TWI694256B - 可放大訊號的分子探針及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

一種分子探針包含一偵測分子可特異性辨認一目標分子，以及一標記連結至該偵測分子。該標記包含一觸媒用於自一溶液產生電子及/或中間物。該觸媒包含一奈米材料、一酵素、一金屬及/或一金屬複合物。該中間物可在該溶液中累積一段時間。該偵測分子及該目標分子可透過一蛋白質類作用關係或一核苷酸序列類作用關係彼此交互作用。該中間物參與一化學反應產生一訊號，該訊號可以是一光學、電磁學、熱力學或機械性質變化。提供一能量給該溶液可提高產生該中間物的效率。該分子探針可被用於一實行於表面的分子偵測分析法中。同時提供一使用該分子探針分析目標分子的方法。

Description

可放大訊號的分子探針及其使用方法
本發明揭露涉及一種分子探針，一種試劑組以及一種放大訊號的方法，更明確地，涉及一種分子探針，一種試劑組以及一種放大分子偵測訊號的方法。
傳統免疫分析法，如圖1所示，利用一組捕捉抗體及偵測抗體可辨認並結合目標分子的能力，可偵測目標分子是否存在於溶液中，已經是實驗室檢測及醫療診斷的有力工具。為量化目標分子，該偵測抗體通常會與一可被測的標記連結，當抗體與該目標分子結合時，該標記可引發或可被引發發光、發散電磁波、產生顏色變化或催化引發任何可被查覺的變化，產生可被量測的訊號。
然而，在此傳統偵測方法下，單一目標分子一次僅對應產生單一可被量測的訊號(例如，在冷光呈色免疫分析法中，一個HRP分子僅能與一個luminol分子產生一個光子，且該光子在產生後立即消逝)，故當目標分子濃度低時，將導致訊號強度微弱，使偵測的靈敏度及準確度不良。因此，有部份的傳統免疫分析方法已知會導致錯誤診斷及錯誤治療。
為增進現有分子檢測法的靈敏度及準確度，本發明揭露的一實施例提供一分子探針可放大分子偵測的訊號。該分子探針包含一偵測分子可特異 性辨認一目標分子，以及至少一標記共價或非共價連結至該偵測分子，該標記包含一觸媒用於自一溶液產生電子及中間物。
優選地，該標記的觸媒包含至少一奈米材料、一酵素、一金屬及一金屬複合物。該奈米材料包含奈米顆粒、二維奈米結構物及塊狀奈米結構材料。該奈米顆粒包含金屬奈米顆粒、富勒烯及量子點。該量子點包含金屬量子點、氧化石墨稀量子點、石墨烯量子點以及碳量子點。
優選地，該觸媒產生的中間物可在該溶液中累積存在一段時間。
優選地，該中間物可參與一化學反應並產生一訊號，該訊號包含光學特性變化、電磁學性質變化、熱力學性質變化或機械性質變化。
優選地，該觸媒產生的中間物至少包含活性氧類(ROS)、活性氮類(RNS)、脂質過氧化物或脂質氧化物、三丙胺(TPA)、中間價化合物(intermediate valence compounds)、四甲基聯苯胺(TMB)、氮氧類持續性自由基、自由基加合物、N-叔丁基α-苯基硝酮(PBN)、5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)、穀胱甘肽、穀胱甘肽二硫化物、菸鹼醯胺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)、菸鹼醯胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH/NADP)及C-亞硝基自旋捕捉物(C-nitroso spin traps)。
優選地，該觸媒產生中間物的效率可由提供該溶液能量而提高。該能量可包含一化學能、一輻射能、一熱能、一電能、一磁能、一電磁能、一音波能、一機械能或其任何組合。
優選地，該偵測分子及該目標分子彼此選擇性地分子間交互作用，透過一蛋白質類作用關係或一核苷酸序列類作用關係。該蛋白質類作用關係包含一配體-受器作用關係或一抗體-抗原作用關係。
優選地，該分子探針被使用於一分子偵測法中，該偵測法於一表面上實施。
在本發明揭露的另一實施例中，提供檢測一目標分子的方法。該 方法包含以下步驟：在一溶液中使至少一個前述的分子探針結合至至少一個目標分子；使該溶液放置一段時間；添加至少一個一化學反應的反應物至該溶液中；以及量測該化學反應產生的訊號。
優選地，該使溶液放置一段時間的步驟進一步包含下列步驟：對該溶液提供一能量。
總結而言，依據前述實施例，本發明揭露利用被一或多能與溶液反應產生電子及/或中間物的觸媒所標記的偵測分子，放大分子偵測法的訊號或測得放大的分子偵測訊號。該中間物可以穩定地在溶液中累積一段時間，並參與分子偵測法中的化學反應，如此可在偵測到目標分子時產生顯著增幅放大的訊號(意即，「一對多」放大)。因此，本發明揭露以少量的成本有效地改善了現有檢測法的偵測靈敏度。除此之外，由於該電子以及中間物可以同時被生成，此發明揭露提供至少兩種可量測的訊號，這提供了雙重確認偵測訊號可信度的可能，因此能確保分子偵測的準確性。
1:捕捉抗體
2:目標分子
3:偵測抗體
4:標籤分子
5:反應物
6:訊號
7:分子探針
8:偵測分子
9:標記
10:中間物
11:溶液
12:能量
以下圖式展示了一或多個本發明揭露的實施例，配合文字敘述可更佳地理解本發明揭露。相同的標號將通用於不同圖式，用於指稱實施例中相同或相似的元件。
圖1是根據既有技術，已知的傳統分子偵測法的概念示意圖；圖2是根據本發明揭露的一實施例，分子探針結合傳統分子偵測法的概念示意圖；圖3是根據本發明揭露的一實施例，一放大分子偵測訊號方法的概念示意圖；圖4是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示氮摻雜氧化石墨烯量子點(NGOQDs)的濃度與過氧化氫(H2O2)的濃度之間的相關性； 圖5A是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示過氧化氫隨時間累積；圖5B是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示過氧化氫在一段時間內的穩定性；圖6A是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示過氧化氫濃度與HRP基質所產生的化學發光訊號強度之間的相關性；圖6B是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示過氧化氫濃度與發光胺(luminol)所產生的化學發光訊號強度之間的相關性；圖7A是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示氮摻雜氧化石墨烯量子點(NGOQDs)的濃度與化學發光訊號的強度之間的相關性；圖7B是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示該目標分子的濃度與化學發光訊號強度之間的相關性；圖8是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示因光照射而產生的電流訊號；圖9是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示提供光能量提高產生過氧化氫的效率；圖10是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示電流訊號隨介白素(IL-6)含量提高而增強；圖11是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示在提供光能量的情況下，電流訊號強度隨時間的變化；圖12A是根據本發明揭露的一實施例，由二氧化鈦產生過氧化氫的實驗結果；圖12B是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示由鐵鉑奈米粒子產生過氧化氫具濃度相依性； 圖13是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示提供化學能提高產生過氧化氫的效率；以及圖14是根據本發明揭露的一實施例，實驗結果顯示由鐵鉑奈米粒子產生的過氧化氫可累積。
根據慣例，各種被描述的特徵沒有依比例繪製，並強調了與揭露內容相關的特徵。在圖式及文字中相同的參照符號代表相同的元件。
此處將參照相對應的圖式，更詳細描述本發明揭露的各種實施例。然而，本發明揭露可以被不同樣態的實驗例所實現，不應受所描述的具體實施例的範圍所限制。相反地，提供這些實施例是為使本發明揭露清楚和完整，並使本領域技術人員能充份地理解本發明揭露的範圍。相同的圖式標號始終表示相同的元件。
在此用於描述特定實施例的術語不應侷限本發明揭露。除非上下文另外清楚地指出，否則在此使用的單數形式「一」、「一個」及「該」也包括複數形式。在此所使用的「包括」、「包含」或「有」將進一步被理解為指稱存在著所述特徵，區域，整體，步驟，操作，元件和/或組件，但並不排除存在或添加一個或多個其他特徵，區域，整體，步驟，操作，元件，組件和/或其組合。
術語「和/或」及「至少一個」應被理解為包括一個或多個相關所列項目的任何和所有組合。此外，雖然「第一」、「第二」及「第三」等術語被用於描述各種元件，部件，區域，部分和/或區段，但是這些元件，部件，區域，部分和/或部分不應該受這些術語所限制。這些術語僅用於區分一個元素，組件，區域，部分或區段與另一個元素，組件，區域，部分或區段。因此，在不脫離本發明揭露教示的情況下，下面討論的第一元件，部件，區域，部分或區段可以被稱為第二元件，部件，區域，部分或區段。
術語「分子偵測法」在此用於描述一生化檢測，可量測一目標分子(即，一待分析物)在一溶液(例如，生物體液)中是否存在及/或其濃度。如圖1所示，一常見的分子偵測法的組成包含一捕捉抗體1對目標分子2具特異性(即，對該目標子具有親和力或特定性質，因此可特異性結合至該目標分子)，以及一偵測抗體3亦對該目標分子2具特異性並且與一標籤分子4連結，當與一試劑或反應物5接觸時可催化一化學反應生成一可被偵測的變化，致使該偵測抗體3與該目標分子2結合時產生一可被量測的訊號6。
該化學偵測法所用的化學反應可以是氧化還原反應、光化學反應、電化學反應、光電化學反應或其他產生可量測訊號的反應。該可量測訊號可以是光學性質變化、電磁學性質變化、熱力學性質變化或機械性質變化的形式。更特定地，該光學性質可包含，但不限於，冷光強度、螢光強度、顏色、冷光波長變化、螢光波長變化以及光波長變化。該電磁學性質可包含，但不限於，電流強度、電位、導電度、電荷量、電壓以及相對介電常數。該熱力學性質包含，但不限於，溫度。該機械性質包含，但不限於，光密度(即，吸光率)、共振頻率、振盪頻率、表面聲波、壓電效應以及植體穩定度。
該化學反應產生的訊號可被恆電位儀、恆電流儀、循環伏安儀、電化學分析儀、電致變色分析儀、螢光光譜儀、化學發光光譜儀、電化學發光光譜儀、光化學發光光譜儀、光電化學發光光譜儀、安培儀、導電率儀、溫度計、壓電儀、共振頻率分析儀、伏特計、電位計、示波器、拉曼光譜儀、表面聲波感測器或石英壓電晶體微天平所量測。
化學反應的反應物可包含5-乙基-5-苯基巴比妥酸luminal)、4-氨基邻苯二甲酰肼(isoluminol)、吖啶酯(acridinium ester)、三(2,2’雙吡啶)合釕(II)離子tris(2,2’-bipyridyl)ruthenium(II)、三(雙吡啶)合釕(II)離子Ru(bpy)3 2+、3-(2’3-(2'-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3"-磷酰氧基)苯-1,2-二氧杂环丁烷 (3-(2'-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3"-phosphoryloxy)phenyl-1,2-dioxetane,AMPPD)、3-(2'-spiroadamantane)-4-methoxy-4-(3"-beta-D'-galactopyrano-yloxy)phenyl-1,2-dioxetane(AMPGD)、10-乙醯-3,7-二羥基啡
Figure 107108836-A0305-02-0009-19
(10-acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine,Amplex Red reagent)、螢光素(luciferin)、光澤精(lucigenin)、過氧化酶(peroxidase)、辣根過氧化酶(Arthromyces ramosusperoxidase,ARP)、山葵過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)、水解酶(hydrolase)、鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、葡萄糖氧化酶(glucose oxidase)、β-D-半乳糖苷酶(beta-D-galactosidase)、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphatedehydrogenase)、螢光素酶(luciferase)、金奈米粒子(gold nanoparticle)、氯化血紅素(hemin)、金屬複合物(metal complexes)(即，Cu2+及Fe3+酞青錯合物(phthalocyanine complex))或其任意組合。
進一步，該捕捉抗體1可被固定於一表面之上，使該分子偵測法可被實行於一器皿、一孔槽、一盒體、一管體、一毛細管、一電極、一腔室、一薄膜、一顆粒、一感測器、一微量孔盤、一微量試片、一半導體感測器晶片或一比色管。部份分子偵測法的例子可包含但不侷限螢光分析法(fluorescent assay)、酵素分析法(ELISA)、側流分析法(lateral flow assay)、電化學分析法(electrochemical assay)、光化學分析法(photochemical assay)及光電化學分析法(photoelectrochemical assay)。
除非另外說明，否則在本發明揭露所用的術語(包含技術及科學用語)具有與相關領域習知通常技藝者所理解的意義。進一步理解的是，諸如在通用字典中定義的那些術語應該被解釋為具有與其在相關領域和本發明揭露內中相同的含義，並且除非有明確地定義，否則不應被理想化或過於形式地解釋。
參照圖2，本發明揭露首先提供了一放大訊號的分子探針。在一實施例中，該分子探針7包含一偵測分子8以及至少一連結至該偵測分子的標記9。該標記9以例如：酯鍵、肽鍵或硫酯鍵等共價鍵結，或以例如：氫鍵或π-π交互等非共價鍵結的方式連結於該偵測分子8。該標記9包含一觸媒可自一溶液產生電子及 /或中間物10。該偵測分子8可以是一抗體、一抗原、一配體、一受器或一核苷酸序列，對一目標分子2具特異性(即，可特異性結合)。該目標分子2可以是一有機化合物、一無機化合物或一生物分子。優選地，該有機化合物是一芳香族化合物、醇類、醛類、酮類、酸類、胺類、尿素或一其聚合物或複合物；該無機化合物是十二硼酸鹽(dodecarborate)、氮化物或含金屬複合物；以及該生物性分子是胺基酸、核苷酸、脂質、醣類、胜肽、核酸、多醣、維他命、荷爾蒙或一其聚合物或複合物。
該偵測分子8與該目標分子2彼此間具有選擇性地分子間交互作用，該選擇性分子間交互作用包含一蛋白質類作用關係、一核苷酸序列類作用關係或一其組合。該蛋白質類作用關係可以是一配體-受器作用關係或一抗體-抗原作用關係。更明確地，在部份實施例中，該配體-受器作用關係包含，但不限於，一蛋白質及脂質間作用關係(例如：annexin A5及磷脂醯絲胺酸(phosphatidylserine))、一蛋白質及聚醣/多醣間作用關係(例如：內凝集素(intelectins)及微生物聚醣)、一蛋白質及金屬間作用關係(例如：鐵蛋白(ferritin)及鐵)或一蛋白質及小分子間作用關係(例如：表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)及吉非替尼(gefitinib)；或鏈親和素(streptavidin)及生物素(biotin))。在部份實施例中，該抗體-抗原作用關係包含，但不限於，一去氧核糖核酸及抗體間作用關係(例如：抗雙股去氧核糖核酸抗體)、一小分子及抗體間作用關係(例如：抗黃麴毒素抗體)、一脂質及抗體間作用關係(例如：抗磷脂質抗體)、一有機化合物及抗體間作用關係(例如：抗氯酚抗體)、一無機化合物及抗體間作用關係(例如：抗mercaptoundecahydrododecaborate抗體(anti-BSH antibody))或一環境汙染物或食品汙染物及抗體間作用關係(例如：抗直鏈烷基苯磺酸鹽抗體)。在部份實施例中，該核苷酸類作用關係包含，但不限於，一寡去氧核糖核酸/寡核糖核酸間互補序列的作用關係、一小分子及適體(aptamer)間作用關係(例如：抗多巴胺適體)、一蛋白質及適體間作用關係(例如：抗凝血酶適體)或一核酸及適體間作用關係(例口：抗人類免疫 缺陷病毒反式作用適體)。前述交互作用關係可被免疫分析法、核酸偵測分析法、脂質偵測分析法或醣類偵測分析法所偵測。
該標記9的觸媒可以至少是一奈米材料、一酵素、一金屬以及一金屬複合物。該奈米材料可包含二維奈米結構物(例如，石墨烯奈米片及氧化石墨烯奈米片)、塊狀奈米結構材料(例如，奈米多孔材料、奈米複合物以及奈米晶體材料)以及一奈米粒子(例如：金奈米粒子、銀奈米粒子、鉑奈米粒子、鐵奈米粒子、鐵金奈米粒子、鐵鉑奈米粒子、二氧化鈦奈米粒子以及量子點(QDs))。該量子點可包含，但不限於，core-type量子點、core-shell量子點、合金量子點、碲化鎘量子點、硒化鎘量子點、硫化鎘量子點、硫化鋅量子點、硫化鉛量子點、硫化汞量子點、硒化鉛量子點、石墨烯量子點(GQD)、砷化銦/硒化鋅量子點、砷化銦/硒化碲量子點、砷化銦/磷化銦量子點、銅：磷化銦/硒化鋅量子點、磷砷化銦/磷化銦/硒化鋅量子點(InAsxP1-x/InP/ZnSe QDs)。該酵素可包含，但不限於，過氧化物酶、氧化酶或其衍生物，如：辣根過氧化酶(Arthromyces ramosus peroxidase,ARP)、山葵過氧化酶(horseradish peroxidase,HRP)、過氧化氫酶、穀胱甘肽過氧化物酶、菸鹼醯胺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、葡萄糖氧化酶、細胞色素P450氧化酶、L-古洛糖酸內酯氧化酶、單胺氧化酶或離胺基氧化酶；水解酶、鹼性磷酸酶(ALP)或其衍生物；葡萄糖氧化酶或其衍生物，例如：beta-D-半乳糖苷酶(beta-D-galactosidase)、葡萄糖-6-磷酸去氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase)；超氧化物歧化酶、脂氧合酶或螢光素酶)。該金屬及金屬複合物可包含，但不限於，單原子釕、二價銅酞菁複合物、三價鐵酞菁化合物、血紅蛋白、過渡金屬卡賓複合物，例如：格拉布觸媒(Grubb’s catalyst)。
在部份實施例中，該奈米材料被進一步地摻雜鎂、氧、磷、硼、鐵、鈷、鎳或其他IIA族、IIIA族、IVA族、VA族、VIA族元素或具有空的d軌域的過渡元素，優選的比例約由0莫耳百分比(mol%)至50莫耳百分比。該奈米材料也可以胺基(-NH2)、亞磷酸基(-PO3)、羰基(-CO)、羥基(-OH)、羧基(-COOH)、丙 烯醯基、硼原子(B)、氫原子(H)、氮原子(N)、氧原子(O)、硫原子(S)、磷原子(P)或其他IIIA族、IVA族、VA族、VIA族、VIIA族元素官能團進行修飾，優選的比例以由0莫耳百分比(mol%)至50莫耳百分比。
在部份實施例中，該奈米材料的顆粒粒徑範圍由約0.34奈米至100奈米，例如：0.34奈米、0.51奈米、3奈米、5奈米、10奈米、15奈米、20奈米、25奈米、30奈米、35奈米、40奈米、45奈米、50奈米、55奈米或60奈米。該奈米材料的形狀一般而言是球狀、柱狀或盤狀。在部份實施例中，該奈米材料為盤狀的氧化石墨烯，具有的厚度範圍由約約0.34奈米至20奈米，例如：0.34奈米、0.5奈米、1奈米、3奈米、5奈米、10奈米、15奈米或20奈米。
再次參照圖2，該標記9的觸媒可以在給予能量或無給予能量時，由一溶液產生電子及/或中間物10，在各種溫度下(優選地，在攝氏4度至56度間，或更優選地，在攝氏4度、25度、37度或50度)。該中間物10可以是活性氧類(ROS；例如：有機氫過氧化物、有機過氧化物、自由基引發劑、過氧化氫、氫氧根離子、超氧自由基、氫氧自由基或臭氧)、活性氮類(RNS；例如：一氧化氮、二氧化氮或過氧亞硝酸(peroxynitrous acid)、脂質過氧化物或脂質氧化物(例如：脂肪酸自由基或過氧化脂肪酸自由基)、三丙胺(TPA)、中間價化合物(例如：氯化亞錫、硫酸亞鐵、一氧化碳、二氧化釕或三氯化鈦)、四甲基聯苯胺(TMB)、氮氧類持續性自由基、自由基加合物、N-叔丁基α-苯基硝酮(PBN)、5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)、穀胱甘肽、穀胱甘肽二硫化物、菸鹼醯胺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)、菸鹼醯胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH/NADP)及C-亞硝基自旋捕捉物(例如：3,5-dibromo-4-nitrosobenzenesulfonic acid(DBNBS)及5-Diisopropoxyphosphoryl-5-methyl-1-pyrroline-N-oxide(DIPPMPO)。
該溶液可以是氣態溶液、液態溶液以及固態溶液。假如該溶劑是一氣體，在給定條件下只有氣體溶於其中。假如該溶劑是液體，幾乎所有氣體、液體 及固體可被溶解，包含氣體於液體中、液體於液體中以及固體於液體中。假如該溶劑是一固體，氣體、液體及固體可被溶解，包含氣體於固體中、液體於固體中以及固體於固體中。該液體溶液可進一步被分類為極性與非極性溶液，根據該溶液的分子是否具有永久性電偶極矩。
該中間物可於該溶液中累積一段時間，時間範圍可為數秒至數個月，並參與一產生可量測訊號6的化學反應，因此當偵測到該目標分子2時能得到放大的訊號。換言之，本發明揭露實施例中的每一個觸媒可產生複數個中間物，每個中間物可與該化學反應的反應物進行反應，同時產生複數個可量測訊號，因此達成「一對多」的訊號放大模式。
該外部提供、用於增強該中間物產生的能量可以是一化學能、輻射能、熱能、電能、磁能、電磁能、超音波能、機械能或其任意組合。該能量可藉由一電射、一水銀燈、一可見光、一紫外光、一紅外光、一內視鏡光源、一X射線、一音波、一電場、一磁場、一核磁共振、一函數產生器、一加熱板或一發光二極體提供。
根據本發明揭露的一實施例，該分子探針可使用於一分子偵測分析法(例如：酵素免疫分析法(ELISA)、螢光免疫分析法(fluorescent immunoassay)、側流免疫分析法(lateral flow assay)、電化學免疫分析法(electrochemical immunoassay)、光化學免疫分析法(photochemical immunoassay)及光電化學免疫分析法(photoelectrochemical immunoassay)，放大該分子偵測分析法的偵測訊號。更明確地，在部份實施例中利用該分子探針用於分析一目標分子的方法包含下列步驟：在一溶液中使至少一個前述的分子探針結合至至少一個目標分子；使該溶液放置一段時間；添加至少一個一化學反應的反應物至該溶液中；以及量測該化學反應產生的訊號。在該實施例中，該目標分子在與該分子探針結合前，藉由與捕捉抗體或偵測分子交互作用而固定於一表面，該交互作用可以是蛋白質類或核苷酸 序列類的作用關係。因此，在該分子探針與該目標分子結合後，該方法可選擇性地包括一步驟：移除一部份未結合至該目標分子的分子探針，舉例而言，重複地移除該溶液並加入一不同有該目標分子或分子探針的新鮮溶液。
在其他實施例中，該分子探針7可被固定於該表面，以及該標記9在與該目標分子2結合時，可被透過一構形改變或其他機制而被活化。
優選地，該分子探針8的標記9在該溶液中的最終濃度範圍約為1x 10-15mg/mL至500mg/mL。該方法可被實行於一表面上，例如一器皿、一孔槽、一盒體、一管體、一毛細管、一電極、一腔室、一薄膜、一顆粒、一感測器、一微量孔盤、一微量試片、一半導體感測器晶片或一比色管。
在另一些實施例中，該分子探針可提供於一試劑組中，與分子檢測分析法一起使用，用以放大該分子偵測分析的訊號。在一實施例中，該試劑組包含至少一個前述偵測分子，至少一個前述含觸媒的標記以及一或多的試劑用於共價或非共價連結該偵測分子及該含觸媒的標記。在實行該分子偵測分析法之前，該偵測分子及該標記藉由添加該試劑而相連結。
在部分實施例中，該試劑組進一步包含一氧化還原反應增強物。該氧化還原反應增強物可以是營養物、維他命、鹼金屬鹽或緩衝液、有機化合物、無機化合物、具有空的d或f或g軌域的過渡金屬離子與其化合物。該營養物可以包含無血清RPMI、無血清DMEM、無血清MEM α、無血清F12、無血清L15、無血清Hybri-Care或胎牛血清。該維他命可包含抗壞血酸、輔酶Q10、穀胱甘肽、蝦青素。該鹼金屬鹽或緩衝液可包含磷酸鹽緩衝液及多硫化物。該有機化合物可包含卟啉、葉綠素、組織胺、甲醇、乙醇、三羥乙基胺、乳酸、尿素或其它具有至少一個羥基，羰基或氮原子的雜環或大環化合物。該無機化合物可包含硝酸銀或碘酸鈉。該具有空的d或f或g軌域的過渡金屬離子可包含三價鐵離子、二價鐵離子、鈷離子、鎳離子、過錳酸鉀或其任意組合。優選地，該化還原增加物可以濃度範圍大約為1×10 -12體積/體積百分比(% v/v)至50體積/體積百分比(% v/v)或在1×10-15體積莫爾濃度(M)至10體積莫爾濃度(M)的範圍添加至該試劑組中。
參照圖3，本發明揭露提供一偵測目標分子的方法。在一實施例中，該方法包含下列步驟：(S1)提供至少一個固定於一表面的補捉抗體1；(S2)添加一含有至少一個目標分子2的樣本，使該捕捉抗體1可以與目標分子2在一溶液中結合；(S3)添加至少一個前述的分子探針7，使該分子探針7的偵測分子可與該目標分子2結合；(S4)使該溶液放置一段時間，使該分子探針7的標記9可生成中間物10並累積於該溶液中；(S5)添加至少一個反應物5至該溶液，使一化學反應開始進行，產生可量測訊號6；以及(S6)量測該訊號6的強度。
優選地，該分子探針8的標記9在該溶液中的最終濃度範圍約為1x 10-15mg/mL至500mg/mL。同時，當該分子探針加入時，該溶液可含有所有實行該分子偵測法所需的試劑及緩衝溶液，除了用於使該化學反應進行的部份(例如，該化學反應的反應物)。
由該標記9產生的該中間物10可以是活性氧類(ROS)、活性氮類(RNS)、脂質過氧化物或脂質氧化物、三丙胺(TPA)、中間價化合物(intermediate valence compounds)、四甲基聯苯胺(TMB)、氮氧類持續性自由基、自由基加合物、N-叔丁基α-苯基硝酮(PBN)、5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)、穀胱甘肽、穀胱甘肽二硫化物、菸鹼醯胺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)、菸鹼醯胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH/NADP)及C-亞硝基自旋捕捉物(C-nitroso spin traps)。該中間物可累積於該溶液中，優選地累積期間是數分鐘至數週，並參與該化學反應，藉此在偵測到目標分子2時，增加該化學反應的量，達成「一對多」訊號放大。優選地，在添加該反應物5之前，放置含有該分子探針以及固定化的該目標分子的該溶液於室溫中1分鐘。然而，應被理解的是在本發明揭露中的溶液放置時間及溫度不應受限；只要該中間物能穩定地產生及累積於該溶液中，本發明揭露之實施例皆可運作。
在部份實施例中，該可量測訊號可以是光學性質變化、電磁學性質變化、熱力學性質或機械性質變化的形式。舉例來說，該光學性質可包含冷光強度、螢光強度、顏色、冷光波長變化、螢光波長變化以及光波長變化。該電磁學性質可包含電流強度、電位、導電度、電荷量、電壓以及相對介電常數。該熱力學性質包含，但不限於，溫度。該機械性質包含光密度(即，吸光率)、共振頻率、振盪頻率、表面聲波、壓電效應以及植體穩定度。在部份實施例中，該訊號可被恆電位儀、恆電流儀、循環伏安儀、電化學分析儀、電致變色分析儀、螢光光譜儀、化學發光光譜儀、電化學發光光譜儀、光化學發光光譜儀、光電化學發光光譜儀、安培儀、導電率儀、溫度計、壓電儀、共振頻率分析儀、伏特計、電位計、示波器、拉曼光譜儀、表面聲波感測器或石英壓電晶體微天平所量測。
在部份實施例中，該方法可被實行於一表面上，例如：一器皿、一孔槽、一盒體、一管體、一毛細管、一電極、一腔室、一薄膜、一顆粒、一感測器、一微量孔盤、一微量試片、一半導體感測器晶片或一比色管。
在一替代性的實施例中，該方法不需使用該捕捉抗體。意即該分子探針7可被固定在該表面，以及該標記9在與該目標分子2結合時，可被透過一構形改變或其他機制而被活化。
在一個較佳的實施例中，該偵測一目標分子的方法可進一步包含一步驟：在放置該溶液一段時間的同時提供能量12給該分子偵測法的溶液。該能量12可以是化學能、輻射能、熱能、電能、磁能、電磁能、音波能、機械能或其任意組合。該能量可藉由一電射、一水銀燈、一可見光、一紫外光、一紅外光、一內視鏡光源、一X射線、一超音波、一電場、一磁場、一核磁共振、一函數產生器、一加熱板或一發光二極體提供。該能量應足以加速或促進該探針分子7的標記9產生電子或/及中間物10。優選地，該能量以光照一段時間的方式(例如，100mW/cm2的可見光照20秒)及/或添加一氧化還原增加物的方式(例如，10mM的 抗壞血酸)提供給該溶液。
更明確地，可提供1皮米至1600奈米波長範圍的輻射能，或優選地，1皮米至1奈米(游離輻射)、10奈米至400奈米(紫外光)、400奈米至1000奈米(可見光及紅外光)或其任意組合。該輻射能以約1 x 10-6微瓦特每平方釐米(μW/cm2)至約100瓦特每平方釐米(W/cm2)，或優選地以約10微瓦特每平方釐米(μW/cm2)至約5瓦特每平方釐米(W/cm2)的功率範圍施用。可提供約1 x 10-6微瓦特每平方釐米(μW/cm2)至約100瓦特每平方釐米(W/cm2)功率範圍的熱能，或優選地以約10微瓦特每平方釐米(μW/cm2)至約5瓦特每平方釐米(W/cm2)的功率範圍。可提供電勢範圍約0.0001伏特至約500伏特的電能，或優選地以約0.1伏特至約5伏特的電勢範圍。此外，該電能以約1 x 10-15安培每平方釐米(A/cm2)至約100安培每平方釐米(A/cm2)的電流強度範圍內施用，或優選地以約1 x 10-12安培每平方釐米(A/cm2)至約10安培每平方釐米(A/cm2)的電流強度範圍內施用。可提供約1 x 10-6微瓦特每平方釐米(μW/cm2)至約100瓦特每平方厘米(W/cm2)功率範圍的磁能，或優選地以約10微瓦特每平方釐米(μW/cm2)至5瓦特每平方釐米(W/cm2)的功率範圍內施用。可以約1 x 10-6微瓦特每平方釐米(μW/cm2)至約100瓦特每平方釐米(W/cm2)功率範圍的超聲波能的形式提供機械能，或優選地以約10微瓦特每平方釐米(μW/cm2)至5瓦特每平方釐米(W/cm2)的功率範圍。
參照圖4，本發明揭露的實施例中分子探針的觸媒數量與所生成的中間物具相關性。在一實施例中，如圖4所示，待測溶液中的過氧化氫濃度隨氮摻雜氧化石墨烯量子點的濃度增加而增加，說明該氮摻雜氧化石墨烯量子點可以引發自溶液生成過氧化氫的反應。
參照圖5A及圖5B，本發明揭露的實施例展示該中間物可在待測的溶液中累積及維持一段時間。如圖5A所示，當一分析法加入0.005mg/mL終濃 度的氮摻雜氧化石墨烯量子點，以購得的Amplex® Red Hydrogen Peroxide/Peroxidase Assay Kit量測過氧化氫濃度，結果顯示在50mW/cm2的光能提供下3分鐘即累積超過60μM。累積的過氧化氫穩定性佳；如圖5B所示，1μM的過氧化氫可穩定存在待測溶液中至少2個小時。
參照圖6A及圖6B，本發明揭露的實施例中所生成的中間物與冷光訊號的放大有明顯關聯性。如圖6A所示，使用HRP及化學發光HRP基質的免疫分析法生成的冷光訊號強度隨過氧化氫的濃度增加而增加。相同地，如圖6B所示的另一實驗，由發光胺(luminol)所生成的化學冷光訊號也隨過氧化氫的濃度增加而增加。
參照圖7A及圖7B，實施例說明本發明揭露可放大一用於偵測介白素(IL-6)的免疫分析訊號。在一實施例中，如圖7A所示，該分子探針的標記包含氮摻雜氧化石墨烯量子點(NGOQDs)，以及該免疫分析法包含使用一化學發光HRP基質及一HPR的冷光反應，該待分析溶液在給予20秒100Mw/cm2的光能後，所偵測到的冷光訊號強度隨氮摻雜氧化石墨烯量子點的劑量增加而增加。同時，如圖7B所示，在一使用氮摻雜氧化石墨烯量子點標記的分子探針的三明治免疫分析法中，所產生的冷光訊號強度隨IL-6的濃度增加而增加。
參照圖8，本發明揭露的實施例展示該分子偵測法的化學反應會產生電子，因此有電流發生。在圖8所示的實驗中，當該含氮摻雜氧化石墨烯量子點標記的分子探針的待測溶液受到100mW/cm2的光照射時，可偵測到電流產生；該光照持續20秒，期間電流持續產生但隨時間逐漸減弱。在光照停止後該電流亦停止產生。進一步地，如同本發明揭露中的實施例利用分子探針上的觸媒同時產生電子及中間物，如圖8所示，也指示了中間物(例如：過氧化氫)的生成時間及相對量。
參照圖9，根據本發明揭露的實施例顯示產生中間物的效率可由 提供該溶液一能量(例如：光能)而提高。在圖9所示的一實驗中，當提供2mM的抗壞血酸給含有0.008mg/mL或0.0008mg/mL氮摻雜氧化石墨烯量子點的溶液，該氮摻雜氧化石墨烯量子點曝露於50mW/cm-2的光照下10分鐘，過氧化氫的生成量為沒有光照的(NL)組別的生成量的近5倍。
參照圖10，本發明揭露的實施例進一步說明如何用於偵測及定量一目標分子。如圖10所示的實驗中，當該具有氮摻雜氧化石墨烯量子點標記之分子探針加入一偵測IL-6的三明治免疫分析法中，偵測所得的電流強度隨著IL-6濃度增加而增加。
參照圖11，根據本發明揭露的實施例，顯示該觸媒所標記的分子探針產生電子的現象是可在同時提供超過一種能量時被增強。如圖11所示的實驗，當對含有氮摻雜氧化石墨烯量子點標記的分子探針的溶夜提供10mM的抗壞血酸(即，化學能)及不連續的光照(即，輻射能)時，可持續地偵測到該氮摻雜氧化石墨烯量子點在有化學能的環境中產生的電流，並隨光能的開/關而變動。
參照圖12A及圖12B，根據本發明揭露的部份實施例，該分子探針的觸媒可以是奈米粒子或其他種類的量子點(例如：金屬半導體量子點)。如圖12A及圖12B所示的實驗，二氧化鈦及鐵鉑奈米粒子可以由一水溶液中產生過氧化氫。
參照圖13，根據本發明揭露的部份實施例，提供一能量(例如：一化學能)給該溶液，可提高產生中間物的效率。舉例而言，如圖13所示的實驗，對含有0.01mg/mL或0.001mg/mL鐵鉑奈米粒子的水溶液添加抗壞血酸(於圖中標記為AA)，導致過氧化氫生成量相較於沒有抗壞血酸的控制組(標記為MQ)顯著地提高，此結果同時顯示鐵鉑奈米粒子產生過氧化氫是具濃度相依性。
參照圖14，根據本發明揭露的部份實施例，由其他種類觸媒(例如：奈米粒子)產生的中間物也可以於溶液中累積一段時間。如圖14所示的實驗， 由0.001mg/mL的鐵鉑奈米粒子，存在2mM抗壞血酸的環境下30分鐘，產生累積的過氧化氫濃度已超過8μM。
總結而言，根據前述實施例，本發明揭露藉由被標記一或多觸媒的偵測分子可由溶液產生電子及中間物，可放大或得到放大的分子偵測訊號。該中間物可穩定累積於溶液中一段時間，並參與分子偵測法的化學反應進行，因此在偵測到目標分子存在時能產生顯著放大的訊號(意即，「一對多」放大)。據此，本發明揭露能以少量的成本有效增進現有分析法的靈敏度及準確度。除此之外，由於該電子及中間物是同時被生成，本發明揭露提供至少兩種可量測訊號，這提供了雙重確認偵測訊號可信度的可能，因此能確保分子偵測的準確性。
以上描述僅為本發明揭露的實施例，不應用於限制本發明揭露之範圍。上面示出和描述的實施例僅僅是示例。在本領域中經常發現許多細節，例如氧化石墨烯量子點的其它特徵。因此，許多這樣的細節既未示出也未描述。儘管在前面的描述中已經闡述了本技術的許多特徵和優點，連同本公開的結構和功能的細節，但是本公開僅是說明性的，並且可以在細節上進行改變，包括在本公開的原理內的部件的類型、尺寸和濃度，並且包括由權利要求中使用的術語的寬泛的一般含義所確定的全部範圍。因此，應當理解，可以在權利要求的範圍內修改上述實施例。此外，摘要和標題僅用於便於檢索專利文獻，並不意圖以任何方式限制要求保護的公開的範圍。
1:捕捉抗體
2:目標分子
5:反應物
6:訊號
7:分子探針
8:偵測分子
9:標記
10:中間物
11:溶液

Claims (16)

  1. 一種分子探針，包括：一偵測分子，該偵測分子對一目標分子具特異性；以及至少一標記以共價或非共價方式與該偵測分子連結，該標記包括一觸媒，用於自一溶液產生中間物；其中該中間物可在該溶液中累積一段時間並參與一化學反應，該化學反應直接或間接產生對應於該中間物的濃度或存在的訊號。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之分子探針，其中該標記的觸媒包括奈米材料、酵素、金屬及金屬複合物的至少其中之一，該奈米材料包括奈米顆粒、二維奈米結構物及塊狀奈米結構材料，該奈米顆粒包括金屬奈米顆粒、富勒烯及量子點，以及該量子點包括金屬量子點、石墨烯量子點、氧化石墨烯量子點以及碳量子點。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之分子探針，其中該化學反應產生之該訊號，包括一光學性質變化、一電磁學性質變化、一熱力學性質變化或一機械性質變化。
  4. 如申請專利範圍第1項所述之分子探針，其中由該觸媒產生的該中間物包括活性氧類、活性氮類、脂質過氧化物或脂質氧化物、三丙胺(TPA)、中間價化合物(例如：氯化亞錫、硫酸亞鐵、一氧化碳或三氯化鈦)、四甲基聯苯胺(TMB)、穀胱甘肽、氮氧類持續性自由基、自由基加合物、N-叔丁基α-苯基硝酮(PBN)、5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)、穀胱甘肽二硫化物、菸鹼醯胺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)、菸鹼醯胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH/NADP)及C-亞硝基自旋捕捉物(C-nitroso spin traps)的至少其中之一。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之分子探針，其中由該觸媒產生的該中間物的效率可由提供該溶液一能量而提高。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之分子探針，其中該能量包括一化學能、一輻射量、一熱能、一電能、一磁能、一電磁能、一音波能、一機械能或其任意組合。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之分子探針，其中該偵測分子與該目標分子彼此間具有選擇性分子間交互作用，該選擇性分子間交互作用包含一蛋白質類作用關係、一核苷酸序列類作用關係或一其組合。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之分子探針，其可被用於一分子偵測分析法中，該分子偵測分析法被實行於一表面上。
  9. 一種偵測一目標分子的方法，其步驟包括：在一溶液中使至少一個分子探針結合至至少一個目標分子，其中每一個分子探針包括：一偵測分子，該偵測分子對該目標分子具特異性；以及至少一標記以共價或非共價方式與該偵測分子連結，該標記包括一觸媒，用於自一溶液產生中間物；該中間物可在該溶液中累積一段時間並參與一化學反應，該化學反應直接或間接產生對應於該中間物的濃度或存在的訊號；使該溶液放置一段時間；添加至少一個一化學反應的反應物至該溶液中；以及量測該化學反應產生的該訊號。
  10. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該使該溶液放置一段時間的步驟更進一步包括一步驟：提供一能量給該溶液。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之方法，其中該能量包括一化學能、一輻射量、一熱能、一電能、一磁能、一電磁能、一音波能、一機械能或其 任意組合。
  12. 如申請專利範圍第9項所述之方法，該標記的觸媒包括奈米材料、酵素、金屬及金屬複合物的至少其中之一，該奈米材料包括奈米顆粒、二維奈米結構物及塊狀奈米結構材料，該奈米顆粒包括金屬奈米顆粒、富勒烯及量子點，以及該量子點包括金屬量子點、石墨烯量子點、氧化石墨烯量子點以及碳量子點。
  13. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中由該觸媒產生的該中間物包括活性氧類、活性氮類、脂質過氧化物或脂質氧化物、三丙胺(TPA)、中間價化合物(例如：氯化亞錫、硫酸亞鐵、一氧化碳或三氯化鈦)、四甲基聯苯胺(TMB)、穀胱甘肽、氮氧類持續性自由基、自由基加合物、N-叔丁基α-苯基硝酮(PBN)、5,5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物(DMPO)、穀胱甘肽二硫化物、菸鹼醯胺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)、菸鹼醯胺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH/NADP)及C-亞硝基自旋捕捉物(C-nitroso spin traps)的至少其中之一。
  14. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該偵測分子與該目標分子彼此間具有選擇性分子間交互作用，該選擇性分子間交互作用包含一蛋白質類作用關係、一核苷酸序列類作用關係或一其組合。
  15. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其中該訊號包括一光學性質變化、一電磁學性質變化、一熱力學性質變化或一機械性質變化。
  16. 如申請專利範圍第9項所述之方法，其可被實行於一表面上。
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