CN1188705C - 一种测定血浆对疾病的毒性的预防能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种测定血浆的细胞保护活性的方法,所述血浆的细胞保护活性可预防血管内皮细胞的破坏并防止多种疾病,如动脉粥样硬化,先兆子痫,水肿,肾病综合征,及中风的发展。本发明包括一种通过测定表示pI 5.6白蛋白浓度的值来诊断患者是否具有患病倾向的方法,其中所述疾病与血浆中pI 5.6白蛋白浓度的下降有关,且所述pI 5.6白蛋白不与患者血清中的VLDL结合(“游离的pI 5.6白蛋白”)。本方法的优选实施方案是利用体外方法代替直接测量游离pI 5.6白蛋白浓度的方法来获得游离pI 5.6白蛋白的指示值。
Description
发明领域
本发明涉及预测下列疾病的方法。更特别地是,本发明涉及先兆子痫及其它疾病的诊断。
发明背景
血管疾病常常与流过其中的血流的组成有关。具体而言,血液中高浓度的极低密度脂蛋白(VLDL)对血管的完整性产生有害的作用。血液中的极低密度脂蛋白趋向于损坏血管内壁,从而引起血管疾病,包括先兆子痫,动脉粥样硬化,中风,外周血管病,糖尿病性血管病等。
因此人们希望能够有一种早期检测血管疾病的方法,及诊断患者在其生命的后期是否有患血管疾病的倾向的方法,这样就可更好地控制这种疾病,甚至予以避免。先兆子痫的早期检测是非常重要的。
先兆子痫是一种有特殊影响的血管毒性疾病。先兆子痫是在妊娠后期发展的,且其特征在于血压的突然升高,体重过度增加,全身水肿,蛋白尿,严重的头痛,和视觉障碍。孕妇子宫中的血管可为她的胎盘和胎儿提供血液,但其在先兆子痫过程中受到限制,由此造成给胎儿递送的血和氧的量减少。先兆子痫与不良的胎儿发育有关,其最严重的形式对胎儿和母亲均是致命的。
人的血液可天然防御VLDL对血管内皮细胞和白细胞的破坏作用,这已经通过被称作血液“毒性预防活性”或“TxPA”的指数或因子而量化(Arbogast,B.W.,和Dreher,N.J.Coronary Diease PredictionUsing a New Atherogenic Index(使用一种新的致动脉粥样硬化的指数预测冠状疾病),Atherosclerosis,Vol.73(1988)259-267)。(Chi,D.S.等,在链脲菌素诱导的糖尿病大鼠中减少淋巴细胞应答:极低密度脂蛋白的功能(Decreased Lymphocyte Response inStreptozotozin Induceel Diabetic Rats:A Function of Very LowDensity Lipoprotoins.),Diabetes 31(1982)1098-1104)。美国专利US 4,699,878公开了血液样品的TxPA可通过比较用毒性量VLDL处理过的细胞培养物的生长,并改变血液样品的量,使细胞参考培养物达到“零”生长来评估,其中所述细胞参考培养物是用相同毒性量的VLDL处理的,且没有血液。
VLDL与TxPA的比值可体外测定血液的细胞毒性。VLDL与TxPA的比值还可在体外有效预测血管疾病。使用VLDL与TxPA的比值来预测先兆子痫进一步发展的可能性的准确率达到90%(Arbogast,B.W.,Leeper,S.C.,Merrick,R.D.,Olive,K.E.和Taylor,R.N.体外测定血管内皮细胞脂类毒性的血浆因子可正确鉴定在早期和晚期妊娠中有先兆子痫的妇女(Plasma Factors that determine EndothelialCell Lipid Toxicity in vitro Correctly Identify Women withPreeclampsia in Early and Late Pregnancy.),Hypertension inPregnancy Vol.15(1996)263-279)。在动脉粥样硬化中可获得相似的准确率(Arbogast,B.W.,Gi11,L.R.和Schwertner,H.A.一种新的冠状动脉疾病的保护因子:极低密度脂蛋白的毒性-预防活性(ANew Protective Factor in Coronary Artery Disease:Very-Low-Density Lipoprotein Toxicity-Preventing Activity),Atherosclerosis Vol.57(1985)75-86)。(Arbogast,B.W.和Dreher,N.J.Coronary Disease Prediction Using a NewAtherogenic Index.Atherosclerosis Vol.66(1987)55-62)。该细胞培养方法的缺点在于它是一种相对较昂贵的测定方法,且其需要细胞生长的时间。且,不确定度的水平大约为10%,其对于医疗测定来说是不太理想的。
血浆所含的组分包括以不同量存在于极低密度脂蛋白(VLDL),低密度脂蛋白(LDL),和高密度脂蛋白(HDL)中的白蛋白,未-酯化脂肪酸(NEFA),和甘油三酯。人血白蛋白分为两类,通过它们的电泳迁移率可将等电点为pH4.8和pH5.6两种白蛋白区分开(Basu,S.P.,Rao,S.N.和Hartsuck,J.A.脂肪酸和聚焦时间对人血浆白蛋白等电聚焦的影响(Influence of Fatty Acid and Time of Focusing onthe Isoelectric Focusing of Human Plasma Albumin),BiochimBiophys Acta,Vol.533(1978)66)。人们已经发现,人血液的毒性预防活性主要是由pI 5.6白蛋白提供的。Arbogast公开了pI 5.6白蛋白类可为VLDL对脉管系统内皮细胞和白细胞的损害提供保扩作用(Arbogast,B.W.极低密度脂蛋白的纯化和毒性预防活性的鉴定(Purification and Identification of Very Low DensityLipoprotein Toxicity Preventing Activity),.AtherosclerosisVol.7(1988)259-267和Chi,D.S.,Berry,D.L.,Dillon,K.A.和Arbogast,B.W.:在链脲菌素诱导的糖尿病大鼠中减少淋巴细胞应答:极低密度脂蛋白的功能(Decreased Lymphocyte Response inStreptozotocin Induced Diabetic Rats:A Function of Very LowDensity Lipoproteins),Diabetes
31:1098-1104,1982)。因此,血液中pI 5.6白蛋白浓度的测定对于诊断血管和白细胞相关疾病是非常有益的。
由于pI 5.6和pI 4.8白蛋白是以不可预知的比例存在于人血浆中的,因此不能根据总白蛋白的浓度测定pI 5.6白蛋白的浓度。血浆样品的TxPA可通过液柱等电聚焦法将pI 4.8白蛋白与pI 5.6白蛋白区分开来,并经由吸收光谱测定法测定pI 5.6白蛋白的浓度而测定。然后将血浆中pI 5.6白蛋白的浓度与已知的标准浓度进行比较,从而描述诊断患有动脉疾病的患者和诊断未患动脉疾病的患者(Arbogast,B.W.,Leeper,S.C.,Merrick,R.D.,Olive,K.E.和Taylor,R.N.:体外测定内皮细胞脂类毒性的血浆因子可正确鉴定在早期和晚期妊娠中有先兆子痫的妇女(Plasma Factors thatDetermine Endothelial Cell Lipid Toxicity in vitro CorrectlyIdentify Women with Preeclampsia in Early and LatePregnancy),Hypertension in Pregnancy
15:263-279,1996)。Arbogast所公开的电泳方法对于临床操作来说十分烦琐且昂贵。电泳方法的不确定度约为10%。
按照如上所述,我们希望能够有一种更简单的方法来诊断是否患有白蛋白-抑制的VLDL-敏感性疾病,包括血管和非-血管疾病和病症,或是否有患这种疾病的倾向。不需要细胞培养生长或等电聚焦分离的方法会更实用。我们还希望这种新的诊断方法比先前的方法更准确。
发明概述
本发明提供一种测定血浆对疾病的毒性预防能力的方法,其中所述疾病与血浆中pI 5.6白蛋白浓度的下降有关。本发明方法包括下列步骤:
(a)提供一种血浆样品,该血浆样品含有游离白蛋白,游离未-酯化脂肪酸,甘油三酯,极低密度脂蛋白,低密度脂蛋白和高密度脂蛋白;
(b)测定游离白蛋白的浓度;
(c)测定游离未-酯化脂肪酸的浓度;和
(d)通过将游离白蛋白的浓度与游离未-酯化脂肪酸的浓度进行比较来计算表示血浆毒性预防能力的值。优选的指示值是“TxPA-S比”,其是通过使游离白蛋白的浓度除以游离未-酯化脂肪酸的浓度计算的。
本发明还包括一种用于进行本方法的测定试剂盒。该测定试剂盒包括:
(a)一种脂类-沉淀试剂;
(b)一种与白蛋白结合时显现颜色的试剂;和
(c)一种与未-酯化脂肪酸结合时显现颜色的试剂。
附图简述
图1表示通过比较严重先兆子痫患者和对照患者的血浆白蛋白浓度而产生的诊断分离不足的图。对照患者的妊娠时间,母亲的年龄和种族与先兆子痫患者相匹配。
图2与图1相似,但是其中的白蛋白浓度是指通过沉淀和离心除去VLDL和LDL后,血浆上清液中的白蛋白浓度。
图3表示通过比较严重先兆子痫患者和对照患者的血浆NEFA浓度而产生的有少许诊断分离的图。
图4与图3相似,但是其中NEFA浓度是指通过沉淀除去VLDL和LDL后,血浆上清液中的NEFA浓度。
图5表示当绘制血浆白蛋白浓度与血浆NEFA浓度的比时,先兆子痫患者与对照患者间的诊断分离提高了。
图6表示当绘制上清液白蛋白浓度与上清液NEFA浓度的比(TxPA-S比)时,严重先兆子痫患者与对照患者间的诊断分离提高了。
图7表示在同组血液样品上测量的,TxPA-S比(上清液)与柱TxPA值(来源于血浆)间的线性关系图。
图8与图1相似,其中的血浆样品采集自不同组患中度先兆子痫的妇女和一组对照妇女。
图9与图6相似,其中的血浆样品采集自与图8所用血液样品相同组的妇女。
图10与图9相似,但是其中用TxPA-S比的系数与HDL浓度的乘积来代替单独的TxPA-S。这组血液样品均采集自美国以外的妇女。HDL有助于将这些妇女分类,它既可以是采集样品的世界范围的函数,也可以是用于测量TxPA-S的新方法的完整部分。
本发明的详细公开
本申请人已经发现了一种新的方法,用于预测血浆抑制源于血液毒素的有害细胞损伤,特别是抑制VLDL-细胞毒性的能力的方法。本发明方法是以本申请人的发现为基础的,即血液的毒性抑制能力可通过不与VLDL结合的特殊的pI 5.6白蛋白来表示。不与VLDL结合的白蛋白在此被称作“游离白蛋白”。本申请人发现,在本发明下,直接测量游离pI 5.6白蛋白可用来表示毒性的抑制活性,这种直接测量需要将pI 4.8白蛋白与pI 5.6白蛋白分离开来,同时将结合VLDL的白蛋白与游离白蛋白分离开来。为了找到一种能够代替烦琐的电泳聚焦测定法,并将pI 4.8白蛋白与pI 5.6白蛋白分离开来的方法,本申请人已经发现,可比较游离(总)白蛋白的浓度和结合游离白蛋白的未-酯化脂肪酸(“NEFA”)的浓度,从而提供一种非常好的,测定游离pI 5.6白蛋白浓度的方法。这里提供了一种更简便的方法,因为这些量可通过体外技术简单测量。本申请人发现,游离白蛋白的浓度与结合游离白蛋白的NEFA(此处被称作“游离NEFA”) 浓度的比值是一种改进的、表示血浆抑制源于血液毒素的细胞损伤能力的指示值。然而,在游离白蛋白和游离NEFA浓度的基础上计算的其它诊断值被看作是本发明的改变。
应当注意的是,通过本发明方法测定的诊断比值是以除TxPA之外的不同参数为基础的,先前在美国专利US4,699,878中,TxPA值用于表示血液的毒性抑制能力,或在等电聚焦方法中用于分离pI 5.6白蛋白。因此,这两种值不具有可比性。为了清楚地区分通过本发明测定的新的毒性抑制能力诊断比值,和先前在现有技术中使用的TxPA值,在下文中,我们将通过本发明测定的诊断比值称作“TxPA-S”,其中用“S”表示所测定的血浆上清液。按照本发明,在测定TxPA-S比和诊断的基础上,使用比电泳和细胞培养更简单的测定法,可准确表示发展成白蛋白-抑制疾病的可能性。
本发明包括一种测定血液TxPA-S比的方法和一种基于该TxPA-S比进行医疗诊断的方法。本发明的方法可通过测试血液,血清或血浆样品来进行。由于凝固作用,血液较难分析,因此优选分析从全血提取的血清和血浆。用于进行本发明方法的特殊测定法类型可确定血清或血浆是否是最优选的血液形式。虽然血浆是本发明方法最优选的血液形式,但下文中的术语“血浆”用于表示血液,血清,和/或血浆。
本发明所测血浆的最恰当组分是游离白蛋白,具有6-20个碳原子的酰基链的NEFA,具有6-20个碳原子的酰基链的甘油三酯,低密度脂蛋白(“LDL”),极低密度脂蛋白(“VLDL”),和高密度脂蛋白(“HDL”)。VLDL的密度约小于1.006mg/ml。LDL的密度为约1.006-约1.063mg/ml。HDL的密度约大于1.063mg/ml。所述NEFA组分是由结合VLDL的NEFA和不结合VLDL的NEFA组成的。既然人们已经发现,绝大多数不结合VLDL的NEFA是游离的NEFA,那么除非另有说明,下文中的术语“游离NEFA”可交换地是指NEFA本体。
本发明方法包括测定血浆样品中游离白蛋白(pI 4.8和pI 5.6白蛋白)的浓度和游离NEFA的浓度,并通过使游离白蛋白的浓度除以游离NEFA的浓度来计算血浆的TxPA-S比。游离NEFA的浓度优选在除去血浆中的VLDL后测定。白蛋白的浓度或者在除去VLDL前作为总血浆白蛋白测量,或者在除去VLDL后作为剩余的游离白蛋白测量。然而,更准确的TxPA-S比是使用游离NEFA浓度和游离白蛋白浓度计算TxPA-S比而得到的。
更优选所测量的游离白蛋白和游离NEFA的浓度不包括结合LDL的白蛋白或NEFA。因此,优选将LDL连同VLDL一起从血浆中除去。人们已经发现,当所测量的游离白蛋白和游离NEFA不包括结合LDL的本体时,TxPA-S的比值更准确。
测定TxPA-S比后,通过比较TxPA-S比和特殊疾病的标准TxPA-S,优选将TxPA-S用于区分血浆对特殊白蛋白-抑制的毒性疾病或病症的毒性预防能力。标准TxPA-S是对统计学上有显著意义的大多数血浆样品通过本发明方法而测定的,其中所述血浆样品对可疑的白蛋白抑制疾病或病症具有潜在的可能性。按照对可疑白蛋白-抑制疾病的独立医疗诊断,可将相对于各血浆标准品测定的TxPA-S比分类。对可疑的白蛋白-抑制疾病的阳性诊断是以特定时期内疾病的实际发展为基础的。对白蛋白-抑制疾病的阴性诊断是以特定时期内疾病不发展为基础的。所述标准可以是单一的基准TxPA-S比或,优选地,表示对白蛋白-抑制疾病具有较高可能性的TxPA-S比的范围。最优选的标准是一对TxPA-S比的范围,其中一个范围代表对白蛋白-抑制疾病具有较高可能性的TxPA-S比,另一个范围表示对相同疾病具有较低的可能性。
本发明方法在这样一对具有较高和较低可能性的TxPA-S比标准范围间,提供了一个令人意想不到的较高分离率。从足够多人口的血浆标准品中得到的TxPA-S标准比,最优选集合成两个基本独立的范围,即除了统计学上少数的异常值外,两个范围间没有重叠。
因而,使用本发明方法的诊断准确性比先前的方法要高。落在较高标准范围内的样品TxPA-S比表示患者发展成所怀疑疾病的可能性非常低。落在较低标准范围内的样品TxPA-S比表示患者发展成该疾病的可能性非常高。落在两个标准范围之间的试验TxPA-S比表示不确定是否具有发展成所述疾病的危险。
当本方法进一步包括测量血浆中总甘油三酯浓度的步骤,并将甘油三酯的浓度代入诊断方程时,可更准确地测定出患者是否有发展成白蛋白-抑制疾病的倾向。测定患者的疾病倾向时,可考虑甘油三酯的浓度,其是通过评估TxPA-S比与甘油三酯浓度的图表而进行的。从这样一个图表可计算线性方程,该方程可把具有较高疾病潜在性的血浆与具有较低疾病潜在性的血浆区分开。通过将TxPA-S比和甘油三酯浓度代入方程中,可很容易地进行血浆样品的诊断。当诊断中包括了甘油三酯浓度的作用时,较高和较低的疾病可能性范围更加狭窄,且彼此分开。然而,用TxPA-S比代替TxPA值,从而为诊断的准确性带来明显的提高是通过下列事实加以证明的,即与甘油三酯浓度对TxPA值标准范围的作用相比,其对诊断标准范围之间的分离量的作用非常小,其中所述诊断标准范围是以TxPA-S比为基础的。
可通过本发明方法诊断的疾病是与血浆中pI 5.6白蛋白浓度下降有关的疾病。该方法特别适于预测由VLDL攻击所致的内皮细胞毁坏的血管疾病。此处所用的术语“疾病”是指疾病和其它医学可诊断的病症。这种疾病的实例是先兆子痫,动脉粥样硬化,中风,肾病综合征(肾病),外周血管病,和糖尿病性血管病。不被认为是血管疾病,但与白蛋白浓度有关的非-血管疾病和病症的实例是癌症,死亡,发病,败血症,休克和衰老。
用于除去VLDL,测量游离NEFA,和测量白蛋白的特殊方法并不是决定性的。用于进行本发明方法中各步骤的各种方法在本领域中是已知的。下面提供适宜方法和试剂的实例,但其不用于限制本发明的范围。
对于本方法来说,虽然目的NEFA浓度是指结合游离白蛋白的NEFA浓度,但是已经发现,不结合VLDL的NEFA浓度的测定值是的一种有效的,与结合游离白蛋白的NEFA浓度近似的值。因而,可区分结合VLDL的NEFA和不结合VLDL的NEFA的任何一种技术均适于测定游离NEFA的浓度。除去血浆中的VLDL后,可将结合VLDL的NEFA与游离NEFA区分开。
通过各种技术均可将VLDL从血浆中除去。这种分离方法的实例包括用于除去LDL和/或VLDL的任何一种已知的技术,包括超速离心,在二价离子存在的情况下,通过硫酸化聚糖或磷钨酸沉淀,免疫-沉淀,电泳,等电聚焦,电荷分离技术,如离子交换色谱,大小分离技术如凝胶过滤色谱等。VLDL最优选通过沉淀,接着将上清液从沉淀的固体中过滤,虹吸或倾倒而除去。
VLDL可通过使用非-白蛋白结合脂类沉淀试剂来沉淀。优选的试剂包括硫酸化聚糖,如葡聚糖硫酸酯,和二价离子,如氯化镁。用于沉淀VLDL的,市场上可购买到的沉淀试剂实例是HDL-胆固醇沉淀试剂,其由葡聚糖硫酸酯,氯化镁,氯化钠,和聚乙二醇组成,可从RefLabMedical Analysis Systems,Inc购买到。优选的沉淀试剂是葡聚糖硫酸酯(0.2mM),氯化镁(63.9mM),氯化钠(63.3mM),和聚乙二醇(3.3mM)的混合物。优选将LDL连同VLDL一起从血浆样品中除去。LDL连同VLDL一起从溶液中沉淀出来。沉淀的VLDL和LDL固体可通过已知的方法被除去,如离心该溶液,接着弃除血浆上清液。可供选择的VLDL和LDL沉淀试剂是由30.3mM磷钨酸和100mM氯化镁组成的。该溶液是以样品∶试剂=1∶5的比例混合的,且沉淀的VLDL和LDL固体是按照上述葡聚糖-镁沉淀方法被除去的。
除去VLDL后,可通过任何一种已知的测定脂肪酸浓度的方法测定上清液中游离NEFA的浓度。这种方法的实例在美国专利US4,071,413;US4,360,591;US4,349,625;US4,301,244和US4,229,538中公开。测量NEFA浓度的适宜方法包括滴定法,比色法,和放射性同位素法,其中优选比色法。萃取NEFA的适宜溶剂系统由Dole在V.P.J.Clin.Invest Vol 35(1956)150中公开。萃取的NEFA可通过用标准碱滴定至酸-碱指示终点来测量。
用于测定NEFA浓度的放射化学方法包括将NEFA萃取到Dove萃取液的庚烷相中,并去除磷脂。然后通过将它与放射性的硝酸镍混合而用放射性的63Ni标记该萃取物。其后,测定上层的,含镍-脂肪酸复合物的有机相的放射性。可用60Co代替63Ni,但由于它是一种γ-放射体,因而更加危险。
比色测定NEFA浓度的各种方法在本领域中是已知的,且可对从上清液萃取的NEFA进行,或对存在于体外上清液中的NEFA进行。萃取方法是以铜或钴盐的形成,及盐萃取到非-极性有机溶剂中为基础的,其中它与铬精染料络合,用于比色测量。可供选择地,且更优选地,可使用酶比色方法体外测量NEFA。这种方法的其中之一包括在加入三磷酸腺苷(ATP),镁离子和CoA的情况下,用酰基(acyl)辅酶A合成酶处理上清液,从而形成被称为酰基CoA的CoA的硫羟酸酯及副产物腺苷一磷酸(AMP)和焦磷酸盐(PPi)。然后用酰基CoA氧化酶氧化由此产生的酰基CoA,产生过氧化氢。在过氧化物酶存在的情况下,过氧化氢使3-甲基-N-乙基-N-β-羟乙基-苯胺与4-氨基安替比林氧化缩合,从而形成紫色的加合物。上清液中NEFA的浓度可从在550nm最大吸光度处测量的光密度测定。
我们发现,当使用该比色测定法时,血浆中存在的抗坏血酸(维生素C)经常会干扰NEFA浓度的测定。这可能主要是由于抗坏血酸作为抗氧化剂的生物作用及其与过氧化氢反应的能力。因此,当使用此类型的比色法测定NEFA的浓度时,优选在比色测定NEFA的浓度前,除去血浆或血浆上清波中的抗坏血酸。抗坏血酸盐氧化酶(AOD)的加入是一种除去抗坏血酸的适当方法。
在测定白蛋白浓度的步骤中,优选所测定的白蛋白浓度是游离白蛋白的浓度。因此,白蛋白浓度优选是在除去VLDL,特别是除去VLDL和LDL后,从剩余的血浆上清液测量的。白蛋白的浓度可通过已知的方法来测量,如酶联免疫吸附测定法(ELISA),免疫测定法,放射免疫测定法(RIA),染料结合比色分析法,及使用沉淀,电泳,电聚焦,凝胶过滤,离子交换色谱,亲和色谱等纯化白蛋白后,测量蛋白或氨基酸量的方法。染料结合比色测定法是一种测定白蛋白浓度的优选测定方法,这是因为它比其它方法更简便,且耗时更少。通常,当染料与白蛋白分子上的一个位点结合时,由于白蛋白团块和溶液中pH环境的差异,可对它进行检测。这种比色染料结合白蛋白测定法的实例在美国专利US5,182,214;US4,568,647;US3,873,272;US3,884,637;US5,194,390;US4,337,064和US4,230,456中公开。用于测定白蛋白浓度的优选比色测定法包括将约1-约10μL的上清液或血浆与约50-约200μL 0.030mmol/升的溴甲酚绿(pH4.2)白蛋白试剂混合。该白蛋白的浓度可通过测量628nm最大吸光度处的光密度来测定。
一种选择性的,测定游离pI 5.6白蛋白浓度指示值的方法包括测量白蛋白和结合VLDL的NEFA的浓度,并从血清中白蛋白和NEFA的总浓度中减去那些浓度,由此获得游离白蛋白的浓度和游离NEFA的浓度。这些浓度可用于计算上面提供的TxPA-S值。
特定血浆样品的TxPA-S比是按照本发明,通过用游离白蛋白的浓度除以游离NEFA的浓度计算的。所用的浓度单位并不重要,只要使用相同的单位,即可得到TxPA-S比的标准值。例如,TxPA-S值可用mg白蛋白/mg NEFA或吸光度白蛋白/吸光度NEFA或上述单位的组合来表达。
应当理解,虽然上面已经描述了本发明测定TxPA-S比的优选实施方案,本发明还包括一种方法,其中测定了游离pI 5.6白蛋白的实际浓度,或任何其它的这种指示值,并将其用作表示血液对特殊疾病的毒性预防能力的值。本发明的这种实施方案包括上述提供血浆样品的步骤,测定血浆中游离pI 5.6白蛋白的浓度,并通过比较游离pI 5.6白蛋白的浓度和标准值来评估血浆对疾病的毒性预防能力,其中所述标准值是通过对大多数血浆样品进行所述各步骤(a)和(b)而得到的,所述血浆样品均采集已知的,诊断患有或发展成所述疾病的患者。本领域的技术人员应当认识到,直接测量pI 5.6白蛋白的浓度不像测量游离白蛋白和游离NEFA浓度那样可行,这是因为进行电泳聚焦,从而将pI 5.6白蛋白与pI 4.8白蛋白分离开来是非常复杂的。
本发明优选的方法包括测量甘油三酯的浓度,并将其乘以在诊断中得到的值。甘油三酯的浓度可通过进行酶比色终点测定法来测定。
本发明还包括一种测定试剂盒,其是一种用于进行本发明优选方法的,特殊的试剂组合物,其中在经由比色测定法测定上清液中剩余的白蛋白和NEFA的浓度前,通过沉淀除去VLDL。本发明的测定试剂盒包括一种VLDL沉淀试剂,一种白蛋白结合pH-敏感性染料,和一种酶脂肪酸,一种比色试剂。本发明的测定试剂盒优选包括一种抗坏血酸氧化剂,如抗坏血酸盐氧化酶。
该测定试剂盒还优选包括一种甘油三酯酶比色终点试剂。适于结合并指示甘油三酯的比色试剂包括一种化合物和酶,其可一起发挥作用,将甘油三酯水解成甘油和脂肪酸。三磷酸腺苷(ATP)和甘油与甘油激酶反应,形成甘油-1-磷酸盐和二磷酸腺苷。甘油-1-磷酸盐(G-1-P)可被氧化产生过氧化氢,其是按照与NEFA试剂相似的方法测量的。可供选择地,G-1-P可与烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)反应,产生还原的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)。然后NADH可还原一种染料,其在还原形成甲时,颜色发生改变。或在前述测定法中,在乳酸脱氢酶存在的情况下,将丙酮酸盐加入到NADH中,并使用紫外光测定最终的NAD。在选择性的方法中,用醇KOH水解甘油三酯,形成甘油和脂肪酸。然后在有甘油激酶存在的情况下,甘油和ATP发生反应,形成甘油-1-磷酸盐和ADP。在下一个步骤中,在有丙酮酸激酶存在的情况下,ADP与磷酸烯醇丙酮酸结合,形成丙酮酸盐和ATP。然后,在有乳酸脱氢酶存在的情况下,丙酮酸盐与NADH反应,形成乳酸盐和NAD。然后用紫外光测量NAD。
该诊断试验试剂盒的VLDL沉淀试剂优选包括作为硫酸化聚糖的葡聚糖硫酸酯和作为二价离子的氯化镁,或磷钨酸和氯化镁。
pH-敏感性白蛋白结合染料优选溴甲酚绿,溴甲酚紫等。优选的酶脂肪酸比色试剂是含有酰基辅酶A合成酶,三磷酸腺苷,和辅酶A的混合物。关于本发明试剂盒中的各种试剂,有一种化合物当与血浆本体结合时可显现出颜色,颜色在任何时间的显现是由于试剂与血浆接触时,血浆本体上发生了化学反应。
通过下列实施例可进一步举例说明本发明,该实施例可举例说明其优选的实施方案。然而,应当理解,除非另有说明,否则这些实施例仅用于举例说明,而不是限制本发明的范围。
实施例
在下列实施例中,血液样品均是从在那时没有患先兆子痫的孕妇中采集的。在妊娠结束时,证实了这些患者中的先兆子痫发展,或没有先兆子痫发展。实施例1-6包括从患严重先兆子痫的妇女中采集的血液样品,这些妇女患有妊娠后期高血压(绝对血压至少为140/90毫米汞柱,或收缩压比前20周至少升高30毫米汞柱,或舒张压比前20周至少升高15毫米汞柱),蛋白尿(在插入导管的样品中,至少为30mg蛋白/dL尿,或在排泄的尿中,至少为60mg/dL),和血尿酸过多(对于妊娠时间来说,血清尿酸>1个标准偏差即高于正常水平)且不能妊娠到足孕。实施例7-9包括从患中度先兆子痫的妇女中采集的血液样品,其中的标准与严重先兆子痫的标准相同,除了它们可继续妊娠直到足孕。
实施例中使用了下列试剂:
沉淀试剂-
RefLab牌的HDL-胆固醇沉淀试剂,购自Medical Analysis Systems,Inc,(USA),含0.2mM葡聚糖硫酸酯,63.9mM氯化镁,63.3mM氯化钠,和3.3mM聚乙二醇。
白蛋白结合试剂-
购自Wako chemicals USA,Inc的白蛋白测定试剂盒,在50mmole/L柠檬酸盐缓冲液中,含有pH3.8的,0.2mmol/L的溴甲酚绿。
NEFA结合试剂与抗坏血酸去除剂-
购自Wako chemicals USA,Inc,Richmond,VA.的测定试剂盒试剂A是为了测定NEFA,而使抗坏血酸氧化并使辅酶A乙酰化而制备的。试剂B是为了测定NEFA,而使乙酰CoA氧化并产生过氧化氢而制备的。然后过氧化氢与3-甲基-N-乙基-N-β-羟乙基-苯胺和4-氨基安替比林反应,形成紫色。
试剂A:
ACS(酰基辅酶A合成酶) 3U/小瓶
AOD(抗坏血酸盐氧化酶) 15U/小瓶
CoA(辅酶A) 7mg/小瓶
ATP(三磷酸腺苷) 30mg/小瓶
4-氨基安替比林 3mg/小瓶
将10ml稀释剂(0.05M磷酸盐缓冲液,pH6.9,3mM氯化镁,表面活性剂和稳定剂)加入到试剂A的各小瓶中,制成工作溶液A。
试剂B:
ACOD(酰基辅酶A氧化酶) 132U/小瓶
POD(过氧化物酶) 150U/小瓶
NEHA(3-甲基-N-基-N-β-羟乙基-苯胺) 4mg/小瓶
工作溶液B是通过用20ml苯氧基乙醇(0.3%v/v)和表面活性剂稀释试剂B而制备的。
实施例1-(对照)
图1表示通过简单测量11个先兆子痫妇女和11个匹配对照妇女的血浆总白蛋白浓度而发生的诊断分离不足。
实施例2-(对照)
除了在测量白蛋白浓度前除去血浆中的VLDL之外,对相同的血浆样品进行与实施例1相同的测量(总)白蛋白的方法。在离心管中,将100μL血浆与100μL沉淀试剂混合,可将VLDL从各血浆样品中沉淀出来(根据试剂的浓度,样品与试剂可接受的比例为1∶1或1∶5)。在涡动混合器上振荡离心管从而达到混合,并以3,000rpm离心10分钟。通过将其吸量到一个干净的试管中而倾出上清液。用所得的上清液测定白蛋白的浓度。结果在图2中表示。
对图1和2所示数据进行的比较表明,在测量白蛋白前就除去VLDL组分,可提高先兆子痫血液样品和对照血液样品间白蛋白浓度的分离。图2比图1的重叠要少。对照患者血液样品的平均白蛋白浓度高于先兆子痫患者血液样品的平均白蛋白浓度。
实施例3-(对照)
此实施例举例说明实施例1中11个先兆子痫患者和11个对照患者血液样品间的NEFA浓度的分离。把从血液样品提取的血浆用于测试NEFA的浓度(没有除去VLDL)。为了测量NEFA的浓度,将5μL血浆吸量到平底微量滴定板的孔中。加入试剂A的工作溶液,将溶液(70μL)混合均匀,并将该板在37℃培养10分钟。然后加入试剂B的工作溶液(140μL),混合均匀,并将该板在37℃培养10分钟。在微量滴定板的阅读器上,测量550nm波长处的光密度。其中减去了水空白的吸光度,并记录了NEFA的浓度,与已知的标准相比,其与最终的吸光度成正比。
结果在图3中表示。
实施例4-
实施例4举例说明了进行本发明方法的方法。
在测量NEFA浓度前除去血浆中的VLDL,从而提供一种结合白蛋白的游离上清液,然后试验实施例3中的22个血浆样品。将100μL血浆与100μL沉淀试剂在离心管中混合,从而将VLDL从各血浆样品中沉淀出来。在涡动混合器上振荡该离心管从而混合,并以3,000rpm离心10分钟。通过将其吸量到一个干净的试管中而倾出上清液。按照实施例3所用的方法测量上清液的NEFA浓度。结果在图4中表示。
对图3和图4进行的比较表明,当把VLDL从血浆中除去时,在先兆子痫样品和对照样品间,患者样品中的NEFA浓度有显著的分离。这表明血浆中大量的NEFA除了结合白蛋白外,还结合VLDL。因此,除去结合VLDL的NEFA和结合VLDL的白蛋白后,可更准确地测量结合游离白蛋白的NEFA浓度,其与血液的毒性预防能力紧密相关。
实施例5-
使用实施例1-4的结果可计算出22个患者样品中的白蛋白与NEFA的比值。该比值首先是通过将实施例1(血浆样品)测定的白蛋白浓度除以实施例3(血浆样品)测定的NEFA浓度而计算的。这些结果在图5中绘出。
TxPA-S比值是按照本发明,相对于22个患者的样品,通过将实施例2(所测量的上清液)测定的白蛋白浓度除以实施例4(所测量的上清液)测定的NEFA浓度而计算的。这些结果在图6中绘出。
对图5和6进行的比较表明,在除去VLDL后,通过测量本发明方法中的白蛋白浓度和NEFA浓度,可获得显著的分离。图6表示先兆子痫样品和对照样品间的完全分离。
对图6所示结果的分析表明,落在约1.17-约1.78之间的TxPA-S比值表示正常的先兆子痫危险,其确定程度大约为100%,落在约0.63-约0.9之间的TxPA-S比值表示较高的先兆子痫危险,其确定程度大约为100%。而落在这两个范围间的TxPA-S比值是不确定的。
图6所示图表是利用本发明方法,将TxPA-S比的标准值用于诊断的实施例。例如,如果需要,单一的TxPA-S临界比值1.0可分离用于诊断目的的试验TxPA-S比。但小心地使用该范围会更加准确,特别是用大多数人口的参考样品得到的TxPA-S标准范围。
实施例6-
本实施例举例说明先前使用的测定柱TxPA的方法,并将结果与TxPA-S进行比较。按照Arbogast在Hypertension in PregnancyVol.15中公开的方法,通过等电聚焦方法直接从血浆(没有除去VLDL)的等分试样(10μl)测量血浆样品的(总)白蛋白浓度,其中所述血浆样品是从11个被诊断患有严重先兆子痫的孕妇和11个在妊娠时间,母亲年龄和种族上均匹配的孕妇中得到的。将10微升血浆放在10ml蔗糖密度(5%-50%)梯度和0.25ml pI4-6.5的安福灵(ampholine)中。通电18小时,并将柱洗脱到微孔板中。收集滴下的部分。将200微升白蛋白试剂与洗脱的样品混合,并在大约660nm处测量颜色。
图7的图表表示图6所示的结果与通过柱方法测定的TxPA的高度相关性,其中图6所示的结果是按照本发明比色测定的上清液等分试样的TxPA-S,柱方法测定的TxPA是按照Arbogast在Hypertension inPregnancy Vol.15中公开的方法,对来源于相同患者样品的血浆等分试样进行的。两组结果间的相关性系数(R2)为0.66。与柱TxPA方法的平行测定差异大约为10%,其中使用上清液的本发明比色方法具有大约2%的差异。
实施例7-9表示本发明方法在后来被诊断患有中度先兆子痫的妇女中的用途。
实施例7(对照)-
图8表示通过进行与实施例1相同的方法得到的总血清白蛋白水平,其是在妊娠后期(third frimester)的25个先兆子痫妇女和25个对照妇女中进行的。由此可见,大多数先兆子痫妇女的总白蛋白水平(<4g/dl)均低于对照组的标准范围。然而,两组之间显著重叠,使得总血清白蛋白的水平不能令人满意地预测先兆子痫。
实施例8-
实施例7所测的同样50份血液样品的TxPA-S比值是通过与实施例5相同的方法测定的。图9表示对同样两组妇女测定的TxPA-S与在实施例7中测量的总血清白蛋白水平相比,可产生更好的分离。使用图9所示的水平线作为诊断基准,可将对照组的76%(19/25)与先兆子痫的68%(17/25)区分开。与实施例7相比,其有了显著的提高。
实施例9-
在本实施例中,通过将各TxPA-S的比值乘以上清液(除去了VLDL和LDL)中的HDL浓度来进一步评估实施例8所测的TxPA-S数据。HDL胆固醇浓度是使用磷钨酸沉淀VLDL和LDL后,对上清液测量的,该方法在Lopes-Virella MF,Stone P,Ellis S,Colwell JA.在通过三种不同方法分离的高密度脂蛋白中测定胆固醇(CholesterolDetermination in High Density Lipoproteins Separated by ThreeDifferent Methods),Clin Chem 23:882-6(1977),和Allain CA,Poon LS,Chan CSG,Richmond W.Fu PC.总血清胆固醇的酶测定(Enzymatic Determination of Total Serum Cholesterol),ClinChem 20:470-5(1974)中公开,这两篇文献引入此处作为参考。
图10表示将HDL水平代入到方程中,可获得进一步的提高。在此实施例中,76%(19/25)的对照妇女与88%(22/25)的先兆子痫妇女可被区分开。
虽然已经通过说明书和实施例中的优选实施方案描述了本发明,但应当理解这种公开不是对此处所述发明的限制。毫无疑问,在阅读所公开的内容之后,各种变化和改进对于本领域的那些技术人员来说均是显而易见的。附加的权利要求才是对本发明范围的覆盖。所有这种变化和改进均落在本发明的精神和范围之内。
Claims (15)
1.一种测定血浆对疾病的毒性预防能力的方法,该疾病与血浆中pI 5.6白蛋白浓度的下降有关,所述方法包括下列步骤:
(a)提供一种血浆样品,该血浆样品含有游离白蛋白,具有6-20个碳原子的酰基链的游离未-酯化脂肪酸,具有6-20个碳原子的酰基链的甘油三酯,极低密度脂蛋白,低密度脂蛋白和高密度脂蛋白;
(b)测定游离白蛋白的浓度;
(c)测定游离未-酯化脂肪酸的浓度;和
(d)通过将游离白蛋白的浓度与游离未-酯化脂肪酸的浓度进行比较来计算表示血浆的毒性预防能力的值;
其中所述测定步骤(b)和(c)采用非细胞培养试验进行。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述计算步骤包括用游离白蛋白的浓度除以游离未-酯化脂肪酸的浓度,由此提供作为指示值的上清液的毒性预防活性比。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述测定游离白蛋白的浓度的步骤和测定游离未-酯化脂肪酸浓度的步骤是在除去血浆样品中的极低密度脂蛋白后进行的。
4.根据权利要求1所述的方法,进一步包括测定甘油三酯和高密度脂蛋白浓度的步骤,此外,其中所述计算步骤(d)包括将甘油三酯和高密度脂蛋白的浓度乘入值的计算中。
5.根据权利要求1或4所述的方法,进一步包括评估血浆对所述疾病的毒性预防能力的步骤(e),其包括将在所述步骤(d)中计算的值与标准值进行比较,该标准值是通过对大量血浆样品进行所述各步骤而测定的,且各血浆样品是从已知的、诊断患有或可能发展成所述疾病的患者中抽出的。
6.根据权利要求2所述的方法,进一步包括通过将含所述上清液毒性预防活性值的诊断因数与标准值进行比较来诊断所述血浆的毒性预防能力,其中所述标准值是通过对大量血浆样品进行权利要求2的方法而测定的,该血浆样品对白蛋白抑制疾病具有已知的毒性预防能力。
7.根据权利要求6所述的方法,其中所述标准值是一个单一的值,一个单一的值的范围,或多个的值的范围。
8.根据权利要求7所述的方法,其中所述多个范围彼此不相包含。
9.根据权利要求1所述的方法,其中所述疾病是先兆子痫、动脉粥样硬化、中风、外周血管病、糖尿病性血管病、肾病综合征、败血症、休克、癌症、衰老、死亡或发病。
10.根据权利要求3所述的方法,其中所述除去极低密度脂蛋白的步骤(a)是通过沉淀进行的,所述步骤(b)是通过进行比色染料结合测定法、ELISA或放射免疫测定法进行的,所述步骤(c)是通过进行滴定法、放射性同位素测定法或比色测定法,包括酶比色测定法进行的。
11.根据权利要求1所述的方法,其中所述血浆样品含有抗坏血酸,且所述测定游离未-酯化脂肪酸浓度的步骤是在除去血浆样品中的抗坏血酸后进行的。
12.一种测定血浆对疾病的毒性预防能力的方法,该疾病与血浆中pI 5.6白蛋白浓度的下降有关,所述方法包括下列步骤:
(a)提供一种血浆样品,该血浆样品含有的总游离白蛋白的浓度包括游离pI 5.6白蛋白的浓度和游离pI 4.8白蛋白的浓度,且含有具有6-20个碳原子的酰基链的甘油三酯,极低密度脂蛋白,低密度脂蛋白,高密度脂蛋白,和结合总游离白蛋白的未-酯化脂肪酸,所述未-酯化脂肪酸具有6-20个碳原子的酰基链;
(b)测定表示游离pI 5.6白蛋白浓度的值;并
(c)通过将该值与标准值进行比较来评估血浆对所述疾病的毒性预防能力,其中所述标准值是通过对大量血浆样品进行所述步骤(a)和(b)而得到的,且所述各个血浆样品是从已知的、诊断患有该疾病的患者中抽出的。
13.根据权利要求12所述的方法,其中所述测定步骤(b)是通过测定总游离白蛋白的浓度,并测定与总游离白蛋白结合的未-酯化脂肪酸的浓度进行的,并通过将总游离白蛋白的浓度与结合总游离白蛋白的未-酯化脂肪酸的浓度进行比较来计算该值。
14.根据权利要求12所述的方法,其中在所述步骤(b)中测定的值是血浆中游离pI 5.6白蛋白的浓度,且所述步骤(b)包括除去血浆中的极低密度脂蛋白和pI 4.8白蛋白,从而提供一种血浆上清液,然后测量上清液中剩余白蛋白的浓度。
15.根据权利要求12所述的方法,其中所述疾病是先兆子痫、动脉粥样硬化、中风、外周血管病、糖尿病性血管病、肾病综合征、败血症、休克、癌症、衰老、死亡或发病。
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