KR20140057254A - 검정법 - Google Patents

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마이 파우르쇼우 이사크센
아나 헤밍센 켈레트-스미스
네일 맥레넌
세인웬 길버트
마이브리트 하우게 퀴네브
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듀폰 뉴트리션 바이오사이언시즈 에이피에스
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Abstract

본 발명은 샘플 중 활성 효소를 검출하기 위한 검정 장치 (1)에 대해 개시한다. 상기 검정 장치 (1)는 하기의 구성요소들을 포함한다: (a) 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역 (10); (b) 샘플이 상기 배치 영역 (10)에 존재하는 (예컨대 배치되는) 경우 매트릭스 (20)를 따라 이동할 수 있도록 상기 배치 영역 (10)에 작동가능하게 연결된 매트릭스 (20); (c) 각 별개의 포획 위치 (30)가 배치 영역 (10)으로부터 이격되어 있으며, 샘플이 상기 별개의 포획 위치 (30)를 가로질러 이동할 수 있는, 상기 매트릭스 (20) 상의 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30); (d) 각 별개의 포획 위치 (30)에 존재하거나 그것을 한정하며, 활성 효소 샘플의 적어도 일부분이 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30)에서 유지되도록 상기 효소에 결합할 수 있는 포획 수단 (40); 및 (e) 상기 포획 수단 (40)에 결합된 활성 효소의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 선택적 표시 수단 (50) 또는 적어도 그의 구성요소.

Description

검정법 {ASSAY}
본 발명은 효소 검정법(enzyme assay)의 분야에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 효소 활성 스트립(strip) 검정법에 관한 것이다.
더 구체적으로, 본 발명은 검정 장치 및 그의 사용 방법 및 그의 용도에 관한 것이다. 상기 검정 장치 및 검정법은 활성 효소를 검출할 수 있다. 상기 활성 효소는 포스파타제, 예컨대 피타제 또는 산 포스파타제, 또는 글리코시드 히드롤라제, 예컨대 크실라나제, β-글루카나제 또는 아밀라제일 수 있다. 더욱 바람직한 측면에서, 활성 효소는 피타제이다.
본 발명은 생물연료 생산, 세제 조성물에서 활성 효소를 검출하는 것, 그리고 식품 및 동물 사료에서 활성 효소를 검출하는 것과 같은 다양한 산업 용도에서의 적용에 유용하다.
실험실에서, 그리고 또한 식품 및 동물 사료, 생물연료 생산, 및 세척 비누 및 분말과 같은 다양한 분야에서는, 빈번하게 분석물(analyte), 특히 효소의 존재 또는 부재를 측정할 필요성이 존재한다. 이와 같은 목적에는 보통 면역검정법과 같은 검정법들이 사용된다.
샘플에서 항체 또는 항원의 존재를 검출하는 데에는, 효소-연관 면역흡착 검정법 (ELISA)이 사용될 수 있다. 이 방법에서는, 항체가 표면에 고정된 항원에 결합되거나, 또는 그 반대이다. 그와 같은 항체는 보통 색상 변화인 검출가능한 신호를 생성시킬 수 있는 효소에 결합된다.
또다른 통상적인 유형의 검정법 또는 면역검정법은 측방 유동 검정법(lateral flow assay)이다. 이 검정법에서는, 고체 지지체를 따라 유동하는 샘플 중에서 분석물의 존재가 검출된다. 이후, 분석물, 또는 분석물에 결합되는 항체와 같은 시약은 항원 또는 항체로 처리되어 있는 지지체 내의 선 또는 구역에 결합한다.
ELISA 및 측방 유동 검정법은 모두 샌드위치 검정법일 수도 있다. 이는 샘플이 먼저, 검출될 항원에 결합하는 포획 항체와 접촉된다는 것을 의미한다. 이후, 상기 항원은 측방 유동 검정법의 경우 고정된 시험 선에 존재할 가능성이 있는 추가 항체에 결합된다. 이에 따라 항원은 2종 이상의 항체들 사이에 샌드위칭된다. 상기 제2의 항체는 검출가능한 신호에 결합된다.
상기한 유형의 많은 검정법 또는 면역검정법들이 특정 효소의 존재를 측정한다.
그러나, 일부 샘플에서, 효소는 존재하기는 하지만, 예컨대 열적 또는 화학적 불활성화에 의해 불활성화되어 있다. 그와 같은 경우, 기존의 검정법들은 여전히 효소의 존재를 검출한다.
예를 들어, US4425438호는 측방 유동 시스템보다는 칼럼을 사용하는 검정법에 대해 기술하고 있다. 샘플은 분석물 흡착제로 코팅되어 있는 비드 구역을 통하여 유동한다. 분석물 결합이 발생하는 구역은 분석물 정량의 수단을 제공한다. 또다른 칼럼 검정법이 US5073484호에 기술되어 있는데, 거기에서는 유동 경로를 따라 이격된 구역들을 사용하여 액체 중 분석물의 정량 측정이 이루어진다.
예를 들어 US5451504호에 기술되어 있는 것과 같은 측방 유동 장치는 보통 샘플의 침착, 분석물의 포획 또는 고정, 및 포획된 분석물 또는 분석물 복합체의 검출을 위한 여러 구역들을 가지고 있다. 분석물이 효소인 경우, 그와 같은 장치들은 분석물을 정량하거나 활성을 확인하지는 못한다.
US6183972호에 개시되어 있는 측방 유동 검정법은 표지된 항-분석물 항체를 포획하고 검출가능한 신호를 제공하기 위한 다수의 포획 위치 또는 밴드들을 사용한다. 상기 밴드들은 독특한 신호 패턴을 제공하는데, 단조의 투여량-반응 곡선을 생성시키기 위하여 수학적으로 조합될 경우 그것은 샘플 중 분석물의 농도를 표시한다.
US5229073호는 샘플 중 분석물의 양을 준-정량하기 위하여 다수의 포획 위치들을 사용하는 측방 유동 검정법에 대해 기술하고 있다.
대형 분자 (예컨대 > 3000 달톤)는 US6358548호의 측방 유동 장치를 사용하여 검출될 수 있다. 실시양태에 따라, 포획 부위에서의 색상 강도 또는 선 수가 분석물 양의 표시를 제공한다.
US7425302호는 반응물들이 건조되어 있는 측방 유동법에 대해 개시하고 있다. 액체 샘플을 첨가하는 것은 건조 반응물들을 재-구성한다. 이 방법은 색상 변화의 강도를 기준으로 분석물을 정량한다. 특정 효소 G6PD의 활성이 색상 변화가 발생하는 데에 걸리는 시간의 길이에 의해 측정되는데, 이는 얼마나 빨리 G6PD가 그의 기질과 반응하는지의 척도이다. 그러나, US7425302호의 방법은 특이적으로 G6PD에 제한되며, 별개의 포획 위치에서 효소가 유지되지 않는다.
WO2005/014847호는 피타제, 크실라나제 및 아밀라제와 같은 효소를 검출하기 위한 표준 측방 유동 샌드위치 면역검정법의 용도에 대해 기술하고 있다. 효소의 양은 적어도 부분적으로 생성된 색상 변화의 강도에 의해 측정될 수 있다. WO2007/001895호는 특이적으로 이. 콜라이 (E. coli ) 피타제를 검출하는 데에 사용되는 콜로이드성 금 샌드위치 검정법에 대해 기술하고 있다. 이와 같은 콜로이드성 금 샌드위치 검정법은 면역학적으로 피타제를 인식하는 일차 모노클로날 항체, 및 검출의 수단에 접합되는 이차 항체를 포함한다.
이에 따라, 이전에 사용되던 검정법들 중 일부는 샘플 중 효소의 정량 측정만을 제공할 수 있을 뿐, 효소의 활성을 측정하거나 활성 효소를 특이적으로 확인할 수는 없다. 기타 검정법들은 분석물 농도를 측정하는 데에 포획 밴드의 복잡한 수학적 분석을 필요로 한다.
따라서, 효소의 활성 형태만을 검출하는 검정법에 대한 필요성이 존재한다. 그와 같은 검정법이 적어도 약간의 준-정량적 정보를 제공할 수 있다면, 그것 역시 유리할 것이다.
본 발명은 선행 기술 장치 및 방법의 문제점들 중 일부를 극복하고자 한다.
지금부터, 본 발명이 기술될 것이다. 참조의 용이성을 위하여, 하나 이상의 표제하에 본 발명의 요소들을 기술하였다. 각 표제하의 교시는 다른 표제하의 교시에도 적용된다는 것을 유념해야 한다. 예를 들어, 본 발명의 장치와 관련하여 언급되는 각 바람직한 요소 및 측면은 본 발명의 방법 또는 본 발명의 용도와 관련하여서도 동일하게 바람직한 요소 또는 측면이다. 마찬가지로, 본 발명의 방법 또는 용도와 관련하여 언급되는 각 바람직한 요소 및 측면은 본 발명의 장치와 관련하여서도 동일하게 바람직한 요소 또는 측면이다.
개요 측면
넓은 측면에서, 본 발명은 샘플 중 활성 효소를 검출하는 효소 검정법 및 장치, 그리고 샘플 중 활성 효소의 존재를 측정하기 위한 방법에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 검정법, 특히 측방 유동 검정법을 수행하기 위한 장치 및 키트, 그리고 측방 유동 검정법 및 면역검정법을 수행하기 위한 장치에 관한 것이다.
일반 실시양태
한 실시양태에서, 본 발명은 샘플 중 활성 효소를 검출하기 위한 검정 장치를 제공한다.
상기 장치는 하기를 포함한다: (a) 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역(placement region); (b) 샘플이 상기 배치 영역에 존재하는 (예컨대 배치되는) 경우 매트릭스를 따라 이동할 수 있도록 상기 배치 영역에 작동가능하게 연결된 매트릭스; (c) 각 별개의 포획 위치가 배치 영역으로부터 이격되어 있으며, 샘플이 상기 별개의 포획 위치를 가로질러 이동할 수 있는, 상기 매트릭스 상의 하나 이상의 별개의 포획 위치; (d) 각 별개의 포획 위치에 존재하거나 그것을 한정하며, 활성 효소 샘플의 적어도 일부분이 하나 이상의 별개의 포획 위치에서 유지되도록 상기 효소에 결합할 수 있는 포획 수단; 및 (e) 상기 포획 수단에 결합된 활성 효소의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 선택적 표시 수단(selective indication means) 또는 적어도 그의 구성요소.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 검정 장치의 배치 영역에 샘플이 배치되고, 장치의 선택적 표시 수단이 활성 효소가 존재하는지를 표시하는, 샘플 중 활성 효소의 존재를 측정하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 검정 장치의 배치 영역에 샘플이 배치되고, 장치의 선택적 표시 수단이 존재하는 활성 효소의 양을 준-정량적으로 표시하는, 샘플 중 활성 효소 수준을 측정하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본 발명의 검정 장치를 포함하거나 형성할 수 있는 키트를 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 하기의 단계들을 포함하는, 샘플 중 활성 효소의 존재를 측정하는 방법을 제공한다:
a) 샘플의 적어도 일부분을 포획 수단과 접촉시킴으로써, 상기 포획 수단에 의해 효소를 포획하는 단계;
b) 포획된 효소에 대하여 적합한 기질을 제공하며, 상기 기질은 상기 포획된 효소와 반응하여 효소 생성물을 생성하는 것인 단계;
c) 효소 생성물과 반응할 수 있는 반응성 종을 제공하며, 상기 반응성 종은 상기 효소 생성물과 반응하여 불용성 생성물을 생성하는 것인 단계; 및
d) 단계 c)에서 수득된 불용성 생성물을 검출하며, 상기 검출은 상기 샘플 중 활성 효소의 존재 및/또는 양과 상관되는 것인 단계.
몇몇 장점
본 발명의 장점은 장치 및 그를 사용하는 방법이 작업자가 샘플 중 활성 효소를 확인하는 것을 가능케 한다는 것이다.
본 발명의 추가적인 장점은 장치 및 그를 사용하는 방법이 작업자가 간단한 방식으로, 그리고 경우에 따라서는 적어도 준-정량적인 방식으로 샘플 중 활성 효소를 확인하는 것을 가능케 한다는 것이다.
본원에서 사용될 때의 "준-정량적"이라는 용어는 상대적 정량, 대략적인 정량, 또는 알려져 있는 범위 내에서의 정량을 의미한다.
바람직하게는, "준-정량적"이라는 용어는 활성 효소 수준의 추정치, 즉 활성효소의 "낮거나" "허용가능하거나" 또는 "높은" 수준을 의미한다. 그러나, 그것이 정확한 정량적 단위 측정을 배제하는 것은 아니다. 그것은 예를 들어 더 개별적인 포획 영역 내 포획 위치에 의해, 또는 색상 형성의 강도를 측정하거나 관찰하는 것에 의해, 또는 색상 변화를 측정하거나 관찰하는 것에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 추가적인 장점들은 본원에서 언급된다.
일반 측면
한 측면에서, 검정 장치는 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역을 포함한다. 바람직하게는, 샘플은 액체 샘플이다. 바람직하게는, 샘플은 식품 또는 사료 샘플, 또는 식품 또는 사료 성분을 포함하는 샘플이다. 배치 영역에는, 샘플이 배치 영역으로부터 매트릭스를 따라 이동할 수 있도록, 매트릭스가 작동가능하게 연결되어 있다. 바람직하게는, 매트릭스는 니트로셀룰로스와 같은 재료이다.
본 출원 검정 장치의 매트릭스는 배치 영역으로부터 이격되어 있는 하나 이상의 별개의 포획 위치를 포함한다. 샘플은 포획 위치를 가로질러 이동할 수 있다. 바람직하게는, 2개 이상의 포획 위치가 사용된다. 바람직하게는, 3개 이상의 포획 위치가 사용된다. 바람직하게는, 3개의 포획 위치가 사용된다.
본 발명의 검정 장치의 각 포획 위치에는, 포획 수단이 존재한다. 포획 수단은 검정 장치에 의해 검출될 효소에 결합할 수 있다. 적어도 효소의 샘플은 하나 이상의 포획 위치에서 유지된다. 포획 수단은 바람직하게는 항체이며, 가장 바람직하게는 포획 수단은 효소에 결합하는 항체이다. 항체는 원래 효소에 대하여, 또는 그의 구성요소 (예컨대 그의 단편 및/또는 그의 에피토프)에 대하여 발생된 것일 수 있다.
본 발명의 검정 장치에서, 선택적 표시 수단은 포획 수단에 결합된 활성 효소의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 데에 사용된다. 바람직하게는, 선택적 표시 수단은 침전 반응을 포함하고/거나 생성물 형성시 발생하는 가시 또는 UV 파장의 측정가능한 변화를 제공한다. 색상 변화는 기질과 효소의 반응에 의해 야기될 수 있다. 기질과의 반응은 효소가 활성이며 단순히 불활성이거나 변성된 형태로 존재하기만 하는 것이 아님을 표시한다.
바람직하게는, 가시적인 색상 변화는 나안에 의해, 또는 기계식 해독기 및/또는 전자식 해독기에 의해 관찰될 수 있는 색상 변화를 의미한다.
선택적 표시 수단의 전체 또는 적어도 일부 구성요소는 검정 장치에 존재한다. 일부 실시양태의 경우, 전체 선택적 표시 수단이 검정 장치 내에 및/또는 검정 장치 상에 존재한다. 다른 실시양태에서, 검정 장치는 선택적 표시 수단의 구성요소들 중 1종 이상을 포함하며, 선택적 표시 수단의 다른 구성요소(들)는 (예컨대 키트로서) 장치에 공급된다. 따라서, 사용시, 사용자는 활성 효소를 검정하는 데에 장치를 사용하기 위한 선택적 표시 수단의 모든 필수 구성요소를 보유하게 된다.
본 발명은 활성 효소를 검출하는 데에 사용될 수 있는 신규하고 간단한 검정법을 제공하기 때문에 유리하다. 그것은 효소가 현행의 가용한 검정법들을 사용하여서는 존재하는 것으로 검출될 수 있지만, 예를 들어 열적 또는 화학적 처리로 인한 불활성화로 인하여 가용하지 않은 바이오에탄올, 세제, 및 식품 및 사료 산업에서 특히 유용하다. 또한, 본 발명의 검정법 및 방법들은 사료 또는 식품 첨가제 중 추가적인 활성 효소가 필요한지 여부를 결정하는 데에 유용할 수 있다. 그와 같은 방법은 식품 또는 사료 생성물과 같은 제품의 품질 제어에 사용될 수도 있다.
본 발명의 또다른 측면은 샘플 중 활성 효소의 양을 준-정량적으로 측정하는 방법을 제공한다는 것이다. 바람직하게는, 이와 같은 준-정량적 접근법은 결합된 효소의 존재를 표시하는 포획 영역의 수와 관련된다.
본 발명의 다른 측면은 식품 또는 사료 중 활성 효소의 수준을 측정하는 방법, 및 추가적인 효소, 또는 사료 또는 식품 첨가제가 필요한지 여부를 측정하는 방법을 제공한다는 것이다. 그와 같은 방법은 식품 또는 사료 생성물과 같은 제품의 품질 제어에 사용될 수도 있다.
본 발명은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 그와 같은 키트는 작업자가 바람직하게는 실험실 외부에서 검정법을 수행하는 것을 가능케 하게 된다. 키트는 검정법을 수행하는 데에 필요한 모든 시약들을 제공할 수 있다. 그와 같은 시약들 전체 또는 일부는 건조된 형태일 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 검정법 또는 검정 장치에 의해 검출되는 활성 효소는 포스파타제 또는 글리코시드 히드롤라제, 바람직하게는 산 포스파타제, 피타제, 크실리나제, 아밀라제 또는 β-글루카나제이다.
더욱 바람직한 측면에서, 본 발명의 검정법 또는 검정 장치에 의해 검출되는 활성 효소는 포스파타제, 바람직하게는 산 포스파타제, 더욱 바람직하게는 피타제이다.
"피타제"라는 용어는 피테이트/피트산을 포함한 인산 에스테르의 가수분해를 촉매하여 무기 포스페이트를 방출할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드를 의미한다. 일부 피타제는 피테이트 이외에 중간 인산화도를 갖는 이노시톨-포스페이트들 중 일부 이상을 가수분해할 수 있다.
밀 및 보리와 같은 일부 곡물의 비-전분 다당류 (NSP) 분획은 장내 점도를 증가시키는데, 이는 영양소의 확산을 훼손한다. 이와 같은 항-영양 효과는 각각 헤미-셀룰로스 중합체인 크실란 및 베타-글루칸을 단편화하는 크실라나제 및/또는 베타-글루카나제의 첨가에 의해 감소될 수 있다.
여러 보충제들 중에서도 특히 알파-아밀라제는 사료 중 전분 이용률을 향상시키기 위하여 사료에 첨가된다.
예를 들어 부티옥셀라 종( Buttiauxella sp .)으로부터 유래하는 6-피타제 BP17과 같은 피타제 효소들은 포스페이트 가용성을 증가시킴으로써 생성물의 영양가를 증가시키기 위하여 동물 사료에 첨가된다. 예를 들어 열 및 고압하에서의 사료의 처리는 피타제를 변성시켜 그의 활성을 감소시킬 수 있다. 본 발명은 사료 중에 존재하는 피타제 활성의 처리-후 수준의 표시를 특이적으로 제공할 수 있는 준-정량적 시험을 제공한다.
매우 바람직한 측면에서, 본 발명에 의해 검출되는 활성 효소는 피타제, 더 구체적으로는 6-피타제이다.
매우 바람직한 측면에서, 검출될 활성 효소는 BP-17이다. BP17은 부티옥셀라 종 피타제의 효소 변종이다. BP17의 서열 (신호 펩티드 배제)은 하기와 같다:
Figure pct00001
또다른 실시양태에서, 검출될 활성 효소는 BP11이다. BP11은 부티옥셀라 종 피타제의 효소 변종이다. BP11은 바이오에탄올 생산에서 사용된다. BP11의 서열 (신호 펩티드 배제)은 하기와 같다:
Figure pct00002
또다른 실시양태에서, 검출될 활성 효소는 BP111이다. BP111은 부티옥셀라 종 피타제의 효소 변종이다. BP111은 바이오에탄올 생산에서 사용된다. BP111의 서열 (신호 펩티드 배제)은 하기와 같다:
Figure pct00003
본 발명은 하기의 도면들을 참조하여 기술될 것이다:
도 1 - 2개의 도식을 나타냄.
도 2 - 도식 (포맷 1: 효소 포획 및 침전 기질 검정법)을 나타냄.
도 3 - 일련의 사진들 (반-건조 포맷에 관련된 단계들)을 나타냄.
도 4 - 사진 (반-건조 포맷을 사용한 피타제 BP17의 일련의 희석물들로부터의 결과)을 나타냄.
도 5 - 도식 (포맷 2: 금 접합체 항체 샌드위치 검정법)을 나타냄.
도 6 - 일련의 사진들 (건조 포맷 테스트의 예)을 나타냄.
도 7 - 일련의 사진들 (아세테이트 완충제, 밀리Q 워터 및 수돗물에서 제조되는 샘플의 결과)을 나타냄.
도 8 - 일련의 사진들 (상이한 시간 간격에서의 샘플링)을 나타냄.
도 9 - 일련의 사진들 (사료 샘플 및 정제된 피타제 BP17의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅)을 나타냄.
도 10 - 일련의 사진들 (피타제 BP17 특이적 억제제 MIHS를 사용한 금 샌드위치 포맷과 침전 기질 효소 활성 포맷의 비교)을 나타냄.
도 11 - 도식 및 사진 (유통(Flow Through) 포맷의 개략적인 도시)을 나타냄.
도 12 - 도식 (침지 스틱 포맷의 개략적인 도시)을 나타냄.
도 13 - 사진 (침지-스틱 포맷 테스트 결과)을 나타냄.
도 14 - 도식 (모세관흡수(Wicking) 스틱 포맷의 개략적인 도시)을 나타냄.
도 15 - 일련의 사진들 (모세관흡수 스틱 포맷 테스트 결과)을 나타냄.
도 16 - 일련의 사진들 (상이한 차단제들을 사용한 모세관흡수 스틱 포맷 테스트 결과)을 나타냄.
도 17 - 일련의 사진들 (테스트의 준-정량적 특성을 조정하기 위한 가변적인 테스트 선 농도. 모세관흡수 스틱 포맷)을 나타냄.
도 18 - 일련의 사진들 (모세관흡수 스틱 포맷을 사용한 NBT와 INT 사이의 비교)을 나타냄.
도 19 - 일련의 사진들 (가장 적합한 것을 확인하기 위하여 광범위한 니트로셀룰로스 유형들을 시험함)을 나타냄.
도 20 - 사진 (계면활성제 (트윈-20)의 존재하에 차단제 카세인의 농도를 감소시키는 것을 시험)을 나타냄.
도 21 - 일련의 사진들 (만족스러운 결과가 수득될 수 있는지를 시험하기 위하여 테스트 니트로셀룰로스상에 직접 차단 시약을 첨가함)을 나타냄.
도 22 - 일련의 사진들 (본 방법의 감도를 시험하기 위하여 INT 및 NBT 기질 양자와 함께 계면활성제로만 차단된 NC를 사용하여 시험된 피타제 BP17 농도의 일련의 희석물들)을 나타냄.
도 23 - 일련의 사진들 (함께 혼합된 다양한 기질 성분들을 건조하고 저장하는 것을 시험)을 나타냄.
도 24 - 일련의 사진들 (반-건조 포맷과 모두 용액인 포맷 사이의 비교)을 나타냄.
도 25 - 일련의 사진들 (활성에 대하여 용액을 주기적으로 시험하는 것은 테트라졸륨 용액이 우수한 안정성을 가지고 있음을 암시함)을 나타냄.
도 26 - 크실라나제 활성에 대하여 용액을 시험한 사진을 나타냄.
도 27 - 크실라나제 활성에 대하여 용액을 시험한 사진을 나타냄.
도 28 - 활성 크실라나제 활성에 대한 시험을 위한 개략도를 나타냄.
도 29 - 일련의 개략도들을 나타냄.
본 발명은 활성 효소를 검출하기 위한 장치를 제공한다. 상기 장치는 다양한 분야의 실험실, 및 또한 실험실 외부에서 사용될 수 있다.
본 발명은 샘플 중 활성 효소를 검출하기 위한 검정 장치 (1)를 제공한다. 상기 검정 장치 (1)는 하기의 구성요소들을 포함한다: (a) 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역 (10); (b) 샘플이 상기 배치 영역 (10)에 존재하는 (예컨대 배치되는) 경우 매트릭스 (20)를 따라 이동할 수 있도록 상기 배치 영역 (10)에 작동가능하게 연결된 매트릭스 (20); (c) 각 별개의 포획 위치 (30)가 배치 영역 (10)으로부터 이격되어 있으며, 샘플이 상기 별개의 포획 위치 (30)를 가로질러 이동할 수 있는, 상기 매트릭스 (20) 상의 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30); (d) 각 별개의 포획 위치 (30)에 존재하거나 그것을 한정하며, 활성 효소 샘플의 적어도 일부분이 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30)에서 유지되도록 상기 효소에 결합할 수 있는 포획 수단 (40); 및 (e) 상기 포획 수단 (40)에 결합된 활성 효소의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 선택적 표시 수단 (50) 또는 적어도 그의 구성요소.
활성 효소의 존재 및 그와 같은 효소의 양을 검출하는 것은 식품 및 사료 분야에서 특히 중요하다. 활성 효소의 부재는 잠재적으로 식품 또는 사료를 섭취하는 인간 및 동물에서 영양소 및 무기질 결핍으로 이어질 수 있다. 기존의 방법을 사용할 경우, 효소의 존재를 검출하는 능력은 활성 효소의 존재를 검출하는 능력과 동일하지 않을 수 있다.
구체적인 예로서, 피테이트는 곡물 및 콩류에서 인의 주요 저장 형태이다. 그러나, 돼지, 가금류 및 어류와 같은 단위(monogastric) 동물들은 피테이트 (또는 피트산)를 대사하거나 흡수할 수 없으며, 그에 따라 집중적인 가축 생산 지역에서는 그것이 인 오염으로 이어질 것으로 예상된다. 또한, 피트산 역시 칼슘, 구리 및 아연과 같은 금속 요소를 킬레이팅함으로써, 단위 동물에서는 항-영양 작용제로 작용한다.
피타제의 작용을 통하여, 피테이트는 일반적으로 가수분해됨으로써 저급 이노시톨-포스페이트 및 무기 포스페이트를 생성시킨다. 피타제는 동물 사료에 대한 첨가제로서 유용한데, 거기에서 그것은 동물에 대한 유기 인의 가용성을 향상시키고, 환경의 포스페이트 오염을 감소시킨다 (문헌 [Wodzinski RJ, Ullah AH. Adv Appl Microbiol. 42, 263-302 (1996)]). 그러나, 사료에 함유되어 있는 피타제가 불활성일 경우, 피타제 가수분해 효과가 존재하지 않게 되고, 이는 동물에서의 영양실조로 이어질 수 있다. 따라서, 본 발명은 동물 관리인, 농부, 수의사, 동물원 관리인, 사료 첨가제 생산자, 사료 제조자, 과학자 또는 공무원과 같은 작업자가 예를 들어 피타제와 같은 활성 효소를 함유하고 있는지, 및 피타제와 같은 활성 효소의 양을 확인하기 위하여 동물 사료를 시험하는 것을 가능케 한다.
본 발명은 또한 포스파타제 또는 글리코시드 히드롤라제, 바람직하게는 산 포스파타제, 피타제, 크실라나제, 아밀라제 또는 β-글루카나제와 같은 효소가 첨가되어 있는 사료 또는 식품의 제조, 생물연료 생산 또는 세제 조성물에서의 품질 제어 방법에 사용될 수 있다.
검정법 및 장치
본원에서 사용될 때의 "검정 장치"라는 용어는 장치, 장치 또는 장비의 모음을 의미한다.
상기 (a) 내지 (e)에 열거되어 있는 특징들을 포함하는 검정 장치 또는 장비를 도 1에 나타내었다.
도 1을 참조하면, 본 발명의 검정 장치 (1)를 - 도 1(a) (실시양태 1) 및 도 1(b) (실시양태 2)에 제시되어 있는 - 2종의 실시양태로 나타내었다.
양 실시양태에서, 검정 장치 (1)는 매트릭스 (20)에 작동가능하게 연결된 배치 영역 (10)을 포함한다. 매트릭스 (20)상에는 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30)가 존재한다. 포획 수단 (40)은 각 별개의 포획 위치 (30)에 존재하거나, 그것을 한정한다. 사용시, 작업자는 샘플을 배치 영역 (10)상에 배치시키며, 샘플은 매트릭스 (20)를 따라 화살표가 나타내는 방향으로 이동한다. 실시양태 1에서, 선택적 표시 수단 (50) (미도시) 또는 적어도 그의 구성요소 (미도시)는 포획 위치 (30)에 첨가되거나 거기에 구성된다. 한 측면에서, 선택적 표시 수단은 활성 효소가 기질과 반응되었을 때 관찰가능한 색상 변화를 생성시킬 수 있는 시약 (반응성 종)을 포함한다. 이와 같은 측면에서, 상기 시약은 사용시 액체 형태로 장치에 공급될 수 있다.
검정 장치 (1)의 실시양태 2는 실시양태 1과 동일한 방식으로 기능한다. 그러나, 이 경우 검정 장치 (1)는 접힘 부문 또는 접힘선 (70)에 의해 연결되는 2개의 대향 반체 (2) 및 (3)으로 구성된다. 매트릭스 (20)에 작동가능하게 연결되어 있는 배치 영역 (10)은 장치의 일 반체 (2)에 위치된다. 포획 위치(들) (30) 및 포획 수단 (40)은 매트릭스 (20)상에 위치된다. 장치의 동일 또는 대향 반체 (3)는 선택적 표시 수단 또는 적어도 그의 구성요소를 포함하며, 대향 반체 (3)는 임의로 과량의 샘플을 흡수하는 흡수제 패드 (60)를 포함한다.
작업자가 접힘선 (70)을 접는 경우, 실시양태 2의 선택적 표시 수단 (50) 또는 적어도 그의 구성요소는 매트릭스 (20) 및 포획 수단 (40)과 접촉된다. 작업자는 선택적 표시 수단 (50) 또는 선택적 표시 수단 (50)의 일부 구성요소(들)를 액체 형태로 장치에 첨가할 필요가 있을 수 있다. 다르게는, 선택적 표시 수단 또는 선택적 표시 수단의 적어도 일부 구성요소는 위치 (90)에 건조된 형태로 존재할 수도 있다.
임의로, 바람직한 실시양태 2는 일단 장치의 2개 반체 (2) 및 (3)이 닫히고 난 후 작업자가 검정 장치의 결과를 관측하는 것 (다른 말로 하면, 포획 위치를 관측하는 것)을 가능케 하는 관측 창(viewing window) (80)을 포함한다. 관측 창 (80)은 플라스틱 재료로 제조될 수 있거나, 개방된 구멍일 수 있다.
실시양태 2에서, 반체 (2, 3) 중 하나 또는 각각은 지지력를 제공하기에 충분하게 강성인 플라스틱 또는 카드 재료로 제조될 수 있다.
언급된 바와 같이, 검정 장치 (1)는 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역을 포함한다. 바람직하게는, 샘플은 액체 샘플이다. 매트릭스 (20)는 샘플이 배치 영역 (10)으로부터 매트릭스 (20)를 따라 이동할 수 있도록 배치 영역 (10)에 작동가능하게 연결된다. 바람직하게는, 매트릭스 (20)는 예를 들어 니트로셀룰로스와 같이 샘플이 이동하는 것을 가능케 하는 재료이다. 본 출원 검정 장치 (1)의 매트릭스 (20)는 배치 영역 (10)으로부터 이격되어 있는 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30)를 포함한다. 샘플은 포획 위치 (30)를 가로질러 이동할 수 있다. 바람직하게는, 3개의 포획 위치 (30)가 사용된다. 본 발명의 검정 장치 (1)의 각 포획 위치 (30)에는 포획 수단 (40)이 존재한다. 포획 수단 (40)은 검정 장치 (1)에 의해 검출될 효소에 결합할 수 있다. 적어도 효소의 샘플은 하나 이상의 포획 위치 (30)에서 유지된다. 포획 수단 (40)은 바람직하게는 항체이며, 가장 바람직하게는 포획 수단 (40)은 효소에 결합하는 항체이다. 상기 항체는 원래 효소에 대하여, 또는 그의 구성요소 (예컨대 그의 단편 및/또는 그의 에피토프)에 대하여 발생된 것일 수 있다.
선택적 표시 수단 (50)은 본 발명의 검정 장치 (1)에서 포획 수단 (40)에 결합된 활성 효소의 존재의 선택적 표시를 제공하는 데에 사용된다. 바람직하게는, 선택적 표시 수단 또는 적어도 그의 구성요소는 매트릭스 (20)와 대비하여 검정 장치 (1)의 대향 반체상의 위치 (90)에 존재한다. 바람직하게는, 선택적 표시 수단 (50)은 침전 반응을 포함하고/거나 가시적인 색상 변화를 제공한다. 상기 색상 변화는 기질과 효소의 반응에 의해 야기될 수 있다. 기질과의 반응은 효소가 활성이며 단순히 불활성이거나 변성된 형태로 존재하기만 하는 것이 아님을 표시한다.
바람직한 측면에서, 장치는 - 활성 효소가 존재할 때 선택적 표시 수단이 색상 변화를 생성시키는 경우, 색상 변화를 나타내는 장치 포획 위치 (30)의 수에 의해, 및/또는 포획 위치(들)에서의 색상 변화의 강도에 의해 활성 효소의 양 (분석물 양)이 표시된다는 의미에서 - 준-정량적이다.
본 발명의 검정 장치 (1)는 바람직하게는 작동가능하게 연결되는 수개의 영역을 포함한다. 상기 영역에는 바람직하게는 배치 영역 (10)이 포함된다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 검정 장치 (1)는 측방 유동 장치이다.
본 발명의 검정 장치 (1)는 임의로 검정 장치가 올바르게 작동하고 있는지를 표시하는 "지표(indicator) 영역" 또는 "지표선" (91)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 지표 영역 또는 선은 색상 또는 색상 변화를 통하여 검정법이 작동하였음을 표시한다. 임의의 지표 영역 또는 선은 항체를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 원래 효소에 대하여, 또는 그의 구성요소 (예컨대 그의 단편 및/또는 그의 에피토프)에 대하여 발생된 것일 수 있으며, 여기서 상기 효소는 검출될 활성 효소와 무관하다. 더하여 또는 다르게는, 지표선은 기질 성분들 중 적어도 일부와 반응할 수 있는 관련 또는 무관 효소를 포함할 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 장치 및 검정법은 활성의 피타제 효소를 검출하는 데에 사용된다. 그와 같은 경우, 지표선에서의 상기 관련 또는 무관 효소는 포스파타제 활성을 갖는 효소일 수 있다. 예를 들자면, 지표선은 검출될 것과 관련된 효소 또는 동일한 효소를 포함할 수 있는데, 예컨대 BP17 피타제를 검출하기 위한 검정법에서, 지표선은 BP17 피타제를 포함할 수 있다. 더 예를 들자면, 지표선은 효소 및 항체를 포함할 수 있으며, 여기서 항체는 지표선의 효소 또는 또다른 효소에 대하여 특이적일 수 있다.
"검정법"은 물질의 화학적 조성 또는 농도의 분석이다. 여기에는 혼합물 중 특정 성분의 검출이 포함될 수 있다. 검정 장치 (1)는 활성 효소를 검출하기 위한 것인 본 발명의 검정법을 수행하는 데에 사용된다.
본 출원에서 "면역검정법" 및 "검정법"이라는 용어는 호환가능하게 사용되는데, "검정법"이라는 용어가 "면역검정법"을 포괄할 수 있다. 면역검정법은 샘플 중 물질을 확인하는 데에 항원과 그의 항체 사이의 특이적인 결합을 사용하는 특정 형태의 검정법이다.
검정 장치는 바람직하게는 차단 시약(blocking reagent)을 포함할 수 있거나, 또는 차단 시약이 장치에 첨가될 수 있다.
"차단 시약"이라는 용어는 검출될 활성 효소 (즉 분석물)의 포획 수단과의 상호작용을 조절하는 작용제를 지칭하는데, 바람직하게는 여기서 포획 수단은 항체를 포함한다. 차단 시약은 장치의 매트릭스를 따르는 샘플의 이동을 가능케 함으로써, 전체 샘플이 제1 포획 수단에 의해 차단되지 않도록 해준다. 차단 시약은 계면활성제일 수 있거나, 계면활성제를 포함할 수 있다. 적합한 차단 시약 또는 차단 시약 성분의 예에는 카세인 및 데쿼트(Dehquart) CC6이 포함된다.
매트릭스 (20)는 차단 시약을 포함할 수 있다. 다르게는, 차단 시약 또는 그의 성분이 장치에 첨가될 수 있다. 차단 시약은 검정 장치의 구성요소 (30)에, 또는 그 부근에, 또는 심지어는 그로부터 이격되어 첨가될 수 있다. 차단 시약은 매트릭스 (20)에 결합될 수 있거나, 또는 패드상에서 매트릭스 (20)에 적용될 수 있다. 차단제는 건조된 형태 및/또는 탈수된 형태일 수 있다.
효소
본원에서 사용될 때의 "효소"라는 용어는 반응 완료시 자신이 파괴되거나 변경되지 않으면서도 다른 물질의 화학 반응을 촉매하는 단백질을 지칭한다.
본 발명에 의해 검출되는 효소는 자연상에 존재하는 효소인 야생형, 또는 변종일 수 있다. "변종"은 변종이 유래하는 야생형 효소 또는 심지어는 변종 효소와 같은 모 서열과 비교할 때 하나 또는 수개의 삽입, 결실 및/또는 치환을 가지며, 효소의 기능적 특성을 유지하고/거나 향상된 활성과 같이 특성을 향상시키는 아미노산 서열을 갖는 효소이다. 본원에서 사용될 때, "아미노산 서열"이라는 용어는 "폴리펩티드"라는 용어 및/또는 "단백질"이라는 용어와 동의어이다.
본원에서 사용될 때의 "활성 효소"라는 용어는 그의 촉매 기능을 유지하는 효소를 지칭한다. 예를 들어, 피타제는 인산 에스테르의 가수분해를 촉매할 수 있다.
"불활성 효소"라는 용어는 샘플 중에 존재하기는 하지만 그의 촉매 기능을 수행할 수 없는 효소를 지칭한다. 불활성화는 효소의 변성으로 인하여, 열처리로 인하여, 또는 화학적 처리, 또는 프로테아제에 의한 단백질분해 또는 글리코시다제에 의한 탈글리코실화와 같은 또다른 효소에 의한 처리 또는 가공으로 인하여 발생할 수 있다. 불활성화는 화학적 억제제에 기인할 수도 있다. 예를 들어 피타제 BP17과 같이 효소가 피타제인 경우, 사용될 수 있는 억제제는 미오이노시톨 헥사술페이트 (MIHS)이다.
본 발명에 의해 검출되는 효소의 예에는 포스파타제 및 글리코시드 히드롤라제가 포함된다.
포스파타제 또는 인산 모노에스테르 히드롤라제 (EC 3.1.3)는 그의 기질로부터 포스페이트 기를 방출할 수 있는 효소이다. 유용한 포스파타제에는 알칼리 포스파타제 (EC 3.1.3.1), 산성/산 포스파타제 (EC 3.1.3.2), 3-피타제 (EC 3.1.3.8) 또는 6-피타제 (EC 3.1.3.26)가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 본 발명의 검정 장치에 의해 검출되는 효소는 피타제이다. 바람직하게는, 효소는 6-피타제이며, 가장 바람직하게는 효소는 부티옥셀라 종으로부터 유래하는 6-피타제 (BP17)이다.
상기 6-피타제는 "4-피타제" 또는 "피테이트 6-포스파타제"로도 지칭된다. 다른 피타제로는 원핵생물 (예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)로부터의 appA 피타제) 및 진핵생물 (아스페르길루스 종( Aspergillus sp .)으로부터의 phyA 및 B, 효모 및 식물로부터의 HAP 피타제들)에서 발견되는 구성원들을 포함하는 군인 히스티딘 산 피타제 (HAP)들이 포함된다. HAP 피타제들은 그의 DNA 서열에서 공통 활성 부위 모티프(motif)로써 N-말단 단부에 RHGXRXP를, 그리고 C-말단 단부에 HD 모티프를 공유한다. 이는 포스포모노에스테르의 가수분해에서 2-단계 기작을 가능케 한다. 에이. 니거(A. niger)로부터의 phyA 및 phyB, 그리고 이. 콜라이로부터의 appA가 가장 많이 특성화되어 있는 대표이다.
바람직한 측면에서, 효소는 피타제이며, 활성 효소 활성은 착색될 수 있는 가시적으로 관찰가능한 침전물과 같은 가시적으로 관찰가능한 효과를 생성하는 반응성 종 - 예컨대 테트라졸륨염 -의 환원에 의해 측정된다. 장치는 준-정량적이며, 분석물 양은 침전물로 인하여 색상 변화를 나타내는 장치 포획 위치 (30)의 수에 의해 표시된다. 색상을 생성시키는 테트라졸륨 환원은 본질적으로 그의 자신의 기질에 대한 포스파타제 효소 작용의 간접적인 척도이다. 이와 관련하여서는, 이후 테트라졸륨에 작용하여 포르마잔 염료를 생성시키는 환원성 요소 또는 반응성 모이어티가 생성된다.
한 실시양태에서, 본 발명에 의해 검출되는 효소는 예를 들어 부티옥셀라 종 트리코데르마 리에세이( Trichoderma reesei ), 이. 콜라이, 아스페르길루스 니거, 시트로박터 브라키이 ( Citrobacter braakii ), 시트로박터 프레운디이( Citrobacter freundii), 페니포라 리시이 ( Peniphora lycii ) 또는 페니실리움 푸니쿨로숨( Penicillium funiculosum ) 유래의 6-피타제이다.
한 실시양태에서, 피타제는 예를 들어 시트로박터 프레운디이, 바람직하게는 씨. 프레운이디 NCIMB 41247, 및, 예컨대 WO2006/038062호 (본원에 참조로써 개재됨) 및 WO2006/038128호 (본원에 참조로써 개재됨)에 개시되어 있는 바와 같은 그의 변종, WO 2004/085638호에 개시되어 있는 바와 같은 시트로박터 브라키이 YH-15, WO2006/037328호 (본원에 참조로써 개재됨)에 개시되어 있는 바와 같은 시트로박터 브라키이 ATCC 51113은 물론, 예컨대 WO2007/112739호 (본원에 참조로써 개재됨) 및 WO2011/117396호 (본원에 참조로써 개재됨)에 개시되어 있는 바와 같은 그의 변종, 시트로박터 아말로나티쿠스 ( Citrobacter amalonaticus ), 바람직하게는 WO2006037327호 (본원에 참조로써 개재됨)에 개시되어 있는 바와 같은 시트로박터 아말로나티쿠스 ATCC 25405 또는 시트로박터 아말로나티쿠스 ATCC 25407, 시트로박터 길레니이 ( Citrobacter gillenii ), 바람직하게는 WO2006037327호 (본원에 참조로써 개재됨)에 개시되어 있는 바와 같은 시트로박터 길레니이 DSM 13694, 또는 시트로박터 인테르메디우스 ( Citrobacter intermedius ), 시트로박터 코세리( Citrobacter koseri), 시트로박터 무를리니아에 ( Citrobacter murliniae ), 시트로박터 로덴티움( Citrobacter rodentium ), 시트로박터 세들라키이 ( Citrobacter sedlakii ), 시트로박터 웨르크마니이 ( Citrobacter werkmanii ), 시트로박터 윤가에( Citrobacter youngae), 시트로박터 종 폴리펩티드류 또는 이들의 변종으로부터 유래하는 시트로박터 피타제이다.
한 실시양태에서, 피타제는 시트로박터, 예를 들어 시트로박터 프레운디이 유래의 피타제, 예컨대 본원에 참조로써 개재되는 WO2006/038128호에 교시되어 있는 피타제 효소(들)일 수 있다.
일부 실시양태에서, 피타제는 바람직하게는 듀폰 뉴트리숀 바이오사이언시즈(DuPont Nutrition Biosciences) ApS 사에 의해 피자임(Phyzyme) XP™이라는 명칭하에 시판되고 있는 이. 콜라이 피타제이다.
다르게는, 피타제는 부티옥셀라 피타제, 예를 들어 부티옥셀라 아그레스티스( Buttiauxella agrestis ) 피타제, 예컨대 모두 본원에 참조로써 개재되는 WO 2006/043178호, WO 2008/097619호, WO09/129489호, WO2008/092901호 또는 WO10/122532호에 교시되어 있는 피타제 효소들일 수 있다.
한 실시양태에서, 피타제는 하프니아 ( Hafnia ), 예를 들어 하프티아 알베이( Hafnia alvei ) 유래의 피타제, 예컨대 본원에 참조로써 개재되는 US2008263688호에 교시되어 있는 피타제 효소(들)일 수 있다.
한 실시양태에서, 피타제는 아스페르길루스, 예를 들어 아스페르길루스 오르지아에( Apergillus orzyae ) 유래의 피타제일 수 있다.
한 실시양태에서, 피타제는 페니실리움, 예를 들어 페니실리움 푸니쿨로숨 유래의 피타제일 수 있다.
본원에서 사용될 때, 1 FTU (피타제 단위)가 ISO 2009 피타제 검정법 - 피타제 활성을 측정하기 위한 표준 검정법으로써, 1 FTU는 International Standard ISO/DIS 30024: 1-17, 2009에서 찾을 수 있음 - 에 규정되어 있는 반응 조건하에서 1분 이내에 기질로부터 1 μmol의 무기 오르소포스페이트를 방출시키는 데에 요구되는 효소의 양으로 정의된다는 것은 알고 있을 것이다.
다르게는, 본원에서 사용될 때 피타제 1 단위 (FTU)는 pH 5.5, 37℃에서 0.00015 mol/L의 나트륨 피테이트로부터 1 마이크로몰의 무기 인/분을 방출시키는 효소의 양으로 정의된다 (문헌 [Denbow, L.M., V. Ravindran, E.T. Kornegay, Z. Yi, and R.M. Hulet. 1995. Improving phosphorus availability in soybean meal for broilers by supplemental phytase. Poult. Sci.74:1831-1842]).
한 실시양태에서, 적합하게는 효소는 상기 E.C. 분류를 사용하여 분류되는데, E.C. 분류는 1 FTU를 측정하는 것으로 본원에서 교시되는 검정법으로 시험하였을 때 해당 활성을 갖는 효소를 지정한다.
본 발명의 검정 장치 및 방법에 의해 검출될 수 있는 또다른 효소 군은 글리코시드 히드롤라제의 군 (EC 3.2.1), 즉 O- 및 S-글리코실 화합물을 가수분해하는 효소들이다. 이 효소 군의 다른 통상적인 특성은 그들이 예를 들어 환원성 말단-기 (알데히드 기 함유)를 갖는 단편 또는 생성물을 방출한다는 것이다. 이와 같은 군의 예에는 크실라나제, 예컨대 엔도-1,4-β-크실라나제 (EC 3.2.1.8) 및 크실란 엔도-1,3-β-크실로시다제 (EC 3.2.1.32), 바람직하게는 크실란 1,4-베타-크실로시다제 (EC 3.2.1.37); α-아밀라제 (EC 3.2.1.1); β-아밀라제 (EC 3.2.1.2); 올리고-1,6-글루코시다제 (EC 3.2.1.10); 글루칸 1,4-알파-글루코시다제 (EC 3.2.1.3); 풀룰라나제 (EC 3.2.1.41); 셀룰라제 (EC 3.2.1.4); 엔도-1,3(4)-베타-글루카나제 (EC 3.2.1.6); 또는 글루칸 엔도-1,3-베타-D-글루코시다제 (EC 3.2.1.39)가 포함된다.
크실라나제는 선형 다당류 베타-1,4-크실란을 크실로스로 분해시킴으로써 식물 세포 벽의 주요 성분들 중 1종인 헤미셀룰로스를 분해하는 종류의 효소에 부여되는 명칭이다.
본 발명에서 사용하기 위한 크실라나제는 임의의 시중에서 구입가능한 크실라나제일 수 있다.
적합하게는, 크실라나제는 엔도-1,4-β-d-크실라나제 (E.C. 3.2.1.8로 분류) 또는 1,4 β-크실로시다제 (E.C. 3.2.1.37로 분류)일 수 있다.
한 실시양태에서, 바람직하게는 크실라나제는 엔토크실라나제, 예컨대 엔도-1,4-β-d-크실라나제이다. 엔도-1,4-β-d-크실라나제의 분류는 E.C. 3.2.1.8이다.
아밀라제가 본 발명의 검정 장치 및 방법에 의해 검출될 수도 있다.
아밀라제는 전분을 말토스와 같은 더 단쇄인 올리고당으로 가수분해할 수 있는 종류의 효소에 부여되는 명칭이다. 이후, 글루코스 모이어티는 원래의 전분 분자에서보다 더욱 용이하게 말토스로부터 모노글리세리드 또는 글리코실모노글리세리드로 전달될 수 있다.
아밀라제라는 용어에는 α-아밀라제 (E.C. 3.2.1.1), G4-형성 아밀라제 (E.C. 3.2.1.60), β-아밀라제 (E.C. 3.2.1.2) 및 γ-아밀라제 (E.C. 3.2.1.3)가 포함된다.
한 실시양태에서, 바람직하게는 아밀라제는 α-아밀라제이다. α-아밀라제는 (E.C. 3.2.1.1)로 분류된다.
바람직하게는, 기질은 포스파타제 기질이며, 가장 바람직하게는 상기 포스파타제 기질은 2-포스프-L-아스코르브산 트리나트륨 (AsAP)이다.
샘플
본원에서 사용될 때의 "샘플"이라는 용어는 활성 효소가 존재하는지 여부를 측정하기 위한 분석용으로 수집된 물질 또는 조성물의 시료 또는 추출물을 의미한다.
샘플은 바람직하게는 액체이다. 샘플은 바람직하게는 물과 같은 용매 중에서 분석될 물질 또는 조성물을 위치시키거나, 용해시키거나, 액화시키거나 또는 으깸으로써 수득된다. 바람직하게는, 샘플은 수성 샘플이다. 수돗물 또는 정제수 및 탈이온수, 예컨대 밀리Q(MilliQ) 또는 또다른 적합한 수용액이 사용될 수 있다. 샘플을 제조하기 위해서는, 분석될 물질 또는 조성물이 용매와 혼합되거나, 거기에서 분해되고/거나 거기에 용해되도록 하기 위한 소정 형태의 추출이 필요할 수도 있을 것으로 생각된다. 예를 들어, 교반(agitation)이 사용될 수 있다.
작업자가 사전결정된 수준 (용기에 선으로 표시됨)까지 식품 또는 사료 또는 생물연료 또는 세제 조성물을 샘플 추출 용기 (예컨대 튜브, 플라스틱 백 또는 통)에 충진한 다음, 제2의 선까지 수돗물, 정제수 또는 탈이온수와 같은 물을 튜브에 충진하게 되는 키트가 제조될 것으로 생각된다. 이후, 추출 용기는 바람직하게는 진탕된다. 이는 작업자가 균일한 방식으로 샘플을 제조하는 것을 가능케 하게 된다.
본 발명의 샘플은 식품 또는 사료로부터, 또는 식품 또는 사료 조성물로부터, 또는 세제로부터, 또는 세제 조성물로부터, 또는 에탄올 또는 생물연료 생산으로부터 유래하거나, 추출되거나, 또는 채취될 수 있다. 본원에서, "식품"이라는 용어는 넓은 의미로 사용되며 - 인간을 위한 식품은 물론, 동물을 위한 식품 (즉 사료)도 포괄한다. 바람직한 측면에서, 식품은 인간 소비용이다. 또다른 바람직한 측면에서, 식품은 비-인간 동물 사료이다.
식품 또는 사료는 용도 및/또는 적용 양식 및/또는 투여 양식에 따라 용액, 또는 슬러리, 또는 펠렛과 같은 고체로서의 형태일 수 있다.
"식품" 및 "사료"라는 용어는 식품 성분을 지칭할 수도 있다. 본 발명의 샘플은 식품 성분으로부터 유래하거나, 추출되거나 또는 채취될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "식품 또는 사료 성분"이라는 용어에는 영양 보충제 및/또는 섬유 보충제이거나 그로써 기능성 식품 또는 식료품에 첨가될 수 있는 배합물이 포함된다. 본원에서 사용될 때의 "식품 또는 사료 성분"이라는 용어는 점도의 증가 없이 비제한적으로 겔화, 결화(texturising), 안정화, 에멀젼화, 현탁, 필름-형성 및 구조화, 다즙성(juiciness)의 유지 및 향상된 입맛을 포함한 특정 사료 또는 식료품과 관련하여 원하는 유익한 기능적 효과를 부여하기 위하여 매우 다양한 생성물에서 낮은 수준으로 사용될 수 있는 배합물을 지칭하기도 한다.
다른 실시양태에서, "식품 또는 사료 성분"에는 빵 개선제 조성물 또는 굽기 전의 반죽과 같은 식품 중간물이 포함된다. 제빵 적용분야 영역에서는, 굽기 전의 반죽 조성물에 통상적으로 효소가 첨가되는데, 바람직한 실시양태에서, 굽기 과정 동안의 효소의 변성은 더 이상의 효소 활성을 종결시킨다. 따라서, 본 발명의 효소 검정법은 굽기 전에 반죽 또는 반죽 성분 조성물에서 수행되어야 한다. 다른 실시양태에서, 본 발명은 곡물 성분, 바람직하게는 귀리, 호밀, 쌀, 밀, 밀기울 또는 이들의 가공된 유도체를 함유하는 낙농 식품 조성물에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 낙농 식품 조성물은 요구르트, 치즈 또는 민속 음료이다.
식품 성분은 용도 및/또는 적용 양식 및/또는 투여 양식에 따라 용액, 또는 슬러리, 또는 펠렛과 같은 고체로서의 형태일 수 있다.
"식품" 및 "사료"라는 용어는 또한 식품 첨가제를 지칭할 수 있다. 본 발명의 샘플은 식품 첨가제에서 유래하거나, 추출되거나 또는 채취될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "식품 또는 사료 첨가제"라는 용어에는 식품 및 동물 사료에서 소화를 향상시키는 배합물이 포함된다. 특히, "식품 또는 사료 첨가제"는 식품 및 동물 사료에서 포스페이트 소화를 향상시키기 위하여 사용될 수 있는 피타제와 관련된다.
식품 첨가제는 용도 및/또는 적용 양식 및/또는 투여 양식에 따라 용액, 또는 슬러리, 또는 펠렛과 같은 고체로서의 형태일 수 있다.
사료 조성물 및/또는 사료 첨가제는 a) 곡물, 예컨대 소형 곡류 (예컨대 밀, 보리, 호밀, 귀리 및 이들의 조합) 및/또는 대형 곡류, 예컨대 옥수수 또는 사탕수수; b) 곡물 유래 부산물, 예컨대 옥수수 글루텐 가루, 주정박(Distillers Dried Grain Soluble) (DDGS) (특히 옥수수 기재의 주정박 (cDDGS)), 밀기울, 밀 조분, 휘트 쇼트(wheat short), 쌀기울, 쌀겨, 귀리겨, 야자인, 및 귤 과육; c) 콩, 해바라기, 땅콩, 루핀(lupin), 완두콩, 잠두, 목화, 카놀라, 어류 가루, 건조된 혈장 단백질, 고기 및 골 가루, 감자 단백질, 유장, 코프라(copra), 참깨와 같은 공급원으로부터 수득된 단백질; d) 식물 및 동물 공급원으로부터 수득된 오일 및 지방; e) 무기질 및 비타민을 포함하는 군에서 선택되는 1종 이상의 사료 재료를 포함할 수 있다.
본 발명은 바이오에탄올 생산과 같은 생물연료 생산에서 활성 효소를 검출하는 데에 유용하다.
검정 장치의 구조
본 발명의 검정 장치 (1)는 배치 영역 (10)을 포함한다. 본원에서 사용될 때의 "배치 영역"이라는 용어는 샘플이 배치될 수 있는 검정 장치 (1)의 영역을 지칭한다. 바람직하게는, 배치 영역 (10)은 흡수제 패드이다. 배치 영역 (10)은 매트릭스 (20)에 작동가능하게 연결되어 있다. 배치 영역 (10)은 매트릭스 (20)와 인접하거나 연속될 수 있다. 배치 영역 (10)은 매트릭스 (20)의 구성 영역일 수 있다. 바람직하게는, 배치 영역 (10)은 매트릭스 (20)의 한쪽 단부에 존재한다. 임의로, 과량의 샘플을 흡수하기 위하여 추가적인 흡수제 패드가 존재한다 (60).
본 상세한 설명의 문맥에서, "작동가능하게 연결된"은 연결되어 있거나, 서로 체결되어 있거나, 또는 장치의 작동시 접촉되는 것을 의미한다.
바람직하게는, 매트릭스 (20)는 흡수제 재료이거나, 흡수제 재료를 포함한다. 더욱 바람직하게는, 매트릭스 (20)는 니트로셀룰로스이거나, 니트로셀룰로스를 포함한다. 예를 들어, 매트릭스 (20)는 유형 MDI 90 CNPH, MDI SS12 12μ 또는 SS12 15μ의 니트로셀룰로스일 수 있거나, 니트로셀룰로스를 포함할 수 있다.
샘플 영역 (10)에 존재하거나 배치될 경우, 샘플은 매트릭스 (20)를 따라 이동할 수 있다. 바람직하게는, 상기 이동은 모세관 작용과 같은 액체 이동이다. 바람직하게는, 이동은 종방향의 것인데, 가장 바람직하게는 그것은 검정 장치 (1)가 스트립 또는 스틱(stick)인 경우에 그러하다. 바람직하게는, 스틱 또는 스트립은 하우징 내에 담겨 있다.
차단 시약이 검정 장치에 첨가될 수 있다. 매트릭스 (20)는 차단 시약을 포함할 수 있다. 차단 시약은 매트릭스 (20)에 결합될 수 있으며, 차단 시약은 건조되거나 탈수된 형태로 존재할 수 있다. 본원에서, "결합된"에는 커플링되거나 부착되는 것이 포함된다. 차단 시약은 직접적으로 또는 간접적으로 매트릭스에 결합될 수 있다. 차단 시약은 임의의 적합한 차단 시약일 수 있다. 차단 시약의 예는 카세인이다. 차단 시약은 계면활성제일 수 있거나, 계면활성제를 포함할 수 있다. 차단 시약은 바람직하게는 계면활성제를 포함한다. 차단 시약은 바람직하게는 비-이온성 계면활성제 및/또는 양쪽이온성 계면활성제이다. 예를 들어, 계면활성제는 트윈(Tween)-20 또는 데쿼트 CC6일 수 있다.
본 발명의 검정 장치 (1)는 매트릭스 (20)상에 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30)를 포함한다. 각 포획 위치 (30)는 배치 영역 (10)으로부터 이격되어 있으며, 별개의 포획 위치(들) (30)를 가로질러 샘플이 이동할 수 있다. 본원에서 이와 같은 문맥에 사용될 때의 "별개"는 다른 포획 위치 (30)로부터 분리되어 있음을 의미한다.
본 발명의 검정 장치 (1)는 다수의 별개의 포획 위치 (30); 바람직하게는 2개를 초과하는 별개의 포획 위치 (30)를 포함할 수 있는데, 가장 바람직하게는 장치는 3개의 별개의 포획 위치 (30)를 포함한다.
검정 장치 (1)는 각각의 영역이 하나 이상의 별도의 포획 위치들 (30)을 포함하는 2개 이상의 포획 위치 영역을 가질 수 있다. 예를 들어, 3개의 별도 포획 위치 영역을 갖는 경우, 하나의 샘플에서 1회의 측정으로 예를 들어 피타제, 크실라나제 및 아밀라제와 같은 3종 이상의 상이한 유형의 효소들을 포획하는 것이 가능할 수 있다.
각 포획 위치 (30)에는, 포획 수단 (40)이 존재한다. 각 포획 위치 (30)에서의 포획 수단 (40)은 상이할 수 있거나, 동일할 수 있다. 포획 수단 (40)은 검정 장치 (1)에 의해 검출되어야 하는 효소에 결합할 수 있다. 이는 적어도 효소의 샘플 또는 샘플 중 일부가 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30)에서 유지되는 결과를 초래한다. 상기 결합은 포획 수단 (40)과 효소 사이의 것으로써, 바람직하게는 항체/항원 결합의 결과이다. 포획 수단 (40)은 단독으로 포획 위치 (30)를 한정할 수 있다.
검정 장치 (1)의 각 별개의 포획 위치 (30)에서의 포획 수단 (40)의 양은 상이하거나 동일할 수 있다. 위치가 배치 영역 (10)으로부터 더 멀어질수록, 각 별개의 포획 위치 (30)에서의 포획 수단 (40)의 양은 증가될 수 있다. 위치가 배치 영역 (10)으로부터 더 멀어질수록, 각 별개의 포획 위치 (30)에서의 포획 수단 (40)의 양은 감소될 수 있다.
일부 실시양태에서, 검정 장치 (1)의 각 별개의 포획 위치 (30)에서의 포획 수단 (40)의 양은 실질적으로 동일하다.
본 발명의 검정 장치 (1)는 임의로 검정 장치가 올바르게 작동하고 있는지를 표시하는 지표 영역 또는 선 (91)을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 지표 영역 또는 선은 색상 변화를 통하여 검정법이 작동하였음을 표시한다. 임의의 지표 영역 또는 선은 항체를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 원래 효소에 대하여, 또는 그의 구성요소 (예컨대 그의 단편 및/또는 그의 에피토프)에 대하여 발생된 것일 수 있으며, 여기서 상기 효소는 검출될 활성 효소와 무관하다. 더하여 또는 다르게는, 지표선은 기질 성분들 중 적어도 일부와 반응할 수 있는 무관 효소를 포함할 수 있다.
항체
본 발명의 포획 수단 (40)은 바람직하게는 검정 장치 (1)에 의해 검출될 활성 효소에 결합하는 항체이다. 상기 항체는 원래 효소에 대하여, 또는 그의 구성요소 (예컨대 그의 단편 및/또는 그의 에피토프)에 대하여 발생된 것일 수 있다.
본 발명의 검정 장치 (1)의 임의의 지표 영역 또는 선 (91)은 항체를 포함할 수 있다.
가장 바람직하게는, 포획 수단 (40)은 피타제 또는 그의 구성요소 (예컨대 그의 단편 및/또는 그의 에피토프), 예컨대 피타제 BP17, BP11 또는 BP111에 대하여 발생된 항체이다.
항체는 표준 기술, 예컨대 혼합물, 정제 샘플 또는 그의 단편으로서의 관심 효소를 사용한 면역화에 의해, 또는 파지 디스플레이 라이브러리(phage display library)를 사용하여 제조될 수 있다.
본 발명의 목적상, "항체"라는 용어에는 달리 명기되지 않는 한 폴리클로날, 모노클로날, 키메라, 단일 사슬, Fab 단편, Fab 발현 라이브러리에 의해 생성되는 단편은 물론, 이들의 모방체가 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 그와 같은 단편들에는 표적 물질에 대한 그의 결합 활성을 유지하는 전체 항체의 단편, Fv, F(ab') 및 F(ab')2 단편은 물론, 단일 사슬 항체 (scFv), 융합 단백질, 및 항체의 항원-결합 부위를 포함하는 기타 합성 단백질들이 포함된다. 또한, 항체 및 그의 단편은 인간화된 항체일 수 있다.
중화 항체 (즉 물질 폴리펩티드의 생물학적 활성을 억제하며 보통 치료제에 사용되는 것들)은 본 발명의 장치 또는 검정법에 바람직하지 않다.
폴리클로날 항체를 원하는 경우에는, 검출될 효소 (또는 그의 면역학적 에피토프를 포함하는 폴리펩티드 단편)를 사용하여 선택된 동물 (예컨대 마우스, 토끼, 염소, 말, 닭 등)이 면역화된다. 숙주 종에 따라서는, 면역학적 반응을 증가시키기 위하여 다양한 아주반트들이 사용될 수도 있다.
면역화된 동물로부터의 혈청은 수집되어, 공지의 절차에 따라 처리된다. 본 발명의 검정 장치에 의해 검출될 효소, 및/또는 그 효소의 아미노산 서열 (또는 그의 면역학적 에피토프를 포함하는 서열)에 대한 폴리클로날 항체를 함유하는 혈청이 다른 항원에 대한 항체를 함유하고 있는 경우에는, 면역친화성 크로마토그래피에 의해 폴리클로날 항체가 정제될 수 있다. 폴리클로날 항혈청을 제조하고 처리하는 기술에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있다 (예컨대 문헌 [Harboe N, Ingild A. Immunization, isolation of immunoglobulins, Estimation of antibody titre. Scand J Immunol Suppl. 1973, 1:161-4]). 실시예 부문에서는, 하르뵈(Harboe) (동 문헌)의 방법론을 사용하여 피타제 효소 BP17에 대한 항체를 생성시켰다. 그러나, 적합한 항체를 생성시키는 데에는, 다른 기술이 사용될 수 있고/거나 다른 효소가 사용될 수 있다.
본 발명의 검정 장치 (1)에 의해 검출될 효소, 및/또는 그 효소의 아미노산 서열 (또는 그의 면역학적 에피토프를 포함하는 서열)에 대하여 유도되는 모노클로날 항체 역시 당업계 숙련자에 의해 용이하게 제조될 수 있는데, 하이브리도마 기술 (문헌 [Koehler and Milstein (1975 Nature 256:495-497)]), 인간 B-세포 하이브리도마 기술 (문헌 [Kosbor et al ., (1983) Immunol Today 4:72]; [Cote et al ., (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030]), 및 EBV-하이브리도마 기술 (문헌 [Cole et al ., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan Rickman Liss Inc, pp 77-96])이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, "키메라 항체"의 제조를 위하여 개발된 기술로써, 적절한 항원 특이성 및 생물학적 활성을 갖는 분자를 수득하기 위한 인간 항체 유전자로의 마우스 항체 유전자의 스플라이싱(splicing)이 사용될 수 있다 (문헌 [Morrison et al ., (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855]; [Neuberger et al ., (1984) Nature 312:604-608]; [Takeda et al ., (1985) Nature 314:452-454]).
다르게는, 단일 사슬 항체 제조용으로 기술되어 있는 기술 (US4946779호)이 물질 특이적 단일 사슬 항체를 제조하도록 변경될 수 있다.
물질에 대한 특이적 결합 부위를 함유하는 항체 단편 역시 생성될 수 있다. 예를 들어, 그와 같은 단편에는 항체 분자의 펩신 소화에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편, 및 F(ab')2 단편의 디술피드 가교를 환원시킴으로써 생성될 수 있는 Fab 단편이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다. 다르게는, 원하는 특이성을 갖는 모노클로날 Fab 단편의 빠르고 용이한 확인을 가능케 하기 위하여, Fab 발현 라이브러리가 구성될 수도 있다 (문헌 [Huse WD et al ., (1989) Science 256:1275-1281]).
일부 실시양태에서, 바람직하게는 항체는 폴리클로날 항체이다.
더욱 더 우수한 장치 또는 검정법에 어울리도록, 항체는 변형 - 예컨대 유도체화 -될 수 있다. 예를 들어, 항체는 유도체화된 플라스틱과 같은 매트릭스에 대한 특이적 부착/커플링을 가능케 하는 1종 이상의 화학적 모이어티로 커플링될 수 있다.
선택적 표시 수단
본 발명의 검정 장치는 포획 수단 (40)에 결합된 활성 효소의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하기 위한 선택적 표시 수단 (50) 또는 적어도 그의 구성요소를 포함한다. 선택적 표시 수단 (50)은 침전 반응을 포함할 수 있다.
한 측면에서, 검정 장치는 전체 또는 실질적으로 전체의 선택적 표시 수단을 포함한다.
또다른 측면에서, 검정 장치에는 선택적 표시 수단의 1종 이상의 구성요소가 제공된다. 그와 같은 경우, 검정 장치에는 선택적 표시 수단의 다른 구성요소(들)이 제공된다. 한 측면에서, 선택적 표시 수단은 검정 장치가 사용될 때 검정 장치 상에 및/또는 검정 장치 내에 구성된다. "구성되는"이라는 용어에는 선택적 표시 수단을 생성시키기 위한 구성요소들의 혼합 또는 접촉이 포함된다.
또다른 측면에서는, 본 발명의 검정 장치로 사용될 수 있는 장치가 제공되어 있으며 선택적 표시 수단이 제공되어 있는 키트가 제공된다. 이후 사용시에는, 본 발명의 검정 장치를 형성하도록, 선택적 표시 수단의 구성요소들 전체 또는 일부가 장치에 첨가된다.
본원에서 사용될 때의 "제공하다/되는"이라는 용어는 그 자체로서, 또는 시스템의 일부로서 표시를 나타낼 수 있음을 지칭한다. 다르게는, "제공하다/되는" 또는 "제공되는"이라는 용어는 키트 또는 장치가 확인된 구성요소를 함유 또는 포함한다는 것을 지칭한다.
선택적 표시 수단 (50)은 가시적인 색상 변화를 포함하거나 제공할 수 있다. 색상 변화는 바람직하게는 반응성 종과 반응하는 모이어티를 형성하는 효소 기질의 반응에 의해 야기된다. 기질은 매트릭스 (20)에 결합된 것일 수 있다.
효소가 작용하는 물질은 그의 "기질"로 지칭된다. 바람직하게는, 효소의 기질은 검정 장치 (1)에 결합된다. 본원에서 "결합되는"에는 커플링되는 것 또는 부착되는 것이 포함된다. 기질은 직접적으로 또는 간접적으로 장치에 결합될 수 있다. 가장 바람직하게는, 기질은 검정 장치 (1)의 매트릭스 (20)에 결합되거나, 또는 장치의 대향 반체 (3)상의 위치 (50)에 그것이 존재할 수 있다. 기질은 바람직하게는 건조된 형태이다.
바람직하게는, 효소는 그의 기질에 작용하여 반응성 모이어티를 형성시킨다. 이후 상기 반응성 모이어티는 반응성 종에 작용하여 기능성 효과, 바람직하게는 색상 변화와 같은 가시적으로 관찰가능한 효과를 생성시킬 수 있다.
본원에서, 상기 반응성 모이어티는 모이어티, 환원성 모이어티, 환원성 종 또는 환원성 요소로 지칭될 수도 있다.
기질은 포스파타제 기질, 또는 포스페이트 공여체 기를 갖는 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 기질은 산 포스파타제 기질이다. 일부 측면에 있어서, 포스페이트 공여체 기의 제거는 환원성 요소 또는 반응성 모이어티를 생성한다. 바람직하게는, 포스파타제 기질은 2-포스포-L-아스코르브산 트리나트륨 (AsAP)이다. 다른 예에는 대안적인 아스코르빌 2-포스페이트염 (예컨대 마그네슘, 아연, 칼슘) 또는 3-O-포스페이트 유도체와 같은 유사체들이 포함된다. 다른 가능한 예에는 아스코르빌 포스페이트의 에스테르화된 버젼 (포스포 아스코르빌 팔미테이트)이 포함된다.
선택적 표시 수단 (50)이 반응성 종과 반응하는 모이어티를 형성하는 효소 기질의 반응에 의해 야기되는 색상 변화를 포함하는 경우에서, 상기 반응성 종은 테트라졸륨 화합물일 수 있다. 이와 관련하여, 색상 변화는 효소 반응의 결과로서의 포르마잔 염료의 형성에 의해 야기된다.
당업계에서, 테트라졸륨염은 산화환원 반응의 색상 변화를 교란하게 되는 물질을 제거하는 데에 사용되어 왔다. 예를 들어, US 5,196,314호를 참조하라. 또한, US 5,360,595호에서는, 분석물의 존재의 지표로서 테트라졸륨염의 색상 변화가 사용된 바 있다.
본 발명에서, 반응성 종은 니트로블루 테트라졸륨 화합물일 수 있다. 반응성 종은 니트로블루 테트라졸륨 클로라이드 (NBT)일 수 있다. 반응성 종은 다르게는 할로니트로테트라졸륨 화합물일 수 있다. 반응성 종은 바람직하게는 아이오도니트로테트라졸륨 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 반응성 종은 아이오도니트로테트라졸륨 클로라이드 (INT)이다.
선택적 표시 수단, 가장 바람직하게는 반응성 종에는, 침전물의 확산을 감소시키거나 방지할 수 있는 물질이 첨가될 수 있다. 이는 결과의 질을 개선하는데, 가장 바람직하게는 침전물의 가시적인 선을 개선한다. 가장 바람직하게는, 이와 같은 물질은 폴리에틸렌 글리콜이며, 가장 바람직하게는 이것이 테트라졸륨염에 첨가된다.
따라서, 바람직한 측면에서는, 샘플 중 활성 효소를 검출하는 측방 유동 검정 장치 (1)가 기술된다. 바람직하게는, 효소는 산 포스파타제이며, 효소 활성은 착색된 침전물을 생성시키기 위한 테트라졸륨염의 환원에 의해 측정된다. 장치는 준-정량적이며, 분석물 정량은 침전물로 인하여 색상 변화를 나타내는 장치의 포획 위치 (30)의 수에 의해 표시된다.
선택적 표시 수단 (50)이 상기한 바와 같은 포스파타제 기질을 포함하는 경우, 포스파타제 기질은 반응 증진제의 존재하에 상기한 바와 같이 반응성 종과 반응될 수 있다. 상기 반응 증진제는 제2 매트릭스에 결합된 것일 수 있다. 반응 증진제는 페나진 화합물일 수 있다.
바람직하게는, 반응 증진제는 메토술페이트 화합물이다. 가장 바람직하게는, 반응 증진제는 페나진 메토술페이트 (PMS)이다.
바람직한 실시양태에서, 검출될 활성 효소는 기질에 작용함으로써, 이후 관찰가능한 효과를 생성하는 물질에 작용하는 반응성 모이어티 또는 환원성 요소를 생성시킨다.
바람직한 실시양태에서, 효소는 피타제이며, 기질은 포스파타제 기질, 또는 포스페이트 공여체 기를 갖는 화합물이다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 효소는 크실라나제이며, 기질은 크실란이고, 반응성 모이어티는 크실로스이다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 효소는 아밀라제이며, 기질은 전분이고, 반응성 모이어티는 글루코스이다.
바람직한 실시양태에서, 상기 물질은 테트라졸륨염이며, 관찰가능한 효과는 가시적인 효과, 가장 바람직하게는 색상 변화이다.
바람직한 실시양태
본 발명의 검정 장치 (1)의 2종의 바람직한 실시양태를 도 1a 및 도 1b에 나타내었다.
바람직하게는, 검정 장치 (1)는 스트립 또는 스틱이다. 이와 같은 스트립 또는 스틱을 따라, 도 1에 화살표로 나타낸 종방향으로 액체 샘플이 유동할 수 있다. 스트립 또는 스틱 몸체는 매트릭스 (20)를 포함한다. 장치의 실시양태 1 (도 1a)에서와 같이, 배치 영역 (10)은 바람직하게는 스트립 또는 스틱의 한쪽 단부에 존재한다. 포획 위치 (30)는 바람직하게는 스트립 또는 스틱의 배치 영역 (10)에 대하여 대향 단부에 존재한다.
선택적 표시 수단 (50) 또는 그의 구성요소는 사용시에 검정 장치에 첨가될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 표시 수단 또는 적어도 그의 구성요소는 액체 형태이다. 바람직하게는, 선택적 표시 수단 (50) 또는 선택적 표시 수단 (50)의 일부 구성요소를 제외한 모든 시약들이 건조되어 있다. 다르게는, 모든 시약들이 건조되거나 탈수된 형태일 수 있다.
검정 장치 (1)의 바람직한 실시양태 2를 도 1b에 나타내었다. 이 경우, 검정 장치 (1)는 접힘 부문 또는 접힘선 (70)에 의해 연결되는 2개의 대향 반체로 구성된다. 매트릭스 (20)에 작동가능하게 연결되어 있는 배치 영역 (10)은 장치의 일 반체 (2)에 위치된다. 포획 위치(들) (30) 및 포획 수단 (40)은 매트릭스 (20)상에 위치된다. 장치의 상기 (2) 또는 대향 반체 (3)는 선택적 표시 수단 또는 적어도 그의 구성요소를 포함하며, 대향 반체 (3)는 임의로 과량의 샘플을 흡수하는 흡수제 패드 (60)를 포함한다.
실시양태 2를 사용하는 경우, 작업자는 배치 영역 (10)상에 샘플을 배치시킨다. 다음에는, 적어도 필요한 위치로 샘플이 유동하도록 한다. 다음에는, 접힘 부문 (70)을 따라 장치를 닫는다. 이는 선택적 표시 수단 (50) 또는 적어도 그의 구성요소를 매트릭스 (20) 및 포획 수단 (40)과 접촉시킨다. 작업자는 선택적 표시 수단 (50) 또는 선택적 표시 수단 (50)의 일부 구성요소(들)을 액체 형태로 장치에 첨가할 필요가 있을 수 있다.
일부 실시양태에 있어서, 선택적 표시 수단 또는 선택적 표시 수단의 일부 구성요소는 건조된 형태로 위치 (90)에 존재할 수 있다. 바람직하게는, 모든 시약은 건조되어 있다. 일부 실시양태에서는, INT 또는 NBT 중 어느 하나의 테트라졸륨 용액이 작업자에 의해 위치 (50) 또는 (30)에 첨가될 수 있다.
임의로 바람직하게는, 실시양태 2는 일단 장치의 2개 반체 (2) 및 (3)이 닫히고 난 후 작업자가 검정 장치의 결과를 관측하는 것 (다른 말로 하면, 포획 위치를 관측하는 것)을 가능케 하는 관측 창 (80)을 포함한다.
본 발명의 검정 장치 (1)는 임의로 검정 장치가 올바르게 작동하고 있는지를 표시하는 지표 영역 또는 선을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 지표 영역 또는 선은 색상 변화를 통하여 검정법이 작동하였음을 표시한다. 임의의 지표 영역 또는 선은 항체를 포함할 수 있다. 이러한 항체는 원래 효소에 대하여, 또는 그의 구성요소 (예컨대 그의 단편 및/또는 그의 에피토프)에 대하여 발생된 것일 수 있으며, 여기서 상기 효소는 검출될 활성 효소와 무관하다. 더하여 또는 다르게는, 지표선은 기질 성분들 중 적어도 일부와 반응할 수 있는 무관 효소를 포함할 수 있다.
더하여 또는 다르게는, 지표 영역은 산 포스파타제, 또는 검출될 피타제와 무관한 피타제를 포함할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 샘플 중 활성 효소를 검출하기 위한 검정 장치를 제공하며; 여기서 장치는 하기를 포함한다: (a) 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역; (b) 샘플이 상기 배치 영역에 존재하는 (예컨대 배치되는) 경우 매트릭스를 따라 이동할 수 있도록 상기 배치 영역에 작동가능하게 연결된 매트릭스; (c) 각 별개의 포획 위치가 배치 영역으로부터 이격되어 있으며, 샘플이 상기 별개의 포획 위치를 가로질러 이동할 수 있는, 상기 매트릭스 상의 하나 이상의 별개의 포획 위치; (d) 각 별개의 포획 위치에 존재하거나 그것을 한정하며, 활성 효소 샘플의 적어도 일부분이 하나 이상의 별개의 포획 위치에서 유지되도록 상기 효소에 결합할 수 있는 포획 수단; 및 (e) 상기 포획 수단에 결합된 활성 효소의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 선택적 표시 수단 또는 적어도 그의 구성요소.
바람직하게는, 상기 효소는 피타제이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 샘플 중 활성 효소를 검출하기 위한 검정 장치를 제공하며; 여기서 장치는 사용시 하기를 포함한다: (a) 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역; (b) 샘플이 상기 배치 영역에 존재하는 (예컨대 배치되는) 경우 매트릭스를 따라 이동할 수 있도록 상기 배치 영역에 작동가능하게 연결된 매트릭스; (c) 각 별개의 포획 위치가 배치 영역으로부터 이격되어 있으며, 샘플이 상기 별개의 포획 위치를 가로질러 이동할 수 있는, 상기 매트릭스 상의 하나 이상의 별개의 포획 위치; (d) 각 별개의 포획 위치에 존재하거나 그것을 한정하며, 활성 효소 샘플의 적어도 일부분이 하나 이상의 별개의 포획 위치에서 유지되도록 상기 효소에 결합할 수 있는 포획 수단; 및 (e) 상기 포획 수단에 결합된 활성 효소의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 선택적 표시 수단.
바람직하게는, 상기 효소는 피타제이다.
한 실시양태에서, 본 발명은 샘플 중 활성 효소를 검출하기 위한 검정 장치를 제공하며; 여기서 장치는 하기를 포함한다: (a) 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역; (b) 샘플이 상기 배치 영역에 존재하는 (예컨대 배치되는) 경우 매트릭스를 따라 이동할 수 있도록 상기 배치 영역에 작동가능하게 연결된 매트릭스; (c) 각 별개의 포획 위치가 배치 영역으로부터 이격되어 있으며, 샘플이 상기 별개의 포획 위치를 가로질러 이동할 수 있는, 상기 매트릭스 상의 하나 이상의 별개의 포획 위치; (d) 각 별개의 포획 위치에 존재하거나 그것을 한정하며, 활성 효소 샘플의 적어도 일부분이 하나 이상의 별개의 포획 위치에서 유지되도록 상기 효소에 결합할 수 있는 포획 수단; 및 (e) 상기 포획 수단에 결합된 활성 효소의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 선택적 표시 수단 또는 적어도 그의 구성요소 (여기서 상기 효소는 피타제이며, 상기 선택적 표시 수단은 산 포스파타제를 포함함).
준-정량
본 발명의 검정 장치 (1)는 샘플 중 활성 효소 양의 적어도 준-정량적인 측정을 제공할 수 있다.
바람직하게는, 상기 양은 결합된 효소의 존재를 표시하는 포획 위치 (30)의 수와 관련된다. 다르게는, 준-정량적 측정은 포획 위치(들) (30)에서의 색상 변화의 강도를 사용하여 이루어질 수 있다.
색상 변화의 강도는 바람직하게는 작업자가 매트릭스 (20)상에서의 색상 반응의 강도를 점수 카드와 비교하는, 점수 카드 또는 참조 카드를 사용하여 평가될 수 있다. 더하여 또는 다르게는, 사용자는 색상 변화를 해독하여 그의 분석 결과(들)를 사용자에게 다시 보고할 수 있는 전자 장치를 사용할 수 있다. 예를 들자면, 상기 전자장치는 적합한 "앱(app)"을 포함할 수 있는 이동 전화일 수 있다.
준-정량적 측정은 활성 효소의 양이 소정의 양 또는 농도를 초과하는지 또는 그것 미만인지, 예를 들어 300 FTU/g을 초과하는지 또는 그것 미만인지를 측정할 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도
상기한 바와 같이, 본 발명은 샘플 중에 존재하는 활성 효소가 있는지를 확인하기 위한 (예컨대 본 발명의 장치를 사용한) 방법 또는 용도를 제공한다. 바람직하게는, 이와 같은 방법은 준-정량적이다. 상기 방법은 샘플과 함께 본원에서 기술되는 검정 장치 (1)를 사용하고 결과를 다른 샘플과 비교하는 것을 포함한다.
더 많은 활성 효소를 함유하는 샘플은 더 많은 포획 위치들 (30)이 결합된 활성 효소의 존재를 표시하도록 한다.
다르게는 또는 더하여, 포획 위치에서 더 강한 (예컨대 더 짙은) 색상 변화를 야기하는 샘플은 더 많은 활성 효소를 함유한다.
바람직하게는, 상기 방법은 알칼리 포스파타제 (EC 3.1.3.1), 산성/산 포스파타제 (EC 3.1.3.2), 3-피타제 (EC 3.1.3.8), 6-피타제 (EC 3.1.3.26), 엔도-1,4-β-크실라나제 (EC 3.2.1.8) 및 크실란 엔도-1,3-β-크실로시다제 (EC 3.2.1.32), 바람직하게는 크실란 1,4-베타-크실로시다제 (EC 3.2.1.37); α-아밀라제 (EC 3.2.1.1), β-아밀라제 (EC 3.2.1.2), 올리고-1,6-글루코시다제 (EC 3.2.1.10), 글루칸 1,4-알파-글루코시다제 (EC 3.2.1.3), 풀룰라나제 (EC 3.2.1.41), 셀룰라제 (EC 3.2.1.4), 엔도-1,3(4)-베타-글루카나제 (EC 3.2.1.6), 및 글루칸 엔도-1,3-베타-D-글루코시다제 (EC 3.2.1.39)를 포함한 활성의 포스파타제 또는 인산 모노에스테르 히드롤라제 (EC 3.1.3) 및 글리코시드 히드롤라제 (EC 3.2.1)를 측정하는 데에 사용된다. 더욱 바람직하게는, 활성 6-피타제, 예컨대 피타제 BP17의 수준이 측정된다.
본 발명의 다른 측면은 그것이 식품 또는 사료 또는 생물연료 또는 세제 조성물에서의 활성 효소 수준의 측정 방법을 제공한다는 것이다. 이와 같은 방법은 식품 또는 사료 또는 생물연료 또는 세제 조성물의 샘플, 바람직하게는 수성 샘플을 제조하는 것을 포함한다. 다음에, 샘플은 본 발명의 검정 장치 (1)의 배치 영역 (10)에 배치되며, 검정 장치 (1)는 준-정량적으로 샘플 중 활성 효소의 양을 측정하는 데에 사용된다. 수개 샘플 중 활성 효소의 양이 서로 비교되고/거나 참조 샘플에 비교될 수 있다. 가장 바람직하게는, 이와 같은 방법은 식품 또는 사료에서 활성 피타제 수준, 바람직하게는 활성 피타제 BP17 수준을 측정하는 데에 사용된다.
본 발명은 또한 추가적인 효소, 또는 사료 또는 식품 첨가제가 필요한지 여부의 확인 방법을 제공한다. 상기한 방법을 사용하여 활성 효소의 특정 양 또는 상대적인 양 미만이 검출되는 경우, 이는 추가적인 효소가 첨가되어야 한다는 것을 표시한다. 가장 바람직하게는, 이와 같은 방법은 추가적인 피타제, 바람직하게는 활성인 피타제 BP17이 식품 또는 사료에 첨가되어야 하는지 여부를 확인하는 데에 사용된다.
상기한 방법은 품질 제어에 사용될 수 있다. 그와 같은 방법은 본 발명의 검정 장치 (1)를 사용하여 샘플 중 활성 효소 수준을 측정하는 것, 및 이후 이들 효소가 효소의 품질 제어 수준을 충족하는지를 확인하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 그와 같은 방법은 사료 또는 사료 첨가제에서 피타제 수준을 측정한 다음, 사료 또는 사료 첨가제가 사용될 수 있는지를 결정하는 데에 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 하기의 단계들을 포함하는, 샘플 중 활성 효소의 존재를 측정하는 방법을 제공한다:
a) 샘플의 적어도 일부분을 포획 수단과 접촉시킴으로써, 상기 포획 수단에 의해 효소를 포획하는 단계;
b) 포획된 효소에 대하여 적합한 기질을 제공하며, 상기 기질은 상기 포획된 효소와 반응하여 효소 생성물을 생성하는 것인 단계;
c) 효소 생성물과 반응할 수 있는 반응성 종을 제공하며, 상기 반응성 종은 상기 효소 생성물과 반응하여 불용성 생성물을 생성하는 것인 단계; 및
d) 단계 c)에서 수득된 불용성 생성물을 검출하며, 상기 검출은 상기 샘플 중 활성 효소의 존재 및/또는 양과 상관되는 것인 단계.
바람직하게는, 샘플은 식품 또는 사료 샘플, 또는 식품 또는 사료 성분 샘플, 또는 생물연료 또는 세제 조성물 샘플이다. 바람직하게는, 샘플은 건조되어 있거나, 재-수화되어 있거나, 또는 수성인 샘플이다. 가장 바람직하게는, 샘플은 액체 샘플이다.
바람직하게는, 상기 방법에 의해 검출되는 활성 효소는 포스파타제 또는 글리코시드 히드롤라제, 가장 바람직하게는 산 포스파타제, 피타제, 크실라나제, 아밀라제 또는 β-글루카나제이다.
바람직하게는, 상기 방법에서 사용되는 포획 수단은 검정 장치 (1)에 의해 검출될 활성 효소에 결합하는 항체이다. 상기 항체는 원래 효소에 대하여, 또는 그의 구성요소 (예컨대 그의 단편 및/또는 그의 에피토프)에 대하여 발생된 것일 수 있다.
바람직하게는, 포획된 효소에 대한 기질은 포스파타제 기질, 또는 포스페이트 공여체 기를 갖는 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 기질은 산 포스파타제 기질이며, 가장 바람직하게는 포스파타제 기질은 2-포스프-L-아스코르브산 트리나트륨 (AsAP)이다.
바람직하게는, 방법에서 사용되는 반응성 종은 테트라졸륨 화합물일 수 있다. 가장 바람직하게는, 반응성 종은 니트로블루 테트라졸륨 화합물일 수 있다. 상기 반응성 종은 니트로블루 테트라졸륨 클로라이드 (NBT)일 수 있다. 반응성 종은 다르게는 할로니트로테트라졸륨 화합물일 수 있다. 반응성 종은 바람직하게는 아이오도니트로테트라졸륨 화합물일 수 있다. 바람직하게는, 상기 반응성 종은 아이오도니트로테트라졸륨 클로라이드 (INT)이다.
상기 불용성 생성물은 바람직하게는 침전물, 가장 바람직하게는 가시적으로 검출가능하거나 관찰가능한 침전물, 바람직하게는 착색된 침전물이다.
불용성 생성물은 바람직하게는 가시적으로 또는 전자식으로 검출 또는 관찰된다. 가장 바람직하게는, 그것은 색상 변화로 인하여 검출가능하다.
키트
본 발명은 키트의 형태로 제공될 수 있다. 그와 같은 키트는 작업자가 바람직하게는 실험실 외부에서 검정법을 수행하는 것을 가능케 하게 된다. 키트는 검정법을 수행하는 데에 필요한 1종 이상 또는 모든 시약들을 제공할 수 있다. 그와 같은 시약들은 건조되거나 탈수된 형태일 수 있다. 건조 시약은 용매 중 샘플, 바람직하게는 수성 샘플에 의해 재-구성될 수 있다. 바람직하게는, 선택적 표시 수단 (50) 또는 선택적 표시 수단 (50)의 일부 구성요소를 제외한 모든 시약들이 건조되어 있다. 그와 같은 키트는 "반-건조 포맷"으로 알려져 있을 수 있다. 바람직하게는, 반응성 종을 제외한 모든 시약들이 건조되어 있다. 가장 바람직하게는, INT 또는 NBT 중 어느 하나의 테트라졸륨 용액을 제외한 모든 시약들이 건조되어 있다. 작업자는 건조되어 있는 시약에 액체를 첨가함으로써 검정법을 수행한다.
바람직하게는, 검정 장치 (1)는 스틱, 또는 가장 바람직하게는 스트립의 형태로 공급된다. 가장 바람직하게는, 건조 시약은 그것이 제공될 때 스트립 또는 스틱에 결합되어 있다. 본 발명의 키트는 하나 이상의 백 (예컨대 플라스틱 백), 피펫, 주사기, 튜브 또는 시험관을 포함할 수도 있다. 바람직하게는, 스트립 또는 스틱은 하우징, 예를 들어 플라스틱, 카드 또는 판지 하우징에 담겨 있다.
본 발명의 검정 장치는 도 1의 실시양태 1 또는 도 1의 실시양태 2에 나타낸 바와 같은 키트로 제공될 수 있다.
본 발명의 키트는 하기를 포함하는 검정 장치, 및 검정 장치의 모든 구성요소를 포함하거나 형성할 수 있다:
(a) 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역 (10);
(b) 샘플이 상기 배치 영역 (10)에 존재하는 (예컨대 배치되는) 경우 매트릭스 (20)를 따라 이동할 수 있도록 상기 배치 영역 (10)에 작동가능하게 연결된 매트릭스 (20);
(c) 각 별개의 포획 위치 (30)가 배치 영역 (10)으로부터 이격되어 있으며, 샘플이 상기 별개의 포획 위치 (30)를 가로질러 이동할 수 있는, 상기 매트릭스 (20) 상의 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30);
(d) 각 별개의 포획 위치 (30)에 존재하거나 그것을 한정하며, 활성 효소 샘플의 적어도 일부분이 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30)에서 유지되도록 상기 효소에 결합할 수 있는 포획 수단 (40); 및
(e) 상기 포획 수단에 결합된 활성 효소의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 선택적 표시 수단 (50) 또는 적어도 그의 구성요소.
본 발명의 키트는 검정 장치 (a)-(d)의 구성요소 모두 또는 실질적으로 모두를 포함할 수 있으며, 이후 사용시 장치에 첨가되는 선택적 표시 수단 (50)이 제공된다.
본 발명의 키트는 검정 장치 (a)-(d)의 모든 구성요소, 및 상기 선택적 표시 수단의 1종 이상의 구성요소를 포함할 수 있으며, 이후 사용시 장치에 첨가되는 선택적 표시 수단 (50)의 다른 구성요소(들)를 추가로 포함한다.
본 발명의 키트는 검정 장치 (a)-(e)의 모든 구성요소를 포함할 수 있다.
물과 같은 용매 - 또는 다른 적합한 수용액 -가 본 발명의 키트 또는 장치에 포함될 수 있거나 첨가될 수 있다. 상기 또는 키트 구성요소 중 어느 것은 물, 정제수 또는 탈-이온수와 같은 용매에 분산, 용해 또는 재-수화될 수 있다.
본 발명의 키트에는 점수 카드 또는 참조 카드가 공급될 수 있다. 색상 변화의 강도가 점수 카드 또는 참조 카드를 사용하여 평가될 수 있는데, 바람직하게는 작업자는 매트릭스 (20)상에서의 색상 반응의 강도를 점수 카드와 비교한다. 준-정량적 측정이 점수 카드를 상용하여 수행될 수 있는데, 예를 들어 활성 효소의 양이 소정의 양 또는 농도를 초과하거나 그 미만인지, 예컨대 300 FTU/g을 초과하거나 그 미만인지가 점수 카드를 사용하여 측정될 수 있다.
점수 카드 또는 참조 카드는 종이, 카드 또는 기타 물리적 재료로 제조될 수 있다. 다르게는, 점수 카드 또는 참조 카드는 예를 들어 전화기, 스마트폰, 컴퓨터 또는 기타 컴퓨터 장치에서 전자식으로 관측될 수 있다. 점수 카드는 전자식 참조와 비교될 수 있고/거나 점수 카드는 전자식으로 해독될 수 있다.
실시예
본 발명이 단지 예로써 기술될 것인 바, 첨부된 도면을 참조한다.
실시예 부문의 부분 1은 샘플 중 활성 피타제의 존재를 측정하기 위한 본 발명의 검정 장치 및 방법의 세부사항을 제공한다.
실시예 부문의 부분 2는 샘플 중 활성 크실라나제의 존재를 측정하기 위한 본 발명의 검정 장치 및 방법에 사용될 수 있는 방법론의 세부사항을 제공한다.
본 발명의 검정 장치 및 방법을 위한 항체 생성
본 발명의 검정 장치 및 방법에서 사용하기 위한 항체는 문헌 [Harboe N, Ingild A. Immunization, isolation of immunoglobulins, Estimation of antibody titre. Scand J Immunol Suppl. 1973, 1:161-4]의 방법론을 사용하여 생성될 수 있다.
실시예 부문의 부분 1에서는, 하르뵈 N (1973) (동 문헌)의 방법론에 따라, 본 발명의 검정 장치 및 방법에서 사용하기 위한 피타제 BP17에 대한 항체를 생성시켰다. BP17의 서열 (신호 펩티드 배제)은 상기에 나타내었다.
부분 1
본 발명으로 이어져 그것으로 귀결되는 연구에서는, 두 가지 상이한 조사 방식을 취하였다.
하나의 접근법은 본 발명에 따른 장치 (도 1에 일반적으로 제시되어 있음), 그리고 상기 장치의 사용 방법 및 상기 장치를 포함하는 키트의 사용 방법으로 귀결되었다. 이와 같은 접근 방식은 포맷 1로 지칭하였다. 이와 같은 장치 등에 대해서는 실시예 1 등에서 상세하게 논의한다.
금 접합체 항체 샌드위치 측방 유동 검정법에 대해서도 연구하였다. 이와 같은 접근 방식은 포맷 2로 지칭하였다. 본원에 설명되어 있는 이유로, 이와 같은 접근 방식은 적합하지 않은 것으로 간주되었다. 도 5 및 그의 연관 논평과 같이 포맷 2 (즉 금 접합체 항체 샌드위치 측방 유동 검정법)와 관련된 정보는 비교 목적으로 첨가하였다 (비교 실시예 부문 참조).
또한, 비교 실시예 부문에서는, 실험의 한 측면에 대한 포맷 2와의 포맷 1의 직접 비교를 수행하였다.
실시예 1-9
포맷 1 - 본 발명의 검정 장치 및 방법
실시예 1
본 발명의 검정법 및 장치는 침전 기질을 사용한 항체 포획 테스트(test)와 관련된다 (예컨대 도 1 및 도 2 및 도 3).
이와 관련하여, 침전 기질을 사용한 항체 포획 테스트를 특성화하였다. 주요 특징이 착색된 침전물을 생성시키고 이후 측방 유동-형 검정법에서 투여량-의존성 신호 반응의 기능을 나타내는 테트라졸륨염의 환원인, 적합한 산-포스파타제 기질을 확인하였다.
침전 기질을 사용한 항체 포획 테스트의 개발에는, 기질 복잡성, 및 테스트 유동으로 인한 생성 침전물의 이동과 같은 몇 가지 장애들이 알려져 있다. 그러나, 금 접합체 샌드위치 검정법 (도 5)보다는 이와 같은 테스트가 더 적합하였는데, 그것이 단순히 항체에 대한 효소의 결합에 의존하기보다는 직접적으로 효소 활성을 측정하기 때문이다.
침전 기질을 사용한 항체 포획 검정법 (도 2)은 광범위하게 개발되어 있다. 다수의 포맷들이 조사되어 있으며, 테스트는 다-성분 기질 및 샘플 첨가 후 테스트 스틱 조작을 사용한 초기의 복잡한 설계로부터 최소한의 사용자 단계를 포함하는 단순한 구성으로 개선되었다.
테스트의 준-정량적 측면은 3개 선의 테스트 영역에 의해 측정되는데, 여기서 3개 선의 결과는 고수준의 활성 효소 (통과 결과)를 나타내며, 2개 선은 중간 수준 (경계)을 나타내고, 1개 또는 0개의 선은 낮은 효소 수준 (결핍)을 나타낸다.
이와 같은 검정법의 진화는 매우 유용한 포맷 - 즉 우리가 "반-건조 포맷"으로 지칭하는 것 -의 개발로 이어졌다. 도 3은 본 발명의 반-건조 포맷과 관련된 단계들을 나타낸다.
이와 관련하여 도 3에 도시되어 있는 바와 같이, 반-건조 포맷은 작업자가 테스트 스틱에 적용되는 수중에서 테스트 샘플을 제조할 것을 필요로 한다. 용액 중 기질 복합체의 한 성분이 건조되어 있는 다른 기질 성분들을 함유하는 패드로 덮여 있는 테스트 스틱 매트릭스 (이 경우에서는 니트로셀룰로스)에 '병으로부터 바로' (작업자에 의한 제조를 필요로 하지 않음) 직접 적용된다. 다음에, 테스트가 전개되도록 한 후, 20-30분 후에 결과가 해독된다 (도 4). 여기에서, 도 4는 도 3의 반-건조 포맷을 사용한 일련의 6-피타제 (BP17로 지칭) 희석물로부터의 결과를 나타낸다. 6-피타제는 상기한 바와 같이 부티옥셀라 종으로부터 유래한다.
모든 구성요소가 테스트에 건조되어 있어서, 작업자는 샘플을 적용하기만 하면 되게 되는 "건조 포맷"도 조사하였다 (도 6). 여기에서, 작업자는 단순히 샘플을 첨가하고, 테스트를 밝힌다. 최종 테스트는 카세트화될 수 있어서, 도 6에 도시되어 있는 균형추가 필요하지 않게 된다. 도시되어 있는 예에서는, 포스페이트 공여체인 2-포스포-L-아스코르브산 트리나트륨 (AsAP) 및 반응 증진제 페나진 메토술페이트 (PMS)가 테스트 니트로셀룰로스 매트릭스 (NC)에 건조되고, 테트라졸륨 기질인 아이오도니트로테트라졸륨 클로라이드 (INT)의 나일론 패드가 상부에 고정 위치된다. 액체 샘플이 평상시와 같이 첨가되는데, 기질 성분을 재수화시키는 것은 샘플 용액 자체이다.
따라서, 도 6 (즉 건조 포맷 테스트의 예)에서, 작업자는 단순히 샘플을 첨가하고, 테스트를 밝힌다. 이와 같은 도면에서, 2-포스포-L-아스코르브산 트리나트륨 = AsAP이며; 반응 증진제 페나진 메토술페이트 = PMS이고; 니트로셀룰로스 매트릭스 = NC이며; 테트라졸륨 기질 아이오도니트로테트라졸륨 클로라이드 = INT이다.
실시예 2 - 샘플 제조
용매
샘플 제조 방법은 수중에서 수행하였다. 연속성을 위하여, 밀리Q 워터를 사용하였다. 밀리Q는 물 정제 시스템에 의해 정제된 후 고도로 탈이온된 물을 지칭한다.
도 7은 1 그램의 사료 펠렛을 0.25 M의 아세테이트 완충제, pH 5.0, 밀리Q 워터 또는 수돗물 중 어느 하나에서 30분 동안 추출한 후, 3반복으로 유통 포맷상에서 전개시켰을 때의 수득 결과를 나타낸다 (도 11 또한 참조). 각 경우에서, 저부 선은 테스트 선을 나타내며, 상부 선은 대조 선이다. 기질 적용 10분 및 30분 후에, 테스트를 사진촬영하였다.
실험은 수돗물을 사용하여서도 반-건조 포맷으로 만족스러운 결과를 생성한다는 것을 나타내었다. 수돗물은 시험된 다른 2종의 용매에 비해 약간 증가된 가시적 신호를 생성시킨다.
교반 시간
도 7에 도시된 예에서는, 1 그램의 사료 펠렛을 10 mL의 밀리Q 워터에서 추출하였는데, 일정하게 교반하면서 10분 동안 추출이 진행되도록 하였다. 그러나, 추가 실험은 5분 동안의 추출의 단순한 진탕이 수성 상으로의 피타제 BP17의 완전 추출을 생성한다는 것을 나타내었다 (도 8). 따라서, 테스트 샘플의 제조는 작업자가 최소한의 훈련으로 관리가능한 빠르고 간단한 절차이다.
도 8은 상이한 시간 간격에서의 샘플링의 결과를 나타낸다. 1 그램의 사료 펠렛을 10 mL의 밀리Q 워터에 첨가하고, 생성 용액을 0에서 60분까지 다양한 시간 간격으로 샘플링하였다. 5분 후면, 추출은 시험에 충분한 것으로 보인다.
한 측면에서, 작업자는 샘플 추출 튜브 또는 백에 사전결정된 수준 (튜브상에 선으로 표시)까지 사료 펠렛을 충진시킨 다음, 제2의 선까지 튜브에 수돗물을 충진하게 된다. 상기 선들은 사료 대 물 비를 최적화하도록 표시될 것이다. 전체적으로 1:10의 비가 사용되기는 하였지만, 이와 같은 비는 필요에 따라 유효 효소 농도를 변화시키기 위하여 변경될 수 있다.
여기에서 제공되는 실험에서는, 공백(blank) 사료 매시(mash) (피타제 BP17 결핍)를 사용하여 상기와 같이 추출한 후, 정해진 양의 효소를 생성하기 위하여 여기에 정제된 피타제 BP17을 첨가하였다.
실시예 3
항체 포획 및 침전 기질 테스트 개발
침전 기질
활성 검정을 위하여, 기질을 확인하였다. 이 기질은 포스페이트 공여체 (2-포스포-L-아스코르브산 트리나트륨, AsAP), 반응 증진제 (페나진 메토술페이트, PMS) 및 반응성 종 (니트로블루 테트라졸륨 클로라이드, NBT)을 사용하는 일반적인 산 포스파타제 기질이다. 이들 화학물질 및 산 포스파타제의 존재하에서는, 가용성 테트라졸륨염이 환원되어 불용성인 침전물 (테트라졸륨염의 포르마잔 유도체)의 생성을 초래하게 된다. 니트로블루 테트라졸륨의 경우, 이는 청색/보라색 침전물의 형성으로 이어진다.
테스트 포맷 개발
프로젝트의 가능성 단계에서 수종의 포맷을 분석하였다.
유통 포맷
이 접근법은 '유통' 방법론을 이용한다. 표준 측방 유동 방법론과 달리, 유통 테스트는 특화된 니트로셀룰로스 (항-피타제 BP17 항체를 사용하여 스트립화)의 상부에 대한 직접적인 샘플의 적용을 포함하며, 샘플은 아래의 흡수제 패드에 의해 니트로셀룰로스를 통하여 전개된다. 샘플 적용 후, 동일한 방식으로 기질이 적용된 다음, 테스트가 현상된다 (도 11).
도 11은 유통 포맷의 개략적 도시이다. 도 11의 포맷은 매우 단순하며, 선명한 가시적 결과를 생성한다. 그러나, 일부 측면에 있어서는, 더욱 더 우수한 준-정량적 포맷을 갖는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 이와 같은 방식에서의 결과의 해석에 있어서 작업자를 용이하게 하기 위하여, 시험 완료 후 가시적인 테스트 선의 수가 샘플에 존재하는 효소의 수준을 표시하게 되는 다중 선 테스트 포맷을 제조하기로 결정하였다.
침지 스틱 포맷
이 포맷은 다중 선 접근법을 택한다. 먼저 증가하는 농도의 6개 선을 사용하여 니트로셀룰로스를 스트립화한 후, 전체 테스트 스틱을 사료 추출물 샘플에 담근다 (침지한다). 인큐베이션 후, 스틱을 물에서 세정한 다음, 기질 용액을 적용하고, 테스트를 현상시킨다 (도 12).
도 12는 침지 스틱 포맷의 개략적인 도시를 나타낸다. 이 포맷은 수행하기가 매우 용이하였으며, 테스트 스틱에 존재하는 흡수제 패드가 존재하지 않는다는 것이 한 가지 장점이었는데, 이는 샘플 테스트 후 스틱 조작이 필요하지 않음을 의미한다. 테스트가 기능하기는 하였으나, 더욱 더 우수한 준-정량적 결과가 요구되는 경우가 존재한다. 여기에서는, 시험되는 효소 - 피타제 BP17 -가 존재하는 경우, 투여량-의존성 가시적 강도에도 불구하고 모든 테스트 선이 가시적이었다. 이상적으로는, 낮은 수준의 피타제 BP17 샘플을 사용하여 시도하는 경우에는, 더 낮은 항-피타제 BP17 농도를 사용한 테스트 선은 출현하지 않게 되지만, 여기에서는 해당되지 않았다 (도 13).
도 13은 침지-스틱 포맷 테스트 결과를 나타낸다. 여기에서는, 항-피타제 BP17 4, 2, 1, 0.5, 0.25 및 0.125 mg/mL (사진상 우측에서 좌측으로)에서의 6개 테스트 선을 사용하여 니트로셀룰로스를 스트립화하였다. 테스트 스틱을 직접 사료 추출 튜브 (7 mL, 0-1.0 U/mL 피타제 BP17 포함)에 직접 첨가하고, 진탕하면서 20분 동안 인큐베이팅하였다. 다음에, 스틱을 제거하고, 밀리Q 워터에서 간단하게 세정한 후, 기질을 스틱에 첨가하였다. 테스트가 30분 동안 현상되도록 한 다음, 사진촬영하였다. 결과는 준-정량적인 것으로 보이지 않으며, 고도의 배경도 관찰되는 것으로 보였는데, 이는 샘플 중 피타제 BP17의 양에 비례하였다.
모세관흡수 스틱 포맷
여기에서는, 침지 스틱과 유사한 테스트 스틱을 사용하였으나, 테스트가 상이한 방식으로 전개되었다. 여기에서는, 전체 테스트 스틱을 담그기보다는 샘플을 모세관 작용에 의해 테스트 스틱을 따라 이동시켰다. 완료되고 나면, 동일한 방식으로 기질을 적용하고, 테스트 선 발현이 진행되도록 하였다 (도 14).
도 14는 모세관흡수 스틱 포맷의 개략적 도시를 나타낸다. 이와 같은 테스트 포맷은 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 샘플에 수직으로 전개되며, 샘플이 전개되고 나면, 스틱을 웰로부터 제거하여, 수평으로 위치시키고, 기질 첨가를 시행한다.
먼저 가변량의 항-피타제 BP17을 사용하는 다중 선 테스트를 사용하였는데, 샘플이 선을 만나는 순서가 테스트 개발에 중요한 것으로 나타났다. 샘플 중 피타제 BP17이 제1 테스트 선에 결합되고, 여전히 미결합 피타제 BP17이 존재하게 되는 경우, 그것이 제2 선으로 진행하게 되는 등인 것으로 보인다. 따라서, 제1 테스트 선이 고수준의 항-피타제 BP17 항체를 함유하고 있는 경우라면, 대부분의 샘플은 그 선에 결합하고, 이후의 선에 결합할 나머지가 적게 남을 수 있다. 반면, 만나는 제1 선이 저수준의 항체를 함유하고 있는 경우라면, 그 선은 빠르게 포화되고, 대부분의 피타제 BP17은 다음 테스트 선으로 계속 가게 될 수 있다 (도 15). 이는 바람직하게는 최저 수준의 항체가 배치 영역에 가장 가까워야 한다는 것을 나타낸다.
도 15는 모세관흡수 스틱 포맷 테스트 결과를 나타낸다. 여기에서는, 항-피타제 BP17 4, 1 및 0.25 mg/mL에서의 테스트 선을 사용하여 니트로셀룰로스를 스트립화하였다. 샘플을 피타제 BP17 0.2, 0.05, 0.012, 0.006 U/mL로 수중에 희석하였다. 단부를 용액에 접촉시키고 모세관 작용에 의해 용액이 스틱을 따라 상승 이동하도록 함으로써, 샘플을 NC에 모세관흡수시켰다. 2개 방향의 스틱을 시험하였다: 4에서 0.25 mg/mL까지, 및 0.25에서 4 mg/mL까지. 10분 후, 스틱을 기질 용액에 노출시키고, 30분 동안 현상시켰다. 테스트 선 농도의 방향은 테스트의 성공적인 전개에 상당한 영향을 주었다.
테스트 시스템을 단순화하기 위하여, 항-피타제 BP17 단일 농도의 다중 선을 사용한 실험을 시험하였다. 처음에는, 거의 대부분의 샘플 중 피타제 BP17이 제1 테스트 선에 결합하는 것으로 보였다. 그러나, 이와 같이 인지된 문제점은 샘플에 대한 차단 시약의 첨가에 의해 극복되었는데, 우유 단백질인 카세인이 최고의 결과를 나타내었다 (도 16).
도 16은 상이한 차단 시약들을 사용한 모세관흡수 스틱 포맷 테스트 결과를 나타낸다. 피타제 BP17 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025 U/mL, 및 공백 매시 추출물 (물 또는 카세인 중 어느 하나)인 0의 대조로 샘플을 제조하였다. 40 μL의 샘플을 함유하는 마이크로타이터 플레이트의 웰에 테스트 스틱을 위치시키고, 샘플을 스틱에 10분 동안 상향 모세관흡수시켰다. 스틱을 블롯팅하여 건조시키고, 편평하게 놓은 후, 40 μL의 기질 용액을 니트로셀룰로스상에 피펫팅하였다. 스틱을 30분 동안 현상시킨 다음, 사진촬영하였다 (실시예 6 참조).
도 17은 테스트 (모세관흡수 스틱 포맷)의 준-정량적 특성을 조정하기 위하여 테스트 선 농도를 변화시키는 것과 관련된 결과를 나타낸다. 결과는 테스트 선 항체의 농도가 테스트의 준-정량적 특성에 영향을 준다는 것을 나타내는데, 0.4-0.6 mg/mL의 농도가 요구되는 명확성에 최적이어서 샘플이 포획 수단을 가로질러 횡단할 수 있음을 나타내는 것으로 보였다.
더 상세하게 말하자면, 도 17은 모세관흡수 스틱 포맷을 사용하는 테스트의 준-정량적 특성을 조정하기 위하여 테스트 선 농도를 변화시키는 것의 결과를 나타낸다. 항-피타제 BP17 0.4, 0.6, 0.8 또는 1.0 mg/mL 중 어느 하나인 동일 농도의 3개 테스트 선을 사용하여 니트로셀룰로스를 스트립화하였다. 롤러 믹서에서 10분 동안 인큐베이팅된 10 mL의 50 mg/mL 카세인 용액 중에서 1 g의 매시를 사용하여 공백 매시 추출물을 제조하였다. 순수 피타제 BP17을 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125, 0.00625 및 0.003125 U/mL로 매시 추출물에 첨가하였다. 40 μL의 샘플을 마이크로타이터 플레이트의 웰에 피펫팅하고, 스틱을 삽입한 후, 샘플을 모세관 작용에 의해 10분 동안 스틱에 상향 이동시켰다. 스틱을 제거하여, 블롯팅하고, 40 μL의 기질 용액을 스틱상에 피펫팅한 후, 30분 동안 현상시켰다. 테스트 선 항체의 농도는 테스트의 준-정량적 특성에 영향을 주는데, 0.4-0.6 mg/mL의 농도가 요구되는 명확성에 최적인 것으로 보였다. 이러한 결과는 적정한 차단과 함께 테스트 선 농도를 변화시키는 것이 테스트의 준-정량적 특성을 조정하는 데에 사용될 수 있음을 보여준다.
침지-스틱 포맷에서와 마찬가지로, 모세관흡수 스틱 포맷의 장점은 테스트 스틱에 흡수제 패드가 존재하지 않음으로써, 작업자가 샘플 첨가-후 및 기질 첨가-전에 테스트 스틱을 조작할 필요가 없게 된다는 것이었다. 그러나, 일부 용도, 특히 기질 첨가 전에 스틱이 재-배향되어야 하게 되는 경우에서는 수직 포맷이 아주 바람직하지는 않을 수 있다.
이를 해소하기 위하여, 매우 유사한 재료들을 사용하여 수평 포맷을 개발하였는데, 유일한 첨가물은 테스트 스틱 니트로셀룰로스 부분 상류의 흡수제 샘플 패드이다. 이와 같은 접근법은 고품질의 결과를 생성함으로써, 포맷 2로는 가능하지 않게 되었을 추가적인 개발의 가능성을 열었다. 일부 경우에는, 차단제의 첨가가 필요할 수 있다. 일부 경우에는, 샘플 패드가 기질 첨가 전에 제거될 필요가 있을 수 있다.
실시예 4 - 테트라졸륨 기질
본 실시예에서는, 테트라졸륨 기질인 아이오도니트로테트라졸륨 클로라이드 (INT)를 시험하였다. 이 기질은 테스트 선에서 (NBT에서의 청색/보라색이 아닌) 적색의 침전물을 초래하였다.
도 18은 모세관흡수 스틱 테스트를 사용한 NBT와 INT 사이의 비교를 나타낸다. 롤러 믹서에서 10분 동안 인큐베이팅된 10 mL의 50 mg/mL 카세인 용액 중에서 1 g의 매시를 사용하여 공백 매시 추출물을 제조하였다. 순수 피타제 BP17을 0.4, 0.2, 0.1, 0.05, 0.025, 0.0125 및 0.00625 U/mL로 매시 추출물에 첨가하였다. 40 μL의 샘플을 마이크로타이터 플레이트의 웰에 피펫팅하고, 스틱을 삽입한 후, 샘플을 모세관 작용에 의해 10분 동안 스틱에 상향 이동시켰다. 아세테이트 완충제 중에서 4.45 mg/mL로 INT 용액을 제조하였는데, 이는 NBT 용액과 동일한 몰농도를 생성하는 것이다. 스틱을 제거하여, 블롯팅하고, 40 μL의 기질 용액을 스틱상에 피펫팅한 후, 1분 동안 인큐베이팅하였다. 다음에, 기질 용액을 제거하고, 스틱을 블롯팅한 후, 30분 동안 현상시켰다.
도 18에서 볼 수 있는 바와 같이, 결과는 기질로서 INT를 사용하는 것이 NBT와 유사한 결과를 생성한다는 것을 보여주었다. 이와 같은 점에서, NBT 및 INT 양자는 이후 호환가능하게 사용되었다.
실시예 5 - 니트로셀룰로스 유형
수평 포맷이 유망한 포맷으로 간주되었기 때문에, 이와 같은 포맷에 가장 적합한 것을 확인하기 위하여 광범위한 니트로셀룰로스 유형들을 시험하는 실험을 수행하였다 (도 19).
도 19는 가장 적합한 것을 확인하기 위하여 광범위한 니트로셀룰로스 유형들을 시험한 결과를 나타낸다. 다양한 니트로셀룰로스 유형들을 항-피타제 BP17 0.5 mg/mL의 3개 테스트 선으로 스트립화하였다. 공백 사료 매시 추출물 (물 10 mL 중 1 g)에 정제된 효소로부터 피타제 BP17 샘플을 희석하여, 0.2 및 0.04 U/mL의 피타제 BP17 (더하기 사료만의 0의 대조)을 생성시켰다. 추출물을 테스트 스틱의 샘플 패드상에 피펫팅하고, 모세관 작용에 의해 완료될 때까지 스틱을 따라 샘플을 이동시켰다. 샘플 패드를 제거하여, 40 μL의 기질을 적용하였다. 테스트를 20분까지 진행시킨 다음, 사진촬영하였다.
전기한 포맷을 사용한 전기 실험으로 확인하였을 때, 시험된 니트로셀룰로스 막들 중 1종, 즉 MDI 90 CNPH가 최고의 결과를 나타냄으로써 (도 19 참조), 사실상 선택 니트로셀룰로스가 되었다. 이 니트로셀룰로스는 용이하게 구입가능하다. 2종의 다른 니트로셀룰로스 유형 (MDI SS12 12μ 및 SS12 15μ) 역시 만족스러운 결과를 생성하였다. 시험된 모든 막들이 반응을 생성하였다.
실시예 6 - 차단 시약
지금까지 차단 시약 (예컨대 카세인)은 추출 후에 샘플에 첨가되었었다. 이는 이상적이지 않았던 것으로 판명되었는데, 그것이 용액이 최종 테스트에 공급되는 것을 필요로 하게 되며 작업자가 그것을 사료 추출물에 첨가하는 것을 필요로 하게 되기 때문이다. 이를 해소하기 위한 실험을 수행하였다. 카세인은 물에 용해시키기가 어려울 수 있다. 그러나, 카세인의 나트륨염은 이와 같은 면에서 더 우수한 것으로 밝혀졌다. 이는 사료 추출에 바로 정해진 양의 나트륨 카세인을 첨가할 가능성을 허용한다. 이와 같은 접근법은 실용적이다. 그러나, 일부 측면에 있어서는, 이와 같은 접근법이 더욱 더 최적화될 수 있는데, 그것이 정해진 양의 나트륨 카세인이 선적 및 튜브 개방에 따른 손실시 대체될 수 있는 샘플 추출 튜브에 공급되는 것을 필요로 하게 되기 때문이다. 따라서, 테스트 스틱 자체 내에 차단 반응을을 공급할 가능성을 시험하기로 결정하였다.
실험은 샘플 패드와 테스트 니트로셀룰로스 사이의 패드에 차단 시약을 건조시켜 위치시키도록 설계하였다.
도 20은 계면활성제 (트윈-20)의 존재하에 차단제인 카세인의 농도를 감소시키는 시험의 결과를 나타낸다. 폴리에스테르 접합체 패드를 다양한 농도의 카세인 용액으로 포화시키고, 37℃에서 건조시켰다. 다음에, 패드를 테스트 스틱의 '상류'에 (추가적인 샘플 패드와 함께) 위치시켰다. 물에서 공백 매시를 추출하고 (10 mL 중 1 g), 추출물에 정제된 효소를 희석하였다. 샘플을 샘플 패드상에 피펫팅한 다음, 카세인 함유 패드 및 테스트 스틱상으로 유통시켰다. 샘플 및 접합체 패드를 제거하여, 40 μL의 기질을 적용하였다. 테스트를 20분까지 진행시킨 다음, 사진촬영하였다. 계면활성제 단독의 존재로써 테스트가 만족스럽게 수행되는 것을 가능케 하기에 충분하다는 놀라운 결과가 관찰되었다. 따라서, 카세인이 없는 패드가 카세인을 포함하는 패드와 동일한 색상 강도를 나타내었다.
이와 같은 결과에 힘입어, 이 접근법 역시 만족스러운 결과를 생성하게 되는지 여부를 확인하기 위하여, 직접 테스트 니트로셀룰로스상에 차단 시약을 첨가하도록 실험을 설계하였다.
도 21은 만족스러운 결과가 수득될 수 있는지를 시험하기 위하여 테스트 니트로셀룰로스상에 직접 차단 시약을 첨가함으로써 수득된 결과를 나타낸다.
더 상세하게 말하자면, 도 21은 니트로셀룰로스에 직접 차단 시약을 첨가하는 실험의 결과를 도시한다. 일정 길이의 니트로셀룰로스를 다양한 카세인/트윈 용액 중에서 5분 동안 인큐베이팅한 다음, 55℃에서 10분 동안 건조하였다. 니트로셀룰로스를 미처리 샘플 패드 (접합체 패드는 없음)와 함께 지지 카드에 라미네이트화하였다. 미처리 NC 및 카세인/트윈 접합체 패드를 사용하는 일련의 대조 스틱들도 구성하였다. 공백 사료 매시 추출물 (물 10 mL 중 1 g)에 정제된 효소로부터 피타제 BP17 샘플을 희석하여, 0.2 및 0.04 U/mL의 피타제 BP17 (더하기 사료만의 0의 대조)을 생성시켰다. 추출물을 테스트 스틱의 샘플 패드상에 피펫팅하고, 모세관 작용에 의해 완료될 때까지 스틱을 따라 샘플을 이동시켰다. 샘플 및 접합체 패드를 제거하여, 40 μL의 기질을 적용하였다. 테스트를 20분까지 진행시킨 다음, 사진촬영하였다.
역시 카세인의 부재하에 계면활성제 단독인 경우가 뛰어난 결과를 생성하였다 (도 21).
이와 같은 방법의 감도를 시험하기 위하여, INT 및 NBT 기질 양자와 함께 계면활성제로만 차단된 NC를 사용하여, 피타제 BP17 농도의 일련의 희석물들을 시험하였다.
도 22는 이와 같은 방법의 감도를 시험하기 위하여 INT 및 NBT 기질 양자와 함께 계면활성제로만 차단된 NC를 사용하여 시험된 피타제 BP17 농도의 일련의 희석물들의 결과를 나타낸다. 스트립화된 니트로셀룰로스를 0.25% 트윈-20 용액 중에서 5분 동안 인큐베이팅한 다음, 55℃에서 10분 동안 건조하였다. 공백 사료 매시 추출물 (물 10 mL 중 1 g)에 정제된 효소로부터 피타제 BP17 샘플을 희석하여, 피타제 BP17 (더하기 사료만의 0의 대조) 0.4-0.0015 U/mL의 일련의 희석물을 생성시켰다.
더 상세하게 말하자면, 도 22는 본 실험의 결과를 나타낸다. 스트립화된 니트로셀룰로스를 0.25% 트윈-20 용액 중에서 5분 동안 인큐베이팅한 다음, 55℃에서 10분 동안 건조하였다. 공백 사료 매시 추출물 (물 10 mL 중 1 g)에 정제된 효소로부터 피타제 BP17 샘플을 희석하여, 피타제 BP17 (더하기 사료만의 0의 대조) 0.4-0.0015 U/mL의 일련의 희석물을 생성시켰다. 추출물을 테스트 스틱의 샘플 패드상에 피펫팅하고, 모세관 작용에 의해 완료될 때까지 스틱을 따라 샘플을 이동시켰다. 샘플 및 접합체 패드를 제거하여, 40 μL의 기질 (NBT 또는 INT 기재)을 적용하였다. 테스트를 20분까지 진행시킨 다음, 사진촬영하였다. 결과는 양 기질이 유사한 성능이었으며, 방법의 전체적인 감도 및 준-정량적 특성은 뛰어난 것으로 보인다는 것을 나타낸다.
계면활성제를 사용하여 니트로셀룰로스를 직접 차단하는 방법의 장점은 그것이 테스트 스틱상에 2차 '차단 패드'를 포함시킬 필요성을 제거함으로써 테스트 조립과 관련된 수준의 복잡성을 제거한다는 것이다. 또한, 테스트 자체에의 차단 시약의 포함은 작업자가 샘플 제조용의 빈 튜브에 사료 및 물을 첨가하는 것이 아닌 다른 어떠한 것을 할 필요성도 무효화한다.
제조되는 테스트 스틱은 모두 동일 농도인 항-피타제 BP17 항체의 3개 선으로 스트립화되어 있는 테스트 니트로셀룰로스를 포함하여 구성되며, 공백 미처리 샘플 패드에 부착된 수중 0.1% 트윈-20 용액을 사용하여 탈거 후 차단되는 매우 단순한 설계이다.
실시예 7 - 기질 전달 실험
상기에서 상술한 모든 실험들에서, 기질 용액은 사용 직전에 3종의 성분을 함께 (AsAP, PMS 및 테트라졸륨인 INT 또는 NBT) 혼합함으로써 첨가되었다. 작업자를 위해 이를 단순화하기 위하여, 이들 성분을 최종 테스트 포맷에 건조시키도록 시도하는 실험을 수행하였다. 이는 작업자가 기질 조성을 담당하지 않게 되며 액체 테스트 성분을 공급할 필요성을 무효화하게 됨을 의미하게 된다.
다양한 기질 성분들을 함께 혼합하여, 흡수제 패드를 포화시키는 데에 사용한 후 건조하고 37℃에서 저장하는 최초의 실험을 수행하고, 그 결과를 도 23에 나타내었다.
도 23은 함께 혼합된 다양한 기질 성분들을 건조하고 저장하는 시험에서 수득된 결과를 나타낸다. 1 cm2의 흡수제를 다양한 조합의 (사전혼합된) 기질에 5분 동안 침지시켰다. 패드를 블롯팅하여 건조하고, 37℃의 인큐베이터에 위치시켰다. 30분에, 패드가 건조된 것으로 보였는데, 여기를 '시간=0'으로 간주하였다. 규칙적인 시간 간격으로 패드를 모니터링하였는데, 특히 보라색-성향 (NBT) 또는 적색-성향 (INT)의 색상 변화를 탐색하였다. 시간 0 및 밤샘의 것을 나타내었다.
이와 같은 실험에서는, 1 cm2의 흡수제를 다양한 조합의 (사전혼합된) 기질에 5분 동안 침지시켰다. 패드를 블롯팅하여 건조하고, 37℃의 인큐베이터에 위치시켰다. 30분에, 패드가 건조된 것으로 보였는데, 여기를 '시간=0'으로 간주하였다. 규칙적인 시간 간격으로 패드를 모니터링하였는데, 특히 보라색-성향 (NBT) 또는 적색-성향 (INT)의 색상 변화를 탐색하였다. 시간 0 및 밤샘의 것을 도 23에 나타내었다. 밤샘 후, 더 유용한 조합은 하기인 것으로 보인다: NBT 또는 INT 그 자체; AsAP + PMS; PMS; AsAP + INT는 중간 정도 안정하며, AsAP + NBT보다는 더 안정한 것으로 보임.
이와 같은 실험으로 볼 때, 테트라졸륨 용액인 INT 또는 NBT 양자의 다른 테스트 성분 중 어느 것과의 혼합은 시간 경과에 따른 테트라졸륨의 궁극적인 침전을 초래하는 것이 분명하였다.
AsAP 및 PMS의 혼합 및 건조가 시간이 지나면서 안정해 보인다는 것 역시 입증되었다. 일부 기질 성분은 건조되어 있는 반면 다른 것들은 용액으로 사용되는 실험에서 하였던 것처럼, 이들 모든 건조 성분들을 이용하는 실험을 수행하였다. 검정법의 모든 성분들이 건조된 형태로 제공될 수 있다는 것이 가능한 것으로 보인다. 잠재적인 수성 샘플의 사용이 건조된 성분들을 재수화할 수 있었다.
따라서, 도 6 (건조 포맷 테스트의 예)에서, 사용자 (작업자)는 단순하게 샘플을 첨가하고, 테스트를 밝힌다. 이 도면에서, 2-포스포-L-아스코르브산 트리나트륨 = AsAP이며; 반응 증진제인 페나진 메토술페이트 = PMS이고; 니트로셀룰로스 매트릭스 = NC이며; 테트라졸륨 기질인 아이오도니트로테트라졸륨 클로라이드 = INT이다.
실시예 8 - 건조 포맷
어떠한 추가적인 첨가 또는 조작도 없이, 작업자는 단순히 테스트에 추출물을 첨가한 다음 결과를 해독하기만 하면 되도록, 모든 테스트 성분들을 테스트에 건조시키는 실험을 수행하였다. 여기에서, 모든 성분들이 건조 침착되어 있는 패드들은 테스트 시스템의 다양한 부분에 도입되게 된다. 이전에 나타내었던 바와 같이, 3종의 모든 성분들이 사전혼합되어 단일 패드로 건조될 수는 없으므로, 다양한 성분들이 분리될 수 있거나 적어도 안정한 조합을 이용하는 테스트 시스템이 확인되어야 하며, 테스트 내에서의 그의 다양한 위치 역시 그러하다. 그와 같은 테스트가 어떻게 시도되는지의 예를 도 6에서 볼 수 있다. 따라서, 도 6은 건조 포맷 테스트의 도식을 나타낸다.
도 6의 건조 포맷 테스트에서, 작업자는 단순히 샘플을 첨가하고 테스트를 밝힌다. 최종 테스트는 카세트화될 수 있으며, 도 6에 도시되어 있는 독특한 균형추는 필요치 않게 된다. 도시되어 있는 예에서, PMS/AsAP는 테스트 니트로셀룰로스에 건조되며, INT의 나일론 패드는 상부에 고정 위치된다. 샘플은 평소처럼 첨가되며, 기질 성분을 재수화시키는 것은 샘플 용액 자체이다.
실시예 9 - 준-건조 포맷
건조 포맷 (상기)의 대안으로써, 일부 성분들이 건조 형태로 공급되고 다른 것들은 용액으로 유지되는 실험을 수행하였다. 이것은 반-건조 포맷으로 지칭되는 테스트 시스템을 생성하였다.
반-건조 포맷에서, 샘플은 이전과 같이 수평한 스틱을 따라 전개되며, 완료되고 나면, 테스트의 니트로셀룰로스상에 직접 테트라졸륨 용액이 피펫팅된다. 다음에는, 그것을 건조된 AsAP/PMS를 함유하는 니트로셀룰로스 패드로 덮고, 테스트를 현상시킨다. 이에 대해서는 도 3 (반-건조 포맷과 관련된 단계)에 도시되어 있다.
이와 같은 포맷은 몇 가지 장점을 가진다. 작업자는 시험 전에 기질 시약을 제조할 필요가 없으며, 포맷이 테트라졸륨 용액이 제공되는 것을 필요로 하기는 하지만, 이는 그것을 '병으로부터 바로' 첨가하는 단순한 경우이다. 이 포맷에서 관찰되는 한 가지 장점은 흡수제 패드 제거의 요건이 배제되어 있다는 것이다. AsAP/PMS 패드의 존재가 침전물을 제자리에 고정함으로써, 샘플 패드의 존재하에서도 생성되는 침전물이 이동하지 않는 것으로 보인다.
반-건조 포맷과 이전의 (모두 용액인) 포맷 사이의 비교를 도 24에 나타내었다.
도 24는 반-건조 포맷과 모두 용액인 포맷 사이의 비교를 나타낸다. 공백 사료 매시 추출물 (물 10 mL 중 1 g)에 정제된 효소로부터 피타제 BP17 샘플을 희석하여, 피타제 BP17 (더하기 사료만의 0의 대조) 0.4-0.0015 U/mL의 일련의 희석물을 생성시켰다. 추출물을 테스트 스틱의 샘플 패드상에 피펫팅하고, 모세관 작용에 의해 완료될 때까지 스틱을 따라 샘플을 이동시켰다. 모두 용액인 포맷의 경우, 샘플 패드를 제거하여, 40 μL의 완전 기질을 적용하였다. 반-건조 포맷의 경우, 20 μL의 INT 용액을 테스트 니트로셀룰로스에 첨가하고, PMS/AsAP의 패드를 상부에 위치시켰다. 테스트를 20분까지 진행시킨 다음, 사진촬영하였다.
도 24 실험의 결과는 반-건조 방법의 감도가 테스트 명확성과 관련하여 허용가능하다는 것을 보여준다.
이와 같은 반-건조 포맷이 허용가능하기 위해서는, 테트라졸륨 용액이 최종 테스트의 제안되어 있는 저장 기간 동안 안정하게 유지되는 것이 중요하다. 이를 해소하기 위한 실험을 개시하였다. 그와 같은 실험의 결과를 도 25에 나타내었다.
도 25의 실험에서는, 공백 사료 매시 추출물 (물 10 mL 중 1 g)에 정제된 효소로부터 피타제 BP17 샘플을 희석하여, 0.2 및 0.04 U/mL의 피타제 BP17을 생성시켰다. INT는 용해시키기 위하여 60℃로 가열된 50% 메탄올, 0.125 M 아세테이트 완충제 중에서 40 mg/mL로 제조하였다. 이와 같은 모 용액을 0.25 M 아세테이트 완충제에 10 mg/mL로 희석하였다. 분취량들을 -20℃로 냉동하여, 실온에서, 그리고 55℃에서 저장하였다. 40 μL의 각 추출물을 테스트 스틱의 샘플 패드상에 피펫팅하고, 모세관 작용에 의해 완료될 때까지 스틱을 따라 샘플을 이동시켰다. 테스트는 3반복으로 수행하였다. 20 μL의 INT 용액을 테스트 NC상에 피펫팅하고, PMS/AsAP NC의 스트립을 상부에 위치시켰다. 테스트를 20분까지 진행시킨 다음, 사진촬영하였다. 새로 제조된 INT 용액을 사용하여 즉시 '시간 = 0' 테스트를 수행하여, 기준선 신호를 생성시켰다. 14일 후, 냉동, RT 및 55℃를 시각적으로 비교하여 INT 용액 안정성의 진행 비교를 생성시켰다. 14일 후, RT 또는 55℃에서 INT 용액의 악화는 관찰되지 않았다. -20℃ 테스트에서는 신호가 다른 온도 미만이었는데, 저장 및 해빙 동안의 일부 INT 침전으로 인한 것으로 여겨진다.
2주 후 모든 온도에서 활성의 차이가 발견되지 않았기 때문에, 이는 테트라졸륨 용액이 시간 경과에 따른 우수한 안정성을 가지고 있음을 암시한다 (도 25).
실시예 10 - 키트
도 29는 본 발명의 장치/키트/검정법의 사용에 대해 도시한다.
도 29의 패널 1에서는, 수집 백에 표시되어 있는 제1 선까지 샘플을 충진한 다음, 표시되어 있는 제2 선까지 백에 물을 충진한다.
패널 2에서는, 백을 밀봉한 다음, 샘플이 분해될 때까지 흔든다.
패널 3에서는, 하우징 (도 1에 도시되어 있는 실시양태 1에서와 같음)을 책처럼 연다.
패널 4에서는, 백으로부터 샘플 추출물 중 일부를 피펫에 충진하고, 그것을 하우징상 배치 영역에 적용한다.
패널 5에서, 사용자는 액체가 스틱의 상부로 이동될 때까지 기다린다. 이는 색상 변화로 표시될 수 있다.
패널 6에서는, 선택적 표시 수단의 1종 이상의 구성요소가 장치에 첨가된다.
패널 7에서는, 하우징을 닫고 밀봉한다.
패널 8에서는, 하우징을 편평한 표면에 놓고 현상시킨다.
패널 9에, 1개, 2개 및 3개 선의 결과가 보인다.
비교 실시예
포맷 2 - 금 접합체 항체 샌드위치
도 5에 도시되어 있는 금 접합체 항체 샌드위치는 고수준 및 저수준의 피타제 BP17 활성을 함유하는 사료 샘플들 사이를 구분한다. 이 테스트에서 생성되는 신호 강도는 유리 항-피타제 BP17 항체의 포함에 의해 감쇠될 수 있는데, 그 농도가 테스트의 선형 반응을 원하는 피타제 BP17 활성 범위로 이동시킬 수 있는 것으로 나타났다.
그러나, 이 방법론에서는, 사용되는 폴리클로날 항-피타제 BP17 토끼 혈청이 자연 및 변성 효소 모두와 반응한다.
또한, 금 샌드위치 검정 작업에는, 불활성 샘플이 실제로는 효소가 고갈되었던 것이며 불활성화 절차가 단순 불활성화라기보다는 효소를 파괴했던 것이라는 의혹이 존재한다.
이를 해소하기 위하여, 샘플의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅을 수행하였는데, 여기에서 이와 같은 이론이 옳았으며 불활성 샘플에서 사실상 효소가 고갈되어 있는 것으로 나타났다 (도 9).
도 9는 사료 샘플 및 정제된 피타제 BP17의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 관한 것이다. 결과는 "시험 5" 펠렛이 매시에 비해 매우 적은 검출가능한 피타제 BP17을 가지고 있으며, 불활성인 피타제 BP17이 (재료의 일반적인 스미어(smear)는 웨스턴 블롯에서 관찰되기는 하지만) 구별가능한 피타제 BP17 밴드를 가지지 않는다는 것을 나타내었다. 정제된 피타제 BP17 및 활성 피타제 BP17 (선 9 및 10)은 단백질 염색에서는 하나의 강한 밴드를 생성하였으나 웨스턴 블롯에서는 다수의 밴드를 생성한 바, 피타제 BP17 다량체 및 분해 생성물의 바탕 수준으로 인한 것일 가능성이 있는데, 이중 어느 것도 열-불활성화 샘플 (선 8)에서는 발견되지 않았다.
약간 더 상세하게 말하자면, 도 9는 사료 샘플 및 정제된 피타제 BP17의 SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅 결과를 나타낸다. 활성 및 불활성 피타제 BP17 샘플을 미세농축기를 사용하여 30-배 농축하였다. "시험 5"의 펠렛 및 매시를 사용하였는데, 그것이 매시에는 고수준의 피타제 BP17을, 처리된 펠렛에는 무시할만한 양을 가지고 있는 것으로 나타났기 때문이다. 사료 펠렛 및 매시를 밀리Q 워터 중에서 10분 동안 추출한 후, 생성 추출을 SDS-PAGE상에서 전개시켰다. 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 전달한 후, 폰소(Ponceau) S를 사용하여 전체 단백질을 염색하였다 (좌측 패널). 블롯을 항-피타제 BP17 항혈청 일차 항체를 사용한 후, 이어서 바이오티닐화 염소-항-토끼 이차 항체를 사용하여 탐색하고, 스트렙타비딘-Q도트 625 접합체 (인비트로겐(Invitrogen) 사)로 가시화하였다. 결과는 "시험 5" 펠렛이 매시에 비해 매우 적은 검출가능한 피타제 BP17을 가지고 있으며, 불활성인 피타제 BP17이 (재료의 일반적인 스미어는 웨스턴 블롯에서 관찰되기는 하지만) 구별가능한 피타제 BP17 밴드를 가지지 않는다는 것을 나타내었다. 정제된 피타제 BP17 및 활성 피타제 BP17은 단백질 염색에서는 하나의 강한 밴드를 생성하였으나 웨스턴 블롯에서는 다수의 밴드를 생성한 바, 피타제 BP17 다량체 및 분해 생성물의 바탕 수준으로 인한 것일 가능성이 있는데, 이중 어느 것도 불활성 샘플에서는 발견되지 않았다.
이와 같은 발견은 주어진 샘플에서 활성 효소의 수준을 측정함에 있어서의 금 검정법의 유효성을 의심하게 한다. 실험적으로 낮은 처리-후 피타제 BP17 활성을 갖는 불활성화된 피타제 BP17 및 사료가 기계적으로 유사하게 될 것처럼 (즉 모든 경우에서 피타제 BP17이 파괴된 것으로) 보이지만, 금 기반의 검정법은 피타제 BP17 불활성화가 파괴가 아닌 변성을 통하여 이루어진 상황은 검출할 수 없게 된다.
이를 시험하기 위하여, 특이적 피타제 BP17 억제제인 미오이노시톨 헥사술페이트 (MIHS)를 사용하여 효소를 파괴하지 않고 피타제 BP17 활성을 억제하였다. 여기에서, 금 검정법은 여전히 억제된 효소의 존재를 검출할 수 있었던 반면, 활성 검정법은 크게 감소된 신호를 나타내었다 (도 10).
도 10은 피타제 BP17 특이적 억제제 MIHS를 사용한 금 샌드위치 포맷 (포맷 2) 및 침전 기질 효소 활성 포맷 (포맷 1 - 즉 본 발명의 검정법)의 비교를 나타낸다.
금 샌드위치 테스트의 결과는 도 10에 - 상부에 - 나타내었다. 여기에서는, 75 mM의 글리신-HCl 완충제 pH 2.5 중에서 2.5 mM의 MIHS를 포함하거나 포함하지 않는 다양한 농도의 정제된 피타제 BP17을 제조하고, 시험 전에 20분 동안 인큐베이팅시켰다. 금 테스트는 100 μL의 샘플에 대하여 전개되었다.
비교로써, 침전 기질 테스트도 도 10에 - 저부에 - 나타내었다. 침전 기질 테스트는 다양한 농도의 샘플 40 μL에 대하여 전개되었다. 75 mM 글리신 완충제 중 40 μL의 2.5 mM MIHS (또는 완충제만의 대조)를 테스트 스틱에 적용하고, 15분 동안 인큐베이팅하였다. 다음에, 용액을 제거하고, 기질 용액 (2% 트윈-20 중 AsAP, PMS, 니트로블루 테트라졸륨 클로라이드 (NBT))을 첨가하였다. 이것을 1분 동안 인큐베이팅하여, 제거한 후, 스틱을 현상시켰다. 20분 후에, 테스트를 사진촬영하였다. 결과는 금 테스트가 억제되었는지 아닌지에 관계없이 피타제 BP17을 검출하는 반면, 침전 기질 테스트는 명백하게 활성 효소만을 검출한다는 것을 암시한다.
피타제 BP17 특이적 억제제 MIHS (효소를 파괴하지 않고 피타제 BP17 활성을 억제함)를 사용하는 금 샌드위치 포맷과 침전 기질 효소 활성 포맷의 비교인 도 10으로 볼 때, 금 검정법 (상부)은 여전히 억제된 효소의 존재를 검출할 수 있었던 반면 활성 검정법 (저부)은 크게 감소된 신호를 나타내었음을 알 수 있다.
따라서, 금 접합체 항체 샌드위치 포맷 (도 5)은 효소의 존재를 검출할 뿐, 그의 활성은 검출하지 않는다. 이와 같은 형태의 검정법에서는, 특이적 억제제를 사용한 피타제 BP17의 기능적 불활성화가 여전히 양성의 결과를 생성하였다.
이러한 결과는 단순히 아직 그것이 존재하기 때문에 효소가 활성이라는 가정에 의존하기보다는, 피타제 BP17과 같은 효소의 활성이 직접적으로 측정될 수 있는 검정법에 대한 필요성을 분명하게 입증하고 있다. 본 발명의 검정 장치는 그와 같은 필요성을 충족한다.
WO2005/014847호 및 WO2007/001895호는 금 테스트와 동일한 원리에 기초한 검정법에 대해 기술하고 있다. 주장하는 바에 의하면, 상기 검정법은 기술되어 있는 ELISA 키트를 사용하여 열-처리된 사료의 측정에 의해 활성 피타제만을 검출한다. 이는 맞지 않을 수 있는데, 피타제가 파괴되어, 샘플 제조시 사료 매트릭스와 함께 제거되기 때문이다. 따라서, 상기 키트는 실제로는 존재하는 활성 피타제와 존재하는 비-활성 피타제 사이를 구별할 수 없을 수 있다.
부분 2
본 실험에서는, 본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 샘플 중 활성 크실라나제를 검출하기 위한 검출 방법론에 대한 세부사항을 제공한다.
실시예 i
본 실시예에서 사용되는 방법론은 환원당 방법론에 기초한 검출 시스템이다. 이와 관련하여, 문헌 [Chong et al "Determination of reducing sugars in the nanomole range with tetrazolium blue" (Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 11 (1985) 109-115)]에 기술되어 있는 방법론을 수정하였다. 상기 방법론 (플레이트 검정법임)에서는, NaOH 중에서 테트라졸륨 블루 클로라이드 및 칼륨 나트륨 타르트레이트와 함께 당 샘플을 가열 (95℃로 3분 동안 또는 55℃로 1시간 동안)함으로써 환원당 (예컨대 크실로스)을 검출한다.
본 발명의 장치 및 방법을 사용하여 샘플 중 활성 크실라나제를 검출하기 위한 본 발명의 방법론에서는, 테트라졸륨 블루 클로라이드를 니트로블루 테트라졸륨 클로라이드로 치환하는 것에 의한 실온에서의 인큐베이션에 의해, 크실란 기질에 대한 크실라나제의 효소 활성에 의한 환원당 (예컨대 크실로스)의 생성을 검출한다. 니트로블루 테트라졸륨 클로라이드는 부분 1 (상기)에서 기술된 피타제 방법론에서 사용되는 것과 동일한 기질 족의 것이다.
데이터는 도 26에 나타내었다. 이와 관련하여:
상부 열 (도 26), 좌측에서 우측으로:
순수 크실로스 (5 μL의 1% 용액)에 후속하는 2배 희석물들 (0.5-0.0001% 크실로스) 및 최우측의 0의 대조.
저부 열 (도 26), 좌측에서 우측으로:
첫 번째 웰에서의 5 μL의 10 U/mL 크실라나제를 함유하는 크실라나제 검정, 후속하는 효소의 2배 희석물들 (5-0.001 U/mL의 크실라나제) 및 최우측의 0의 대조. 각 웰 역시 아세테이트 완충제 (0.25 M, pH 4.5) 중에 5 μL의 1% 크실란 (기질)을 함유하고 있음. 각 웰에서 크실라나제와 크실란을 함께 혼합한 후, 플레이트를 37℃에서 60분 동안 인큐베이팅함으로써 효소를 그의 기질과 반응시켰음.
본 발명의 방법론에서는, 200 μL의 '현상 용액'을 각 웰에 첨가하고, 플레이트를 55℃에서 1시간 동안 놓아둔 다음, 사진촬영하였다. 상기 현상 용액은 1 mg/mL의 테트라졸륨 블루, 0.5 M의 칼륨 나트륨 타르트레이트 및 0.05 M의 NaOH를 함유한다.
본 발명의 환원당 방법론은 5 μL의 0.031% 크실로스 (상부 열, 좌측으로부터 웰 6), 및 효소 검정에서의 대략 5 μL의 0.1 U/mL 크실라나제 (저부 열, 좌측으로부터 웰 7)를 검출한다.
실시예 ii
본 실시예에서 사용되는 방법론 역시 환원당 방법론을 기초로 하는 검출 시스템이다. 본 실시예에서 사용되는 방법론은 - 테트라졸륨 블루가 니트로블루 테트라졸륨으로 치환되고 반응을 실온에서 60분 동안 전개시켰다는 것 이외에는 - 상기 실시예 i의 상부 열 (크실로스 1-0.0001%)에서의 것과 동일하다. 데이터는 도 27에 나타내었다.
실시예 iii
실시예 i 또는 실시예 ii에 기술되어 있는 방법론은 샘플 중 활성 크실라나제를 검출하기 위하여 본 발명에 따른 검정 장치 또는 방법에서 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 크실라나제 검출 방법론은 부분 1 (상기)에 기술되어 있는 것과 유사한 속성 테스트에 도입된다.
따라서, 상기에서 언급된 피타제 테스트와 유사한 방식으로, 복합 사료 추출물로부터의 크실라나제가 원하는 크실라나제 또는 적합한 크실라나제에 대하여 발생된 항체상에 포획된다. 방법론에서, 크실라나제 효소는 크실란 기질에 노출되며, 결과적으로 생성되는 크실로스는 예를 들어 테트라졸륨 환원당 검정법에 의해 검출된다. 도 28은 이와 같은 방법론의 개략도를 나타낸다.
상기 명세서에서 언급된 모든 문헌들은 본원에 참조로써 개재된다. 당업계 숙련자라면, 본 발명의 영역 및 기술사상에서 벗어나지 않고도, 기술된 본 발명 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변종들이 떠오르게 될 것이다. 본 발명이 구체적인 바람직한 실시양태와 연계되어 기술되기는 하였지만, 청구되는 바와 같은 본 발명이 그와 같은 구체적인 실시양태로 과도하게 제한되어서는 아니 된다는 것이 이해되어야 한다. 실제로, 생화학 또는 관련 분야의 숙련자에게는 자명한 본 발명을 수행하기 위한 기술된 양식들의 다양한 변형들은 하기하는 청구범위의 영역에 속하는 것으로 하고자 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Danisco A/S <120> ASSAY <130> P043539PCT <150> 11184930.3 <151> 2011-10-12 <150> GB 1111634.0 <151> 2011-07-07 <150> GB 1117309.3 <151> 2011-10-07 <150> US 61/545237 <151> 2011-10-10 <160> 4 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 413 <212> PRT <213> Buttiauxella sp. <400> 1 Asn Asp Thr Pro Ala Ser Gly Tyr Gln Val Glu Lys Val Val Ile Leu 1 5 10 15 Ser Arg His Gly Val Arg Ala Pro Thr Lys Met Thr Gln Thr Met Arg 20 25 30 Asp Val Thr Pro Asn Thr Trp Pro Glu Trp Pro Val Lys Leu Gly Tyr 35 40 45 Ile Thr Pro Arg Gly Glu His Leu Ile Ser Leu Met Gly Gly Phe Tyr 50 55 60 Arg Gln Lys Phe Gln Gln Gln Gly Ile Leu Ser Gln Gly Ser Cys Pro 65 70 75 80 Thr Pro Asn Ser Ile Tyr Val Trp Thr Asp Val Ala Gln Arg Thr Leu 85 90 95 Lys Thr Gly Glu Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Pro Gln Cys Gly Leu 100 105 110 Thr Ile His His Gln Gln Asn Leu Glu Lys Ala Asp Pro Leu Phe His 115 120 125 Pro Val Lys Ala Gly Ile Cys Ser Met Asp Lys Thr Gln Val Gln Gln 130 135 140 Ala Val Glu Lys Glu Ala Gln 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Claims (86)

  1. (a) 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역 (10);
    (b) 샘플이 상기 배치 영역 (10)에 존재하는 (예컨대 배치되는) 경우 매트릭스 (20)를 따라 이동할 수 있도록 상기 배치 영역 (10)에 작동가능하게 연결된 매트릭스 (20);
    (c) 각 별개의 포획 위치 (30)가 배치 영역 (10)으로부터 이격되어 있으며, 샘플이 상기 별개의 포획 위치 (30)를 가로질러 이동할 수 있는, 상기 매트릭스 (20) 상의 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30);
    (d) 각 별개의 포획 위치 (30)에 존재하거나 그것을 한정하며, 활성 효소 샘플의 적어도 일부분이 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30)에서 유지되도록 상기 효소에 결합할 수 있는 포획 수단 (40); 및
    (e) 상기 포획 수단에 결합된 활성 효소의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 선택적 표시 수단 (50) 또는 적어도 그의 구성요소
    를 포함하는, 샘플 중 활성 효소를 검출하기 위한 검정 장치 (1).
  2. 제1항에 있어서, 상기 배치 영역 (10)이 흡수제 패드인 검정 장치 (1).
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 배치 영역 (10)이 상기 매트릭스 (20)의 한쪽 단부에 존재하는 것인 검정 장치 (1).
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 다수의 별개의 포획 위치들 (30)을 포함하는 검정 장치 (1).
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 2개를 초과하는 별개의 포획 위치들 (30)을 포함하는 검정 장치 (1).
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 3개의 별개의 포획 위치들 (30)을 포함하는 검정 장치 (1).
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서, 각 별개의 포획 위치에서의 포획 수단 (40)의 양이 상이하거나 동일한 것인 검정 장치 (1).
  8. 제7항에 있어서, 배치 영역 (10)으로부터 각 별개의 포획 위치 (30)가 더 멀어질수록 각 별개의 포획 위치 (30)에서의 포획 수단 (40)의 양이 증가하거나 감소하는 것인 검정 장치 (1).
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 차단 시약을 포함하는 검정 장치.
  10. 제9항에 있어서, 상기 차단 시약이 직접 결합되어 있는 검정 장치 (1).
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, 상기 차단 시약이 계면활성제이거나, 계면활성제를 포함하는 것인 검정 장치 (1).
  12. 제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 차단 시약이 계면활성제인 검정 장치 (1).
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 상기 차단 시약이 트윈(Tween)인 검정 장치 (1).
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스 (20)가 흡수제 재료인 검정 장치 (1).
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 매트릭스 (20)가 니트로셀룰로스이거나, 니트로셀룰로스를 포함하는 것인 검정 장치 (1).
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택적 표시 수단 (50)이 침전 반응을 포함하는 것인 검정 장치 (1).
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택적 표시 수단 (50)이 가시적인 색상 변화를 포함하거나 제공하는 것인 검정 장치 (1).
  18. 제17항에 있어서, 상기 색상 변화가 반응성 종과 반응하는 모이어티를 형성하는 효소 기질의 반응에 의해 야기되는 것인 검정 장치 (1).
  19. 제18항에 있어서, 상기 기질이 상기 매트릭스 (20)에 결합되어 있는 것인 검정 장치 (1).
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 상기 기질이 포스페이트 공여체를 사용하는/갖는 포스파타제 기질인 검정 장치 (1).
  21. 제20항에 있어서, 상기 포스파타제 기질이 2-포스포-L-아스코르브산 트리나트륨 (AsAP)인 검정 장치 (1).
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응성 종이 테트라졸륨 화합물인 검정 장치 (1).
  23. 제22항에 있어서, 상기 반응성 종이 니트로블루 테트라졸륨 화합물인 검정 장치 (1).
  24. 제23항에 있어서, 상기 반응성 종이 니트로블루 테트라졸륨 클로라이드 (NBT)인 검정 장치 (1).
  25. 제22항에 있어서, 상기 반응성 종이 할로니트로테트라졸륨 화합물인 검정 장치 (1).
  26. 제25항에 있어서, 상기 반응성 종이 아이오도니트로테트라졸륨 화합물인 검정 장치 (1).
  27. 제26항에 있어서, 상기 반응성 종이 아이오도니트로테트라졸륨 클로라이드 (INT)인 검정 장치 (1).
  28. 제18항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포스파타제 기질이 반응 증진제의 존재하에 상기 반응성 종과 반응하는 것인 검정 장치 (1).
  29. 제28항에 있어서, 상기 반응 증진제가 제2 매트릭스에 결합되어 있는 것인 검정 장치 (1).
  30. 제28항 또는 제29항에 있어서, 상기 반응 증진제가 페나진 화합물인 검정 장치 (1).
  31. 제28항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 증진제가 메토술페이트 화합물인 검정 장치 (1).
  32. 제28항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응 증진제가 페나진 메토술페이트 (PMS)인 검정 장치 (1).
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 수단들 (40)이 동일한 것인 검정 장치 (1).
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 포획 수단 (40)이 항체인 검정 장치 (1).
  35. 제34항에 있어서, 상기 항체가 상기 효소 또는 그의 구성요소 (예컨대 그의 단편 및/또는 그의 에피토프)에 대하여 발생된 항체인 검정 장치 (1).
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 상기 항체가 폴리클로날 또는 모노클로날 항체인 검정 장치 (1).
  37. 제1항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 수성 샘플인 검정 장치 (1).
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 사료 또는 사료 첨가제로부터 유래되는 것인 검정 장치 (1).
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 사료 또는 사료 첨가제로부터의 추출물인 검정 장치 (1).
  40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 샘플이 사료 펠렛으로부터의 추출물인 검정 장치 (1).
  41. 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소가 산 포스파타제인 검정 장치 (1).
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소가 피타제인 검정 장치 (1).
  43. 제42항에 있어서, 상기 피타제가 6-피타제, 예컨대 피타제 BP17인 검정 장치 (1).
  44. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 효소가 크실라나제인 검정 장치 (1).
  45. 제1항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이동이 종방향인 검정 장치 (1).
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 위치 (30)가 샘플의 이동 흐름에 수직인 검정 장치 (1).
  47. 제1항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 스트립 또는 스틱인 검정 장치.
  48. 제1항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 덮개를 포함하는 검정 장치.
  49. 제48항에 있어서, 상기 덮개가 2개의 부문을 한정하는 장치의 접힘에 의해 형성되는 것인 검정 장치.
  50. 제49항에 있어서, 장치 구성요소 (a) 내지 (e)의 일부 또는 모두가 한 부문에 존재하고, 장치 구성요소 (a) 내지 (e)의 일부 또는 모두가 다른 부문에 존재하는 것인 검정 장치.
  51. 제49항 또는 제50항에 있어서, 선택적 표시 수단 (e) 또는 적어도 그의 구성요소가 한 부문에 존재하고, 장치 구성요소 (a) 내지 (d)의 일부 또는 모두가 동일한 부문 또는 다른 부문에 존재하는 것인 검정 장치.
  52. 제49항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적 표시 수단 (e) 또는 적어도 그의 구성요소가 한 부문에 존재하고, 장치 구성요소 (a) 내지 (d)가 동일한 부문 또는 다른 부문에 존재하는 것인 검정 장치.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 선택적 표시 수단 (e) 또는 적어도 그의 구성요소가 덮개 내에 또는 덮개 상에 존재하는 것인 검정 장치.
  54. 사료 또는 사료 첨가제 중 활성 피타제의 수준을 적어도 준-정량적으로 평가하기 위한 검정 장치 (1).
  55. 사료 또는 사료 첨가제 중 활성 크실라나제의 수준을 적어도 준-정량적으로 평가하기 위한 검정 장치 (1).
  56. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 검정 장치 (1)의 배치 영역 (10)에 샘플이 배치되고, 상기 장치의 선택적 표시 수단 (50)은 활성 효소가 존재하는지를 표시하는 것인, 샘플 중 활성 효소의 존재를 측정하는 방법.
  57. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 검정 장치 (1)의 배치 영역 (10)에 샘플이 배치되고, 상기 장치의 선택적 표시 수단 (50)은 존재하는 활성 효소의 양을 준-정량적으로 표시하는 것인, 샘플 중 활성 효소 수준을 측정하는 방법.
  58. 제56항 또는 제57항에 있어서, 샘플이 식품 또는 사료로부터 수득되는 것인 방법.
  59. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 검출될 활성 효소가 피타제인 방법.
  60. 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 검출될 활성 효소가 크실라나제인 방법.
  61. 제56항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적인 효소가 식품 또는 사료에 첨가될 필요가 있는지를 결정하는 데에 사용되는 방법.
  62. 제56항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 추가적인 피타제가 식품 또는 사료에 첨가될 필요가 있는지를 결정하는 데에 사용되는 방법.
  63. 제56항 내지 제62항 중 어느 한 항에 있어서, 품질 제어의 형태로 사용되는 방법.
  64. 제1항 내지 제55항 중 어느 한 항에 따른 검정 장치 (1)를 포함하거나 형성할 수 있는 키트.
  65. 제64항에 있어서, 액체 또는 수성 샘플의 첨가에 의해 재구성되는 건조 시약을 포함하는 키트.
  66. 제64항 또는 제65항에 있어서, 작업자에 의해 첨가될 1종 이상의 액체 시약을 추가로 포함하는 키트.
  67. 제66항에 있어서, 액체 시약이 테트라졸륨 용액인 키트.
  68. a) 샘플의 적어도 일부분을 포획 수단과 접촉시킴으로써, 상기 포획 수단에 의해 효소를 포획하는 단계;
    b) 포획된 효소에 대하여 적합한 기질을 제공하며, 상기 기질은 상기 포획된 효소와 반응하여 효소 생성물을 생성하는 것인 단계;
    c) 효소 생성물과 반응할 수 있는 반응성 종을 제공하며, 상기 반응성 종은 상기 효소 생성물과 반응하여 불용성 생성물을 생성하는 것인 단계; 및
    d) 단계 c)에서 수득된 불용성 생성물을 검출하며, 상기 검출은 상기 샘플 중 활성 효소의 존재 및/또는 양과 상관되는 것인 단계
    를 포함하는, 샘플 중 활성 효소의 존재를 측정하는 방법.
  69. 제68항에 있어서, 상기 효소가 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 정의된 효소인 방법.
  70. 제68항 또는 제69항에 있어서, 상기 샘플이 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 정의된 샘플인 방법.
  71. 제68항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 수단이 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 정의된 포획 수단인 방법.
  72. 제68항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응성 종이 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 정의된 반응성 종인 방법.
  73. 제68항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 제1항 내지 제67항 중 어느 한 항에 정의된 장치를 사용하는 방법.
  74. (a) 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역 (10);
    (b) 샘플이 상기 배치 영역 (10)에 존재하는 (예컨대 배치되는) 경우 매트릭스 (20)를 따라 이동할 수 있도록 상기 배치 영역 (10)에 작동가능하게 연결된 매트릭스 (20);
    (c) 각 별개의 포획 위치 (30)가 배치 영역 (10)으로부터 이격되어 있으며, 샘플이 상기 별개의 포획 위치 (30)를 가로질러 이동할 수 있는, 상기 매트릭스 (20) 상의 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30);
    (d) 각 별개의 포획 위치 (30)에 존재하거나 그것을 한정하며, 활성 피타제 샘플의 적어도 일부분이 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30)에서 유지되도록 상기 피타제에 결합할 수 있는 포획 수단 (40); 및
    (e) 상기 포획 수단에 결합된 활성 피타제의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 선택적 표시 수단 (50) 또는 적어도 그의 구성요소
    를 포함하는, 샘플 중 활성 피타제를 검출하기 위한 검정 장치 (1) 또는 그의 사용 방법 또는 그의 용도.
  75. (a) 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역 (10);
    (b) 샘플이 상기 배치 영역 (10)에 존재하는 (예컨대 배치되는) 경우 매트릭스 (20)를 따라 이동할 수 있도록 상기 배치 영역 (10)에 작동가능하게 연결된 매트릭스 (20);
    (c) 각 별개의 포획 위치 (30)가 배치 영역 (10)으로부터 이격되어 있으며, 샘플이 상기 별개의 포획 위치 (30)를 가로질러 이동할 수 있는, 상기 매트릭스 (20) 상의 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30);
    (d) 각 별개의 포획 위치 (30)에 존재하거나 그것을 한정하며, 활성 피타제 플의 적어도 일부분이 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30)에서 유지되도록 상기 피타제에 결합할 수 있으며, 항체를 포함하는 포획 수단 (40); 및
    (e) 상기 포획 수단에 결합된 활성 피타제의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 선택적 표시 수단 (50) 또는 적어도 그의 구성요소
    를 포함하는, 샘플 중 활성 피타제를 검출하기 위한 검정 장치 (1) 또는 그의 사용 방법 또는 그의 용도.
  76. (a) 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역 (10);
    (b) 샘플이 상기 배치 영역 (10)에 존재하는 (예컨대 배치되는) 경우 매트릭스 (20)를 따라 이동할 수 있도록 상기 배치 영역 (10)에 작동가능하게 연결된 매트릭스 (20);
    (c) 각 별개의 포획 위치 (30)가 배치 영역 (10)으로부터 이격되어 있으며, 샘플이 상기 별개의 포획 위치 (30)를 가로질러 이동할 수 있는, 상기 매트릭스 (20) 상의 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30);
    (d) 각 별개의 포획 위치 (30)에 존재하거나 그것을 한정하며, 활성 피타제 샘플의 적어도 일부분이 하나 이상의 별개의 포획 위치 (30)에서 유지되도록 상기 피타제에 결합할 수 있으며, BP17에 결합할 수 있는 항체를 포함하는 포획 수단 (40); 및
    (e) 상기 포획 수단에 결합된 활성 피타제의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 선택적 표시 수단 (50) 또는 적어도 그의 구성요소
    를 포함하는, 샘플 중 활성 피타제를 검출하기 위한 검정 장치 (1) 또는 그의 사용 방법 또는 그의 용도.
  77. (a) 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역;
    (b) 샘플이 상기 배치 영역에 존재하는 (예컨대 배치되는) 경우 매트릭스를 따라 이동할 수 있도록 상기 배치 영역에 작동가능하게 연결된 매트릭스;
    (c) 각 별개의 포획 위치가 배치 영역으로부터 이격되어 있으며, 샘플이 상기 별개의 포획 위치를 가로질러 이동할 수 있는, 상기 매트릭스 상의 하나 이상의 별개의 포획 위치;
    (d) 각 별개의 포획 위치에 존재하거나 그것을 한정하며, 활성 크실라나제 샘플의 적어도 일부분이 하나 이상의 별개의 포획 위치에서 유지되도록 상기 크실라나제에 결합할 수 있는 포획 수단; 및
    (e) 상기 포획 수단에 결합된 활성 크실라나제의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 선택적 표시 수단 또는 적어도 그의 구성요소
    를 포함하는, 샘플 중 활성 크실라나제를 검출하기 위한 검정 장치 또는 그의 사용 방법 또는 그의 용도.
  78. (a) 샘플이 배치될 수 있는 배치 영역;
    (b) 샘플이 상기 배치 영역에 존재하는 (예컨대 배치되는) 경우 매트릭스를 따라 이동할 수 있도록 상기 배치 영역에 작동가능하게 연결된 매트릭스;
    (c) 각 별개의 포획 위치가 배치 영역으로부터 이격되어 있으며, 샘플이 상기 별개의 포획 위치를 가로질러 이동할 수 있는, 상기 매트릭스 상의 하나 이상의 별개의 포획 위치;
    (d) 각 별개의 포획 위치에 존재하거나 그것을 한정하며, 활성 크실라나제 샘플의 적어도 일부분이 하나 이상의 별개의 포획 위치에서 유지되도록 상기 크실라나제에 결합할 수 있으며, 항체를 포함하는 포획 수단; 및
    (e) 상기 포획 수단에 결합된 활성 크실라나제의 존재에 대한 선택적 표시를 제공하는 선택적 표시 수단 또는 적어도 그의 구성요소
    를 포함하는, 샘플 중 활성 크실라나제를 검출하기 위한 검정 장치 또는 그의 사용 방법 또는 그의 용도.
  79. 제1항 내지 제55항 및 제74항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 선택적 표시 수단은 검정 장치가 사용될 때 검정 장치 상에서 및/또는 검정 장치 내에서 구성되는 것인, 검정 장치 또는 그의 사용 방법 또는 그의 용도.
  80. 제1항 내지 제67항 및 제73항 내지 제79항 중 어느 한 항에 따른 검정 장치 (1)를 포함하거나 형성할 수 있으며, 선택적 표시 수단 (50)이 첨가되어 있는 키트.
  81. 제1항 내지 제67항 및 제73항 내지 제80항 중 어느 한 항에 따른 검정 장치 (1)를 포함하거나 형성할 수 있으며, 선택적 표시 수단 (50)의 1종 이상의 구성요소가 첨가되어 있는 키트.
  82. 제64항 내지 제67항, 제80항 및 제81항 중 어느 한 항에 있어서, 점수 카드 또는 참조 카드가 공급되어 있는 키트.
  83. 실질적으로 본원에서 도면을 참조하여 기술된 바와 같은 검정 장치 (1).
  84. 실질적으로 본원에서 도면을 참조하여 기술된 바와 같은 방법.
  85. 실질적으로 본원에서 도면을 참조하여 기술된 바와 같은 용도.
  86. 실질적으로 본원에서 도면을 참조하여 기술된 바와 같은 키트.
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