获位置(30)的数量和/或通过捕获位置处的颜色变化强度来指示。
本发明的测定装置(1)优选包含数个可操作连接的区。所述区优选包括放置区(10)。最优选本发明的测定装置(1)为侧流装置。
本发明的测定装置(1)可任选包含“指示区”或“指示线”(91)，其指示所述测定装置是否正确运行。优选所述指示区或指示线通过颜色或颜色变化来指示所述装置已运行。任选的指示区或指示线可包含抗体。这些抗体可针对酶本身或者针对其组分(例如其片段和/或其表位)产生，其中所述酶与待测活性酶不相关。此外或者备选地，所述指示线可包含可与至少某些底物组分反应的相关或不相关的酶。在本发明的一个实施方案中，所述装置和测定法用于检测活性植酸酶。在该情况下，指示线处的相关或不相关的酶可以是具有磷酸酶活性的酶。例如，所述指示线可包含相关的酶或者与待测酶相同的酶，例如在用于检测BP17植酸酶的测定中，所述指示线可包含BP17植酸酶。又例如，指示线可包含酶和抗体，其中所述抗体可对所述指示线的酶或另一种酶特异。
“测定法”为物质的化学组成或强度的分析。这可包括混合物中特定成分的检测。所述测定装置(1)用于进行本发明的测定法，所述测定法用以检测活性酶。
术语“免疫测定法”和“测定法”在此申请中可交换使用，其中术语“测定法”可包含“免疫测定法”。免疫测定法为特殊形式的测定法，其利用抗原与其抗体之间的特异性结合来鉴定样品中的物质。
优选所述测定装置可包含封闭试剂，或者可向所述装置添加封闭试剂。
术语“封闭试剂”是指调节待测活性酶(即分析物)与捕获工具的相互作用的物质，优选其中所述捕获工具包含抗体。所述封闭试剂允许样品沿所述装置的基质运动，使得全部样品不会被第一个捕获工具封闭。所述封闭试剂可以是或者可包含表面活性剂。合适的封闭试剂或封闭试剂组分的实例包括酪蛋白和Dehquart CC6。
基质(20)可包含封闭试剂。或者可向所述装置添加封闭试剂或其组分。可在测定装置的组件(30)处或者附近或甚至远离组件(30)添加封闭试剂。所述封闭试剂可与基质(20)结合或者施涂在基质(20)的垫片上。所述封闭剂可呈干燥形式和/或脱水形式。
酶
本文所用术语“酶是指这样的蛋白质，其催化其它物质的化学反应而其本身在反应完成后未破坏或改变。
通过本发明检测的酶可以是野生型的(其为自然中存在的酶)或变体。“变体”为具有以下氨基酸序列的酶，所述序列与所述变体所来源的亲本序列(例如野生型酶或甚至变体酶)相比，具有一个或数个插入、缺失和/或取代，并且所述序列保留所述酶的功能特性和/或增强所述酶的特性，例如增强的活性。本文所用术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”同义。
本文所用术语“活性酶”是指保留其催化功能的酶。例如，植酸酶能够催化磷酸酯类的水解。
术语“无活性的酶”是指存在于样品中但不能够执行其催化功能的酶。失活可因酶的变性、因热处理或者因化学处理或通过另一种酶的处理或加工(例如通过蛋白酶的蛋白质水解或糖苷酶的去糖基化)而发生。失活亦可因化学抑制剂所致。在其中所述酶为植酸酶(例如植酸酶BP17)的情况下，可使用的抑制剂为肌醇六硫酸酯(MIHS)。
通过本发明检测的酶的实例包括磷酸酶和糖苷水解酶。
磷酸酶或磷酸单酯水解酶(EC 3.1.3)为能够自其底物中释放磷酸基的酶。有用的磷酸酶包括但不限于碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)、酸式/酸性磷酸酶(EC3.1.3.2)、3-植酸酶(EC 3.1.3.8)或6-植酸酶(EC 3.1.3.26)。优选通过本发明的测定装置检测的酶为植酸酶。优选所述酶为6-植酸酶以及最优选所述酶为来源于布丘氏菌属的6-植酸酶(BP17)。
6-植酸酶亦称为“4-植酸酶”或“肌醇6-磷酸酶”。另外的植酸酶包括组氨酸酸性植酸酶(HAP)，其为包含在原核生物(例如来自大肠杆菌(Escherichia coli)的appA植酸酶)和真核生物(来自曲霉属(Aspergillus sp.)的phyA和B，来自酵母和植物的HAP植酸酶)中发现的成员的族群。HAP植酸酶在其DNA序列中共享在N末端的共同活性位点基序RHGXRXP以及C末端的HD基序。这允许磷酸单酯水解中的两步机制。来自黑曲霉(A. niger)的phyA和phyB以及来自大肠杆菌的appA为最多表征的代表。
在一个优选的方面，所述酶为植酸酶以及活性酶活性通过还原活性物质(例如四唑
盐)产生可视觉观察的效果来确定，所述效果例如为可以是有色的可视觉观察的沉淀。所述装置为半定量的以及分析物量通过所述装置的捕获位置(30)的数量来指示，所述捕获位置(30)因沉淀物而显示颜色变化。产色的四唑
还原实质上为磷酸酶对其自身底物作用的间接测定。在此方面，生成还原剂或活性部分，其然后作用于四唑
生成甲
染料。
在一个实施方案中，通过本发明检测的酶为来自例如布丘氏菌属、里氏木霉(Trichoderma reesei)、大肠杆菌、黑曲霉(Aspergillus niger)、布氏柠檬酸杆菌(Citrobacter braakii)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、隔孢伏革菌(Peniphora lycii)或绳状青霉菌(Penicillium funiculosum)的6-植酸酶。
在一个实施方案中，所述植酸酶为来源于以下的柠檬酸杆菌属植酸酶：弗氏柠檬酸杆菌(优选弗氏柠檬酸杆菌(C. freundii) NCIMB 41247)及其变体(例如在WO2006/038062 (通过引用结合到本文中)和WO2006/038128 (通过引用结合到本文中)中公开的)、如在WO 2004/085638中公开的布氏柠檬酸杆菌YH-15、如在WO2006/037328 (通过引用结合到本文中)中公开的布氏柠檬酸杆菌ATCC 51113以及其变体(例如在WO2007/112739 (通过引用结合到本文中)和WO2011/117396 (通过引用结合到本文中)中公开的)、无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus) (优选在WO2006037327 (通过引用结合到本文中)中公开的无丙二酸柠檬酸杆菌ATCC 25405或无丙二酸柠檬酸杆菌ATCC 25407)、吉林柠檬酸杆菌(Citrobacter gillenii) (优选在WO2006037327 (通过引用结合到本文中)中公开的吉林柠檬酸杆菌DSM 13694)，或者中间型柠檬酸杆菌(Citrobacter intermedius)、克氏柠檬酸杆菌(Citrobacter koseri)、莫林柠檬酸杆菌(Citrobacter murliniae)、啮齿目柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)、塞氏柠檬酸杆菌(Citrobacter sedlakii)、魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacter youngae) 、柠檬酸杆菌属多肽或其变体。
在一个实施方案中，所述植酸酶可以是来自柠檬酸杆菌属的植酸酶，例如来自弗氏柠檬酸杆菌的植酸酶，如在WO2006/038128中教导的植酸酶，所述参考文献通过引用结合到本文中。
在一些实施方案中，优选所述植酸酶为由DuPont Nutrition Biosciences ApS的以名为Phyzyme XPTM销售的大肠杆菌植酸酶。
或者所述植酸酶可以是布丘氏菌属植酸酶，例如乡间布丘氏菌(Buttiauxella agrestis)植酸酶，如在WO 2006/043178、WO 2008/097619、WO09/129489、WO2008/092901或WO10/122532中教导的植酸酶，所述参考文献全部通过引用结合到本文中。
在一个实施方案中，所述植酸酶可以是来自哈夫尼菌属(Hafnia)的植酸酶，例如来自蜂房哈夫尼菌(Hafnia alvei)的植酸酶，如在US2008263688中教导的植酸酶，所述参考文献通过引用结合到本文中。
在一个实施方案中，所述植酸酶可以是来自曲霉属的植酸酶，例如来自米曲霉(Apergillus orzyae)的植酸酶。
在一个实施方案中，所述植酸酶可以是来自青霉属的植酸酶，例如来自绳状青霉菌的植酸酶。
要理解的是，本文所用的1 FTU (植酸酶单位)定义为在ISO 2009植酸酶测定法(用于确定植酸酶活性的标准测定法)中规定的反应条件下在1分钟内自底物释放1 μmol无机正磷酸盐所需的酶量并且1 FTU可在International Standard (国际标准) ISO/DIS 30024: 1-17, 2009中找到。
或者，本文所用的1个单位的植酸酶(FTU)定义为在pH 5.5、37℃下自0.00015 mol/L植酸钠中每分钟释放1微摩尔无机磷的酶量(Denbow, L. M., V. Ravindran, E. T. Kornegay, Z. Yi和R. M. Hulet. 1995. Improving phosphorus availability in soybean meal for broilers by supplemental phytase(通过补充植酸酶改善用于肉鸡的豆粕中的磷可用性). Poult. Sci.74:1831–1842)。
在一个实施方案中，适当地使用上述E.C.分类法将酶分类，并且当以用于确定1 FTU的本文教导的测定法测试时，E.C.分类法命名具有所述活性的酶。
可通过本发明的测定装置和方法检测的另一组酶为糖苷水解酶(EC 3.2.1)族群，即水解O-和S-糖基化合物的酶。这组酶的又一个共同特性为它们释放例如具有还原端基(含醛基)的片段或产物。此族群的实例包括木聚糖酶，例如内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)和木聚糖内切-1,3-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.32)，优选木聚糖1,4-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)；α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)；寡聚-1,6-葡糖苷酶(EC 3.2.1.10)；葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)；支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)；纤维素酶(EC 3.2.1.4)；内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)；或葡聚糖内切1,3-β-D-葡糖苷酶(EC 3.2.1.39)。
木聚糖酶为对于将线性多糖β-1,4-木聚糖降解成木糖从而分解半纤维素的一类酶给出的命名，所述半纤维素为植物细胞壁的主要组分之一。
用于本发明的木聚糖酶可以是任何市购可得的木聚糖酶。
适当地所述木聚糖酶可以是内切-1,4-β-d-木聚糖酶(分类为E.C.3.2.1.8)或1,4 β-木糖苷酶(分类为E.C. 3.2.1.37)。
在一个实施方案中，优选所述木聚糖酶为内切木聚糖酶，例如内切-1,4-β-d-木聚糖酶。对内切-1,4-β-d-木聚糖酶的分类为E.C.3.2.1.8。
亦可通过本发明的测定装置和方法检测淀粉酶。
淀粉酶为对于能够将淀粉水解成诸如麦芽糖等较短链的寡糖的一类酶所给出的命名。与从原始的淀粉分子转化相比，随后可更容易地从麦芽糖将葡萄糖部分转化成甘油一酯或糖基甘油一酯。
术语淀粉酶包括α-淀粉酶(E.C. 3.2.1.1)、G4-形成淀粉酶(E.C. 3.2.1.60)、β-淀粉酶(E.C. 3.2.1.2)和γ-淀粉酶(E.C. 3.2.1.3)。
在一个实施方案中，优选所述淀粉酶为α-淀粉酶。α-淀粉酶分类为(E.C. 3.2.1.1)。
优选所述底物为磷酸酶底物以及最优选所述磷酸酶底物为2-磷酸基-L-抗坏血酸三钠(2-phospho-L-ascorbic acid trisodium，AsAP)。
样品
本文所用术语“样品”意指收集用于分析以确定活性酶是否存在的分析的物质或组合物的样本或提取物。
所述样品优选为液体。所述样品优选通过在诸如水等溶剂中放入、溶解、液化或浆化待分析的物质或组合物来获得。优选所述样品为含水样品。可使用自来水或者诸如MilliQ等纯化和去离子水或者另外的合适水溶液。设想的是，为了制备样品，可能需要某些形式的提取以允许待分析的物质或组合物与溶剂混合、在溶剂中分解和/或溶解。例如，可使用搅拌。
设想的是可生产试剂盒，其中操作者用食品或饲料或者生物燃料或去污剂组合物将样品提取容器(例如管、塑料袋或小罐)装填至预定水平(通过容器上的线标记)，并随后用诸如自来水、纯化或去离子水等水将所述管装填至第二条线。随后优选振荡所述提取容器。这将使操作者能够以一致的方式制备样品。
本发明的样品可来源于、提取自或取自食品或饲料，或者来自食品或饲料组合物，或者来自去污剂或来自去污剂组合物或者来自乙醇或生物燃料生产。此处，术语“食品”以广义使用——并且涵盖用于人的食品以及用于动物的食品(即饲料)。在一个优选的方面，所述食品用于人消费。在另一个优选的方面，所述食品为非人类的动物饲料。
所述食品或饲料可呈溶液或浆液的形式，或者作为诸如颗粒等固体，这取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。
术语“食品”和“饲料”亦可指食品配料。本发明的样品可来源于、提取自或取自食品配料。
本文所用术语“食品或饲料配料”包括作为或者可作为营养补充剂和/或纤维补充剂添加到功能性食品或食料中的制剂。此处所用的术语“食品或饲料配料”亦指可以低水平用于多种产品以得到与所需的特定饲料或食料相关的有益功能作用的制剂，所述有益功能作用包括但不限于胶凝化、组织化、稳定化、乳化、悬浮、成膜和结构化、保留多汁性和改善的口感而不增加粘度。
在又一个实施方案中，“食品或饲料配料”包括食品中间体，例如面包改良剂组合物或焙烤前的生面团。在面包房应用领域，通常在焙烤之前将酶加入生面团组合物中，以及在优选的实施方案中，在焙烤过程期间酶的变性终止进一步的酶活性。因此，本发明的酶测定法必须在焙烤之前的生面团或生面团配料组合物中进行。在又一个实施方案中，本发明可用于含谷类组分(优选燕麦、黑麦、大米、小麦、麦麸或其加工的衍生物)的乳制品组合物中。优选所述乳制品组合物为酸奶、乳酪或培养物饮料。
所述食品配料可呈溶液或浆液形式，或者作为诸如颗粒等固体，这取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。
术语“食品”和“饲料”亦可指食品添加剂。本发明的样品可来源于、提取自或取自食品添加剂。
本文所用术语“食品或饲料添加剂”包括增强食品和动物饲料消化的制剂。具体而言“食品或饲料添加剂”涉及可用于增强食品和动物饲料中磷酸盐消化的植酸酶。
所述食品添加剂可呈溶液或浆液形式，或者作为诸如颗粒等固体，这取决于用途和/或应用模式和/或给予模式。
所述饲料组合物和/或饲料添加剂可包含选自以下的一种或多种饲料原料：a)谷类，例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦及其组合)和/或大粒谷物，例如玉米或高粱；b)来自谷类的副产品，例如玉米谷蛋白粉、干酒糟谷物可溶物(Distillers Dried Grain Solubles) (DDGS) (特别是基于玉米的干酒糟谷物可溶物(cDDGS))、小麦麸、粗小麦粉、次麦粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣；c)从诸如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、棉花、低芥酸菜籽油、鱼粉、干血浆蛋白质、肉骨粉、马铃薯蛋白质、乳清、干椰子核、芝麻等来源获得的蛋白质；d)从植物和动物来源获得的油脂；e)矿物质和维生素。
本发明可用于检测诸如生物乙醇生产等生物燃料生产中的活性酶有效。
测定装置的结构
本发明的测定装置(1)包含放置区(10)。本文所用术语“放置区”是指其上可放置样品的测定装置(1)的区域。优选所述放置区(10)为吸收垫。所述放置区(10)与基质(20)可操作连接。所述放置区(10)可与基质(20)邻接或连续。所述放置区(10)可以是基质(20)的必备区域。优选所述放置区(10)在基质(20)的一端。任选存在额外的吸收垫以吸收过量的样品(60)。
在本说明书的情况下，“可操作连接”意指在操作装置期间与之连接、固定在一起或与之接触。
优选所述基质(20)为吸收材料或者包含吸收材料。更优选所述基质(20)为硝酸纤维素或者包含硝酸纤维素。例如所述基质(20)可以是或者可包含MDI 90 CNPH、MDI SS12 12μ或SS12 15μ型硝酸纤维素。
在出现或放置在样品区(10)时，所述样品可沿基质(20)迁移。优选所述迁移为诸如毛细管作用等液体迁移。优选所述迁移为纵向的，以及最优选这在所述测定装置(1)为条或棒时发生。优选所述条或棒包含在外壳中。
可向所述测定装置添加封闭试剂。基质(20)可包含封闭试剂。所述封闭试剂可与基质(20)结合以及所述封闭剂可呈干燥或脱水形式。此处，“结合”包括偶联或附着。所述封闭试剂可与基质直接或间接结合。所述封闭试剂可以是任何合适的封闭试剂。封闭试剂的一个实例为酪蛋白。所述封闭试剂可以是或者可包含表面活性剂。优选所述封闭试剂包含表面活性剂。所述封闭试剂优选为非离子型表明活性剂和/或两性离子型表面活性剂。例如所述表面活性剂可以是吐温-20或Dehquart CC6。
本发明的测定装置(1)包含基质(20)上的至少一个独特捕获位置(30)。各捕获位置(30)远离放置区(10)以及样品可跨越所述独特捕获位置(30)迁移。本文用于此情况的“独特的”意指与其它捕获位置(30) 分离。
本发明的测定装置(1)可包含多个独特捕获位置(30)；优选多于两个独特捕获位置(30)以及最优选所述装置包含三个独特捕获位置(30)。
测定装置(1)可具有两个或更多个捕获位置区，各区包含一个或多个离散的捕获位置(30)。例如，当具有三个离散的捕获位置区时，有可能在一个样品和一次测定中捕获至少三种不同类型的酶，例如植酸酶、木聚糖酶和淀粉酶。
在各捕获位置(30)存在捕获工具(40)。各捕获位置(30)处的捕获工具(40)可以是不同的或者可以是相同的。所述捕获工具(40)能够与待通过测定装置(1)检测的酶结合。这导致所述酶的至少一个样品或部分样品保留在至少一个独特捕获位置(30)。捕获工具(40)和酶之间的结合优选为抗体/抗原结合的结果。仅捕获工具(40)便可界定捕获位置(30)。
测定装置(1)的各独特捕获位置(30)处的捕获工具(40)的量可以是不同的或相同的。各独特捕获位置(30)处的捕获工具(40)的量可随着所述位置远离放置区(10)的程度而增加。各独特捕获位置(30)处的捕获工具(40)的量可随着所述位置远离放置区(10)的程度而减少。
在一些实施方案中，测定装置(1)的各独特捕获位置(30)处的捕获工具(40)的量基本上为相同的。
本发明的测定装置(1)可任选包含指示区或指示线(91)，其指示所述测定装置是否正确运行。优选所述指示区或指示线通过颜色变化指示所述测定已起作用。任选的指示区或指示线可包含抗体。这些抗体可针对酶本身或者针对其组分(例如其片段和/或其表位)产生，其中所述酶与待测活性酶不相关。此外或者备选地，所述指示线可包含可与至少某些底物组分反应的不相关的酶。
抗体
本发明的捕获工具(40)优选为与待通过测定装置(1)检测的活性酶结合的抗体。这些抗体可针对酶本身或者针对其组分(例如其片段和/或其表位)产生。
本发明的测定装置(1)的任选指示区或指示线(91)可包含抗体。
最优选所述捕获工具(40)为针对植酸酶或其组分(例如其片段和/或其表位)产生的抗体，所述植酸酶例如植酸酶BP17、BP11或BP111。
抗体可通过标准技术生产，例如通过使用作为混合物、纯化样品或其片段的目的酶的免疫法或者通过利用噬菌体展示文库来生产。
对于本发明的目的，除非规定意义相反，否则术语“抗体”包括限不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体、Fab片段、通过Fab表达文库产生的片段及其模拟物。所述片段包括保留其对靶物质的结合活性的完整抗体的片段、Fv、F(ab')和F(ab')2片段以及包含抗体的抗原结合位点的单链抗体(scFv)、融合蛋白和其它合成蛋白质。此外，所述抗体及其片段可以是人源化抗体。
中和抗体(即抑制多肽物质的生物活性且通常用于治疗的抗体)对于本发明的装置或测定法而言并非优选的。
如果需要多克隆抗体，则用待测酶(或包含其免疫学表位的多肽片段)免疫所选动物(例如小鼠、兔、山羊、马、鸡等)。根据宿主物种，可使用不同的辅剂增加免疫反应。
收集来自已免疫动物的血清并依照已知程序处理。如果含有针对待通过本发明测定装置检测的酶和/或该酶的氨基酸序列(或者包含其免疫学表位的序列)的多克隆抗体的血清含有针对其他抗原的抗体，则所述多克隆抗体可通过免疫亲和层析来纯化。用于生产和加工多克隆抗血清的技术为本领域所熟知(例如Harboe N, Ingild A. Immunization, isolation of immunoglobulins, Estimation of antibody titre(免疫、免疫球蛋白的分离、抗体滴度的估算). Scand J Immunol Suppl. 1973, 1:161-4)。在实施例部分，Harboe (同上)的方法用于生成针对植酸酶BP17的抗体。然而，可使用其它技术和/或可使用其它酶来生成合适的抗体。
针对待通过本发明的测定装置(1)检测的酶和/或该酶的氨基酸序列(或者包含其免疫学表位的序列)的单克隆抗体，亦可由本领域技术人员容易地生产，包括但不限于杂交瘤技术(Koehler和Milstein (1975 Nature 256:495-497))、人B-细胞杂交瘤技术(Kosbor等, (1983) Immunol Today 4:72; Cote等, (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030)和EBV-杂交瘤技术(Cole等, (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症疗法), Alan Rickman Liss Inc,第77-96页)。
此外，可使用针对“嵌合抗体”的产生开发的技术，其将小鼠抗体基因剪接至人抗体基因以获得具有适当抗原特异性和生物活性的分子(Morrison等，(1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855; Neuberge等，(1984) Nature 312:604-608; Takeda等，(1985) Nature 314:452-454)。
或者，对于单链抗体的产生描述的技术(US4946779)可适于产生物质特异性单链抗体。
亦可生成含有针对物质的特异性结合位点的抗体片段。例如，这类片段包括但不限于可通过胃蛋白酶消化所述抗体分子而产生的F(ab')2片段以及可通过还原F(ab')2片段的二硫键生成的Fab片段。或者，可构建Fab表达文库以允许快速且简便地鉴定具有所需特异性的单克隆Fab片段(Huse WD等，(1989) Science 256:1275-128 1)。
在一些实施方案中，优选所述抗体为多克隆抗体。
可将所述抗体修饰(例如衍生)成甚至更好地适应所述装置或测定法。例如，所述抗体可与一种或多种化学部分偶联，该化学部分允许与诸如衍生化塑料等基质特异性粘附/偶联。
选择性指示工具
本发明的测定装置包含选择性指示工具(50)或其至少一个组分以提供与捕获工具(40)结合的活性酶存在情况的选择性指示。所述选择性指示工具(50)可包含沉淀反应。
在一方面，所述测定装置包含所有的或基本上所有的选择性指示工具。
在另一方面，所述测定装置提供有所述选择性指示工具的至少一个组分。在该情况下，所述测定装置提供有所述选择性指示工具的其它组分。在一方面，当测定装置在使用中时，所述选择性指示工具在所述测定装置之上和/或之中构成。术语“构成”包括使所述组分混合或接触以生成选择性指示工具。
在另一方面，提供一种试剂盒，其中提供可用作本发明的测定装置的装置以及其中所述试剂盒提供有选择性指示工具。在使用中，随后向所述装置添加选择性指示工具的全部或某些组分以形成本发明的测定装置。
本文所用术语“提供”是指能够以其本身或者作为系统的部分递送指示。或者术语“提供”是指含有或包含已鉴定组分的试剂盒或装置。
选择性指示工具(50)可包含或提供可见的颜色变化。优选所述颜色变化通过酶底物的反应形成与活性物质反应的部分而引发。所述底物可与基质(20)结合。
酶所作用的物质称为其“底物”。优选酶的底物与测定装置(1)结合。此处，“结合”包括偶联或附着。底物可与装置直接或间接结合。最优选所述底物与测定装置(1)的基质(20)结合，或者其可存在于所述装置相对的对半(3)的位置(50)。优选所述底物呈干燥形式。
优选所述酶作用于其底物生成活性部分。所述活性部分然后可作用于活性物质产生功能效应，优选诸如颜色变化等可视觉观察的效应。
所述活性部分在本文中亦可称为部分、还原部分、还原物质或还原剂。
所述底物可以是磷酸酶底物或者具有磷酸根供体基团的化合物。优选所述底物为酸性磷酸酶底物。对于一些方面，磷酸根供体基团的去除产生还原剂或活性部分。优选所述磷酸酶底物为2-磷酸基-L-抗坏血酸三钠(AsAP)。其它实例包括类似物，例如备选的抗坏血酸基2-磷酸盐(例如镁、锌、钙)或3-O-磷酸盐衍生物。其它可能的实例包括抗坏血酸基磷酸盐的酯化形式(磷酸抗坏血酸基棕榈酸酯)。
当选择性指示工具(50)包含由酶底物的反应形成与活性物质反应的部分而引发的颜色变化时，所述活性物质可以是四唑
化合物。在此方面，所述颜色变化是由作为酶反应结果的甲
染料的形成而引发。
四唑
盐已在工业中用于去除会干扰氧化还原反应的颜色变化的物质。例如，参见US 5,196,314。此外，四唑
盐的颜色变化已在US 5,360,595中用作分析物存在情况的指示剂。
在本发明中，所述活性物质可以是氮蓝四唑化合物。所述活性物质可以是氯化氮蓝四唑
(NBT)。或者所述活性物质可以是卤代硝基四唑
化合物。所述活性物质可优选为碘硝基四唑
化合物。优选所述活性物质为氯化碘硝基四唑
(INT)。
可向所述选择性指示工具以及最优选向所述活性物质添加能够减少或防止沉淀物扩散的实体。这改善结果的质量，以及最优选改善沉淀物的视线。最优选此实体为聚乙二醇以及最优选将此加入四唑
盐中。
因此，在一个优选方面，描述了检测样品中活性酶的侧流测定装置(1)。优选酶为酸性磷酸酶以及酶活性通过还原四唑盐产生有色沉淀来确定。所述装置为半定量的以及分析物量通过装置的捕获位置(30)的数量来指示，所述捕获位置显示因沉淀物所致的颜色变化。
当所述选择性指示工具(50)包含如上所述的磷酸酶底物时，所述磷酸酶底物可在反应增强剂存在下与如上所述的活性物质反应。所述反应增强剂可与第二基质结合。所述反应增强剂可以是吩嗪化合物。
优选所述反应增强剂为硫酸甲酯化合物。最优选所述反应增强剂为吩嗪硫酸甲酯(PMS)。
在优选的实施方案中，待测活性酶作用于底物产生活性部分或还原剂，其随后作用于产生可观察效应的实体。
在一个优选的实施方案中，所述酶为植酸酶，所述底物为磷酸酶底物或者具有磷酸根供体基团的化合物。
在另一个优选的实施方案中，所述酶为木聚糖酶，所述底物为木聚糖以及所述活性部分为木糖。
在另一个优选的实施方案中，所述酶为淀粉酶，所述底物为淀粉以及所述活性部分为葡萄糖。
在一个优选的实施方案中，所述实体为四唑
盐以及所述可观察效应为可见效应，最优选颜色变化。
优选的实施方案
本发明的测定装置(1)的两个优选的实施方案以图1a和图1b显示。
优选测定装置(1)为条或棒。沿此条或棒，液体样品可以图1中箭头所示方向纵向流动。所述条或棒主体包含基质(20)。如在所述装置的实施方案1 (图1a)中，放置区(10)优选位于条或棒的一端。捕获位置(30)优选位于条或棒的与放置区(10)相对的一端。
可在使用时向所述测定装置添加选择性指示工具(50)或其组分。优选这些指示工具或其至少一个组分呈液体形式。优选除选择性指示工具(50)或选择性指示工具(50)的某些组分之外的所有试剂均为干燥的。或者所有试剂均可呈干燥或脱水形式。
测定装置(1)的优选实施方案2以图1b显示。在此情况下，测定装置(1)由两个相对的对半组成，所述对半通过折面或折线(70)连接。与基质(20)可操作连接的放置区(10)位于所述装置的一个对半(2)。捕获位置(30)和捕获工具(40)位于基质(20)上。所述装置的同一对半(2)或相对对半(3)包含选择性指示工具或其至少一个组分，以及任选对半(3)包含吸收垫以吸收过量的样品(60)。
当使用实施方案2时，操作者将样品置于放置区(10)上。然后他/她允许所述样品流到至少一个要求的位置。然后他/她沿折面(70)闭合所述装置。这使选择性指示工具(50)或其至少一个组分与基质(20)和捕获工具(40)接触。操作者可能需要以液体形式向所述装置添加选择性指示工具(50)或选择性指示工具(50)的某些组分。
对于某些实施方案，所述选择性指示工具或选择性指示工具的某些组分可以干燥形式存在于位置(90)。优选所有试剂均为干燥的。在一些实施方案中，操作者可向位置(50)或(30)添加四唑
溶液INT或NBT。
任选优选的是，实施方案2包含观察窗(80)，其允许操作者在所述装置的两个对半(2)和(3)闭合后立即观察测定装置的结果(换言之，观察捕获位置)。
本发明的测定装置(1)可任选包含指示区或指示线，其指示所述测定装置是否正确运行。优选所述指示区或指示线通过颜色变化指示所述测定法已起作用。任选的指示区或指示线可包含抗体。这些抗体可针对酶本身或者针对其组分(例如其片段和/或其表位)产生，其中所述酶与待测活性酶不相关。此外或者备选地，所述指示线可包含可与至少某些底物组分反应的不相关的酶。
此外或者在备选方案中，所述指示区可包含与待测植酸酶不相关的酸性磷酸酶或植酸酶。
在一个实施方案中，本发明提供用于检测样品中的活性酶的测定装置；其中所述装置包含：(a)其上可放置样品的放置区；(b)基质，其与所述放置区可操作连接，使得样品当出现(例如放置)在所述放置区时可沿所述基质迁移；(c)在所述基质上的至少一个独特捕获位置，其中各独特捕获位置远离放置区，以及其中样品可跨越所述独特捕获位置迁移；(d)存在于各独特捕获位置或者界定各独特捕获位置的捕获工具，其中所述捕获工具能够与所述酶结合，使得所述酶的所述样品的至少一部分保留在至少一个独特捕获位置；和(e)提供与所述捕获工具结合的活性酶存在情况的选择性指示的选择性指示工具或者其至少一个组分。
优选所述酶为植酸酶。
在一方面，本发明提供用于检测样品中的活性酶的测定装置；其中使用中的装置包含：(a)其上可放置样品的放置区；(b)基质，其与所述放置区可操作连接，使得样品当出现(例如放置)在所述放置区时可沿所述基质迁移；(c)在所述基质上的至少一个独特捕获位置，其中各独特捕获位置远离放置区，以及其中样品可跨越所述独特捕获位置迁移；(d)存在于各独特捕获位置或者界定各独特捕获位置的捕获工具，其中所述捕获工具能够与所述酶结合，使得所述酶的所述样品的至少一部分保留在至少一个独特捕获位置；和(e)提供与所述捕获工具结合的活性酶存在情况的选择性指示的选择性指示工具。
优选所述酶为植酸酶。
在一个实施方案中，本发明提供用于检测样品中的活性酶的测定装置；其中所述装置包含：(a)其上可放置样品的放置区；(b)基质，其与所述放置区可操作连接，使得样品当出现(例如放置)在所述放置区时可沿所述基质迁移；(c)在所述基质上的至少一个独特捕获位置，其中各独特捕获位置远离放置区，以及其中样品可跨越所述独特捕获位置迁移；(d)存在于各独特捕获位置或者界定各独特捕获位置的捕获工具，其中所述捕获工具能够与所述酶结合，使得所述酶的所述样品的至少一部分保留在至少一个独特捕获位置；和(e)提供与所述捕获工具结合的活性酶存在情况的选择性指示的选择性指示工具或者其至少一个组分；和其中所述酶为植酸酶以及其中所述选择性指示工具包含酸性磷酸酶。
半定量的
本发明的测定装置(1)可提供样品中活性酶的量的至少半定量测定。
优选所述量与指示结合酶存在的捕获位置(30)的数量相关。或者，半定量测定可利用捕获位置(30)处的颜色变化强度来进行。
颜色变化强度可利用评分卡或参照卡来评估，优选其中操作者将基质(20)上显色反应的强度与评分卡进行比较。此外或者备选地，使用者可使用电子装置，其可读取颜色变化并向使用者发回其分析结果报告。例如，所述电子装置可以是可包含合适“app”的移动电话。
所述半定量测定可确定活性酶的量高于还是低于特定的浓度量，例如高于或低于300 FTU/g。
本发明的方法和用途
如上所述，本发明提供确定样品中是否存在活性酶的方法或用途(例如使用本发明的装置)。优选此方法为半定量的。所述方法包括以样品使用本文所述的测定装置(1)，并将结果与其它样品进行比较。
含有更多活性酶的样品导致更多的捕获位置(30)指示结合的活性酶的存在。
备选或另外地，在捕获位置导致更强的(例如更深的)颜色变化的样品含有更多活性酶。
优选所述方法用于确定活性磷酸酶或磷酸单酯水解酶(EC 3.1.3)和糖苷水解酶(EC 3.2.1)，包括碱性磷酸酶(EC 3.1.3.1)、酸式/酸性磷酸酶(EC3.1.3.2)、3-植酸酶(EC 3.1.3.8)、6-植酸酶(EC 3.1.3.26)、内切-1,4-β-木聚糖酶(EC 3.2.1.8)和木聚糖内切-1,3-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.32)、优选木聚糖1,4-β-木糖苷酶(EC 3.2.1.37)；α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)；β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)；寡聚-1,6-葡糖苷酶(EC 3.2.1.10)；葡聚糖1,4-α-葡糖苷酶(EC 3.2.1.3)；支链淀粉酶(EC 3.2.1.41)；纤维素酶(EC 3.2.1.4)；内切-1,3(4)-β-葡聚糖酶(EC 3.2.1.6)；和葡聚糖内切1,3-β-D-葡糖苷酶(EC 3.2.1.39)。更优选确定活性6-植酸酶(例如植酸酶BP17)水平。
本发明的又一方面为，其提供确定食品或饲料或者生物燃料或者去污剂组合物中活性酶水平的方法。此方法包括制备食品或饲料或者生物燃料或者去污剂组合物的样品，优选含水样品。然后将所述样品置于本发明的测定装置(1)的放置区(10)上，并将测定装置(1)用于半定量地确定样品中活性酶的量。数个样品中活性酶的量可彼此比较和/或与参照样品进行比较。最优选此方法用于确定食品或饲料中活性植酸酶水平，优选活性植酸酶BP17水平。
本发明进一步提供确定是否需要额外的酶或者饲料或食品添加剂的方法。如果使用上述方法检出低于规定的量或相对量的活性酶，则这表明应添加额外的酶。最优选此方法用于确定是否应向食品或饲料中添加额外的植酸酶，优选活性植酸酶BP17。
上述方法可用于质量控制。所述方法包括使用本发明的测定装置(1)确定样品中的活性酶水平并随后确定这些酶是否满足酶的质量控制水平。优选所述方法可用于确定饲料或饲料添加剂中的植酸酶水平并随后确定是否要使用所述饲料或饲料添加剂。
本发明进一步提供确定样品中活性酶存在情况的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)使至少部分样品与捕获工具接触，籍此酶被所述捕获工具捕获；
b)给捕获的酶提供合适底物，其中所述底物与所述捕获的酶反应生成酶产物；
c)提供能够与所述酶产物反应的活性物质，其中所述活性物质与所述酶产物反应生成不溶性产物；和
d)检测在步骤c)中获得的不溶性产物，其中所述检测与所述样品中活性酶的存在情况和/或量相关。
优选所述样品为食品或饲料样品或者食品或饲料组分样品或者生物燃料或去污剂组合物样品。优选所述样品为干燥的、再水化的或含水样品。最优选所述样品为液体样品。
优选通过所述方法检测的活性酶为磷酸酶或糖苷水解酶，最优选酸性磷酸酶、植酸酶、木聚糖酶、淀粉酶或β-葡聚糖酶。
优选用于所述方法的捕获工具为与待通过测定装置(1)检测的活性酶结合的抗体。所述抗体可针对酶本身或者针对其组分(例如其片段和/或其表位)产生。
优选用于捕获的酶的底物可以是磷酸酶底物或者具有磷酸根供体基团的化合物。优选所述底物为酸性磷酸酶底物以及最优选所述磷酸酶底物为2-磷酸基-L-抗坏血酸三钠(AsAP)。
优选用于所述方法的活性物质可以是四唑
化合物。最优选所述活性物质可以是氮蓝四唑
化合物。所述活性物质可以是氯化氮蓝四唑
(NBT)。或者所述活性物质可以是卤代硝基四唑化合物。所述活性物质可优选为碘硝基四唑化合物。优选所述活性物质为氯化碘硝基四唑
(INT)。
所述不溶性产物优选为沉淀物，最优选视觉上可检测或者可观察的沉淀物，优选有色沉淀物。
所述不溶性产物优选以视觉或以电子方式检测或观察。最优选其因颜色变化而为可检测的。
试剂盒
本发明可以试剂盒的形式存在。所述试剂盒将使操作者能够进行所述测定，优选在实验室外进行。所述试剂盒可提供进行所述测定所需的一种或多种或全部试剂。这类试剂可呈干燥或脱水形式。干燥的试剂可通过样品在溶剂(优选含水样品)中复溶。优选除选择性指示工具(50)或选择性指示工具(50)的某些组分之外的所有试剂均为干燥的。这样的试剂盒可称为“半干式”。优选除活性物质之外的所有试剂均为干燥的。最优选除INT或NBT四唑
溶液之外的所有试剂均为干燥的。操作者向干燥试剂中加入液体来进行所述测定。
优选测定装置(1)以棒或最优选条的形式提供。最优选所述干燥试剂与条或棒结合，正如其所提供的样子。本发明的试剂盒亦可包含一个或多个袋(例如塑料袋)、移液器、注射器、管或试管。优选所述条或棒包含在外壳(例如塑料、卡片或卡纸板外壳)中。
本发明的测定装置可以如图1的实施方案1或图1的实施方案2所示的试剂盒提供。
本发明的试剂盒可包含或者能够形成测定装置及测定装置的所有组件，所述测定装置包含：
(a)其上可放置样品的放置区(10)；
(b)基质(20)，其与所述放置区(10)可操作连接的基质(20)，使得样品当出现(例如放置)在所述放置区(10)时可沿所述基质(20)迁移；
(c)在所述基质(20)上的至少一个独特捕获位置(30)，其中各独特捕获位置(30)远离放置区(10)，以及其中样品可跨越所述独特捕获位置(30)迁移；
(d)存在于各独特捕获位置(30)或者界定各独特捕获位置(30)的捕获工具(40)，其中所述捕获工具(40)能够与所述酶结合，使得所述酶的所述样品的至少一部分保留在至少一个独特捕获位置(30)；和
(e)提供与所述捕获工具结合的活性酶存在情况的选择性指示的选择性指示工具(50)或者其至少一个组分。
本发明的试剂盒可包含所述测定装置的全部或者基本上全部组件(a)-(d)，其中提供随后将其加入使用中的装置的选择性指示工具(50)。
本发明的试剂盒可包含所述测定装置的全部组件(a)-(d)以及所述选择性指示工具的至少一个组分，其中所述试剂盒另外包含随后将其加入使用中的装置的选择性指示工具(50)的其它组分。
本发明的试剂盒可包含所述测定装置的全部组件(a)-(e)。
溶剂例如水或者其它合适的水性溶液可包含在或加入本发明的试剂盒或装置中。上述或任何的试剂盒组件均可在诸如水、纯化水或去离子水等溶剂中分散、溶解或再水化。
本发明的试剂盒可提供有评分卡或参照卡。颜色变化的强度可利用评分卡或参照卡来评估，优选其中操作者将基质(20)上的显色反应强度与评分卡进行比较。半定量测定可利用评分卡进行，例如其中可利用评分卡确定活性酶的量高于或低于特定的量或浓度，如高于或低于300 FTU/g。
所述评分卡或参照卡可由纸、卡片或其它物理材料制成。或者所述评分卡或参照卡可以电子方式(例如用电话、智能手机、计算机或其它计算机装置)查看。所述评分卡可与电子参照进行比较和/或所述评分卡可以电子方式读数。
实施例
将仅仅举例的方式阐述本发明，其中对以下附图进行参考。
实施例部分的第1部分提供关于用于确定样品中活性植酸酶存在情况的本发明测定装置和方法的详情。
实施例部分的第2部分提供关于可用于本发明的测定装置和方法以确定样品中活性木聚糖酶存在情况的方法的详情。
用于本发明的测定装置和方法的抗体产生
用于本发明的测定装置和方法的抗体可通过利用Harboe N, Ingild A. Immunization, isolation of immunoglobulins, Estimation of antibody titre (免疫、免疫球蛋白的分离、抗体滴度的估算). Scand J Immunol Suppl. 1973, 1:161-4的方法产生。
在实施例部分的第1部分，用于本发明的测定装置和方法的针对植酸酶BP17的抗体，通过按照Harboe N (1973) (同上)的方法产生。BP17的序列(不包括信号肽)如上所示。
第1部分
在导向和得到本发明的工作中，采取了两条不同的研究路线。
一个方案得到依照本发明的装置(通常代表于图1中)以及使用所述装置的方法和包含所述装置的试剂盒。此方案路线我们称为形式1。此装置等在实施例1等中详细论述。
我们亦致力于金缀合抗体夹心侧流测定法。此方案路线我们称为形式2。鉴于本文所解释的原因，此方案路线被视为不合适的。出于比较原因(参见比较实施例部分)，加入关于形式2 (即金缀合抗体夹心侧流测定法)的信息(例如图5及其相关注释)。
此外，在比较实施例部分我们对于实验的一个方面进行了形式1与形式2的直接比较。
实施例1-9
形式1-本发明的测定装置和方法
实施例1
本发明的测定法和装置涉及使用沉淀底物测试法的抗体捕获(例如图1、图2和图3)。
在此方面，表征了使用沉淀底物测试法的抗体捕获。鉴定了合适的酸性磷酸酶底物，其主要特征为还原四唑
盐产生有色沉淀物，并随后显示以剂量依赖性信号反应在侧流型测定法中起作用。
在使用沉淀底物测试法的抗体捕获的开发中注意到数个障碍，例如底物复杂性以及因测试流所致的生成的沉淀物迁移。然而，此测试法比金缀合物夹心测定法(图5)更合适，因为其直接测定酶活性而不是仅仅依赖于酶与抗体的结合。
使用沉淀底物测定法的抗体捕获(图2)已得到广泛开发。研究了多种形式并且将所述测试法从具有多组分底物和样品加入后的测试棒操作的初始复杂设计精简为具有最少用户步骤的简单配置。
所述测试法的半定量方面通过三线测试区来确定，其中三条线结果表示活性酶的高水平(合格结果)，两条线表示中间水平(边界线)以及一条或零条线指示低酶水平(不合格)。
此测定法的演变得到一种非常有用形式即我们所称呼的“半干式”的开发。图3显示涉及本发明的半干式的步骤。
在此方面以及如在图3中所述，半干式需要操作者用施加至测试棒的水制备试样。将溶液中的底物复合物的一个组分‘直接从瓶中’(操作者无需制备)直接施加至测试棒基质(在此情况下为硝酸纤维素)，所述基质覆盖有含有干的其它底物组分的垫片。然后使所述测试显影并在20-30分钟后读取结果(图4)。此处，图4显示利用图3的半干式自6-植酸酶(称为BP17)稀释系列得到的结果。如上所述，所述6-植酸酶来源于布丘氏菌属。
亦研究了“干式”，其中使所有组分干燥进入测试，使得操作者仅必需施加样品(图6)。此处操作者仅添加样品和展示测试。最终测试可为盒式的并且会不需要图6中描述的平衡物。在阐述的实施例中，使磷酸根供体2-磷酸基-L-抗坏血酸三钠(AsAP)和反应增强剂吩嗪硫酸甲酯(PMS)干燥进入测试硝酸纤维素基质(NC)中，并将四唑
底物氯化碘硝基四唑
(INT)的尼龙垫牢固地置于顶部。照常加入液体样品，以及是样品溶液本身将底物组分再水化。
因此，在图6 (即干式测试法的实施例)中，操作者仅加入样品和展示测试。在此图中，2-磷酸基-L-抗坏血酸三钠= AsAP；反应增强剂吩嗪硫酸甲酯= PMS；硝酸纤维素基质= NC；和四唑
底物氯化碘硝基四唑
= INT。
实施例2-样品制备
溶剂
样品制备的方法用水进行。出于连续性目的，使用MilliQ水。MilliQ是指已通过水净化系统高度纯化和去离子化的水。
图7显示用0.25 M醋酸盐缓冲液(pH 5.0)、MilliQ水或自来水将1克饲料颗粒提取30分钟并以一式三份用流过式运行获得的结果(亦参见图11)。在各情况下，下线表示测试线以及上线表示对照线。在底物施加后的10和30分钟对所述试验拍照。
实验已显示用自来水使用半干式亦产生满意结果。与其它两种测试溶剂相比，自来水得到小幅增加的目视信号。
搅拌时间
在图7阐述的实施例中，用10 mL MilliQ水提取1克饲料颗粒并在连续搅拌的情况下使提取进行10分钟。然而，另外的实验已显示对提取简单振荡5分钟便使得植酸酶BP17完全提取进入水相(图8)。因此试样的制备为快速而简单的程序，操作者可在最少的培训情况下掌握。
图8显示在不同时间间隔取样的结果。向10 mL MilliQ水中加入1克饲料颗粒并在0-60分钟的不同时间间隔对所得溶液取样。5分钟后，所述提取似乎足以进行测试。
在一方面，操作者用饲料颗粒将样品提取管或袋装填至预定水平(通过管上的线标记)，随后用自来水将所述管装填至第二条线。标记所述线以优化饲料/水比率。尽管始终使用1:10的比率，需要时可更改此比率以改变有效酶浓度。
在此处显示的实验中，使用空白粉状饲料(不含植酸酶BP17)并如上提取，将纯化植酸酶BP17加入其中以得到确定的酶量。
实施例3
抗体捕获和沉淀底物测试法开发
沉淀底物
鉴定了用于所述活性测定法的底物。此底物为使用磷酸根供体(2-磷酸基-L-抗坏血酸三钠，AsAP)、反应增强剂(吩嗪硫酸甲酯，PMS)和活性物质(氯化氮蓝四唑
，NBT)的通用酸性磷酸酶底物。在这些化学品和酸性磷酸酶存在下，将可溶性四唑
盐还原导致产生不可溶沉淀物(四唑
盐的甲
衍生物)。在氮蓝四唑
的情况下，这导致蓝/紫色沉淀物的形成。
测试形式开发
已在项目的可行性阶段期间分析了数种形式。
流过式
此方案利用“流过”法。与标准的侧流法相比，流过测试法包括直接在特化的硝酸纤维素(用抗植酸酶BP17抗体形成条带)上施加样品以及通过下面的吸收垫将样品吸过硝酸纤维素。在样品施加之后，以相同的方式施加底物并随后使所述测试显影(图11)。
图11为流过式的示意图。图11的形式非常简单并得到清晰的可视结果。然而，对于某些方面，可能需要具有甚至更好的半定量形式。因此，为了利于操作者解读以此方式得到的结果，决定建立多线测试形式，其中在测试完成之后可见的测试线的数量会指示存在于样品中的酶的水平。
浸量尺式
此形式采取多线方案。最初将硝酸纤维素用渐增浓度的6条线形成条带，并将整个测试棒浸入(沉入)饲料提取物样品中。在孵育之后用水漂洗棒，随后施加底物溶液并使所述测试显影(图12)。
图12显示浸量尺式的示意图。此形式非常容易进行并且一个优势为测试棒上不存在吸收垫，这意味着不需要样品后的测试棒操作。所述测试法起作用但存在需要甚至更好的半定量结果的情况。此处，虽然处于剂量依赖性可视强度，但是当测试酶(植酸酶BP17)存在时，所有测试线均为可见的。理想上，当受到低水平植酸酶BP17样品挑战时，具有较低抗植酸酶BP17浓度的测试线不会显现，但这并非如此(图13)。
图13显示浸量尺式测试结果。此处，硝酸纤维素用4、2、1、0.5、0.25和0.125 mg/mL抗植酸酶BP17 (在照片上从右往左)的6条测试线形成条带。直接向饲料提取管(7 mL，具有0-1.0 U/mL植酸酶BP17)中加入测试棒并振荡孵育20分钟。然后移出棒，用MilliQ水简略漂洗并向该棒添加底物。使测试显影30分钟并随后拍照。结果似乎并非半定量的以及似乎亦见到高背景，其与样品中植酸酶BP17的量成比例。
毛细棒式
此处使用与浸量尺类似的测试棒，但是以不同的方式进行测试。此处通过毛细管作用使样品沿测试棒迁移，而不是浸没整个测试棒。一旦完成，即以类似方式施加底物并进行测试线显影(图14)。
图14显示毛细棒式的示意图。此测试形式使用微量滴定板孔中的样品垂直进行，一旦样品流动便将棒从孔中移出并水平放置以允许底物添加。
最初使用具有不同量的抗植酸酶BP17的多线测试法并且显示样品与线相遇的顺序对于测试显影而言很重要。似乎样品中的植酸酶BP17会与第一条测试线结合，以及如果仍有未结合的植酸酶BP17，这会进行到第二条线，以此类推。因此，如果第一条测试线含有高水平的抗植酸酶BP17抗体，则大部分样品可与该线结合，使得留下很少的剩余样品与之后的线结合。另一方面，如果相遇的第一条线含有低水平的抗体，则此线可迅速变为饱和并且大部分植酸酶BP17会继续到下一条测试线(图15)。这表明最低水平的抗体应优选最靠近放置区。
图15显示毛细棒式测试结果。此处，硝酸纤维素用4、1和0.25 mg/mL抗植酸酶BP17的测试线形成条带。用水将样品稀释为0.2、0.05、0.012、0.006 U/mL植酸酶BP17。通过使末端与溶液接触将样品芯吸(wick up)至NC并通过毛细管作用使溶液沿棒向上行进。测试了棒的两个方向：从4到0.25 mg/mL，以及从0.25到4 mg/mL。10分钟后，将棒暴露给底物溶液并允许显影30分钟。测试线浓度的方向对所述测试的成功进行具有显著影响。
为了简化测试系统，测试了具有处于单浓度抗植酸酶BP17的多条线的实验。最初似乎样品中绝大部分植酸酶BP17与第一条测试线结合。然而，此察觉的问题通过向样品中加入封闭试剂来避免，乳蛋白酪蛋白显示最佳结果(图16)。
图16显示使用不同封闭剂的毛细棒式测试结果。以0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 U/mL植酸酶BP17制备样品并且以空白粉料提取物(水或酪蛋白)制备零对照。将测试棒放入含40 μL样品的微量滴定板的孔中并允许将样品芯吸至棒达10分钟。将棒吸干、平放并将40 μL底物溶液用移液器吸移至硝酸纤维素上。使棒显影30分钟并随后拍照(参见实施例6)。
图17显示关于改变测试线浓度以调整测试法(毛细棒式)的半定量性质的结果。结果显示，测试线抗体的浓度影响所述测试的半定量性质，0.4-0.6 mg/mL的浓度似乎对所需规范而言为最佳的，并因此显示所述样品能够横跨捕获工具。
更详细而言，图17显示来自改变测试线浓度以调整使用毛细棒式的测试的半定量性质的结果()。硝酸纤维素用相同浓度(0.4、0.6、0.8或1.0 mg/mL抗植酸酶BP17)的三条测试线形成条带。用滚轴混合器将1 g粉料在10 mL 50 mg/mL酪蛋白溶液中孵育10分钟来制备空白粉料提取物。以0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625和0.003125 U/mL向粉料提取物中加入纯植酸酶BP17。将40 μL样品吸入微量滴定板的孔中，插入棒并允许样品通过毛细管作用沿棒上移达10分钟。将棒移出、吸干，以及将40 μL底物溶液用移液器吸移至棒上并允许显影30分钟。测试线抗体的浓度影响所述测试的半定量性质，0.4-0.6 mg/mL的浓度似乎对所需规范而言为最佳的。这些结果表明，使用适当的封闭，改变测试线浓度可用于调整所述测试的半定量性质。
与使用浸量尺式一样，毛细棒式的优势为在测试棒中不存在吸收垫并因此操作者无需在样品添加之后和底物添加之前操作测试棒。然而，垂直形式对于某些用途而言可能不是非常合乎需要的，尤其是在棒在底物添加之前必须重新定位的情况下。
为解决此问题，使用非常相似的材料开发了水平式，添加的仅为测试棒的硝酸纤维素部分上游的吸收性样品垫。此方案得到高质量结果并且打开了使用形式2进一步开发(其要不然的话是不可能的)的可能性。在某些情况下，可能需要添加封闭剂。在某些情况下，可能需要在底物添加之前移除样品垫。
实施例4-四唑底物
在此实施例中，测试了四唑
底物氯化碘硝基四唑
(INT)。此底物导致测试线上的红色沉淀(而不是使用NBT的蓝/紫色)。
图18显示使用毛细棒测试法的NBT和INT之间的比较。用滚轴混合器将1 g粉料在10 mL 50 mg/mL酪蛋白溶液中孵育10分钟来制备空白粉料提取物。以0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125和0.00625 U/mL向粉料提取物中加入纯植酸酶BP17。将40 μL样品用移液器吸移至微量滴定板的孔中，插入棒并允许样品通过毛细管作用沿棒向上迁移达10分钟。用醋酸盐缓冲液以4.45 mg/mL配制INT溶液，这得到与NBT溶液相同的摩尔浓度。将棒移出、吸干，以及将40 μL底物溶液用移液器吸移至棒上，孵育1分钟。然后去除底物溶液、吸干棒并允许显影30分钟。
如从图18可见，结果显示使用INT作为底物得到与NBT类似的结果。自此之后NBT和INT二者可交换使用。
实施例5-硝酸纤维素类型
鉴于水平式被认为是有前景的形式，进行实验测试大范围的硝酸纤维素类型以确定最适于此形式的类型(图19)。
图19显示测试大范围的硝酸纤维素类型以确定最适类型的结果。使各种硝酸纤维素类型用0.5 mg/mL抗植酸酶BP17的三条测试线形成条带。用空白粉状饲料提取物(1 g/10 mL水)从纯化酶稀释植酸酶BP17样品得到0.2和0.04 U/mL植酸酶BP17 (加上仅有饲料的零对照)。将提取物用移液器吸移至测试棒的样品垫上并允许样品通过毛细管作用沿棒迁移至完成。移除样品垫并施加40 μL底物。使测试进行20分钟并随后拍照。
测试的硝酸纤维素膜之一(即MDI 90 CNPH)显示最佳结果(参见图19)并且的确为从使用先前形式的先前实验中确定的所选硝酸纤维素。此硝酸纤维素可容易获得。另两种硝酸纤维素类型(MDI SS12 12μ和SS12 15μ)亦得到满意结果。所有测试的膜均给出响应。
实施例6-封闭试剂
到目前为止已在提取之后向样品中加入封闭试剂(例如酪蛋白)。认为这并不理想，因为其需要给溶液提供最终测试并且需要操作者将其加入饲料提取物中。进行实验以解决此问题。酪蛋白可难溶于水。然而，发现酪蛋白的钠盐在此方面更佳。这允许以限定量直接向饲料提取物添加酪蛋白酸钠的可能性。此方案为可使用的。然而，对于某些方面，此方案甚至可进一步优化，因为其需要在样品提取管中提供限定量的酪蛋白酸钠，酪蛋白酸钠在运输期间可移位并在开管时损失。因此，决定测试在测试棒本身之内提供封闭试剂的可能性。
设计实验将干燥的封闭试剂放入样品垫和测试硝酸纤维素之间的垫片中。
图20显示在表面活性剂(吐温-20)存在下减少封闭剂酪蛋白浓度的测试结果。用不同浓度的酪蛋白溶液使聚酯缀合物垫饱和并在37℃干燥。然后将垫片(连同另外的样品垫)置于测试棒的“上游”。用水提取空白粉料(1 g/10 mL)并用提取物将纯化酶稀释。将样品用移液器吸移至样品垫上，其随后流过含酪蛋白的垫片并流至测试棒上。移除样品垫和缀合物垫并施加40 μL底物。使测试进行20分钟并随后拍照。见到出人意料的结果，因为仅表面活性剂的存在便足以允许测试令人满意地进行。因此，不含酪蛋白的垫片显示与含酪蛋白垫片相同的色度。
受此研究结果的鼓励，设计实验将封闭试剂直接加至测试硝酸纤维素上以确定此方案是否亦将得到满意结果。
图21显示通过将封闭试剂直接加至测试硝酸纤维素上以测试可否获得满意结果所获得的结果。
更详细而言，图21阐述直接向硝酸纤维素中加入封闭试剂的实验的结果。使硝酸纤维素的片段(lengths)在不同的酪蛋白/吐温溶液中孵育5分钟并随后在55℃干燥10分钟。将硝酸纤维素与未处理的样品垫(和无缀合物垫)层压成背衬卡。亦构建具有未封闭NC和酪蛋白/吐温缀合物垫的一组对照棒。用空白粉状饲料提取物(1 g/10 mL水)从纯化酶稀释植酸酶BP17样品得到0.2和0.04 U/mL植酸酶BP17 (加上仅有饲料的零对照)。将提取物用移液器吸移至测试棒的样品垫上并允许样品通过毛细管作用沿棒迁移至完成。去除样品垫和缀合物垫并施加40 μL底物。使测试进行20分钟并随后拍照。
在无酪蛋白存在时仅有表面活性剂的情况再次得到优异结果(图21)。
使用INT和NBT底物二者用仅由表面活性剂封闭的NC测试了植酸酶BP17浓度稀释系列以测试此方法的灵敏性。
图22显示使用INT和NBT底物二者用仅由表面活性剂封闭的NC测试植酸酶BP17浓度的稀释系列以测试此方法的灵敏性的结果。使加有条带的硝酸纤维素在0.25%吐温-20溶液中孵育5分钟并随后在55℃干燥10分钟。用空白粉状饲料提取物(1 g/10 mL水)从纯化酶稀释植酸酶BP17样品得到0.4-0.0015 U/mL植酸酶BP17的稀释系列(加上仅有饲料的零对照)。
更详细而言，图22显示此实验的结果。使加有条带的硝酸纤维素在0.25%吐温-20溶液中孵育5分钟并随后在55℃干燥10分钟。用空白粉状饲料提取物(1 g/10 mL水)从纯化酶稀释植酸酶BP17样品得到0.4-0.0015 U/mL植酸酶BP17的稀释系列(加上仅有饲料的零对照)。将提取物用移液器吸移至测试棒的样品垫上并允许样品通过毛细管作用沿棒迁移至完成。去除样品垫和缀合物垫并施加40 μL底物(基于NBT或INT)。使测试进行20分钟并随后拍照。结果显示两种底物表现相似并且所述方法的总体灵敏性和半定量性质表现优异。
用表面活性剂直接封闭硝酸纤维素的方法的吸引力为，其免除了在测试棒上包含第二层“封闭垫”的必要性并因此消除关于测试装配的一定程度的复杂性。此外，将封闭试剂包含在测试本身中免去了操作者除向空管中加入饲料和水以用于样品制备之外做任何事的需要。
产生的测试棒为非常简单的设计，其中其由用抗植酸酶BP17抗体(均处于相同浓度)的三条线形成条带并在形成条带之后用0.1%吐温-20的水溶液封闭的附着于空白未处理的样品垫的测试硝酸纤维素组成。
实施例7-底物递送实验
在以上详述的所有实验中，在临用前通过将三个组分(AsAP、PMS和四唑INT或NBT)混合在一起加入底物溶液。为了针对操作者将此简化，进行实验试图使这些组分干燥进入最终测试形式。这意味着操作者无需负责底物组合物以及免去提供液体测试组分的需要。
进行初始实验，其中将多种底物组分混合在一起并用于使吸收垫饱和，接着干燥并在37℃保存，结果在图23中显示。
图23显示在测试干燥和储存混合在一起的多种底物组分时获得的结果。将1平方厘米吸收剂浸入(预混)底物的不同组合中达5分钟。将垫片吸干并放入37℃的培养箱中。在30分钟时所述垫片被认为是干的并将此视为‘时间=0’。以定期的时间间隔监测垫片，尤其是查看紫偏移(NBT)或红偏移(INT)颜色变化。显示了时间零点和过夜。
在此实验中，将1平方厘米吸收剂浸入(预混)底物的不同组合中达5分钟。将垫片吸干并放入37℃的培养箱中。在30分钟时所述垫片被认为是干的并将此视为‘时间=0’。以定期的时间间隔监测垫片，尤其是查看紫偏移(NBT)或红偏移(INT)颜色变化。时间零点和过夜在图23中显示。过夜之后似乎更可用的组合为：独立的NBT或INT；AsAP + PMS；PMS；AsAP + INT似乎适度稳定，并且比AsAP + NBT更稳定。
根据此实验，明确的是将四唑
溶液(INT或NBT二者)与测试的任何其它组分混合随时间产生四唑
的最终沉淀。
亦证实的是混合和干燥的AsAP和PMS似乎随时间而稳定。进行了利用所有这些干组分的实验，亦进行了其中某些底物组分为干的而其它以溶液使用的实验。似乎可能的是，所述测定法的所有组分均可以干燥形式提供。可能含水样品的使用可将干燥组分再水化。
因此，在图6 (干式测试法的实例)中，使用者(操作者)仅添加样品并展示测试。在此图中，2-磷酸基-L-抗坏血酸三钠= AsAP，反应增强剂吩嗪硫酸甲酯= PMS；硝酸纤维素基质= NC；和四唑
底物氯化碘硝基四唑
= INT。
实施例8-干式
进行实验使所有测试组分干燥进入测试，由此操作者仅需向所述测试添加提取物并随后读取结果，而无需任何另外的添加或操作。此处将具有干透的所有组分的垫片并入测试系统的多个部分。如先前所示，不可将所有三个组分预混合并干燥成单个垫片，因此应确定其中不同组分可以是分离的或者至少利用稳定组合的测试系统，亦应确定其在测试内的不同位置。如何设想所述测试的实例可见于图6。因此，图6表示干式测试法的图。
在图6的干式测试法中，操作者仅添加样品并展示测试。最终测试可为盒式的并且将不需要图6中描述的独特平衡物。在阐述的实例中，使PMS/AsAP干燥进入测试硝酸纤维素并将INT的尼龙垫牢固地置于顶部。照常加入样品，以及是样品溶液本身将底物组分再水化。
实施例9-半干式
作为干式(上文)的备选方案，进行了其中某些组分以干燥形式提供而其它保持在溶液中的实验。这产生了称为半干式的测试系统。
在半干式中，样品如前沿水平棒流动，以及一旦完成即将四唑
溶液直接用移液器吸移至测试的硝酸纤维素上。然后用含干燥AsAP/PMS的硝酸纤维素垫将此覆盖并使所述测试显影。这在图3 (涉及半干式的步骤)中阐述。
此形式具有数个优势。操作者无需在测试之前配制底物试剂，以及尽管所述形式需要提供四唑
溶液，但这仅仅是将其‘直接从瓶中’添加的情形。用此形式观察到的一个优势为，免除了吸收垫去除的需要。似乎AsAP/PMS垫的存在将沉淀物固定在原地并且甚至在样品垫存在时所得沉淀物亦不会迁移。
半干式和先前(全溶液)形式之间的比较在图24中显示。
图24显示半干式和全溶液式之间的比较。用空白粉状饲料提取物(1 g/10 mL水)从纯化酶稀释植酸酶BP17样品得到0.4-0.0015 U/mL植酸酶BP17的稀释系列(加上仅有饲料的零对照)。将提取物用移液器吸移至测试棒的样品垫上并允许样品通过毛细管作用沿棒迁移至完成。对于全溶液式，去除样品垫并施加40 μL完整底物。对于半干式，向测试硝酸纤维素添加20 μL INT溶液并将PMS/AsAP垫置于顶部。使测试进行20分钟并随后拍照。
图24的实验结果显示半干法的灵敏性对于测试规范而言为可接受的。
为了使此半干式为可接受的，重要的是四唑
溶液在最终测试的建议储存期内保持稳定。开展实验以解决此问题。所述实验的结果在图25中显示。
在图25的实验中，用空白粉状饲料提取物(1 g/10 mL水)从纯化酶稀释植酸酶BP17样品得到0.2和0.04 U/mL BP17。用50%甲醇、0.125M醋酸盐缓冲液在60℃加热至溶解，以40 mg/mL配制INT。用0.25M醋酸盐缓冲液将此储存液稀释成10 mg/mL。将等份样冻存于-20℃、储存于室温和55℃。将40 μL各提取物用移液器吸移至测试棒的样品垫上并允许样品通过毛细管作用沿棒迁移至完成。一式三份进行测试。将20 μL INT溶液用移液器吸移至测试NC上并将一条PMS/AsAP NC置于顶部。使测试进行20分钟并拍照。立即使用新鲜配制的INT溶液进行‘时间=0’测试以得到基线信号。14天之后，目测比较冷冻、RT和55℃溶液以得到INT溶液的稳定性的持续比较。14天后，RT或55℃未看到INT溶液的变质。-20℃测试的信号弱于其它温度，认为这是因储存和解冻期间的某些INT沉淀所致。
2周之后，在所有温度均未发现活性上的差异，这表明四唑
溶液具有良好的随时间推移的稳定性(图25)。
实施例10-试剂盒
图29阐述本发明的装置/试剂盒/测定法的使用。
在图29的图片1中，用样品将收集袋装填至指示的第一条线，然后用水将袋子装填至指示的第二条线。
在图片2中，将袋子密封并随后振荡直至样品分散。
在图片3中，像书一样打开外壳(依照在图1中描述的实施方案1)。
在图片4中，用来自袋子的一些样品提取物装填移液器，并将此施加至外壳上的放置区。
在图片5中，使用者等待直至液体迁移到棒的顶部。这可通过变色来指示。
在图片6中，向所述装置添加选择性指示工具的一个或多个组分。
在图片7中，将外壳闭合并密封。
在图片8中，将外壳放成平面以显影。
在图片9中，显示一条线、两条线和三条线的结果。
比较实施例
形式2-金缀合抗体夹心法
在图5中阐述的金缀合抗体夹心法区分含有高水平和低水平植酸酶BP17活性的饲料样品。在此测试中生成的信号强度可通过包含游离的抗植酸酶BP17抗体来衰减，显示所述抗体的浓度能够将测试的线性响应移动至所需的植酸酶BP17活性范围。
然而，使用此方法时，所用的多克隆抗植酸酶BP17兔血清与天然酶和变性酶二者反应。
此外，随着金夹心测定法起作用，存在以下怀疑：无活性样品实际上已被耗尽酶以及灭活程序将酶破坏而不是简单灭活。
为解决此问题，进行样品的SDS-PAGE和蛋白质印迹，这显示此理论为正确的以及无活性样品的确已被耗尽酶(图9)。
图9涉及饲料样品和纯化植酸酶BP17的SDS-PAGE和蛋白质印迹。结果显示，与粉料相比，“试验5”颗粒料具有非常少的可检测植酸酶BP17，以及无活性植酸酶BP17不具有可辨别的植酸酶BP17条带(尽管在蛋白质印迹上可见一般的物质印迹)。纯化植酸酶BP17和活性植酸酶BP17 (第9列和第10列)在蛋白质染色中得到一条强带但在蛋白质印迹中得到多个条带，这可能因植酸酶BP17多聚体和降解产物的背景水平所致，这些条带在使用热灭活的样品(第8列)时未发现。
稍微更具体而言，图9显示饲料样品和纯化植酸酶BP17的SDS-PAGE和蛋白质印迹的结果。使用微量浓缩器将活性和无活性植酸酶BP17样品浓缩30倍。使用来自“试验5”的颗粒料和粉料，因为已显示粉料中具有高水平植酸酶BP17以及加工的颗粒料中具有可忽略量的植酸酶BP17。用MilliQ水将饲料颗粒和粉状提取10分钟并使所得提取物在SDS-PAGE上泳动。将蛋白质转移至硝酸纤维素膜并用丽春红S对总蛋白染色(左侧图片)。将印迹用抗植酸酶BP17抗血清第一抗体探测，接着用生物素化的羊抗兔第二抗体探测并用链霉抗生物素-Qdot 625缀合物(Invitrogen)显现。结果显示，与粉料相比，“试验5”颗粒料具有非常少的可检测植酸酶BP17，以及无活性植酸酶BP17不具有可辨别的植酸酶BP17条带(尽管在蛋白质印迹上可见一般的物质印迹)。纯化植酸酶BP17和活性植酸酶BP17在蛋白质染色中得到一条强带但在蛋白质印迹中得到多条条带，这可能因植酸酶BP17多聚体和降解产物的背景水平所致，这些条带在使用无活性样品时未发现。
此研究结果致使怀疑金测定法在确定给定样品中的活性酶水平的可靠性。尽管似乎可能的是，以实验灭活的植酸酶BP17和具有低处理后植酸酶BP17活性的饲料会是机械上相当的(即在两种情况下植酸酶BP17均被破坏)，但是基于金的测定法将不能检测因变性而非破坏所致的植酸酶BP17失活的情况。
为测试此问题，使用特异性植酸酶BP17抑制剂肌醇六硫酸酯(MIHS)来抑制植酸酶BP17活性而不破坏所述酶。此时所述金测定法仍能检出受抑制的酶的存在，然而活性测定显示大大减弱的信号(图10)。
图10显示使用植酸酶BP17特异性抑制剂MIHS的金夹心形式(形式2)和沉淀底物酶活性形式(形式1-即本发明的测定法)的比较。
对于金夹心测试法的结果在图10上部中显示。此处，在含或不含2.5 mM MIHS的情况下用75 mM甘氨酸-HCl缓冲液(pH 2.5)以不同浓度配制纯化植酸酶BP17并允许其在测试之前孵育20分钟。以100 μL样品进行金测试法。
作为比较，沉淀底物测试法亦在图10下部中显示。以不同浓度的40 μL样品进行沉淀底物测试法。将40 μL含2.5 mM MIHS的75 mM甘氨酸缓冲液(或者仅缓冲液对照)施加至测试棒并孵育15分钟。然后去除所述溶液并加入底物溶液(含AsAP、PMS、氯化氮蓝四唑
(NBT)的2%吐温-20)。将此溶液孵育1分钟、去除并使棒显影。在20分钟后对测试拍照。结果表明，金测试法检测植酸酶BP17而不论其是否受抑制，然而沉淀底物测试法仅清楚地检出活性酶。
从图10 (其为使用植酸酶BP17特异性抑制剂MIHS (其抑制植酸酶BP17活性而不破坏所述酶)的金夹心形式和沉淀底物酶活性形式的比较)可见，金测定法(上图)仍能检出受抑制的酶的存在，然而活性测定法(下图)显示大大减弱的信号。
因此，金缀合抗体夹心形式(图5)仅检测酶的存在情况而非其活性。使用此形式的测定法，用特异性抑制剂使植酸酶BP17功能性灭活仍得到阳性结果。
这些结果清楚地证实对于这样的测定法的需求，所述测定法中诸如植酸酶BP17等酶的活性可直接测定，而不是依赖于所述酶仅因其仍存在就为活性的这一假定。本发明的测定装置满足所述需求。
WO2005/014847和WO2007/001895描述基于与金测试法相同原理的测定法。据称，所述装置仅检测活性植酸酶，其使用所描述的Elisa试剂盒测定热处理的饲料。这可能不正确，因为在样品制备中植酸酶被破坏并随饲料基质一起去除。因此所述试剂盒实际上不能区分存在的活性植酸酶和存在的非活性植酸酶。
第2部分
在这些实验中，我们提供关于利用本发明的装置和方法检测样品中的活性木聚糖酶的检测方法的详情。
实施例i
用于此实施例的方法是基于还原糖法的检测系统。在此方面，我们修改Chong等“Determination of reducing sugars in the nanomole range with tetrazolium blue(使用四唑
蓝以纳摩尔范围测定还原糖)” (Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109?115)阐述的方法。在该方法(其为平板测定法)中，通过在NaOH中将糖样品与氯化四唑
蓝和酒石酸钾钠一起加热(95℃ 3分钟或者55℃ 1小时)来检测还原糖(例如木糖)。
在使用本发明的装置和方法检测样品中活性木聚糖酶的我们的方法中，我们通过将氯化四唑
蓝替换成氯化氮蓝四唑，经由在室温下孵育来检测因木聚糖酶对其木聚糖底物的酶活性所致的还原糖(例如木糖)的产生。氯化氮蓝四唑来自与在第1部分(上文)中阐述的植酸酶方法中所用底物相同的底物家族。
数据在图26中显示。在此方面：
(图26的)上排，从左往右：
纯木糖(5 μL 1%溶液)，接着成倍的稀释物(0.5?0.0001%木糖)以及最右侧的零对照
(图26的)下排，从左往右：
在第一个孔中含有5 μL 10 U/mL木聚糖酶的木聚糖酶测定，接着酶的成倍稀释物(5?0.001 U/mL木聚糖酶)以及最右侧的零对照。各孔亦含有5 μL含1%木聚糖(底物)的醋酸盐缓冲液(0.25 M, pH 4.5)。在木聚糖酶和木聚糖在各孔中混合在一起后，使平板在37℃孵育60分钟以允许酶与其底物反应。
在我们的方法中，向各孔加入200 μL‘显影液’并将平板置于55℃达1小时并随后拍照。所述显影液含有1 mg/mL四唑
蓝、0.5 M酒石酸钾钠和0.05 M NaOH。
我们的还原糖法检出5 μL 0.031%木糖(上排，从左侧起第6个孔)以及在酶测定中检出约5 μL 0.1 U/mL木聚糖酶(下排，从左侧起第7个孔)。
实施例ii
用于此实施例的方法亦为基于还原糖法的检测系统。用于此实施例的方法与用于上文实施例i上排(木糖1-0.0001%)的方法相同——除了将四唑
蓝替换成氮蓝四唑
以及使反应在室温下显影60分钟之外。数据在图27中显示。
实施例iii
在实施例i或实施例ii中阐述的方法可用于依照本发明的测定装置或方法以检测样品中的活性木聚糖酶。在此方面，将所述木聚糖酶检测法并入类似于第1部分(上文)所述测试法的快速测试法。
因此，以与上文提及的植酸酶测试法类似的方式，用针对所需或合适木聚糖酶产生的抗体捕获来自复合饲料提取物的木聚糖酶。在所述方法中，将木聚糖酶暴露给木聚糖底物以及产生的所得木糖通过例如四唑还原糖测定法检测。图28显示此方法的示意图。
在以上说明书中提及的所有出版物均通过引用结合到本文中。在不背离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变动将对本领域技术人员显而易见。尽管结合具体的优选实施方案来阐述本发明，但应理解的是，如所要求保护的本发明不应过度限于所述具体实施方案。事实上，意图的是，用于实施本发明的所述模式的各种修改在随附权利要求的范围之内，所述修改对生物化学领域或相关领域的技术人员而言为明显的。
Claims (86)
1. 一种用于检测样品中的活性酶的测定装置(1)，所述装置包含：
(a)其上可放置样品的放置区(10)；
(b)基质(20)，其与所述放置区(10)可操作连接，使得样品当出现(例如放置)在所述放置区(10)时可沿所述基质(20)迁移；
(c)在所述基质(20)上的至少一个独特捕获位置(30)，其中各独特捕获位置(30)远离放置区(10)，以及其中样品可跨越所述独特捕获位置(30)迁移；
(d)存在于各独特捕获位置(30)或者界定各独特捕获位置(30)的捕获工具(40)，其中所述捕获工具(40)能够与所述酶结合，使得所述酶的所述样品的至少一部分保留在至少一个独特捕获位置(30)；和
(e)提供与所述捕获工具结合的活性酶存在情况的选择性指示的选择性指示工具(50)或者其至少一个组分。
2. 依照权利要求1的测定装置(1)，其中所述放置区(10)为吸收垫。
3. 依照权利要求1或权利要求2的测定装置(1)，其中所述放置区(10)在所述基质(20)的一端。
4. 权利要求1-3中任一项的测定装置(1)，其中所述装置包含多个独特捕获位置(30)。
5. 权利要求1-4中任一项的测定装置(1)，其中所述装置包含多于两个独特捕获位置(30)。
6. 权利要求1-5中任一项的测定装置(1)，其中所述装置包含三个独特捕获位置(30)。
7. 权利要求5或权利要求6的测定装置(1)，其中各独特捕获位置处的捕获工具(40)的量为不同的或相同的。
8. 权利要求7的测定装置(1)，其中各独特捕获位置(30)处的捕获工具(40)的量随着所述位置远离所述放置区(10)的程度而增加或减少。
9. 权利要求1-8中任一项的测定装置，其中所述装置包含封闭试剂。
10. 权利要求9的测定装置(1)，其中所述封闭试剂与所述装置直接结合。
11. 权利要求9或权利要求10的测定装置(1)，其中所述封闭试剂为表面活性剂或包含表面活性剂。
12. 权利要求9-11中任一项的测定装置(1)，其中所述封闭试剂为表面活性剂。
13. 权利要求11或权利要求12的测定装置(1)，其中所述封闭试剂为吐温。
14. 权利要求1-13中任一项的测定装置(1)，其中所述基质(20)为吸收性材料。
15. 权利要求1-14中任一项的测定装置(1)，其中所述基质(20)为硝酸纤维素或包含硝酸纤维素。
16. 权利要求1-15中任一项的测定装置(1)，其中所述选择性指示工具(50)包含沉淀反应。
17. 权利要求1-16中任一项的测定装置(1)，其中所述选择性指示工具(50)包含或提供可见的颜色变化。
18. 权利要求17的测定装置(1)，其中所述颜色变化通过酶底物的反应形成与活性物质反应的部分而引发。
19. 权利要求18的测定装置(1)，其中所述底物与所述基质(20)结合。
20. 权利要求18或权利要求19的测定装置(1)，其中所述底物为使用/具有磷酸根供体的磷酸酶底物。
21. 权利要求20的测定装置(1)，其中所述磷酸酶底物为2-磷酸基-L-抗坏血酸三钠(AsAP)。
22. 权利要求18-21中任一项的测定装置(1)，其中所述活性物质为四唑 
化合物。
23. 权利要求22的测定装置(1)，其中所述活性物质为氮蓝四唑
化合物。
24. 权利要求23的测定装置(1)，其中所述活性物质为氯化氮蓝四唑
(NBT)。
25. 权利要求22的测定装置(1)，其中所述活性物质为卤代硝基四唑
化合物。
26. 权利要求25的测定装置(1)，其中所述活性物质为碘硝基四唑
化合物。
27. 权利要求26的测定装置(1)，其中所述活性物质为氯化碘硝基四唑
(INT)。
28. 权利要求18-27中任一项的测定装置(1)，其中所述磷酸酶底物在反应增强剂存在下与所述活性物质反应。
29. 权利要求28的测定装置(1)，其中所述反应增强剂与第二基质结合。
30. 权利要求28或权利要求29的测定装置(1)，其中所述反应增强剂为吩嗪化合物。
31. 权利要求28-30中任一项的测定装置(1)，其中所述反应增强剂为硫酸甲酯化合物。
32. 权利要求28-31中任一项的测定装置(1)，其中所述反应增强剂为吩嗪硫酸甲酯(PMS)。
33. 权利要求1-32中任一项的测定装置(1)，其中所述捕获工具(40)为相同的。
34. 权利要求1-33中任一项的测定装置(1)，其中所述捕获工具(40)为抗体。
35. 权利要求34的测定装置(1)，其中所述抗体为针对所述酶或其组分(例如其片段和/或其表位)产生的抗体。
36. 权利要求34或权利要求35的测定装置(1)，其中所述抗体为多克隆或单克隆抗体。
37. 权利要求1-36中任一项的测定装置(1)，其中所述样品为含水样品。
38. 权利要求1-37中任一项的测定装置(1)，其中所述样品来源于饲料或饲料添加剂。
39. 权利要求1-38中任一项的测定装置(1)，其中所述样品为来自饲料或饲料添加剂的提取物。
40. 权利要求1-39中任一项的测定装置(1)，其中所述样品为来自饲料颗粒的提取物。
41. 权利要求1-40中任一项的测定装置(1)，其中所述酶为酸性磷酸酶。
42. 权利要求1-41中任一项的测定装置(1)，其中所述酶为植酸酶。
43. 权利要求42的测定装置(1)，其中所述植酸酶为6-植酸酶，例如植酸酶BP17。
44. 权利要求1-41中任一项的测定装置(1)，其中所述酶为木聚糖酶。
45. 权利要求1-44中任一项的测定装置(1)，其中所述迁移为纵向的。
46. 权利要求1-45中任一项的测定装置(1)，其中所述捕获位置(30)垂直于样品的迁移流。
47. 权利要求1-46中任一项的测定装置，其中所述装置为条或棒。
48. 权利要求1-47中任一项的测定装置，其中所述装置包含封盖。
49. 权利要求48的测定装置，其中所述封盖由所述装置中界定两个部分的折叠形成。
50. 权利要求49的测定装置，其中所述装置组件(a)-(e)的某些或全部存在于一个部分，并且其中所述装置组件(a)-(e)的某些或全部存在于另一部分。
51. 权利要求49或权利要求50的测定装置，其中所述选择性指示工具(e)或其至少一个组分存在于一个部分，并且其中所述装置组件(a)-(d)的某些或全部存在于同一部分或另一部分。
52. 权利要求49-51中任一项的测定装置，其中所述选择性指示工具(e)或其至少一个组分存在于一个部分，并且其中所述装置组件(a)-(d)存在于同一部分或另一部分。
53. 权利要求48-52中任一项的测定装置，其中所述选择性指示工具(e)或其至少一个组分存在于封盖之中或之上。
54. 一种用于至少半定量地评估饲料或饲料添加剂中的活性植酸酶水平的测定装置(1)。
55. 一种用于至少半定量地评估饲料或饲料添加剂中的活性木聚糖酶水平的测定装置(1)。
56. 一种确定样品中的活性酶存在情况的方法，其中将所述样品置于权利要求1-55中任一项的测定装置(1)的放置区(10)上以及所述装置的选择性指示工具(50)指示活性酶是否存在。
57. 一种确定样品中的活性酶水平的方法，其中将所述样品置于权利要求1-55中任一项的测定装置(1)的放置区(10)上以及所述装置的选择性指示工具(50)半定量地指示存在的活性酶的量。
58. 权利要求56或57的方法，其中所述样品获自食品或饲料。
59. 权利要求56-58中任一项的方法，其中所述待测的活性酶为植酸酶。
60. 权利要求56-58中任一项的方法，其中所述待测的活性酶为木聚糖酶。
61. 权利要求56-60中任一项的方法，其中所述方法用于确定是否需要向食品或饲料中添加额外的酶。
62. 权利要求56-61中任一项的方法，其中所述方法用于确定是否需要向食品或饲料中添加额外的植酸酶。
63. 权利要求56-62中任一项的方法，其中所述方法用作质量控制的形式。
64. 一种试剂盒，所述试剂盒包含或能够形成权利要求1-55中任一项的测定装置(1)。
65. 权利要求64的试剂盒，所述试剂盒包含通过添加液体或含水样品复溶的干燥试剂。
66. 权利要求64或65的试剂盒，所述试剂盒另外包含待通过操作者添加的至少一种液体试剂。
67. 权利要求66的试剂盒，其中所述液体试剂为四唑
溶液。
68. 一种确定样品中的活性酶存在情况的方法，其中所述方法包括以下步骤：
a)使至少一部分样品与捕获工具接触，籍此酶被所述捕获工具捕获；
b)给捕获的酶提供合适底物，其中所述底物与所述捕获的酶反应生成酶产物；
c)提供能够与所述酶产物反应的活性物质，其中所述活性物质与所述酶产物反应生成不溶性产物；和
d)检测在步骤c)中获得的不溶性产物，其中所述检测与所述样品中活性酶的存在情况和/或量相关。
69. 依照权利要求68的方法，其中所述酶为如在权利要求1-67的任一项中所定义的酶。
70. 依照权利要求68或权利要求69的方法，其中所述样品为如在权利要求1-67的任一项中所定义的样品。
71. 依照权利要求68-70中任一项的方法，其中所述捕获工具为如在权利要求1-67的任一项中所定义的捕获工具。
72. 依照权利要求68-71中任一项的方法，其中所述活性物质为如在权利要求1-67的任一项中所定义的活性物质。
73. 依照权利要求68-72中任一项的方法，其中所述方法使用如在权利要求1-67的任一项中所定义的装置。
74. 测定装置(1)或使用所述测定装置(1)的方法或其用途，其中所述测定装置用于检测样品中的活性植酸酶，所述装置包含：
(a)其上可放置样品的放置区(10)；
(b)基质(20)，其与所述放置区(10)可操作连接，使得样品当出现(例如放置)在所述放置区(10)时可沿所述基质(20)迁移；
(c)在所述基质(20)上的至少一个独特捕获位置(30)，其中各独特捕获位置(30)远离放置区(10)，以及其中样品可跨越所述独特捕获位置(30)迁移；
(d)存在于各独特捕获位置(30)或者界定各独特捕获位置(30)的捕获工具(40)，其中所述捕获工具(40)能够与所述植酸酶结合，使得所述植酸酶的所述样品的至少一部分保留在至少一个独特捕获位置(30)；和
(e)提供与所述捕获工具结合的活性植酸酶存在情况的选择性指示的选择性指示工具(50)或者其至少一个组分。
75. 测定装置(1)或使用所述测定装置(1)的方法或其用途，其中所述测定装置用于检测样品中的活性植酸酶，所述装置包含：
(a)其上可放置样品的放置区(10)；
(b)基质(20)，其与所述放置区(10)可操作连接，使得样品当出现(例如放置)在所述放置区(10)时可沿所述基质(20)迁移；
(c)在所述基质(20)上的至少一个独特捕获位置(30)，其中各独特捕获位置(30)远离放置区(10)，以及其中样品可跨越所述独特捕获位置(30)迁移；
(d)存在于各独特捕获位置(30)或者界定各独特捕获位置(30)的捕获工具(40)，其中所述捕获工具(40)能够与所述植酸酶结合，使得所述植酸酶的所述样品的至少一部分保留在至少一个独特捕获位置(30)，其中所述捕获工具包含抗体；和
(e)提供与所述捕获工具结合的活性植酸酶存在情况的选择性指示的选择性指示工具(50)或者其至少一个组分。
76. 测定装置(1)或使用所述测定装置(1)的方法或其用途，其中所述测定装置用于检测样品中的活性植酸酶，所述装置包含：
(a)其上可放置样品的放置区(10)；
(b)基质(20)，其与所述放置区(10)可操作连接，使得样品当出现(例如放置)在所述放置区(10)时可沿所述基质(20)迁移；
(c)在所述基质(20)上的至少一个独特捕获位置(30)，其中各独特捕获位置(30)远离放置区(10)，以及其中样品可跨越所述独特捕获位置(30)迁移；
(d)存在于各独特捕获位置(30)或者界定各独特捕获位置(30)的捕获工具(40)，其中所述捕获工具(40)能够与所述植酸酶结合，使得所述植酸酶的所述样品的至少一部分保留在至少一个独特捕获位置(30)，其中所述捕获工具包含可结合BP17的抗体；和
(e)提供与所述捕获工具结合的活性植酸酶存在情况的选择性指示的选择性指示工具(50)或者其至少一个组分。
77. 测定装置或使用所述测定装置的方法或其用途，其中所述测定装置用于检测样品中的活性木聚糖酶，所述装置包含：
(a)其上可放置样品的放置区；
(b)基质，其与所述放置区可操作连接，使得样品当出现(例如放置)在所述放置区时可沿所述基质迁移；
(c)在所述基质上的至少一个独特捕获位置，其中各独特捕获位置远离放置区，以及其中样品可跨越所述独特捕获位置迁移；
(d)存在于各独特捕获位置或者界定各独特捕获位置的捕获工具，其中所述捕获工具能够与所述木聚糖酶结合，使得所述木聚糖酶的所述样品的至少一部分保留在至少一个独特捕获位置；和
(e)提供与所述捕获工具结合的活性木聚糖酶存在情况的选择性指示的选择性指示工具或者其至少一个组分。
78. 测定装置或使用所述测定装置的方法或其用途，其中所述测定装置用于检测样品中的活性木聚糖酶，所述装置包含：
(a)其上可放置样品的放置区；
(b)基质，其与所述放置区可操作连接，使得样品当出现(例如放置)在所述放置区时可沿所述基质迁移；
(c)在所述基质上的至少一个独特捕获位置，其中各独特捕获位置远离放置区，以及其中样品可跨越所述独特捕获位置迁移；
(d)存在于各独特捕获位置或者界定各独特捕获位置的捕获工具，其中所述捕获工具能够与所述木聚糖酶结合，使得所述木聚糖酶的所述样品的至少一部分保留在至少一个独特捕获位置，其中所述捕获工具包含抗体；和
(e)提供与所述捕获工具结合的活性木聚糖酶存在情况的选择性指示的选择性指示工具或者其至少一个组分。
79. 依照前述权利要求中任一项的测定装置或使用所述测定装置的方法或其用途，其中当所述测定装置在使用中时，所述选择性指示工具在所述测定装置之上和/或之中构成。
80. 一种试剂盒，所述试剂盒包含或能够形成前述权利要求中任一项的测定装置(1)，其中向所述试剂盒中加入所述选择性指示工具(50)。
81. 一种试剂盒，所述试剂盒包含或能够形成前述权利要求中任一项的测定装置(1)，其中向所述试剂盒中加入所述选择性指示工具(50)的至少一个组分。
82. 前述权利要求中任一项的试剂盒，所述试剂盒提供有评分卡或参照卡。
83. 基本上如本文所述并参考附图的测定装置(1)。
84. 基本上如本文所述并参考附图的方法。
85. 基本上如本文所述并参考附图的用途。
86. 基本上如本文所述并参考附图的试剂盒。
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Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105543335A (zh) * | 2016-01-08 | 2016-05-04 | 南京理工大学 | 一种酸性磷酸酶活性的测定方法 |
| TWI625377B (zh) * | 2016-03-21 | 2018-06-01 | 國立成功大學 | 反應系統及該反應系統的使用方法 |
| TWI694256B (zh) * | 2017-03-20 | 2020-05-21 | 國立成功大學 | 可放大訊號的分子探針及其使用方法 |
| US10962530B2 (en) | 2016-03-21 | 2021-03-30 | National Cheng Kung University | Molecular probe for signal amplification and kit and assay using the same |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB201303876D0 (en) * | 2013-01-29 | 2013-04-17 | Verenium Corp | Animal feed enzyme extraction |
| KR101656181B1 (ko) * | 2015-03-30 | 2016-09-08 | 경희대학교 산학협력단 | 마이크로 패드 플랫폼 |
| US10605807B2 (en) | 2016-02-24 | 2020-03-31 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for fluorescence detection |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987006706A1 (en) * | 1986-04-30 | 1987-11-05 | Igen, Inc. | Electrochemiluminescent assays |
| WO2003023051A2 (en) * | 2001-09-11 | 2003-03-20 | Merck Patent Gmbh | Lateral flow test format for enzyme assays |
| WO2005012567A1 (en) * | 2003-08-01 | 2005-02-10 | Iseao Technologies Limited | Methods and kits for detecting an enzyme capable of modifying a nucleic acid |
| WO2005014847A2 (en) * | 2003-07-07 | 2005-02-17 | Syngenta Participations Ag | Reagents, methods and kits for detecting feed enzymes |
| WO2006123254A2 (en) * | 2005-05-16 | 2006-11-23 | Danisco A/S | Method for determining phytase activity |
| WO2007001895A2 (en) * | 2005-06-24 | 2007-01-04 | Syngenta Participations Ag | Monoclonal antibodies, hybridoma cell lines, methods and kits for detecting phytase |
| WO2010083289A1 (en) * | 2009-01-16 | 2010-07-22 | Reed Immunodiagnostics Llc | Detection devices and methods |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4425438A (en) | 1981-03-13 | 1984-01-10 | Bauman David S | Assay method and device |
| EP0063456B1 (en) | 1981-04-13 | 1984-08-01 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Pseudo-aminosugars, their production and use |
| US5073484A (en) | 1982-03-09 | 1991-12-17 | Bio-Metric Systems, Inc. | Quantitative analysis apparatus and method |
| US5196314A (en) | 1986-04-04 | 1993-03-23 | Boehringer Mannheim Gmbh | Process and reagent for the determination of substrates or enzyme activities |
| JPH0599A (ja) * | 1991-06-24 | 1993-01-08 | Konica Corp | ホスフアターゼの活性測定法 |
| US5451504A (en) | 1991-07-29 | 1995-09-19 | Serex, Inc. | Method and device for detecting the presence of analyte in a sample |
| US5229073A (en) | 1992-02-27 | 1993-07-20 | Abbott Laboratories | One-step competitive immunoassay for the semiquantitative determination of plasma lipoprotein(a) |
| US5360595A (en) | 1993-08-19 | 1994-11-01 | Miles Inc. | Preparation of diagnostic test strips containing tetrazolium salt indicators |
| US6119587A (en) | 1995-05-11 | 2000-09-19 | Restaurant Technology, Inc. | Cooked food staging device and method |
| WO1997024141A1 (en) * | 1995-12-29 | 1997-07-10 | Piper Robert C | Monoclonal antibodies and immuno-capture method for quantitation and speciation of malaria parasites |
| US6610494B2 (en) * | 1996-05-14 | 2003-08-26 | Ronald R. Marquardt | Solid-phase activity assay for biologically active substance |
| US6183972B1 (en) | 1998-07-27 | 2001-02-06 | Bayer Corporation | Method for the determination of analyte concentration in a lateral flow sandwich immunoassay exhibiting high-dose hook effect |
| DE10023923A1 (de) * | 1999-06-10 | 2000-12-14 | Aventis Behring Gmbh | Verfahren zur Bestimmung der Aktivität der Faktor VII-aktivierenden Protease aus Proteinlösungen |
| CN1756834B (zh) | 2003-02-24 | 2010-05-26 | 比南股份有限公司 | 干式化学、侧向流动重建流的层析酶驱动测定 |
| DK1598670T3 (da) * | 2003-02-25 | 2007-10-08 | Nitto Boseki Co Ltd | Metode til immunobestemmelse af tartratresistent sur phosphatase 5b og kit til anvendelse derved |
| WO2004085638A1 (en) | 2003-03-25 | 2004-10-07 | Republic Of National Fisheries Research And Development Institute | Phytase produced from citrobacter braakii |
| GB0422052D0 (en) | 2004-10-04 | 2004-11-03 | Dansico As | Enzymes |
| WO2006038128A2 (en) | 2004-10-04 | 2006-04-13 | Danisco A/S | Citrobacter freundii phytase and homologues |
| AR050895A1 (es) | 2004-10-04 | 2006-11-29 | Novozymes As | Polipeptidos que tienen actividad de fitasa y polinucleotidos que los codifican |
| BRPI0517539A (pt) | 2004-10-04 | 2008-10-14 | Novozymes As | polipeptìdeo isolado, polinucleotìdeo isolado, construto de ácido nucleico, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptìdeo, e para melhorar o valor nutricional de uma ração animal, célula de planta, parte de planta ou planta transgênica, animal não-humano, transgênico, ou produtos, ou elementos do mesmo, uso de pelo menos um polipeptìdeo, aditivo de ração animal, e, composição de ração animal |
| GB0423139D0 (en) | 2004-10-18 | 2004-11-17 | Danisco | Enzymes |
| MX2008012632A (es) | 2006-04-04 | 2008-10-13 | Novozymes As | Variantes de fitasa. |
| WO2007139243A1 (en) * | 2006-05-30 | 2007-12-06 | Ewha University-Industry Collaboration Foundation | Methods and kits for in situ measurement of enzyme activity and amount using single measurement system |
| US7897360B2 (en) * | 2006-12-15 | 2011-03-01 | Kimberly-Clark Worldwide, Inc. | Enzyme detection techniques |
| AU2008209720C1 (en) | 2007-01-30 | 2016-06-16 | Novozymes A/S | Polypeptides having phytase activty and polynucleotides encoding same |
| CN101688192A (zh) | 2007-02-07 | 2010-03-31 | 丹尼斯科美国公司 | 用植酸酶和α-淀粉酶进行淀粉水解 |
| KR20100014593A (ko) | 2007-03-26 | 2010-02-10 | 노보자임스 에이/에스 | 하프니아 파이타제 |
| HUE052318T2 (hu) | 2008-04-18 | 2021-04-28 | Danisco Us Inc | Bittiauxella sp. fitáz változatok |
| GB0922467D0 (en) | 2009-04-24 | 2010-02-03 | Danisco | Feed supplement |
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Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1987006706A1 (en) * | 1986-04-30 | 1987-11-05 | Igen, Inc. | Electrochemiluminescent assays |
| WO2003023051A2 (en) * | 2001-09-11 | 2003-03-20 | Merck Patent Gmbh | Lateral flow test format for enzyme assays |
| WO2005014847A2 (en) * | 2003-07-07 | 2005-02-17 | Syngenta Participations Ag | Reagents, methods and kits for detecting feed enzymes |
| WO2005012567A1 (en) * | 2003-08-01 | 2005-02-10 | Iseao Technologies Limited | Methods and kits for detecting an enzyme capable of modifying a nucleic acid |
| WO2006123254A2 (en) * | 2005-05-16 | 2006-11-23 | Danisco A/S | Method for determining phytase activity |
| WO2007001895A2 (en) * | 2005-06-24 | 2007-01-04 | Syngenta Participations Ag | Monoclonal antibodies, hybridoma cell lines, methods and kits for detecting phytase |
| WO2010083289A1 (en) * | 2009-01-16 | 2010-07-22 | Reed Immunodiagnostics Llc | Detection devices and methods |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105543335A (zh) * | 2016-01-08 | 2016-05-04 | 南京理工大学 | 一种酸性磷酸酶活性的测定方法 |
| CN105543335B (zh) * | 2016-01-08 | 2019-05-31 | 南京理工大学 | 一种酸性磷酸酶活性的测定方法 |
| TWI625377B (zh) * | 2016-03-21 | 2018-06-01 | 國立成功大學 | 反應系統及該反應系統的使用方法 |
| US10962530B2 (en) | 2016-03-21 | 2021-03-30 | National Cheng Kung University | Molecular probe for signal amplification and kit and assay using the same |
| TWI694256B (zh) * | 2017-03-20 | 2020-05-21 | 國立成功大學 | 可放大訊號的分子探針及其使用方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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