JPH02222699A - リポタンパク成分の分画方法及び分析方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、血液等の各種体液、その他の液体試料に含ま
れている成分、特に高比重リポタンパク（以下％ＨＤＬ
と略記する）分画中に含有される成分を分画する方法及
び分析する方法に関する。

〔従来の技術〕

近年、臨床医字面においては、血液中のリポタンパク成
分、特に、ＨＤＬ分画中に含まれる成分を定量分析する
ことが診断上欠かせなくなっている。

測定法は全り・ボタンバクから、ＨＤＬを分画する操作
、ＨＤＬ中の成分を測定する操作の°２゛段階で構成さ
れている。ＨＤＬを分画するには、超遠心法、グルｒ過
法、ポリアニオン−２価金属沈殿法などが用いられてい
る。現在は、操作が間便でかつ特別な機器を使用しない
ことからポリアニオン−２価金属沈殿法による測定が圧
倒的に多用されている。

上記の沈殿法による分画は、低比重リポタンパク（ＬＤ
Ｌ）と超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）のみを不溶性
の沈殿とし、ＨＤＬを沈殿させない。

沈殿したＬＤＬとＶＬＤＬは、遠心分離によつて沈殿し
ないＨＤＬと分離される。上溝として分離されたＨＤＬ
中の脂質、タンパク質などの成分を常法によって分析す
る、という段階を経る。

測定される成分としては、特にコレステロール、すなわ
ちＨＤＬ−コレステロールの測定が有用である。

〔発明が解決しようとする諌題〕

液体試料中の成分を定量しようとする場合、それに用い
る反応に過酸化水素が関与する方法では、試料中に還元
性物質が存在する場合には、障害が起り得る。試料中に
は、アスコルビン酸が存在することが特に多く、次の反
応により、測定を妨害することが知られている。

デヒドロアスコルビンＭ　＋　Ｈ３Ｏ この反応を抑えるためには、アスコルビン酸オキシダー
ゼな゛ど、アスコルビン酸を酸化する物質を系に添加し
、アスコルビン酸をあらかじめ酸化しておくとよい。

しかし、特公昭５５−２１６７７号、特開昭５５−１６
４３５６号、同５７−１２５８４７号各公報などに記載
された、操作性が簡便なドライケミストリーを用いる分
析素子の場合、完全に７スコルビン酸の影響を除くこと
は困難で、しかもアスコルビン酸オキシダーゼを大量に
用いる必要があった。しかも、アスコルビン酸オキシダ
ーゼを分析素子に導入すると、分析素子の製造コストが
高くなる、という問題点を有してい次。

本発明の目的は、アスコルビン酸の影響を抑え、しかも
高価なアスコルビン酸オキシダーゼの使用量が少蓋で済
み、分析素子の展進コストを抑えた分画方法及び分析方
法を提供することにある。

〔味題を解決するための手段〕

本発明を概説すれば、本発明の第１の発明は分画方法に
関す゛る発明であって、液体試料中のリポタンパクをポ
リアニオン−２価金属沈殿法を用いて分画する方法にお
いて、腋分画操作をアスコルビン酸オキシダーゼの存在
下に行うことを特徴とする。

そして、本発明の第２の発明は分析方法・に関する発明
であって、液体試料中のリポタンパクをポリアニオン−
２価金属沈殿法を用いて分画し、次いで分画したリポタ
ンパク分画中の特定成分を分析する方法において、核分
画操作をアスコルビン酸オキシダーゼの存在下に行うこ
とを特徴とする。

本発明は、分画の際に用いる試薬（以下、分画試薬と記
載する）にアスコルビン酸オキシダーゼ　を加えること
により完成した。すなわち、測定の前段階で行われる分
画操作時に、試料中のアスコルビン酸を消去することで
、測足時の妨害を防ぐことができた。

本発明において用いられる分画方法としては、ポリアニ
オン−２価金属沈殿法への適用が好ましい。用いる試薬
は、ポリアニオン−２価金属沈殿法で通常用いられる試
薬を支障なく使うことができる。通常用いられるものと
しては、ポリアニオンではヘパリン、デキストラン硫酸
、リン・タングステン酸、などが用いられ、これらに組
合せる２価金属イオンとしてはマグネシウム、カルシウ
ム、マンガン、ニッケルなどが用いられる。

本発明の方法により、分画されたＨＤＬ分画の構成成分
は、公知の方法に従って分析することができる。本発明
の方法の適用が特に有効な成分の測定は、酵素法を用い
るコレステロール測定においてであるが、その他に、同
じ過酸化水素検出系を用いるリン脂質、また同様に７ス
コルビン酸の影響を受けるホルマザン色素生成系を用い
るトリグリセライドなどの測定においても有効である。

本発明の方法は前記のようなドライケミストリーを用い
る分析菓子に適用し、特定成分の定蓋分析を行５場合、
特に有効である。従来、アスコルビン酸オキシダーゼは
、分析菓子の構成層内に入れていたが、通常１０μを程
度の微量の液体試料中の水分を用いて反応を行うため、
アスコルビン酸オキシダーゼの効果が充分発揮されず、
しかも比較的多くの童のアスコルビン酸オキシダーゼを
用いる必要がある次め、製造費用がかさむなどの問題点
があつ次。本発明の方法を用いれば、アスコルビン酸オ
キシダーゼは有効に働き、しかも、比較的少量でも効果
があるので、分析素子中に７スコルビン酸オキシダーゼ
を入れる必要がなく、製造費用を安価にすることができ
、しかも、アスコルビン酸の影響を受けにくい分析素子
の製造が可能である。

また、驚くべきことに、分析素子、あるいは＃液性で用
いる反応試薬に７スコルビン酸オキシダーゼをいれない
と、分析素子あるいは溶層法で用いる反応試薬の保存安
定性が向上する、といり予想されない効果があることが
判明した。

葦た、分画する前の液体試料にアスコルビン酸オキシダ
ーゼを添加してもこれと同様の効果が得られるが、アス
コルビン酸オキシダーゼ添加、分画操作、測定、と５段
階の手間がかかつてしまう。これに対し、本発明の方法
を用いれば、分画操作、測定の２段階ですむのでより簡
便である。

本発明に用いるアスコルビン酸オキシダーゼは由来する
生物により各種のものが市販されているが、いずれのも
のを用いてもよく、また、アスコルビン酸オキシダーゼ
の名称をもたなくても、アスコルビン酸を特異的に酸化
する物質であれは用いることができる。またこれらを２
攬以上組合せて使用することも可能である。

本発明の分析方法を適用する分析素子が、過酸化水素検
出反応を用いる場合には、その反応系は、通常用いられ
ているものを不都合なく用いることができる。

ペルオキシダーゼを用いる場合には、常法に従って水素
供与体及びカプラーを併用する。

水素供与体の例としては、特開昭４８−５２１５８号公
報に開示されている４−置換アンチビリン、同５５−２
０４７１号公報に開示されている２−ヒドラジノペンジ
チアゾリン、同５５−１４８１００号公報に開示されて
いるｐ−ハロゲノフェノール（以上、特開昭５７１７４
０９９号公報参照）、更に特開昭５０−１３７１９２号
、同５７−９４６５５号、及び同５７−１７４０９９号
各公報に開示されている０−又はｐ−フェニレンジアミ
ン系化合物が挙けられる。

これらの中で好ましいものは、４−置換アンチビリン及
びｐ−７ユニレンジアミン系化合物であり、特に、４−
アミノアンチビリン、特開昭５７−９４６５３号公報に
具体例として挙げられているｐ−７ユニレンジアミン系
化合物が好ましい。

水素供与体は広範に選択された量を用いることが可能で
あるが、１０１〜１００ミリモル／　ｍ３、好ましくは
１０５〜５０ミリモル／ｍ２の範囲で用りることができ
る。

カプラーの例としては、特開昭５７−９４６５４号公報
に開示されているアシルアセトアミド化合物、同５７−
９４６５６号及び同５７−１７４０９９号各公報に開示
されているビラグロン系化合物、同５７−９４６５５号
及び同５７−１７４０？９号各公報に開示されているフ
ェノール系化合物、同５７−９４６５５号及び同５７−
１７４０９９号各公報に開示されているナフトール系化
合物、及び同５７−１７４０９９号公報に開示されてい
るＮ、Ｎ−ジ置換アニリン化合物が挙げられる。これら
の中で好ましいものは、ピラゾロン系化合物、フェノー
ル系化合物及びナフトール系化合物であり、特に特開昭
５７−９４６５６号、同５７−９４６５３号、同５７−
９４６５５号及び同５７−１７４０９９号各公報に具体
例として挙げられている化合物、ま次具体的には、７−
クロロ−３−（２−（２−ヘキシルデシルスルホニル〕
エチル〕−６−メチル−ピラゾロ−（３，２−ｏ’）−
ａ−）リアゾールなどが好ましい。

カプラーは広範に選択された量を用いることが可能であ
るが、α１〜１００　ミ１７モル／　ｍ”、好ましくは
ＣＬ５〜５０ミリモル／　ｍ”の範囲で用いることがで
きる。

本発明の分析方法を適用する分析素子は支持体上に、液
体試料中の成分と反応する少なくとも一種の試薬を含み
且つ親水性コロイドからなる少なくとも一層の試薬層と
、その上方に前記液体試料中の成分を前記試薬層へ透過
又はｆ遇する展開層を順次積１−シてつくられる。

本発明の分析方法を適用する分析素子に用いる支持体は
、従来公知のものでよく、好適なものには、液体不浸透
性で、且つ光透過性のものかあジ、例えば酢酸セルロー
ス、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、
又はポリスチレンのような植々の重合体材料が、この使
用目的に適する。更には、上記重合体材料のみならず、
ガラスのごとき無機材料も同様に用いることが可能であ
る。支持体の厚さは任意であるが、好ましくは約５０〜
約２５０μｍである。

また、支持体の観測側の一側面は、その目的に応じて任
意に加工することが可能である。更に試薬層を積層する
側の支持体面に、場合によっては光透過性の下塗り層を
使用して試薬層と支持体との接着性を改良することがで
きる。

本発明の分析方法を適用する分析素子の展開層は、（１
）一定容量の液体試料を単位面積当Ｖ　−定容量を試薬
層に均一に配布する機能を有するものである。その上、
更に、特公昭５３−２１６７７号公報に記載された性能
、すなわち（２）液体試料中の分析反応を阻害する物質
又は−要因を除去する機能、及び／又は（３）分光光度
分析を行うときに支持体を経て透過する測定光を反射ｊ
゛るバックグランド作用を行５機能を有するものであれ
ば好ましい。し次がって、展開層は、上記＋１１の機能
のみを有する層、＋１１に加えて（２）及び／又は（３
）の機能を併せて有する層のいずれかとすることができ
、あるいは、（１１包含する複数の機能を適宜分離し、
各機能ごとに別の層を使用することも可能である。更に
（１）、（２）及び（３）の機能のうち、２つの機能を
有する層と、残りの１つの機能を有する層を組合せて使
用することもできる。例えば、前述の特公昭５５−２１
６７７号公報に記載された二酸化チタン及び二師酵セル
ロースから成るプラッシュポリマーと呼称される非繊維
多孔質媒体の展開層、特開昭５５−１６４３５６号公報
に記載され九親水化処理した織物の展開層、特開昭５７
−９４６５Ｂ号、同５７−１２５８４７号、同５７−１
９７４６６号及び同５８−７０１６１号等の各公報に記
載された線維溝造展開層、％開昭５８−９０１６７号各
公報に記載された粒子結合体構造展開層が挙げられる。

特に、上記愼維構造展開層及び粒子結合体構造展開層は
、血球部分も速やかに移送することが可能な素材として
特に有用である。

本発明を適用する分析素子における展開層の膜厚は、そ
の窒隙率によって決定されるべきであるが、好ましくは
約１００〜約５００μｍ１更に、好ましくは約１５０〜
５５０　Ａｍである。また、！２隙率は好ましくは約２
０〜約８５％である。

また他の付加的な添加剤として１例えば保恒剤、緩衝剤
、界面活性剤等、種々の龜加剤も所望に応じて添加する
ことができる。

特に界面活性剤は液体試料を分析素子に適用した際の浸
透速度の調節等有効に用いることができる。

使用可能な界面活性剤としては、イオン性（アニオン性
又はカチオン性）、非イオン性を潤わず使用することが
可能であるが、非イオン性界面活性剤が有効である。非
イオン性界面活性剤の例としては、例えば２．５−ジー
ｔ−ブチルフェノ中シポリエチレングリコール、ｐ−オ
クチルフェノキシポリエチレングリコール、ｐ−イソノ
ニルフェノキシポリエチレングリコール等のアルキル置
換フェノールのポリアルキレングリコール誘導体、高級
脂肪酸のポリアルキレングリコールエステル等が挙げら
れる。これらの界面活性剤は液体試料の受容層への浸透
速度を調節し、同時に好ましからざる「クロマトグラフ
ィ現象」発生を抑制する効果を有する。

上記界面活性剤は広範に選択された量を用いることか可
能であるが、塗布液の重量に対して１０重量％〜０．０
０５重ｔ％、好ましくは６１ｉ量チ〜ｌ１０５重量優用
いることができる。

本発明の分析方法を適用する分析素子に係る試薬Ｎは親
水性バインダーから構成されるものであジ、二層以上の
試薬層に分離することも可能である。

バインダーとしては、ゼラチン、フタル化ゼラチン等の
ゼラチン誘導体、ヒドロキシエチルセルロース、カルボ
キシメチルセルロースナトリウム塩等の水溶性セルロー
ス誘導体、ポリビニルアルコール、ポリアクリルアミド
、ポリメタクリルアミド、ポリ（モノ又はジアルキル置
換）アクリルアミド、ポリ（モノ又はジアルキル置換）
メタクリルアミド、及びこれらの水浴性共重合体等が挙
げられる。

本発明の分析方法を適用する分析素子は、心安に応じて
、例えば米国特許第５，９９２，１５８号明細畳記載の
反射層、下塗り層、米国特許第４．０４２，５５５号明
細書記載の放射線ブロッキング層、米国特許第４，０６
６，４０５号ＢＡ細書記載のバリヤー層、米国特許第４
，１６６，０９５号明細書記載のマイグレーション阻止
層、特開昭５５−９Ｑ８５９号公＠記載のスカベンジャ
ー層及び米国特許第４，１１０，０７９号明細書記載の
破壊性ポンド状部材等を任意に組合せて目的に合せた任
意の構成とすることができる。

これら分析素子の種々の鳩は、支持体上に所望の構成に
従い、従来写真工業において公知のスライドホッパー塗
布法、押出し塗布法、浸漬塗布法等を適宜選択して用い
、順次積／ｉＩすることで任意の厚みの層を塗設するこ
とができる。

本発明の分析方法を適用する分析素子を用いて、液体試
料中の特定成分の量を、本発明に係る支持体側から反射
スペクトロホトメトリーにより初速置注又は反応終結法
に従って測定することができる。このようにして得られ
た測定値は、あらかじめ作成しておい次検量線に轟では
めることで特定成分の量を決定することができる。

本発明の分析方法を適用する分析素子に適用される液体
試料の量は任意に定めることができるが、好ましくは約
５μｔから約５０　Ａｌであり、更に好ましくは５　Ａ
ｔから２０μｔである。通常約１０μｔの液体試料を適
用するのが好ましい。

本発明の分析方法は、血清及び血奈のいずれの分析にも
不都合なく用いることができる。史には尿、１ノンバ液
、髄液等の他の体液も不都合なく用いられる。

本発明の分析方法を適用する分析素子に用いられる分析
反応は、その目的により任意に定めることができるが、
例えば臨床化学の分野に有用であり、特に生物学的液体
試料、すなわち血液又は尿中の成分の分析に用いられる
。

〔実施例〕

以下、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明するが
、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。

実施例１ ＰＩＸ厚１８０　ａｍの透明な下引済ポリエチレンテレ
ツタレート支持体上に、下記第１表−ＩＫ記載の組成の
試薬層を順次塗設して分析素子を製造した。

第１表−１ 第１表−１ （続き） レスチロール殴度と反射濃度から、それぞれの検量線を
作成し友。

更に下記第２辰の組成の分画試薬をＰＡ製した。

第 懺 以上のようにして得られた分析素子（１１，＋２１に対
して種々の既知ａ度のＨＤＬ−コレステロールを含む分
画済みのヒト血漿１０μｔを展開層上から滴下し、３７
℃で７分間インキュベーションを行った後、反射濃度を
測定し、ＨＤＬ−コまた、下記の第１表−２のようにし
て、分析試薬を１ｌ１４ｉＬ、た。

第１表−２ る吸光度を測定し、ＨＤＬ−コレステロール濃度と反射
濃度から、それぞれの検量線を作成した。

分析素子＋１１、（２）を気温４０Ｃ１湿度５５％の条
件下で、３日、及び７日間保存した後、既知濃度のＨＤ
Ｌ−コレステロールを含む分画済のヒト血漿を滴下し、
３７℃で７分間インキュベーションを行い、反射濃度を
測定し、それぞれの検ｔＳを用いてＨＤＬ−コレステロ
ール濃度に変換し念。結果を第５表に示す。

第　　３　　弐 以上のような組成の水溶液の分析試薬（８）、ｇ３）に
対して、種々の既知濃度のＨＤＬ−コレステロールを含
む分画済のヒト血漿を用いて、試薬容量２．９５Ｗｉｔ
、ヒト血漿α１１１ｔ、セル長１．０傭、３７℃７分間
の反応時間、波長ｓ　ｏ　ｏ　ｎｍにおけ第５表に示し
たとおり、アスコルビン酸オキシダーゼ非添加の分析素
子＋１１は、保存安定性に優れているが、アスコルビン
酸オキシダーゼを添加した分析素子（２）は、保存安定
性が劣ることが判る。

実施例２ 鏝度既知のＨＤＬ−コレステロールを含ム分画前のヒト
血漿２ｓｌＶｃ％アスコルビン酸を添カロした。それぞ
れを、本発明の分画試薬囚、比較分画試薬（Ｂ）それぞ
れを用いて分画した。分画は、試料α１ｗ１ｔに対し、
分画試薬α１−を加えて混和し、約１０分間静置した後
、５０００回転で１０分間遠心分離して行った。それぞ
れの上澄１０μｔを分析素子（１）に滴下した。更に比
較分画試薬の）で分画した試料だけ、分析素子（２）に
も滴下した。部下後、３７℃で７分間インキュペーショ
／を行った後、反射濃度を測足し、それぞれの検量線を
用いてＨＤＬ−コレステロール濃度に変換した。その結
果を第４表に示す。

第　　４ 表 この結果より、本発明の分画試薬（８）を用いると、ア
スコルビン酸の影響が軽減され、分析素子に７スコルビ
ン酸オキシダーゼを添加した分析素子（２）より影響を
受けにくいことがわかる。

実施例５ 分析試薬囚、ＣＢ）を気温１０℃、湿度２５％の条件下
で７日、及び１４日間保存した後、既知濃度のＨＤＬ−
コレステロールを宮む分画済のヒト血漿を用い、試薬容
量２．９５＋ｄ、ヒト面素（Ｌ１ａ＋ｊ、セル長１．０
　ｃｍ、　３７℃７分間の反応時間、波長５００　ｎｉ
ｎにおける吸光度を測定し、それぞれの検量線を用いて
ＨＤＬ−コレステロール濃度に変換した。その結果を第
５表に示す。

第　　５　　表 第５表に示したとおり、アスコルビン酸オキシダーゼ非
含有の分析試薬囚は、保存安定性に優れているが、アス
コルビン職オキシダーゼ含有の分析試薬（Ｂ）は保存安
定性が劣ることがわかる。

〔発明の効果〕

実施例　に示した分析素子（２）は、従来用いられてき
たＨＤＬ−コレステロール測定用分析素子である。１回
の測定に用いる分析素子の面積は２．２５ｉ　（−辺１
．５錦の正方形）であるので、１回測定分中には五３７
ユニツトのアスコルビン酸オキシダーゼを用いる。

これに対し、本発明によれば、１回の測定に、分画試薬
をＣＬ１ｄ用いる場合、アスコルビン酸オキシダーゼの
使用量は１ユニツトで、従来の５分の１以下の使用量で
すませることができる。

更に、使用する分画試薬のｉｔを減らすことにより、更
に少量ですませることが可能となる。

以上詳説したように、本発明の分析方法によれば、アス
コルビン酸の影＃を抑制し、しかも高価なアスコルビン
酸オキシダーゼの使用量が少量ですむ高精度の分析が可
能となり、更に、分析素子の保存安定性も損うことなく
、実用上極めて有効である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、液体試料中のリポタンパクをポリアニオン−２価金
   属沈殿法を用いて分画する方法において、該分画操作を
   アスコルビン酸オキシダーゼの存在下に行うことを特徴
   とする分画方法。 ２、液体試料中のリポタンパクをポリアニオン−２価金
   属沈殿法を用いて分画し、次いで分画したリポタンパク
   分画中の特定成分を分析する方法において、該分画操作
   をアスコルビン酸オキシダーゼの存在下に行うことを特
   徴とする分析方法。